Tóm tắt luận án: Xây dựng quy trình công nghệ chiết tách, xác định thành phần hóa học của rễ cây mật nhân (eurycoma longifolia Jack) ở khu vực miền Trung Tây Nguyên và ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm.

Xây dựng quy trình công nghệ chiết tách, xác định thành phần hóa học của rễ cây mật nhân (eurycoma longifolia Jack) ở khu vực miền Trung Tây Nguyên và ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm.Xây dựng quy trình công nghệ chiết tách, xác định thành phần hóa học của rễ cây mật nhân (eurycoma longifolia Jack) ở khu vực miền Trung Tây Nguyên và ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm.Xây dựng quy trình công nghệ chiết tách, xác định thành phần hóa học của rễ cây mật nhân (eurycoma longifolia Jack) ở khu vực miền Trung Tây Nguyên và ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm.Xây dựng quy trình công nghệ chiết tách, xác định thành phần hóa học của rễ cây mật nhân (eurycoma longifolia Jack) ở khu vực miền Trung Tây Nguyên và ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm.Xây dựng quy trình công nghệ chiết tách, xác định thành phần hóa học của rễ cây mật nhân (eurycoma longifolia Jack) ở khu vực miền Trung Tây Nguyên và ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm.Xây dựng quy trình công nghệ chiết tách, xác định thành phần hóa học của rễ cây mật nhân (eurycoma longifolia Jack) ở khu vực miền Trung Tây Nguyên và ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm.

(EURYCOMA LONGIFOLIA JACK) Ở MIẾN

TRUNG – TÂY NGUYÊN VÀ ỨNG DỤNG TRONG

Công trình được hoàn thành tại TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

Người hướng dẫn khoa học:

PGS.TS Trương Thị Minh Hạnh PGS.TS Giang Thị Kim Liên

Phản biện 1:

Phản biện 2:

Luận án sẽ được bảo vệ tại hội đồng chấm luận văn tiến sĩ họp tạiĐại học Bách khoa vào ngày … … tháng … … năm … …

Có thể tìm hiểu luận văn tại:

 Trung tâm Học liệu và Truyền thông, Đại học Đà Nẵng tại Trường Đại học Bách khoa

 Thư viện Khoa Hóa, Trường Đại học Bách khoa - ĐHĐN

ở miền Trung - Tây Nguyên, ứng dụng trong công nghiệp thực phẩmnhằm đa dạng hóa sản phẩm thực phẩm, nâng cao giá trị kinh tế vàkhuyến khích bảo tồn nguồn nguyên liệu thiên nhiên này.

2 Mục tiêu nghiên cứu

Tìm kiếm, phát hiện và xác định những hợp chất có hoạt tínhsinh học đáng quý trong rễ cây mật nhân ở miền Trung – TâyNguyên Từ đó, ứng dụng bổ sung vào quy trình sản xuất thực phẩmbảo vệ sức khỏe

3 Đối tượng, phạm vi và nội dung nghiên cứu

Rễ cây mật nhân được thu nhận ở Gia Lai và Quảng Nam đểkhảo sát, chiết, phân lập, định danh, xác định thành phần, ứng dụngsản xuất thực phẩm ở quy mô phòng thí nghiệm

4 Phương pháp nghiên cứu

4.1 Phương pháp nghiên cứu lý thuyết

Tổng hợp các tài liệu, tư liệu, sách báo, các công trình nghiêncứu trong nước và quốc tế về rễ mật nhân ở trong nước và thế giới

4.2 Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

4.2.1 Phương pháp phân lập

Sử dụng phương pháp sắc ký cột kết hợp sắc ký lớp mỏng vớicác hệ dung môi thích hợp

4.2.1.1 Phương pháp định danh, xác định cấu trúc hóa học của các chất

Sử dụng phương pháp phổ hồng ngoại, phổ khối, phổ cộnghưởng từ hạt nhân

4.2.1.2 Phương pháp tối ưu hóa một số yếu tố ảnh hưởng bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm trực giao cấp 1, 2 mức với k yếu tố ảnh hưởng

Sử dụng phương pháp quy hoạch thực nghiệm trực giao cấp 1,

2 mức với k yếu tố ảnh hưởng (TYT 2k)

4.2.2 Phương pháp xác định hoạt tính sinh học của các dịch chiết

Xác định hoạt tính gây độc tế bào ung thư, hoạt tính khángviêm, hoạt tính ức chế sản sinh NO, hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase, hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định, hoạt tính chốngoxy hóa Thử độc tính, thử khả năng gây độc đối với tế bào người

4.2.3 Phương pháp sản xuất sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe

Xây dựng quy trình công nghệ tạo ra sản phẩm đáp ứng quyđịnh hiện hành của Nhà nước đối với thực phẩm bảo vệ sức khỏe

4.2.4 Phương pháp đánh giá mức độ an toàn thực phẩm

Xác định hàm lượng kim loại nặng, vi sinh vật gây bệnh

4.2.5 Phương pháp phân tích và đánh giá cảm quan sản phẩm thực phẩm

Sử dụng phương pháp cho điểm thị hiếu để đánh giá mức độ chấp nhận của người tiêu dùng đối với sản phẩm

4.2.6 Phương pháp xử lý số liệu

Sử dụng các phần mềm xử lý số liệu: TableCurve 2Dv4, Matlab R2016a, Anova, Excel

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

6 Bố cục của luận án

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ CÂY MẬT NHÂN

1.1.1 Đặc điểm sinh thái, phân bố

Mật nhân (danh pháp khoa học: Eurycoma longifolia) là loại cây có hoa thuộc họ Simaroubaceae Cây mật nhân mọc nhiều nơi ở

nước ta, nhưng phổ biến nhất là ở miền Trung và một số vùng TâyNguyên như: Quảng Nam, Thừa Thiên Huế, Gia Lai, trong đó, ởvùng núi tỉnh Gia Lai như huyện Kbang, huyện Ia-Grai, cây mậtnhân mọc tự nhiên rất nhiều và được khai thác với số lượng lớn.

1.1.2 Thành phần hóa học của cây mật nhân

1.1.3 Tác dụng dược lý của cây mật nhân và ứng dụng trong dân gian

1.2 TỔNG QUAN VỀ CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1.2.1 Tổng quan về phương pháp chiết

1.2.2 Tổng quan về phương pháp phân lập

1.2.3 Tổng quan về phương pháp xác định cấu trúc hóa học 1.2.4 Tổng quan về phương pháp thăm dò hoạt tính sinh học 1.2.5 Tổng quan về quy trình sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe

1.3 TỔNG QUAN VỀ TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU MẬT

NHÂN TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC

1.3.1 Nghiên cứu thành phần hóa học

1.3.2 Nghiên cứu về hoạt tính sinh học

1.3.3 Nghiên cứu về phương pháp chiết

1.3.4 Nghiên cứu về ứng dụng mật nhân trong thực phẩm 1.4 ĐÁNH GIÁ TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU CÂY MẬT NHÂN

Tại Việt Nam, các nghiên cứu về mật nhân chưa mang tính hệthống và tính định hướng từ khảo sát nguyên liệu, chiết tách, thăm dòhoạt tính sinh học và ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm, đặcbiệt đối với mật nhân tại khu vực miền Trung và Tây Nguyên Bêncạnh đó, hiện chưa nhiều các sản phẩm ứng dụng mật nhân mang tính

thị

hiếu vừa có tác dụng hỗ trợ sức khỏe, vừa có chức năng giải khát.

Chương 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3 SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU TỔNG QUÁT

Hình 2.2 Sơ đồ tổng quát nội dung nghiên cứu

2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM

2.4.1 Khảo sát, lựa chọn nguyên liệu

2.4.2 Phương pháp phân lập, xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất từ rễ cây mật nhân

2.4.2.1 Phân lập các hợp chất hóa học

2.4.2.2 Xác định cấu trúc hóa học của các chất phân lập được

2.4.3 Phương pháp xây dựng quy trình chiết rễ mật nhân

2.4.3.1 Chiết rễ mật nhân trong dung môi nước

2.4.3.2 Chiết rễ cây mật nhân trong dung môi ethanol 80 %

2.4.4 Khảo sát hoạt tính sinh học của dịch chiết rễ cây mật nhân

- Xác định khả năng gây độc tế bào ung thư

- Xác định hoạt tính kháng viêm

- Xác định khả năng ức chế đại thực bào sản sinh NO

- Xác định hoạt tính ức chế enzyme α- glucosidase

- Xác định hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định

- Xác định hoạt tính chống oxy hóa

- Thử độc tính

- Thử khả năng không gây độc đối với tế bào người

2.4.5 Nghiên cứu ứng dụng mật nhân trong sản xuất một

số sản phẩm thực phẩm

2.4.5.1 Cơ sở bổ sung mật nhân vào sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe

2.4.5.2 Nghiên cứu sản xuất cao chiết mật nhân

2.4.5.3 Nghiên cứu sản xuất bột mật nhân

2.4.5.4 Nghiên cứu sản xuất trà thảo mộc mật nhân và nước rau má mật nhân

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 ĐỊNH DANH MẪU THỰC VẬT VÀ LỰA CHỌN

NGUYÊN LIỆU NGHIÊN CỨU

3.1.1 Kết quả định danh mẫu thực vật

Kết quả chi tiết được trình bày tại phụ lục 4

3.1.2 Đánh giá, lựa chọn vùng nguyên liệu nghiên cứu

3.1.2.1 Khảo sát một số thành phần hóa học trong nguyên liệu

Kết quả phân tích một số thành phần hóa học trong nguyên liệu được thể hiện ở bảng 3.1

Bảng 3.1 Một số thành phần hóa học trong rễ mật nhân tại

Gia Lai và Quảng Nam

3.1.2.2 Khảo sát khả năng gây độc tế bào ung thư

Kết quả được thể hiện ở bảng 3.2 và bảng 3.3

Bảng 3.2 Khả năng gây độc tế bào ung thư của dịch chiết ethanol 80 % rễ cây mật nhân tại huyện Ia Grai, tỉnh Gia Lai

% ức chế tế bào Nồng độ

Từ kết quả bảng 3.2 và bảng 3.3 cho thấy, dịch chiết ethanol

80 % của rễ cây mật nhân ở cả hai vùng nguyên liệu đều có khả nănggây độc tế bào ung thư với các dòng đã khảo sát, tuy nhiên, kết quảtại huyện Ia Grai, tỉnh Gia Lai có tốt hơn tại huyện Phước Sơn, tỉnhQuảng Nam

3.1.2.3 Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa bằng phương pháp DPPH

Kết quả được thể hiện ở bảng 3.4

Bảng 3.4 Giá trị IC 50 của dịch chiết rễ mật nhân

và vitamin C

Dịch chiết rễ mật nhân Quảng Nam 907,4082

Dịch chiết rễ mật nhân Gia Lai 859,3081

Từ kết quả bảng 3.4 cho thấy, khả năng kháng oxy hóa củadịch chiết rễ cây mật nhân Gia Lai tốt hơn Quảng Nam Ngoài ra,cây mật nhân mọc tự nhiên ở vùng đồi núi tỉnh Gia Lai nhiều vàđược khai thác quanh năm, do đó, chúng tôi lựa chọn rễ cây mậtnhân tại vùng này cho những nghiên cứu tiếp theo

3.2 KẾT QUẢ PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HÓA HỌC

Cấu trúc hóa học được xác định bằng các phương pháp phântích phổ hiện đại kết hợp với tài liệu tham khảo là các kết quả nghiêncứu đã được công bố

Kết quả: Đã chiết tách, phân lập và cấu trúc hóa học của cáchợp chất với thông tin chung được trình bày tại bảng 3.11

Bảng 3.11 Bảng tổng hợp kết quả phân lập và xác định cấu trúc

hóa học các chất từ rễ cây mật nhân

TT Tên hợp chất Đặc điểm, hoạt tính sinh học

9,10-

dimethoxycanthin-6-one

Hợp chất có hoạt tính kháng độc tế bàokhá mạnh đối với dòng tế bàoFibrosarcoma HT-1080 ở người vớinồng độ tác dụng IC50 = 5,0 μMM

3 Chất 3: Infractine Hợp chất lần đầu tiên từ rễ cây mật

nhân ở miền Trung – Tây Nguyên đượcphân lập và công bố

II Hợp chất không thuộc nhóm alkaloid, bao gồm:

5 Chất 5: Eurylene Hợp chất có hoạt tính chống lại dòng tế

bào ung thư máu P388 với IC50 95 µM

Eurycomanone

Hợp chất này cùng với eurycomanol,được biết đến là một trong hai hoạt chấtchính làm tăng cường và thúc đẩyhoóc-môn sinh dục nam testosterone

7 Chất 7:

14,15β-hydroxy klaineanol

Hợp chất này có hoạt tính kháng kýsinh trùng sốt r t

Dịch chiết ethanol

Cô quay chân không (50 oC; Bx = 50 %)

Ethanol 80 %Chưng ninh hồi lưu (83,2 oC; 202,2 phút, tỷ lệ dung môi/nguyên liệu: 20/1)

Bã

Cô quay chân không (50 oC; Bx = 50 %)

Lọc chân khôngBột rễ mật nhân

Bã

Chưng ninh hồi lưu (100 oC; 199,2 phút, tỷ lệ dung môi/nguyên liệu:Nước

3.3 XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHIẾT RỄ CÂY MẬT NHÂN

3.3.1 Xây dựng quy trình chiết rễ cây mật nhân bằng

phương pháp chưng ninh hồi lưu trong dung môi ethanol 80 %

Quy trình chiết mật nhân trong ethanol 80 % được trình bày theo

sơ đồ hình 3.8

Hình 3.8 Sơ đồ quy trình chiết mật nhân trong ethanol

3.3.2 Xây dựng quy trình chiết rễ cây mật nhân bằng

phương pháp chưng ninh hồi lưu trong nước

Quy trình chiết mật nhân trong nước được trình bày theo sơ đồ

hình 3.9

Bột rễ mật nhân

Dịch chiết nướcLọc chân không

Hình 3.9 Sơ đồ quy trình chiết mật nhân trong nước

Kết quả: Đã xây dựng được hai quy trình chiết rễ cây mật nhânbằng phương pháp chưng ninh hồi lưu trong nước ở 100 oC; 199,2phút, tỷ lệ dung môi/nguyên liệu: 22,4/1 và trong ethanol 80 % ở83,2 oC; 202,2 phút, tỷ lệ dung môi/nguyên liệu: 20/1

3.4 NGHIÊN CỨU, KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA DỊCH CHIẾT RỄ CÂY MẬT NHÂN

3.4.1 Kết quả thử khả năng gây độc tế bào ung thư của dịch chiết nước và dịch chiết ethanol 80 % từ rễ cây mật nhân

Kết quả về khả năng gây độc tế bào ung thư in vitro của dịch

chiết ethanol 80 % rễ cây mật nhân được thể hiện ở bảng 3.12

Bảng 3.12 Khả năng gây độc tế bào ung thư của dịch chiết

ethanol 80 % rễ cây mật nhân

% ức chế tế bào Nồng độ

Kết quả về khả năng gây độc tế bào ung thư in vitro của dịch

chiết nước rễ cây mật nhân được thể hiện ở bảng 3.13

Bảng 3.13 Khả năng gây độc tế bào ung thư của dịch chiết

nước rễ cây mật nhân

% ức chế tế bào Nồng độ

3.4.2 Kết quả thử khả năng kháng viêm thông qua khảo sát cytokine tiền viêm và cytokine gây viêm

Kết quả khả năng ức chế cytokine tiền viêm TNF-anpha đượctrình bày trên hình 3.10

Hình 3.10 Khả năng ức chế sản sinh TNF-anpha ở dịch chiết nước

nồng độ khác nhau

Kết quả khả năng ức chế IL-6 được trình bày trên hình 3.11

Hình 3.11 Khả năng ức chế sản sinh IL-6 ở dịch chiết

nước nồng độ khác nhau

Kết quả khả năng ức chế IL-8 được trình bày trên hình 3.12

Hình 3.12 Khả năng ức chế sản sinh IL-8 ở dịch chiết nước nồng

độ khác nhau

Từ kết quả ở hình 3.10, 3.11, 3.12 cho thấy, dịch chiết nước rễmật nhân không thể hiện khả năng ức chế cytokine tiền viêm TNF-anpha; tuy nhiên, dịch chiết nước có khả năng ức chế sản sinh IL–6 ởmột số nồng độ là 50 và 100 g/mL (19,23 % và 24,04 %, một cáchtương ứng) và khả năng ức chế sản sinh IL-8 ở một số nồng độ (5;10; 20; 50; 100 g/mL), tốt nhất ở nồng độ 50 µg/mL (đạt 57,55 %)

3.4.3 Kết quả thử khả năng ức chế sản sinh NO

Kết quả được thể hiện ở bảng 3.14

Bảng 3.14 Khả năng ức chế sản sinh NO của dịch chiết nước ở

ức chế sinh

NO (%)

Tỷ lệ tế bào sống (%)

ức chế sinh NO (%)

Tỷ lệ tế bào sống (%)

3.4.4 Khả năng ức chế enzyme -glucosidase

Kết quả: Dịch chiết nước không có khả năng kháng bệnh đáitháo đường Tuýp 2 vì không thể ức chế enzyme -glucosidase nhằmlàm giảm tác động của carbohydrate đối với lượng đường trong máu

3.4.5 Kết quả thử khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của dịch chiết nước

Kết quả: Dịch chiết nước của rễ mật nhân không thể hiện khảnăng kháng vi sinh vật

3.4.6 Kết quả thử khả năng kháng oxy hóa của dịch chiết nước

3.18

Phân tích kết quả và xử lý số liệu được thể hiện ở bảng 3.17 và

Bảng 3.17 Kết quả đo ABS đối với dịch chiết rễ cây mật nhân

và acid ascorbic Dịch chiết rễ cây mật nhân Acid ascorbic

3.4.7 Kết quả thử độc tính bất thường của dịch chiết rễ cây mật nhân

Sau 48 giờ quan sát 05 chuột (mỗi chuột uống 0,5 mL chế phẩm), không có chuột nào chết

3.4.8 Kết quả thử khả năng không gây độc đối với tế bào thận gốc phôi ở người HEK-293

Kết quả thí nghiệm được trình bày ở bảng 3.20

Bảng 3.20 Khả năng gây độc tế bào HEK-293 của dịch chiết rễ

mật nhân

% ức chế và nồng độ mẫu Nồng độ

Nồng độ (µg/mL) Ellipticine

Do đó, có thể bổ sung mật nhân vào sản xuất thực phẩm

Kết luận: Dịch chiết ethanol 80 % có thể hiện hoạt tính gâyđộc tế bào ung thư trên các dòng: KB, Hep-G2, LU-1, MCF7 ở cácnồng độ thử nghiệm Dịch chiết nước không thể hiện khả năng gâyđộc tế bào ung thư trên các dòng: MKN7, SW626, HL-60, SK-Mel-

2, NIH/3T3, tuy nhiên, dịch chiết nước lại thể hiện một số hoạt tínhkháng viên như: khả năng ức chế tế bào đại thực bào sinh NO và khảnăng ức chế sản sinh IL-8 Ngoài ra, dịch chiết rễ cây mật nhânkhông gây độc cho tế bào thận ở người và gây độc tính bất thường

3.5 NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG SẢN XUẤT MỘT SỐ SẢN PHẨM THỰC PHẨM BẢO VỆ SỨC KHỎE

3.5.1 Sản phẩm cao chiết mật nhân

3.5.1.1 Kết quả kiểm tra chất lượng sản phẩm cao chiết

Các chỉ tiêu chất lượng của cao mật nhân đạt yêu cầu theo quy định của dược điển Việt Nam tập V

Bảng 3.21 Kết quả chỉ tiêu chất lượng cao chiết mật nhân

Bảng 3.22 Kết quả định tính một số hợp chất thiên nhiên trong

cao chiết mật nhân

chất Thuốc thử Hiện tượng

Kết quả

Kết luận

3 Steroid

Phản ứng Salkowski

Dung dịch chuyển sangmàu đỏ đậm

+CóPhản ứng

Bourchard

Lieberman-Dung dịch chuyển sangmàu cam

+

Từ kết quả từ bảng 3.22 nhận thấy, sự hiện diện của các hợp chất alkaloid, polyphenol, steroid trong cao mật nhân Đây đều là

những chất đã được chứng minh là có nhiều hoạt tính sinh học.

3.5.1.2 Kết quả kiểm tra an toàn vệ sinh thực phẩm của sản phẩm cao mật nhân

Mẫu cao chiết mật nhân đảm bảo an toàn thực phẩm theo

QĐ 46:2007/BYT về giới hạn kim loại và vi sinh trong thực phẩm

3.5.1.3 Công bố chất lượng sản phẩm cao mật nhân

Xây dựng bản công bố chất lượng sản phẩm

3.5.2 Sản phẩm trà thảo mộc mật nhân

Nụ vối có vị đắng thanh dịu nên có thể làm hài hòa vị đắnggắt của mật nhân Ngoài ra, bổ sung các nguyên liệu có hậu vị ngọtnhư cỏ ngọt, cam thảo, la hán quả, những thảo dược này đã đượcchứng minh có rất nhiều tác dụng dược lý tốt cho sức khỏe nhưchống tiểu đường, béo phì, cao huyết áp, giải nhiệt

Cao chiết mật nhân: Sử dụng sản phẩm cao chiết được sảnxuất và kiểm tra chất lượng theo mục 3.5.1 ở trên để bổ sung vào quytrình sản xuất

3.5.2.1 Quy trình công nghệ sản xuất trà thảo mộc mật nhân

Sau quá trình thử nghiệm và đánh giá sản phẩm, đã đưa rađược công thức sản xuất 1 lít sản phẩm trà thảo mộc mật nhân nhưsau: Nụ vối khô: 30 g; Quả la hán khô: 6 g; Cỏ ngọt khô: 8,5 g; Camthảo: 1 g; Nước: 1400 mL; Cao mật nhân: 1000 mg

3.5.2.2 Kết quả đánh giá cảm quan sản phẩm

Kết quả: Điểm mức độ yêu thích: 6,6 ± 0,9 điểm, nằm trongkhoảng 6 - 7 điểm, khoảng từ tương đối thích đến thích

3.5.2.3 Kết quả kiểm tra chất lượng sản phẩm

Kết quả thử nghiệm các chỉ tiêu an toàn thực phẩm đều thấphơn giới hạn tối đa cho ph p Bên cạnh đó, hàm lượng EL4: 0,38 mg/

L, hàm lượng này gần như không bị biến đổi

3.5.2.4 Công bố chất lượng sản phẩm cao mật nhân

nhân

Xây dựng bản công bố chất lượng sản phẩm

3.5.3 Nghiên cứu sản xuất sản phẩm nước rau má mật