Thẩm Định Qui Trình Phân Tích Validation of Analytical Procedures. PGS.TS. Nguyễn Đức Tuấn Bộ môn Hóa Phân Tích – Kiểm Nghiệm

Việc thẩm định lại quy trình phân tích của dược điển được tiến hành theo hướng dẫn thẩm định quy trình phân tích như sau:  Định tính: Tính đặc hiệu  Định lượng Định lượng hoạt chất ho

Thẩm Định Qui Trình Phân Tích

Validation of Analytical Procedures

PGS.TS Nguyễn Đức Tuấn

Bộ môn Hóa Phân Tích – Kiểm Nghiệm

Khoa Dược – Đại học Y Dược TPHCM

Thẩm Định Qui Trình Phân Tích

Mục tiêu

 Trình bày được định nghĩa và phân loại qui trình phân tích; sự cần thiết phải thẩm định qui trình phân tích

 Thực hiện được các chỉ tiêu cho việc thẩm định một qui trình phân tích

 Đánh giá được một qui trình phân tích sau khi được thẩm định

Nội dung

 Qui trình phân tích

 Thẩm định qui trình phân tích

 Các chỉ tiêu trong thẩm định qui trình phân tích

 Thẩm định qui trình định lượng dược chất trong dịch sinh học (tự đọc)

 Một số ví dụ

Đại học Y Dược TPHCM Nguyễn Đức Tuấn

Thẩm Định Qui Trình Phân Tích

Tài liệu tham khảo

1 Quyết định của Bộ Y tế số 44/2014/TT-BYT ngày 25 tháng 11 năm 2014 về việc ban hành

Thông tư Qui định việc đăng ký thuốc, phụ lục 1 “Bộ hồ sơ kỹ thuật chung Asean (ACTD) và các hướng dẫn kỹ thuật”

2 Quyết định của Cục trưởng Cục Quản lý Dược, Bộ Y tế số 07/QĐ-QLD ngày 11 tháng 01 năm

2013 về việc ban hành Sổ tay hướng dẫn đăng ký thuốc, phụ lục 8.

3 Asean guideline for validation of analytical procedures (2008), pp 1-17

4. Bộ môn Hóa phân tích – Kiểm nghiệm, Kiểm nghiệm thuốc (2011), lần xuất bản thứ 1, nhà xuất

bản Giáo dục Việt Nam, Hà Nội, tr 135 - 180

5 Quyết định của Bộ trưởng Bộ Y tế số 1570/2000/QĐ-BYT ngày 22 tháng 5 năm 2000 về việc

triển khai áp dụng nguyên tắc Thực hành tốt phòng kiểm nghiệm thuốc, tr 369 – 370

6. BP 2013, Apendix III, Chromatographic separation techniques, pp 6 -11

7. ICH Harmonised tripartite guideline (2005), Validation of analytical procedures: text and

methodology, pp 1 – 13

8 Dược điển Việt Nam IV (2009), tr 2004, 462, 463, PL-119 – PL-123, PL-311 – PL-312

9. USP 35 (2013), Data elements required for validation, p 736

10 FDA (2001), Guidance for industry, Bioanalytical method validation, pp 4 – 11

11 European Medicines Agency (2010), Guideline on validation of bioanalytical methods, pp 4 - 13

12 Ludwig Huber (2007), Validation and qualification in analytical laboratories, second edition, pp.

144, 146

 Xử lý, tính toán và biện giải kết quả, v.v

 Nhưng không chỉ giới hạn ở các phần này

Đại học Y Dược TPHCM Nguyễn Đức Tuấn

Qui Trình Phân Tích

 Phân loại

 Qui trình định tính: nhằm khẳng định sự có mặt của các chất phân tíchtrong mẫu thử Thường được thực hiện bằng cách so sánh kết quả phântích (phổ đồ, đáp ứng sắc ký, phản ứng hóa học, …) của mẫu thử với chấtchuẩn

 Qui trình thử tạp chất: nhằm mục đích phản ánh chính xác mức độ tinhkhiết của mẫu thử

 Định lượng hàm lượng các tạp chất (quantitative test for impurities’content)

 Thử giới hạn tạp chất (limit tests for the control of impurities)

 So với phép thử giới hạn tạp chất thì phép thử định lượng tạp chất cònyêu cầu thêm một số chỉ tiêu thẩm định khác

 Các chỉ tiêu thẩm định này cũng có thể áp dụng cho các phép định lượng liên quan đến các qui trình phân tích khác (ví dụ: thử độ hòa tan)

 Định lượng dược chất trong dịch sinh học có hướng dẫn thẩm định riêng

Đại học Y Dược TPHCM Nguyễn Đức Tuấn

 Để đưa vào chuyên luận Dược điển hoặc tiêu chuẩn cơ sở

 Thực tế: có thể phác thảo công việc thực nghiệm nhằm xem xét tiến hành đánh giá một cách thích hợp đồng thời nhiều thuộc tính để đưa ra những hiểu biết về khả năng của một qui trình phân tích (ví dụ: tính đặc hiệu, tuyến tính, khoảng xác định, độ đúng

Thẩm Định Qui Trình Phân Tích – Đăng ký thuốc

Trường hợp đăng ký chất lượng theo tiêu chuẩn dược điển:

 Khi đăng ký chất lượng theo một trong các dược điển thuộc nhóm dược điển tham chiếu (DĐVN, BP, USP, JP, IP (DĐQT), EP):

Cần có báo cáo đánh giá sự phù hợp của việc áp dụng quy trình phân tích trong dược điển đăng ký để kiểm tra chất lượng thuốc xin đăng ký Tùy từng trường hợp cụ thể, có thể áp dụng một trong 02 hình thức sau:

 Bằng biện luận : Đưa ra các biện luận đối với mỗi quy trình phân tích được áp dụng nhằm chứng minh kết quả phân tích thu được là không bị ảnh hưởng bởi các thành phần tá dược có mặt trong công thức thuốc xin đăng ký

 Bằng thực nghiệm : Cung cấp các số liệu thẩm định lại quy trình phân tích trong dược điển áp dụng cho thuốc xin đăng ký đối với quy trình phân tích nào khi biện luận cho thấy cần thiết phải đánh giá sự phù hợp bằng thực nghiệm Việc thẩm định lại quy trình phân tích của dược điển được tiến hành theo hướng dẫn thẩm định quy trình phân tích như sau:

 Định tính: Tính đặc hiệu

 Định lượng (Định lượng hoạt chất hoặc thành phần đã chọn khác, tạp chất và lượng hoạt chất giải phóng ở chỉ tiêu độ hòa tan): Độ đúng và tính đặc hiệu

 Thử giới hạn tạp chất: Tính đặc hiệu

Thẩm Định Qui Trình Phân Tích – Đăng ký thuốc

Trường hợp đăng ký chất lượng theo tiêu chuẩn dược điển:

 Khi đăng ký chất lượng theo một dược điển không thuộc nhóm dược điển tham chiếu:

Cung cấp đầy đủ số liệu thẩm định quy trình phân tích như quy định đối với trường hợp đăng ký chất lượng theo tiêu chuẩn nhà sản xuất.

Đại học Y Dược TPHCM Nguyễn Đức Tuấn

Thẩm Định Qui Trình Phân Tích – Đăng ký thuốc

Trường hợp đăng ký chất lượng theo tiêu chuẩn nhà sản xuất:

 Phải tiến hành thẩm định (toàn bộ hoặc một số thông số thẩm định theo yêu cầu) đối với các quy trình phân tích được áp dụng trong các phép thử định tính, thử giới hạn tạp chất, định lượng (bao gồm định lượng tạp chất, dược chất và các thành phần được lựa chọn khác) nhằm chứng minh sự phù hợp của việc áp dụng các quy trình phân tích

đó để đánh giá chất lượng của thuốc xin đăng ký

 Đối với mỗi quy trình phân tích, trong trường hợp không thẩm định thông số nào, nhà sản xuất phải thuyết minh sự phù hợp của việc bỏ thẩm định thông số đó trong báo cáo thẩm định quy trình phân tích

 Tiến hành thẩm định và nộp báo cáo số liệu thẩm định quy trình phân tích theo Hướng dẫn thẩm định quy trình phân tích như sau:

 Đối với quy trình chưa có trong các Dược điển hoặc có trong dược điển không thuộc nhóm tham chiếu: Thẩm định qui trình phân tích đầy đủ theo hướng dẫn của

ASEAN

 Đối với quy trình đã có trong các Dược điển tham chiếu (ví dụ như quy trình

phân tích một thành phần hoạt chất, thử tạp chất trong chế phẩm đa thành phần):

áp dụng như đối với quy trình đăng ký theo Dược điển tham chiếu

Mục đích của qui trình phân tích phải được hiểu rõ ràng vì sẽ quyết định những chỉ tiêu cần được đánh giá

 Độ đúng (accuracy)

 Độ chính xác, độ chụm (precision)

 Độ lặp lại (repeatability)

 Độ chính xác trung gian, độ chụm trung gian (intermediate precision)

 Độ tái lặp (reproducibility) hay độ ổn định (ruggedness)

 Tính đặc hiệu (specificity) hay tính chọn lọc (selectivity)

 Giới hạn phát hiện (limit of detection, LOD)

 Giới hạn định lượng (limit of quantitation, LOQ)

 Tính tuyến tính, độ tuyến tính (linearity)

 Miền giá trị, khoảng xác định (range)

 Độ bền, độ thô (robustness)

 Tính thích hợp (phù hợp, tương thích) của hệ thống (system suitability): HPLC, GC,

CE, IR

Đại học Y Dược TPHCM Nguyễn Đức Tuấn

Các Chỉ Tiêu Điển Hình Trong Thẩm Định Cần Được Xem Xét

Theo ICH (International Conference on Harmonization, 2005)

Loại qui trình phân tích

+: chỉ tiêu cần phải đánh giá;  : chỉ tiêu không cần phải đánh giá

1: Chỉ tiêu chỉ cần được đánh giá trong một số trường hợp; 2: một QTPT kém đặc hiệu có thể được bỗ trợ bằng một hay nhiều

Các Chỉ Tiêu Quan Trọng Nhất Cho Việc Thẩm Định Các Loại QTPT Khác Nhau

Theo ASEAN (2008)

Đại học Y Dược TPHCM Nguyễn Đức Tuấn

Các Chỉ Tiêu Quan Trọng Nhất Cho Việc Thẩm Định Các Loại QTPT Khác Nhau

Loại qui trình phân tích

+: chỉ tiêu cần phải đánh giá;  : chỉ tiêu không cần phải đánh giá

1: trong trường hợp đã tiến hành kiểm tra độ tái lặp thì không cần phải xem xét độ chính xác trung gian; 2: một QTPT kém đặc hiệu có thể được bỗ trợ bằng một hay nhiều QTPT hỗ trợ khác; 3: Chỉ tiêu chỉ cần được đánh giá trong một số trường hợp

Theo Sổ tay hướng dẫn đăng ký thuốc (2013)

Phụ lục 8: Danh mục các qui trình thẩm định

 Phương pháp hóa học

Thẩm định qui trình định lượng bằng chuẩn độ thể tích (CĐ)

 Phương pháp dụng cụ, hóa lý

 Phương pháp đo quang phổ

 Thẩm định qui trình phân tích bằng đo quang phổ IR

 Thẩm định qui trình phân tích bằng đo quang phổ UV/Vis

 Thẩm định qui trình phân tích bằng đo quang phổ AAS

Thẩm định qui trình định lượng một số chế phẩm thuốc enzym

Các Chỉ Tiêu Cần Được Thẩm Định Đối Với Qui Trình Phân Tích

Theo Sổ tay hướng dẫn đăng ký thuốc (2013)

Đại học Y Dược TPHCM Nguyễn Đức Tuấn

Thẩm định qui trình định lượng bằng chuẩn độ thể tích (CĐ)

QTĐL có trong dược điển QTĐL của nhà sản xuất

Theo Sổ tay hướng dẫn đăng ký thuốc (2013)

Thẩm định qui trình phân tích bằng đo quang phổ IR

Qui trình phân tích theo dược điển Qui trình phân tích của nhà sản xuất

Theo Sổ tay hướng dẫn đăng ký thuốc (2013)

Đại học Y Dược TPHCM Nguyễn Đức Tuấn

Thẩm định qui trình phân tích bằng đo quang phổ UV-Vis

Định tính Định lượng, thử tạp

theo dược điển

Định lượng, thử tạp của nhà sản xuất

Tính đặc hiệu Tính đặc hiệu

Theo Sổ tay hướng dẫn đăng ký thuốc (2013)

Thẩm định qui trình phân tích bằng đo quang phổ AAS

QTĐL theo dược điển QTĐL của nhà sản xuất

- Giới hạn phát hiện (LOD)

- Giới hạn định lượng (LOQ)

Các Chỉ Tiêu Cần Được Thẩm Định Đối Với Qui Trình Phân Tích

Theo Sổ tay hướng dẫn đăng ký thuốc (2013)

Đại học Y Dược TPHCM Nguyễn Đức Tuấn

Thẩm định qui trình phân tích bằng SKLM

QTPT có trong dược điển Qui trình phân tích mới

Theo Sổ tay hướng dẫn đăng ký thuốc (2013)

 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng

Các Chỉ Tiêu Cần Được Thẩm Định Đối Với Qui Trình Phân Tích

Theo Sổ tay hướng dẫn đăng ký thuốc (2013)

Đại học Y Dược TPHCM Nguyễn Đức Tuấn

Theo Sổ tay hướng dẫn đăng ký thuốc (2013)

Thẩm định qui trình định lượng kháng sinh bằng vi sinh vật

 Tính đặc hiệu

 Tính tuyến tính – khoảng xác định

 Độ đúng

 Độ chính xác (độ lặp lại trung gian)

Các Chỉ Tiêu Cần Được Thẩm Định Đối Với Qui Trình Phân Tích

Theo Sổ tay hướng dẫn đăng ký thuốc (2013)

Đại học Y Dược TPHCM Nguyễn Đức Tuấn

Thẩm định qui trình phân tích định tính và định lượng

một số chế phẩm bằng enzym

Loại phương

pháp

Định tính

Định lượng

Độ đặc hiệu

Độ đặc hiệu

Độ tuyến tính

Khoảng xác định

Độ đúng

Độ chính xác

Độ lặp lại

Độ chính xác trung gian Phương pháp

-Phương pháp

Các Chỉ Tiêu Cần Được Thẩm Định Đối Với Qui Trình Phân Tích

Lưu ý

 Các chỉ tiêu được liệt kê trong các bảng trên là điển hình đối với các loại QTPT đã nêu Tuy nhiên, các trường hợp ngoại lệ phải được giải quyết theo từng trường hợp cụ thể

 Chỉ tiêu độ thô không được liệt kê trong các bảng trên nhưng cần được xem xét đến ở các giai đoạn thích hợp trong quá trình phát triển QTPT

Các Chỉ Tiêu Quan Trọng Nhất Cho Việc Thẩm Định Các Loại QTPT Khác Nhau

 Việc thẩm định lại QTPT có thể cần thiết trong các trường hợp:

 Thay đổi trong khâu tổng hợp dược chất

 Thay đổi thành phần của thành phẩm

 Thay đổi qui trình phân tích

 Mức độ thẩm định lại được yêu cầu tùy thuộc vào bản chất của

sự thay đổi

 Một số thay đổi khác cũng có thể yêu cầu phải thẩm định lại

Đại học Y Dược TPHCM Nguyễn Đức Tuấn

Thẩm Định Lại Qui Trình Phân Tích

Tính thích hợp của hệ thống

 Là phần không thể tách rời trong nhiều qui trình phân tích (HPLC,

GC, CE, IR)

 Đánh giá tính thích hợp của hệ thống là những phép thử nhằm đánh giá tính thích hợp của toàn hệ thống phân tích được cấu thành bởi các yếu tố như máy móc thiết bị, hệ thống điện, cách tiến hành phân tích và mẫu thử

 Các thông số của phép thử tính tương thích của hệ thống được thiết lập cho từng qui trình riêng biệt phụ thuộc vào loại qui trình được thẩm định Các thông số này đặc biệt quan trọng trong các phương pháp sắc ký

 Các bộ phận cấu thành của hệ thống sắc ký phải có khả năng đáp ứng về độchính xác khi tiến hành phép thử tính phù hợp của hệ thống

Đại học Y Dược TPHCM Nguyễn Đức Tuấn

i i

n

i

X SD RSD

Kết quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống trên mẫu đối chiếu (n = 6)

Salicylamid

TB 5,946 16471990 1,4 4,8 7299

SD 0,014 84524 0,0 0,0 70 RSD 0,23& 0,51% 1,04% 0,54% 0,96%

Đại học Y Dược TPHCM

Thẩm Định Qui Trình Phân Tích bằng HPLC – PDA (theo Sổ tay hướng dẫn đăng ký thuốc 2013) – Độ chính xác

Nguyễn Đức Tuấn

Kết quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống trên mẫu thử (n = 6)

Paracetamol

TB 3,676 4558100 1,3 2,0 5790

SD 0,002 7118 0,0 0,0 111 RSD 0,06% 0,16% 0,30% 0,93% 1,91%

Salicylamid

TB 5,940 16380736 1,4 4,8 7409

SD 0,005 26508 0,0 0,0 98 RSD 0,09% 0,16% 0,96% 0,84% 1,32%

Thẩm Định Qui Trình Phân Tích bằng HPLC – PDA (theo Sổ tay hướng dẫn đăng ký thuốc 2013) – Độ chính xác

 Một QTPT kém đặc hiệu có thể được bổ trợ bằng một hoặc nhiều QTPT khác

 Việc xác định tính đặc hiệu cần được tiến hành trong khi thẩm định các phépthử định tính, xác định tạp chất và định lượng

 Qui trình dùng để xác định tính đặc hiệu phụ thuộc vào mục tiêu đã định củaQTPT

 Tùy đối tượng trong qui trình phân tích mà thực hiện thử nghiệm

 Không phải lúc nào cũng xác định được một QTPT đặc hiệu cho một chấtphân tích nhất định (phân biệt hoàn toàn) Trường hợp này cần phải kết hợp haihay nhiều QTPT để đạt được mức độ đặc hiệu cần thiết

Đại học Y Dược TPHCM Nguyễn Đức Tuấn

Tính Đặc Hiệu/Tính Chọn Lọc – Qui Trình Định Lượng

 Đảm bảo kết quả chính xác về hàm lượng hoặc hoạt lực của chất phân tích trong mẫu thử, tránh ảnh hưởng của các thánh phần khác có trong mẫu

 Đối với phép định lượng không hoặc kém đặc hiệu với hoạt chất cần phân tích (ví dụ như định lượng nguyên liệu khi xuất xưởng bằng phương pháp chuẩn độ thể tích) cần có phương pháp phân tích hỗ trợ khác (để chứng minh tính đặc hiệu) ví dụ như kết hợp phép định lượng nguyên liệu với phép thử tạp chất thích hợp

 Đối với qui trình sắc ký

 Cần đưa ra các sắc ký đồ đại diện để chứng minh tính đặc hiệu trong đó từng thành phần riêng biệt phải được ghi lại (chú thích) rõ ràng

 Độ tinh khiết của pic cần được xác định bằng đầu dò PDA hay khối phổ

 Tính đặc hiệu có thể được chứng minh bằng độ phân giải của hai thành phần được rửa giải gần nhau nhất

 Phải đệ trình các sắc ký đồ của mẫu trắng, mẫu chuẩn, mẫu thử

 Các thông số đánh giá tính phù hợp của hệ thống sắc ký như: số đĩa lý thuyết, độ phân giải, hệ số đối xứng của pic v.v.

Đầu dò PDA: sử dụng chức năng kiểm tra độ tinh khiết của pic để chứng minhpic sắc ký không phải là pic của hai thành phần trở lên

Xác định các pic tinh khiết và không tinh khiết trên sắc ký đồ HPLC

Đại học Y Dược TPHCM

Tính Đặc Hiệu/Tính Chọn Lọc

Nguyễn Đức Tuấn

Tính tuyến tính – Miền giá trị (Khoảng xác định) - LOD – LOQ

Tính Tuyến Tính

 Diễn tả kết quả phân tích thu được tỷ lệ với nồng độ (trong khoảng nhất định) của chất phân tích trong mẫu thử

 Cần đánh giá mối tương quan tuyến tính trong khoảng xác định của QTPT

 Tuyến tính có thể thực hiện trực tiếp trên mẫu chuẩn (bằng cách pha loãng dung dịch chuẩn gốc) và/hoặc cân riêng biệt các hỗn hợp tự tạo chứa các thành phần dược chất dựa trên qui trình đã đặt ra

 Một số QTPT như định lượng miễn dịch không thể hiện tính tuyến tính sau bất kỳ phép biến đổi toán học nào Trường hợp này, cần có một hàm thích hợp để biểu thị mối liên quan giữa đáp ứng thu được (Y) với nồng độ (lượng) chất phân tích trong mẫu (x)

 Để xác định tính tuyến tính cần tiến hành ít nhất 5 nồng độ Trong những trường hợp khác, cần nêu rõ lý do

 Biểu thị bằng hệ số tương quan (coefficient of correlation) r

 Kết quả thử phải được đánh giá bằng phương pháp thống kê thích hợp , ví dụ bằng cách tính đường hồi qui dựa vào phương pháp bình phương cực tiểu theo phương trình Y= ax + b

Đại học Y Dược TPHCM Nguyễn Đức Tuấn

 Sử dụng trắc nghiệm t để kiểm tra ý nghĩa của các hệ số trong phương trình hồi qui

 Sử dụng trắc nghiệm F để kiểm tra tính thích hợp của phương trình hồi qui

Trắc nghiệm t (phân phối Student)

Giả thuyết: H0: Bj = 0 “Hệ số Bj không có ý nghĩa thống kê”

S S

i b

Tính Tuyến Tính

Trắc nghiệm F (phân phối Fischer)

Giả thuyết:

H0: Bj = 0 “Phương trình hồi qui không tương thích”

HA: Bj  0 “Phương trình hồi qui tương thích”

 r = 0,9988; a = 0,6914; b = 0,0074

 Phương trình hồi qui: Y = 0,6914X+ 0,0074

Miền Giá Trị (Khoảng Xác Định)

 Khoảng cách giữa nồng độ trên và dưới của chất phân tích trong mẫu thử (bao gồm

cả các nồng độ này) Trong khoảng nồng độ này, QTPT đã được chứng minh đáp ứng

độ chính xác, độ đúng và tính tuyến tính

 Khoảng xác định thường được lấy từ những nghiên cứu tính tuyến tính và phụ thuộc vào việc ứng dụng dự định của qui trình để định lượng mẫu thử chứa chất phân tích với hàm lượng nằm trong khoảng ở 2 cực (cực đại và cực tiểu) của khoảng xác định của QTPT

 Ví dụ: Trong phần kết luận của phương pháp đo quang “Khoảng nồng độ tuyến tính hay khoảng nồng độ tuân theo định luật Lambert-Beer là 4 mcg/ml – 12 mcg/ml” được xác định bằng cách

 Khảo sát và đánh giá tính tuyến tính

 Khẳng định khoảng này có đáp ứng độ tuyến tính, độ đúng, độ lặp lại hay không

 Còn phụ thuộc vào mục đích của qui trình

Đại học Y Dược TPHCM Nguyễn Đức Tuấn