Xây dựng quy trình công nghệ chiết tách, xác định thành phần hóa học của rễ cây mật nhân (eurycoma longifolia Jack) ở khu vực miền Trung Tây Nguyên và ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm.

Xây dựng quy trình công nghệ chiết tách, xác định thành phần hóa học của rễ cây mật nhân (eurycoma longifolia Jack) ở khu vực miền Trung Tây Nguyên và ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm.Xây dựng quy trình công nghệ chiết tách, xác định thành phần hóa học của rễ cây mật nhân (eurycoma longifolia Jack) ở khu vực miền Trung Tây Nguyên và ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm.Xây dựng quy trình công nghệ chiết tách, xác định thành phần hóa học của rễ cây mật nhân (eurycoma longifolia Jack) ở khu vực miền Trung Tây Nguyên và ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm.Xây dựng quy trình công nghệ chiết tách, xác định thành phần hóa học của rễ cây mật nhân (eurycoma longifolia Jack) ở khu vực miền Trung Tây Nguyên và ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm.Xây dựng quy trình công nghệ chiết tách, xác định thành phần hóa học của rễ cây mật nhân (eurycoma longifolia Jack) ở khu vực miền Trung Tây Nguyên và ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm.

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT

VÕ KHÁNH HÀ

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ CHIẾT TÁCH, XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA

RỄ CÂY MẬT NHÂN (EURYCOMA LONGIFOLIA JACK)

Ở MIẾN TRUNG – TÂY NGUYÊN VÀ ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT

ĐÀ NẴNG, NĂM 2021

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT

VÕ KHÁNH HÀ

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ CHIẾT TÁCH, XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA RỄ

CÂY MẬT NHÂN (EURYCOMA LONGIFOLIA JACK)

Ở MIẾN TRUNG – TÂY NGUYÊN VÀ ỨNG DỤNG TRONG

CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM

Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm

Mã số: 9.54.01.01

ĐÀ NẴNG, NĂM 2021

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác Việc tham khảo các nguồn tài liệu đã được trích dẫn và ghi nguồn tài liệu tham khảo đúng quy định.

Người cam đoan

Võ Khánh Hà

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN

TRANG TÓM TẮT

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Đối tượng, phạm vi nghiên cứu 2

4 Phương pháp nghiên cứu 2

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 4

6 Bố cục của luận án 5

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 6

1.1 Tổng quan về cây mật nhân 6

1.1.1 Đặc điểm sinh thái, phân bố 6

1.1.2 Thành phần hóa học của cây mật nhân 7

1.1.3 Tác dụng dược lý của cây mật nhân và ứng dụng trong dân gian 9

1.2 Tổng quan về các phương pháp nghiên cứu 12

1.2.1 Tổng quan về phương pháp chiết 12

1.2.2 Tổng quan về phương pháp phân lập và xác định cấu trúc hóa học 15

1.2.3 Tổng quan về phương pháp thăm dò hoạt tính sinh học 16

1.2.4 Tổng quan về quy trình sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe 23

1.3 Tổng quan về tình hình nghiên cứu mật nhân trong và ngoài nước 27

1.3.1 Nghiên cứu về thành phần hóa học 27

1.3.2 Nghiên cứu về hoạt tính sinh học 31

1.3.3 Nghiên cứu về phương pháp chiết 32

1.3.4 Nghiên cứu về ứng dụng mật nhân trong thực phẩm 33

1.4 Đánh giá tình hình nghiên cứu cây mật nhân 36

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39

2.1 Nguyên liệu 39

2.1.1 Thu hái và định danh mẫu rễ cây mật nhân 39

2.1.2 Xử lý nguyên liệu 39

2.2 Hóa chất, vật tư, thiết bị, dụng cụ 39

2.2.1 Hóa chất, vật tư 40

2.2.2 Thiết bị, dụng cụ 40

2.3 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát 41

2.4 Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm 42

2.4.1 Khảo sát, lựa chọn nguyên liệu 42

2.4.2 Phương pháp phân lập, xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất từ rễ cây mật nhân 43 2.4.3 Phương pháp xây dựng quy trình chiết rễ mật nhân 48

2.4.4 Khảo sát hoạt tính sinh học của dịch chiết rễ cây mật nhân 54

2.4.5 Nghiên cứu ứng dụng bổ sung mật nhân trong sản xuất một số thực phẩm bảo vệ sức khỏe 55 CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 60

3.1 Định danh mẫu thực vật và lựa chọn nguyên liệu nghiên cứu 60

3.1.1 Kết quả định danh mẫu thực vật 60

3.1.2 Đánh giá, lựa chọn vùng nguyên liệu nghiên cứu 60

3.2 Kết quả phân lập và xác định cấu trúc hóa học 65

3.2.1 Kết quả phân lập, xác định cấu trúc các hợp chất nhóm alkaloid 65

3.2.2 Kết quả phân lập, định danh các hợp chất không thuộc nhóm alkaloid 71

3.3 Xây dựng quy trình chiết rễ cây mật nhân 77

3.3.1 Xây dựng quy trình chiết rễ cây mật nhân bằng phương pháp chưng ninh hồi lưu trong dung môi ethanol 80 % 77

3.3.2 Xây dựng quy trình chiết rễ cây mật nhân bằng phương pháp chưng ninh hồi lưu trong nước 79 3.4 Kết quả thử hoạt tính sinh học của dịch chiết rễ cây mật nhân 85

3.4.1 Kết quả thử khả năng gây độc tế bào ung thư của dịch chiết nước và dịch chiết ethanol 80 % từ rễ cây mật nhân 85

3.4.2 Kết quả thử khả năng kháng viêm thông qua khảo sát cytokine tiền viêm và cytokine gây

3.4.3 Kết quả thử khả năng ức chế đại thực bào sản sinh NO 90

3.4.4 Khả năng ức chế enzyme -glucosidaseglucosidase 91

3.4.5 Kết quả thử khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của dịch chiết nước 91

3.4.6 Kết quả thử khả năng kháng oxy hóa của dịch chiết nước 93

3.4.7 Kết quả thử độc tính bất thường của dịch chiết nước rễ cây mật nhân 94

3.4.8 Kết quả thử khả năng không gây độc đối với tế bào thận gốc phôi ở người HEK-glucosidase293 94 3.5 Nghiên cứu ứng dụng sản xuất một số sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe 96

3.5.1 Sản phẩm cao chiết mật nhân 96

3.5.2 Sản phẩm trà thảo mộc mật nhân 100

3.5.3 Nghiên cứu sản xuất sản phẩm nước rau má mật nhân 105

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 112 CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ TÀI

LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

leukemic ở người

Human Acute Leukemia

Concentration

Concentration

chromatography

HSQC Phổ tương tác dị nhân đơn liên kết Heteronuclear single quantum

coherence spectroscopy

Correlation

DANH MỤC CÁC BẢNG

nước trên thế giới

34

Lai và Quảng Nam

61

cây mật nhân tại huyện Ia Grai, tỉnh Gia Lai

61

cây mật nhân tại huyện Phước Sơn, tỉnh Quảng Nam

62

ascorbic

93

Bảng 3.19 Kết quả thử độc tính bất thường của dịch chiết nước rễ mật nhân 94

nhân

94

nhân

98

DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ

nhân Gia Lai và dịch chiết rễ mật nhân Quảng Nam

63

C, dịch chiết rễ mật nhân Gia Lai và dịch chiết rễ mật nhân Quảng Nam

63

hiệu suất chiết rễ cây mật nhân trong dung môi ethanol 80 %

79

trà thảo mộc mật nhân

103

nước rau má mật nhân

109

longifolia jack hay còn gọi là cây bách bệnh, mật nhơn hay hậu phác nam.

Nhiều công trình khoa học nghiên cứu về cây mật nhân trên thế giới đã đượccông bố và được ứng dụng rộng rãi với kết quả phân lập được nhiều hợp chất hữu cơ cógiá trị, các chiết xuất từ mật nhân được sử dụng để bổ sung vào sản xuất các sản phẩmdược phẩm, thực phẩm có lợi cho sức khỏe Các nghiên cứu trước đây đã chứng minh,

rễ cây mật nhân là thành phần có giá trị nhất và được sử dụng để điều trị đau nhức, ănuống không tiêu, no hơi, đầy bụng, sốt dai d ng, sốt r t, suy dương, kiết l , sưng tuyến

và có thể d ng làm thuốc bổ tăng cường sức khỏe Các chiết xuất từ mật nhân đã đượccon người sử dụng để chống sốt r t, thuốc tăng trưởng hormone sinh dục và thuốc hạnhiệt Ngoài ra, chiết xuất từ rễ cây mật nhân còn được d ng để khôi phục năng lượng

và sinh khí, tăng cường lưu thông máu và có vai trò tốt đối với phụ nữ sau khi sinh con.Bên cạnh đó, chiết xuất này còn chứa các hợp chất có hoạt tính chống khối u và chống

k sinh tr ng, chống lo t Trong đó, được biết đến nhiều nhất là tác dụng làm tăng cườnglượng hormone nội sinh testosterol ở nam giới

Ở nước ta, hiện nay, mật nhân không những được sử dụng trong các bài thuốc cổtruyền mà còn có một số công trình nghiên cứu khoa học được công bố, khá nhiều hợp chất

có giá trị được tìm thấy và đã ứng dụng mật nhân vào sản xuất một số sản phẩm Tại khuvực miền Trung -glucosidase Tây Nguyên, đặc biệt là vùng núi các tỉnh như Gia Lai, Quảng Nam, Huế,cây mật nhân phát triển rất nhiều, người dân khai thác và sử dụng chúng như một loại thuốc

bổ rất phổ biến, đặc biệt là rễ Tuy nhiên, các nghiên cứu được công bố trên đối tượng tạinhững địa phương này không mang tính hệ thống, chưa có công trình nghiên cứu nào công

bố chi tiết và đầy đủ về phân lập, ứng dụng những hoạt tính sinh học quý có trong rễ mậtnhân để làm cơ sở ứng dụng trong công nghệ sản xuất sản phẩm thực phẩm

Ngoài ra, ứng dụng mật nhân chủ yếu trong lĩnh vực dược phẩm, trong khi đó, ứngdụng bổ sung mật nhân vào sản xuất thực phẩm chưa nhiều và đa dạng, đặc biệt, chưa cónhiều sản phẩm nghiên cứu làm giảm vị đắng khó chịu khi bổ sung mật nhân

để tạo thành sản phẩm có giá trị dược lý và có giá trị cảm quan.

Với những tác dụng to lớn như trên của mật nhân, một loại dược liệu qu và tìnhhình thực trạng nghiên cứu về mật nhân tại miền Trung -glucosidase Tây Nguyên hiện nay, đồng thờinhằm đa dạng hóa sản phẩm thực phẩm, nâng cao giá trị kinh tế và khuyến khích công tácbảo tồn nguồn nguyên liệu thiên nhiên này của địa phương, chúng tôi tiến hành nghiên cứu:

“Xây dựng quy trình công nghệ chiết tách, xác định thành phần hóa học của rễ cây mật

nhân (eurycoma longifolia Jack) ở khu vực miền Trung -glucosidase Tây Nguyên và ứng dụng trong

công nghiệp thực phẩm”

2 Mục tiêu nghiên cứu

Tìm kiếm, phát hiện và xác định những hợp chất có hoạt tính sinh học đáng qu trong

rễ cây mật nhân ở miền Trung – Tây Nguyên Từ đó, ứng dụng bổ sung vào quy trình sảnxuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe

3 Đối tượng, phạm vi nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu: Rễ cây mật nhân được thu nhận tại vùng nguyên liệu đượclựa chọn ở khu vực vùng núi tỉnh Gia Lai và Quảng Nam

Phạm vi nghiên cứu: Khảo sát, đánh giá lựa chọn nguyên liệu để phục vụ toàn bộ quátrình nghiên cứu, sử dụng các phương pháp phân lập, định danh xác định thành phần cáchợp chất chính Thăm dò một số hoạt tính sinh học của dịch chiết rễ cây mật nhân Ứngdụng sản xuất một số sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe với quy mô phòng thí nghiệm

4 Phương pháp nghiên cứu

4.1 Phương pháp nghiên cứu lý thuyết

Thu thập, tổng hợp các tài liệu, tư liệu, sách báo, các công trình nghiên cứu trong nước

và quốc tế về đặc điểm, cấu trúc, thành phần, các phương pháp thu nhận cao chiết, khảo sáthoạt tính sinh học và ứng dụng của rễ cây mật nhân trong nước và trên thế giới

4.2 Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

4.2.1 Phương pháp phân lập, định danh và xác định cấu trúc hóa học

ít phân cực để chiết các hợp chất chủ yếu tan nhiều trong dung môi ít phân cực hoặc khôngphân cực.

Phân lập các chất bằng phương pháp sắc ký, tinh chế bằng phương pháp kết tinhphân đoạn, trong đó, cao chiết trong các dung môi khác nhau được tách và tinh chế bằngphương pháp sắc ký cột kết hợp với sắc ký lớp mỏng với các hệ dung môi thích hợp Sắc kýcột gồm sắc ký cột thường và sắc ký cột nhanh (flash chromatography) sử dụng silicagelĐối với các chất phân cực có thể sử dụng Sephadex LH–20 hoặc ngược pha RP–18 Kiểmtra độ tinh khiết của các chất cũng như theo dõi quá trình tách chất trên cột bằng sắc ký lớpmỏng với hệ dung môi thích hợp

4.2.1.2 Phương pháp định danh, xác định cấu trúc hóa học của các chất

Các phương pháp định danh, xác định cấu trúc hóa học phổ biến: Kết hợp giữa các phương

electron (EI-glucosidaseMS), phổ khối ion hóa bằng bụi electron (ESI-glucosidase MS), phổ khối có độ phân giải cao

4.2.1.3 Phương pháp tối ưu hóa một số yếu tố ảnh hưởng bằng phương pháp quy hoạch

thực nghiệm trực giao cấp 1, 2 mức với k yếu tố ảnh hưởng

-glucosidase Xây dựng quy trình tối ưu để chiết những hợp chất có lợi bổ sung vào quy trình công nghệsản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe

-glucosidase Khảo sát các điều kiện thu nhận cao chiết bằng phương pháp chưng ninh hồi lưu

-glucosidase Tối ưu hóa một số yếu tố ảnh hưởng phương pháp chưng ninh hồi lưu Sử dụng phương

-glucosidase Các yếu tố khảo sát gồm: Thời gian chiết, nhiệt độ chiết và tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu

4.2.2 Phương pháp xác định hoạt tính sinh học của các dịch chiết

-glucosidase Phương pháp xác định khả năng gây độc tế bào ung thư

-glucosidase Phương pháp xác định khả năng ức chế sản sinh NO

-glucosidase Phương pháp xác định hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase glucosidase

-glucosidase Phương pháp xác định hoạt tính kháng viêm thông qua khảo sát cytokine tiền

viêm và cytokine gây viêm

-glucosidase Phương pháp xác định hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định

-glucosidase Phương pháp xác định hoạt tính kháng oxy hóa

-glucosidase Phương pháp thử độc tính

-glucosidase Phương pháp thử khả năng không gây độc đối với tế bào người

4.2.3 Phương pháp sản xuất sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe

Nghiên cứu quy trình sản xuất của một số sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe quy

mô phòng thí nghiệm, xây dựng quy trình công nghệ tạo ra sản phẩm đáp ứng quy định hiệnhành của Nhà nước đối với thực phẩm bảo vệ sức khỏe

4.2.4 Phương pháp đánh giá mức độ an toàn thực phẩm

Xác định hàm lượng kim loại nặng, vi sinh vật gây bệnh trong nguyên liệu và sảnphẩm bằng các thiết bị và phương pháp phân tích hiện đại

4.2.5 Phương pháp phân tích và đánh giá cảm quan sản phẩm thực phẩm

Sản phẩm thực phẩm mới, đặc biệt là trong sản phẩm có vị đắng của mật nhân đòihỏi phải được người tiêu dùng chấp nhận, do đó, yêu cầu sản phẩm phải được đánh giá cảmquan là cần thiết và quan trọng Sử dụng phương pháp cho điểm thị hiếu để đánh giá mức

độ chấp nhận của người tiêu d ng đối với sản phẩm

-glucosidase Cung cấp các thông tin khoa học của những sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe được ứngdụng từ rễ mật nhân

* Ý nghĩa thực tiễn

-glucosidase Đặt cơ sở cho việc xây dựng quy trình công nghệ sản xuất thực phẩm bổ sung cao chiết mậtnhân có hiệu quả cao, thúc đẩy sự phát triển đa dạng của ngành công nghiệp sản xuất thựcphẩm có lợi cho sức khỏe người tiêu d ng

-glucosidase Góp phần nâng cao giá trị kinh tế của rễ cây mật nhân tại v ng núi các tỉnh miền Trung vàTây Nguyên

-glucosidase Làm cơ sở để phát triển ngành công nghiệp khai thác và ứng dụng các loại thảo dược qu tạiđịa phương

6 Bố cục của luận án

Luận án gồm 123 trang (không kể phần phụ lục), kết cấu bao gồm: Mở đầu có 5trang trình bày tính cấp thiết, mục tiêu, nội dung, nghĩa khoa học, nghĩa thực tiễn của luậnán

Nội dung chính gồm 3 chương:

Chương 1: Tổng quan tài liệu gồm 32 trang;

Chương 2: Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu, gồm có 18 trang;

Chương 3: Kết quả nghiên cứu gồm có 52 trang;

Phần kết luận và kiến nghị gồm 3 trang;

Các công trình nghiên cứu đã công bố 1 trang

Ngoài ra phần các công trình công bố và tài liệu tham khảo gồm 12 trang

Trong luận án tổng cộng có 37 bảng, 28 hình vẽ và đồ thị Có 114 tài liệu tham khảo tiếng Việt, tiếng Anh và trang web

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về cây mật nhân

1.1.1 Đặc điểm sinh thái, phân bố

Mật nhân, còn gọi là bá bệnh, hậu phác, tho nan Lào , antongsar Campuchia , danh

pháp khoa học: Eurycoma longifolia Jack, là loại cây có hoa thuộc họ Thanh Thất

Simaroubaceae, loài bản địa ở Malaysia, Indonesia, Việt Nam, mật nhân phân bố ít hơn ở

Thái Lan, Lào và Ấn Độ Ở Indonesia, cây mật nhân tự nhiên mọc duy nhất ở Sumatra vàKalimanta [1] [2]

Cây mật nhân (hình 1.1) là loại cây nhỏ có cành, bụi thân mảnh, sinh trưởng ở tầngrừng thấp, trên đất sỏi, ưa chua và dẫn lưu nước tốt Cây có kích thước trung bình, có thể caođến 10 m, thường không phân nhánh Lá kép lông chim chẵn có thể dài đến 1m, cuống lámàu nâu đỏ Mỗi lá k p gồm 30 – 40 lá ch t, hình mũi mác hoặc hình trứng ngược Mỗi lá ch

t dài khoảng (5 – 20) cm, rộng (1,5 – 6) cm, mặt trên của lá màu xanh, mặt d ưới màu trắngHoa mọc thành cụm hình ch y ở nách lá, màu đỏ nâu, có nhiều lông tơ mịn Hoa lưỡng tính,cánh hoa nhỏ, rất mềm Quả hạch cứng, hình trứng, nâu vàng khi còn non và trở thànhnâu đỏ khi chín Vỏ và rễ của mật nhân thường có màu trắng hoặc vàng ngà [1] [2]

Hình 1.1 Hình ảnh cây mật nhân tại vùng núi Gia Lai

Mật nhân thường mọc ở v ng đồi núi có sườn dốc cao, v ng đất cát có tính acid, nghèo

ẩm khoảng 80 – 90 % mọc trong các khu rừng ven bờ biển hoặc rừng nguyên sinh, rừng táisinh và các khu rừng hỗn tạp, rừng thưa, cây ưa acid và đất cát ở độ cao khoảng 700 m so vớimực nước biển [1] [2]

Mật nhân được xem là loại thảo dược quý, các bộ phận của cây mật nhângồm lá, quả, thân, đặc biệt là rễ có tác dụng điều trị nhiều bệnh Hiện nay, mật nhân được d

ng rộng rãi ở rất nhiều nơi trên thế giới, trong đó, có ở cả ở châu Âu, Hoa Kỳ, dưới dạngthực phẩm bổ sung và nước uống [1]

Cây mật nhân mọc nhiều nơi ở nước ta, nhưng phổ biến nhất là ở miền Trung và một

số v ng Tây Nguyên như: Quảng Nam, Thừa Thiên Huế, Gia Lai, trong đó, ở v ng núi tỉnhGia Lai như huyện Kbang, huyện Ia-glucosidaseGrai, cây mật nhân mọc tự nhiên rất nhiều và đượckhai thác với số lượng lớn [1] [2]

1.1.2 Thành phần hóa học chính của cây mật nhân

Thành phần hóa học của mật nhân rất đa dạng, mỗi bộ phận của cây thì có các thànhphần khác nhau, bao gồm những hợp chất thuộc nhóm triterpen với ba khung sườnquassinoid, squallan và tirucallan Ngoài ra, còn có alkaloid (các dẫn chất có khung cơ bảncanthin-glucosidase6-glucosidaseone và β-glucosidasecarbolin), steroid, coumarin, acetic acid, benzoic acid, menthol… Trong

đó, quassinoid và alkaloid đóng vai trò quan trọng và là hoạt chất chủ yếu của các cây họ

Thanh Thất (Simarubaceae) nói chung và cây mật nhân nói riêng [3].

Quassinoid là thành phần chất đắng đặc trưng của những thực vật thuộc họ ThanhThất Các hợp chất quassinoid đều là dẫn xuất của các hợp chất triterpenoid và hầu như đaphần đều có dẫn xuất từ tetracyclic triterpend Đa số các quassinoid đều có dược tính; xuhướng phổ biến của các quassinoid là được sử dụng trong điều trị viêm khớp, chống sốt,điều trị bệnh viêm đường ruột, [4] Nhiều hợp chất quassinoid được tìm thấy ở phần thân

và rễ Trong đó, eurycomanone và eurycomanol là hai quassinoid điển hình trong rễ mậtnhân Các hợp chất này làm tăng nội tiết tố testosterone và lượng tinh dịch ở chuột đực [5]

Ba dạng quassinoid Eurycolactone D, E và F cũng được phân lập từ phần rễ theo báo cáovào năm 2002 của Ang và cộng sự [6] Vào năm 2009, nhóm nghiên cứu Miyake và cộng

sự đã phân lập được 34 loại

quassinoid từ phần thân đồng thời đã khám phá ra 10 hợp chất mới và chứng minh hoạt tínhgây độc tế bào của các hợp chất này [7].

Quassinoid có thể được phân loại thành năm loại chính dựa theo bộ khung carboncấu tạo nên hợp chất đó, bao gồm nhóm quassinoid có 18 nguyên tử carbon

C18 , 19 nguyên tử carbon C19 , loại có 20 nguyên tử carbon C20 , loại có 22 nguyên tửcacbon C22 và loại có 25 nguyên tử carbon C25 trong công thức phân tử Cấu trúc củaquassinoid phụ thuộc nhiều vào bộ khung carbon chính [4]

Alkaloid là một chất hữu cơ có chứa nitơ, đa số có nhân vòng, có phản ứng kiềm,thường gặp trong thực vật và đôi khi có trong động vật, thường có dược tính mạnh, cho kếttủa và phản ứng màu với một số thuốc thử gọi là thuốc thử của alkaloid Alkaloid là một hợp

chất hữu cơ chứa nitơ đa số có nhân vòng Các alkaloidtrong cây mật nhân là các dẫn xuất có khung cơ bản canthin-glucosidase6-glucosidaseone và β-glucosidasecarboline Một số

alkaloid được tìm thấy trong rễ mật nhân như n -glucosidasepentyl β-glucosidasecarboline-glucosidase1-glucosidasepropionate, 5-glucosidase

hydroxymethyl-glucosidase9-glucosidasemethoxycanthin-glucosidase6-glucosidaseone và 1-glucosidasehydroxy-glucosidase9-glucosidasemethoxycanthin-glucosidase6-glucosidaseone, các hợpchất này có hoạt tính gây độc tế bào và chống sốt r t Bên cạnh đó, nghiên cứu về hoạt tínhgây độc tế bào sợi nhân HT-glucosidase1080 của các hợp chất trong mật nhân, nhóm tác giả Miyake vàcộng sự vào năm 2010 đã nghiên cứu và công bố hợp chất 9,10-glucosidase dimethoxy-glucosidasecanthin-glucosidase6-glucosidaseone

Alkaloid thường là các hợp chất có trọng lượng phân tử cao; ở thế rắn khi ở nhiệt độthường, một vài alkaloid ở dạng lỏng Một số alkaloid không đo được độ chảy do nó bị pháhuỷ ở nhiệt độ thấp hơn độ chảy Đa số các alkaloid thường không màu hoặc màu trắng, một

số có màu vàng Ngoài ra, có một số alkaloid ở dạng bazơ không màu nhưng muối của nóvới acid lại có màu Các alkaloid thường có vị đắng Do cấu trúc của phân tử alkaloid phứctạp có chứa cacbon bất đối nên có tác dụng với ánh sáng phân cực Alkaloid tự nhiên thường

có tác dụng quay mặt ph ng ánh sáng phân cực sang trái [8]

Alkaloid thường chứa trong các bộ phận của cây như hoa, lá, rễ, hạt, vỏ Cótrường hợp, trong c ng một cây, bộ phận này rất giàu alkaloid nhưng bộ phận khác lạikhông có Lượng alkaloid và tỷ lệ thành phần các alkaloid trong cây có thể thay đổi tuỳtheo m a thu hái, tuổi của cây, điều kiện khí hậu, thổ nhưỡng Trong c ng một

cây thường chứa các alkaloid có cấu trúc hoá học gần giống nhau Đặc biệt, trong một sốcây có chứa đến vài chục alkaloid Các alkaloid trong cây tồn tại dưới dạng muối của cácacid hữu cơ [8].

1.1.3 Tác dụng dược lý của cây mật nhân và ứng dụng trong dân gian

Mật nhân là một loại thảo dược có giá trị, theo Đông y, cây mật nhân có vị đắng, tính

ấm, có thể chữa nhiều bệnh nên còn có tên là bá bệnh như: Ăn không tiêu, tiêu chảy, nônmữa, kiết l … Nước sắc lá cây trị ghẻ lở, mụn nhọt Các quassinoid từ rễ có tác dụng diệt kí

sinh trùng sốt rét Plasmodium [9].

Theo nội dung trong sách Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam của Đỗ Tất Lợi,trong vỏ cây mật nhân có chứa một chất đắng gọi là quassin Vỏ cây d ng để chữa nhữngtrường hợp ăn uống không tiêu, đau mỏi lưng Quả của cây này d ng để chữa l [2]

Theo từ điển cây thuốc Việt Nam của Võ Văn Chi, người ta dùng rễ cây mật nhânthái nhỏ, tẩm rượu sao để làm thuốc, có vị đắng, tính mát Thường dùng chữa khí hư, huyết

k m, ăn uống không tiêu, tức ngực, gân xương yếu, tay chân tê đau, tả l , nôn mửa Ngoài

ra, rễ mật nhân còn d ng để chữa tứ thời cảm mạo [10]

Tại Việt Nam, rễ, vỏ và quả cây được dùng sắc thuốc, vị rất đắng Thuốc được dùngtrị tẩy giun, sốt rét, kiết l , ngộ độc, đầy bụng, và cả say rượu Khi dùng ngoài da có thể trịghẻ lở Có lẽ vì đa dụng nên cây này còn được gọi là bách bệnh Ngoài ra mật nhân còn cókhả năng tăng cường tetosterone bên trong nam giới, cây d ng như vị thuốc bổ giúp nămgiới tăng cường chức năng sinh l và sức khỏe tình dục, bổ sung năng lượng cho cơ thể, giúpgiảm stress, mệt mỏi, tăng cường miễn dịch, ngăn ngừa khối u và phòng chống lão hóa,giúp tăng năng lượng hoạt động và sức bền cơ thể [11]

Các kết quả nghiên cứu đã được chứng minh rõ ràng trên phương diện khoa học và

đã được công bố rộng rãi cho thấy, mật nhân các tác dụng dược lý linh hoạt bao gồm hoạttính chống ung thư, chống sốt rét, kháng khuẩn, chống oxy hóa, kích thích tình dục, chốngviêm, chống loét, chống đái tháo đường

Hoạt tính kháng sốt rét: Một nghiên cứu tiến hành với dịch chiết rễ mật nhân trên Plasmodium falciparum với mô hình lactate dehydrogenase cho thấy bốn quassinoid gồm

eurycomalactone; 13,21-glucosidasedihydroeurycomanone; 13-glucosidaseα-glucosidase(21)-glucosidase epoxyeurycomanone;eurycomanone đều có tác dụng kháng sốt r t, trong đó,

eurycomanone cho tác dụng mạnh nhất [9].

Tác dụng trị tiểu đường: Bệnh đái đường (hay tiểu đường) là một bệnh mãn tính, do

rối loạn chuyển hoá hydrat cacbon vì thiếu insulin ở các mức độ khác nhau, do đó, nó gâytăng đường huyết và nếu vượt quá ngưỡng thì có đường niệu nước tiểu có đường) Insulin làhormone do tụy tiết ra, khi dòng máu mang glucose đến các cơ quan, insulin sẽ giúpglucose đi vào trong tế bào và giúp tế bào sử dụng glucose để sinh ra năng lượng cho hoạtđộng của các tế bào Khi thiếu insulin, cơ thể sẽ không sử dụng được glucose, hậu quả làglucose trong máu sẽ tăng cao và xuất hiện trong nước tiểu Do đó, để điều trị bệnh này cóthể bằng các cách làm chậm hấp thu đường glucose từ ruột vào máu, tăng hoạt tính củainsulin, kích thích tế bào bêta của tụy tăng sản xuất insulin… Một trong những nguyên nhânlàm tăng lượng glucose vào máu đó là do sự có mặt của enzyme α-glucosidaseglucosidase Lá và rễ câymật nhân đã được d ng để kiểm soát đường huyết Năm 2004, nhóm nghiên cứu của Husen

và cộng sự đã thử dịch chiết nước của rễ mật nhân ở ba liều (50 mg/kg; 100 mg/kg và 150mg/kg) theo mô hình steptozotocin trên chuột bình thường và chuột có đường huyết cao, kếtquả cho thấy ở nồng độ 150 mg/kg cao nước rễ mật nhân có khả năng làm hạ đường huyết ở

lô thử và không gây giảm có nghĩa ở lô đối chứng [12]

Tác dụng kháng khuẩn: Hoạt tính kháng khuẩn là hoạt tính sinh học cho thấy khả

năng tiêu diệt hoặc ức chế hoàn toàn sự phát triển của vi sinh vật Hầu hết các loại vi sinhvật gây độc đối với sức khỏe con người thường được sử dụng trong việc nghiên cứu về hoạt

tính kháng khuẩn của thực vật như: Tụ cầu vàng (S.aureus), E.coli, Samonella,

P.aeruginosa … Năm 2007, nhóm nghiên cứu Farouk cùng cộng sự đã thử nhiều dịch chiết

khác nhau methanol, ethanol, acetone, nước) từ lá, thân và rễ mật nhân trên hoạt tính khángkhuẩn Gram (-glucosidase) và (+) Kết quả cho thấy dịch chiết lá và thân có tác dụng trên cả vi khuẩn

Gram (-glucosidase) và (+), ngoại trừ hai chủng Gram (-glucosidase) là Escherichia coli và Salmonella typhi Dịch chiết nước từ lá cũng có tác dụng kháng khuẩn trên các chủng Staphylococcus aureus và

Serratia marscesens [9].

Tác dụng kích thích sinh dục: Đây là tác dụng chính, vượt trội của cây mật nhân, đã

được chứng nhận và công bố rộng rãi với nhiều đề tài nghiên cứu khoa học trên thế giới Đó

là khả năng tăng cường sức khoẻ tình dục cho nam giới, kích thích cơ thể tăng tiết hormonegiới tính nam (testosterone) một cách tự nhiên, duy trì sự hưng

phấn và phong độ tình dục ở nam giới, ngăn chặn các dấu hiệu suy giảm khi bước vào tuổitrung niên Theo kết quả nghiên cứu vào năm 2010 của nhóm Mohd Ismail Bin và cộng sựcho thấy, 76 trong số 320 bệnh nhân mắc chứng suy sinh dục khởi phát muộn

LOH đã được cung cấp 200 mg dịch chiết mật nhân tiêu chuẩn trong 1 tháng Các triệuchứng lão hóa nam giới AMS theo thang đánh giá tiêu chuẩn và nồng độ testosterone tronghuyết thanh đã được theo dõi Kết quả cho thấy điều trị bệnh nhân LOH với chiết xuất mậtnhân này P <0,0001 đã cải thiện điểm AMS cũng như nồng độ testosterone trong huyếtthanh [13]

Tác dụng kháng ung thư: Năm 2018, nhóm tác giả Thu Hnin E và cộng sự đã công

bố, eurycomanone là một trong những hợp chất dược liệu mạnh nhất của mật nhân, chúngthể hiện được hiệu quả cao trong việc chống ung thư biểu mô phổi (tế bào A-glucosidase549 và ung thư

vú tế bào MCF-glucosidase7) và cho thấy hiệu quả trung bình chống lại ung thư dạ dày (tế bào MGC-glucosidase

803 và ung thư biểu mô đường ruột (tế bào HT-glucosidase29) [14]

Bên cạnh đó, năm 2018, nhóm tác giả Chunxin Zou và cộng sự đã công bố, tám hợpchất trong mật nhân thuộc các dẫn xuất squalene, biphenyl, neolignans và alkaloids được dựđoán là có tiềm năng hoạt động ức chế ung thư gan [15]

Hoạt tính kháng viêm: Năm 2018, nhóm nghiên cứu Lê Thanh Liêm cùng cộng sự đã

công bố kết quả: Chiết xuất alkaloid từ rễ cây mật nhân tại Kỳ Sơn – Nghệ An đã cho thấy

tác dụng chống viêm đáng kể ở cả mẫu in vitro và in vivo Dịch chiết này thể hiện hoạt động

chống viêm thông qua việc ức chế các chất trung gian gây viêm như NO, iNOS và COX-glucosidase2

và bảo vệ chuột khỏi tử vong do LPS gây ra trong mô hình sốc nhiễm trùng [16]

Hoạt tính kháng oxy hóa: Khả năng kháng oxy hóa của một chất là khả năng làm ức

chế quá trình oxy hóa của các phân tử khác Oxy hóa là một phản ứng hóa học có thể tạo racác gốc tự do, dẫn đến các phản ứng dây chuyền có thể làm hỏng các tế bào Các chất khángoxy hóa như thiolis hay vitamin C có thể chấm dứt các phản ứng dây chuyền này để ngăncản quá trình oxy hóa xảy ra Năm 2013, nhóm nghiên cứu của Varghese và cộng sự đãnghiên cứu về hoạt tính kháng oxy hóa và kết luận rằng dịch chiết mật nhân trong cồn thểhiện hoạt động kháng oxy hóa ở tất cả các nồng độ (10, 25, 50, 100 và 250 μg/mL Khả năngkháng oxy hóa của chiết xuất này được so sánh với các giá trị của ascorbic acid [17]

Ngoài ra, theo phát hiện của nhóm nghiên cứu Hulol Saleh Alruhaimi và cộng sự vàonăm 2019 ở Malaysia cho thấy, mật nhân có tác dụng bảo vệ thần kinh đối với giảm máuđến não mãn tính (chronic cerebral hypoperfusion) bằng cách tăng cường khả năng chốngoxy hóa và giảm peroxide hóa và viêm, có thể cải thiện chức năng nhận thức ở chuột [18].

1.2 Tổng quan về các phương pháp nghiên cứu

1.2.1 Tổng quan về phương pháp chiết

Chiết là phương pháp sử dụng dung môi để lấy các chất tan ra khỏi các mô thực vật,sản phẩm thu được của quá trình chiết xuất là dịch chiết Trong phạm vi công nghệ thì córất nhiều phương pháp chiết khác nhau từ phương pháp gián đoạn đến phương pháp liêntục, từ phương pháp đơn giản đến phức tạp, từ phương pháp truyền thống đến hiện đại vớicác loại dung môi khác nhau Các yếu tố ảnh hưởng quá trình chiết: Bản chất của chất tan,dung môi, nhiệt độ, áp suất, cấu tạo của vách tế bào, kích thước tiểu phân bột dược liệu,thời gian chiết [19]

Có rất nhiều kỹ thuật và thiết bị chiết khác nhau như chiết ở nhiệt độ thường

ngâm lạnh, ngâm kiệt ở nhiệt độ thường hoặc chiết ở nhiệt độ cao chiết nóng, hãm, sắc,ngấm kiệt nóng , chiết với các thiết bị khác nhau như: Soxhlet, Kumagawa tùy yêu cầu,điều kiện mà chọn kỹ thuật chiết thích hợp

Phương pháp chưng ninh hồi lưu: Nguyên liệu được ngâm cùng dung môi trong mộtbình cầu đáy tròn được nối với hệ thống ngưng tụ Đun nóng bình cầu chứa nguyên liệu vàdung môi đến nhiệt độ sôi, dung môi bốc hơi sẽ ngưng tụ và quay trở lại Phương phápchưng ninh hồi lưu có ưu điểm: Đơn giản, dễ thực hiện, thiết bị đơn giản, rẻ tiền Tuy nhiên,

có những nhược điểm chung của phương pháp chiết xuất gián đoạn: Năng suất thấp, thaotác thủ công giai đoạn tháo bã và nạp liệu), chiết nhiều lần nên tốn dung môi, thời gian[19]

Phương pháp chiết Soxhlet: Nguyên liệu được cho vào một ống giấy lọc rồi đặt vàongăn chiết Dung môi mới được cho vào bình cầu và đun hồi lưu Dung môi bốc hơi lênđược ngưng tụ xuống ngăn chiết và khi tràn sẽ chảy qua ống xi -glucosidase phông xuống bình cầu bêndưới, mang theo chất hòa tan từ nguyên liệu Ở bình cất, chất tan được giữ lại, dung môibốc hơi được ngưng tụ xuống bình chiết và đi qua lớp nguyên liệu để hòa tan các chất cònlại Quá trình được tiếp tục đến khi nguyên liệu được chiết hoàn

toàn Phương pháp chiết Soxhlet thuộc loại phương pháp chiết bán liên tục, nguyên liệu chovào bộ Soxhlet và đứng yên trong khi dung môi chuyển động liên tục Phương pháp chiếtSoxhlet có ưu điểm: Chiết kiệt, tiết kiệm được dung môi thu hồi dung môi) Tuy nhiên, cónhững nhược điểm: Lượng nguyên liệu chiết phụ thuộc nhiều vào thể tích thiết bị, tiến hànhphức tạp, thiết bị đắt tiền [19].

Ngoài ra, phương pháp chiết còn được phân loại dựa vào các yếu tố sau:

-glucosidase Dựa vào chế độ làm việc có các phương pháp chiết sau: Gián đoạn, bán liên tục, liên tục

-glucosidase Dựa vào chiều chuyển động tương hỗ giữa hai pha, có các phương pháp: Ngược dòng, xuôi dòng, chéo dòng

-glucosidase Dựa vào áp suất làm việc, có các phương pháp chiết ở: Áp suất thường, áp suất giảm áp suất chân không , áp suất cao làm việc có áp lực

-glucosidase Dựa vào trạng thái làm việc của hai pha, có các phương pháp chiết sau: Ngâm, ngấm kiệt

Dựa vào những biện pháp kỹ thuật đặc biệt: Phương pháp siêu âm, phương pháp tạodòng xoáy, phương pháp mạch nhịp [19]

Trong đề tài nghiên cứu này, sử dụng phương pháp chiết Soxhlet và chưng ninh trongquá trình chiết mẫu thực vật phục vụ việc phân lập, định danh, xác định thành phần, cấutrúc hóa học Lựa chọn phương pháp chưng ninh hồi lưu để xây dựng quy trình chiết tạo racao chiết bổ sung vào quy trình công nghệ sản xuất thực phẩm

1.2.1.1 Phương pháp chưng ninh hồi lưu

Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã sử dụng phương pháp chưng ninh hồi lưu, cây mậtnhân cũng từng là đối tượng được nghiên cứu trước đó Phương pháp chưng ninh hồi lưuđược định hướng từ các nghiên cứu của nhóm tác giả Anisa Rahmalia và cộng sự vào năm

2011, nhóm tác giả Zakia Khanam và cộng sự vào năm 2015 [20] [21]

1.2.1.2 Phương pháp chiết Soxhlet

Lựa chọn phương pháp Soxhlet được định hướng từ các nghiên cứu của nhóm TeeThiam Tsui và cộng sự vào năm 2005, nhóm nghiên cứu Đào H ng Cường và cộng sự năm

2010 và nhóm nghiên cứu Nursyazura Khari và cộng sự vào năm 2014 [22] [23] [24]

1.2.1.3 Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết

a Những yếu tố thuộc về thành phần, cấu tạo của nguyên liệu

-glucosidase Màng tế bào dược liệu

-glucosidase Chất nguyên sinh

-glucosidase Một số tạp chất có thể có trong nguyên liệu

Những yếu tố này thì không thể thay đổi được trong quá trình sản xuất, mà phụ thuộcvào nguyên liệu sử dụng, do vậy, trong phạm vi nghiên cứu này, chúng tôi không nghiêncứu sâu về nội dung này [8]

b Những yếu tố thuộc về dung môi

-glucosidase Độ phân cực của dung môi: Dung môi ít phân cực thì dễ hòa tan các chất không phân cực

và khó hòa tan các chất có nhiều nhóm phân cực Ngược lại, dung môi phân cực mạnh thìhòa tan các chất có nhiều nhóm phân cực và khó hòa tan các chất ít phân cực [8]

-glucosidase Theo tác giả Rajeev Bhat và cộng sự, trong thành phần rễ cây mật nhân thành phần chủ yếu

là các quassinoid và alkaloid, trong đó, các alkaloid là những hợp chất có tính chất phâncực mạnh, còn các quassioid là những dẫn xuất của triterpen, là những hợp chất phân cực

Mặt khác, nước là một dung môi rẻ tiền, dễ kiếm, an toàn khi bổ sung vào thực phẩm, lạikhông gây m i vị khó chịu đối với thực phẩm Ngoài ra, dung môi ethanol 80 % trong nướcđược xem là dung môi vạn năng, có thể hòa tan hầu hết các hợp chất từ phân cực mạnh đến

ít phân cực, ethanol cũng có thể sử dụng trong thực phẩm Vì vậy, lựa chọn nước và ethanol

80 % trong nước làm dung môi trong nghiên cứu sau này [25]

-glucosidase Độ nhớt, sức căng bề mặt của dung môi: Dung môi có độ nhớt càng thấp hoặc có sức căng

bề mặt càng nhỏ thì dung môi càng dễ thấm vào dược liệu, tạo điều kiện thuận lợi cho quátrình chiết xuất và ngược lại [8]

c Những yếu tố về kỹ thuật

Yếu tố về kỹ thuật là những yếu tố có thể thay đổi được bằng các biện pháp kỹ thuậtkhác nhau, nhằm tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình chiết xuất Đó có thể là những yếu tốnhư nhiệt độ, thời gian, độ mịn của dược liệu, khuấy trộn, siêu âm [8]

-glucosidase Sự chênh lệch nồng độ giữa hai pha: Trong quá trình trích ly, sự chênh lệch nồng độ giữahai pha là động học của quá trình trích ly, do đó sự chênh nồng độ giữa hai pha càng lớnthì quá trình trích ly diễn ra càng nhanh và thuận lợi Chính vì thế,

trong quá trình trích ly người ta luôn tìm mọi cách để tăng sự chênh lệch nồng độ giữa haipha: Trích ly ngược chiều, tuần hoàn dung môi, bổ sung dung môi trong quá trình trích ly,thay mới dung môi cuối quá trình trích ly [8].

-glucosidase Nhiệt độ chiết: Theo công thức tính hệ số khuếch tán của Einstein, khi nhiệt độ tăng thì hệ

số khuếch tán cũng tăng, do đó, theo định luật Fick, lượng chất khuếch tán cũng tăng lênHơn nữa khi nhiệt độ tăng thì độ nhớt của dung môi giảm nên tạo điều kiện thuận lợi choquá trình chiết Tuy nhiên, khi nhiệt độ tăng sẽ gây ra bất lợi cho những hợp chất k m bền ởnhiệt độ cao, gây phá hủy một số hoạt chất như vitamin, glycosid, alkaloid, Một số bất lợikhác có thể kể đến như khi nhiệt độ tăng làm tăng độ hòa tan của tạp chất, dung môi dễ bịhao hụt và đối với một số chất đặc biệt có quá trình hòa tan tỏa nhiệt, độ hòa tan của chúnggiảm khi nhiệt độ tăng Vì vậy, tùy trường hợp cụ thể, chúng ta cần lựa chọn nhiệt độ saocho ph hợp [8]

-glucosidase Thời gian chiết: Khi bắt đầu chiết, các chất có phân tử lượng nhỏ sẽ được hòa tan vàkhuếch tán vào dung môi trước, sau đó mới đến các chất có phân tử lượng lớn Do đónếu thời gian chiết quá ngắn sẽ không chiết được hết các hoạt chất trong dược liệu Nếuthời gian chiết quá dài, dịch chiết sẽ bị lẫn nhiều tạp chất, gây bất lợi cho quá trình tinhchế và bảo quản Nhưng đến một giới hạn nào đó thì quá trình chiết sẽ đến trạng tháicân bằng d có k o dài thời gian thì quá trình trích ly cũng không tiếp tục diễn ra Vì vậy,cần thiết phải lựa chọn thời gian chiết sao cho ph hợp với thành phần dược liệu, dungmôi và phương pháp chiết [8]

Ngoài những yếu tố kể trên, còn nhiều yếu tố khác cũng gây ảnh hưởng đến quá trìnhchiết như độ mịn, khuấy trộn, áp suất, pH môi trường, chấn động cơ học, dòng điện cao áp[8]

Những yếu tố về kỹ thuật là những yếu tố có thể thay đổi được bằng các biện pháp

kỹ thuật khác nhau, thay đổi các yếu tố này trong quá trình sản xuất là dễ dàng thực hiện Vìvậy, trong nghiên cứu này, chúng tôi lựa chọn ba yếu tố của quá trình chiết xuất là tỷ lệ giữadung môi và nguyên liệu, nhiệt độ chiết và thời gian chiết để tiến hành quá trình khảo sátcác yếu tố ảnh hưởng bằng quy hoạch thực nghiệm và tối ưu hóa quá trình chiết rễ mật nhânbằng phương pháp chưng ninh hồi lưu [26]

1.2.2 Tổng quan về phương pháp phân lập và xác định cấu trúc hóa học

Sau quá trình chiết từ các dung môi khác nhau, dịch chiết được cô khô tạo thành

cao chiết, tách và tinh chế các hợp chất có trong cao chiết bằng phương pháp sắc ký cột kếthợp với sắc ký bản mỏng với các hệ dung môi thích hợp.

Sắc ký cột (CC): Nhằm phân lập các đơn chất từ hỗn hợp Nguyên tắc: Sắc ký hấp phụ

có thể được tiến hành trên một cột thủy tinh th ng đứng với chất hấp phụ đóng vai trò phatĩnh, dung môi rửa cột đóng vai trò pha động chảy qua chất hấp phụ dưới tác động của trọnglực Đối với mỗi chất riêng biệt trong hỗn hợp cần tách, tùy theo khả năng hấp phụ và khảnăng hòa tan của nó đối với dung môi rửa cột để lấy ra lần lượt trước hoặc sau Sắc ký cộtgồm sắc ký cột thường và sắc ký cột nhanh sử dụng silicagel Đối với các chất phân cực cóthể sử dụng sephadex LH-glucosidase20 hoặc ngược pha RP-glucosidase18 Trường hợp cần thiết có thể chạy cộtlặp lại nhiều lần hoặc d ng phương pháp kết tinh phân đoạn, kết tinh lại để tinh chế [19].Sắc ký bản mỏng (Thin Layer Chromatography -glucosidase TLC): Nhằm xác định hệ dung môi

để chạy sắc ký cột, kiểm tra thành phần độ tinh khiết của các hỗn hợp, các phân đoạn củasắc ký cột Nguyên lý: Sắc ký bản mỏng TLC là sắc ký hấp phụ được tiến hành trên mộtbản mỏng, chất hấp phụ là silicagel hay oxýt nhôm Sau khi nhúng bản mỏng vào dung dịchchiết, lấy ra sấy nhẹ, sẽ phát hiện các vết Sắc ký bản mỏng được sử dụng để kiểm tra độtinh khiết cũng như theo dõi quá trình tách chất trên cột bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dungmôi thích hợp [19]

Cấu trúc hóa học của các hợp chất được xác định bằng sự kết hợp giữa các phương pháp vật

-glucosidase Sắc k lỏng khối phổ LC-glucosidaseMS, LC-glucosidaseMS/MS : Sử dụng cho các đối tượng là nhữnghợp chất có khối lượng phân tử lớn, khó bay hơi

-glucosidase Hồng ngoại IR : Sử dụng định danh các nhóm chức có trong hợp chất

-glucosidase Phổ khối va chạm electron EI-glucosidaseMS);

-glucosidase Phổ khối ion hóa bằng bụi electron ESI-glucosidaseMS);

-glucosidase Phổ khối có độ phân giải cao HR-glucosidaseESI-glucosidaseMS);

-glucosidase Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều 1H-glucosidaseNMR, 13C-glucosidaseNMR, DEPT và

1.2.3 Tổng quan về phương pháp thăm dò hoạt tính sinh học

1.2.3.1 Phương pháp thử khả năng gây độc tế bào ung thư

Phương pháp thử khả năng gây độc tế bào ung thư in vitro được Viện Ung thư

Quốc gia Hoa Kỳ (National Cancer Institute – NCI) xác nhận là phép thử độ độc tế bàochuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào

ung thư ở điều kiện in vitro Phương pháp thử nghiệm xác định tính độc tế bào ung thư

cytotoxic assay đối với tế bào nuôi cấy dạng đơn lớp và đối với các dòng tế bào nuôi cấyhỗn dịch [29] [30]

a Xác định khả năng gây độc tế bào ung thư (cytotoxic assay) đối với tế bào nuôi cấy dạng

lệ thuận với lượng SRB gắn với phân tử protein, do đó lượng tế bào càng nhiều lượngprotein càng nhiều) thì giá trị OD càng lớn [29]

b Xác định tính độc tế bào đối với các dòng tế bào nuôi cấy hỗn dịch

Phương pháp xác định tính độc tế bào đối với các dòng tế bào nuôi cấy hỗn dịch làphương pháp dạng MTT Phương pháp này được thực hiện tương tự theo phương pháp củaMosmann Bernardes và cộng sự vào năm 1983 Nhóm tác giả sử dụng muối tetrazoliumMTT-glucosidase(3-glucosidase(4,5-glucosidasedimethylthiazol-glucosidase2-glucosidaseyl)-glucosidase2,5-glucosidasediphenyltetrazolium)) làm thuốc thử trong ph p somàu, qua đó đánh giá về sự sống sót và khả năng phát triển của tế bào Vòng tetrazoliumcủa thuốc thử bám chặt vào ti thể của tế bào hoạt động Dưới tác dụng của enzymedehydrogenase trong tế bào, màu vàng của MTT biến đổi thành màu tím formazan Nhưvậy, càng nhiều formazan thì tỷ lệ tế bào sống sót càng cao [30]

1.2.3.2 Xác định khả năng ức chế đại thực bào sản sinh NO

Việc sản xuất NO sinh lý là cực kỳ quan trọng để bảo vệ cơ thể, tuy nhiên, sản xuấtquá mức và các chất chuyển hóa của nó có liên quan đến sự phát triển của các bệnh lý, ch

ng hạn như sốc nhiễm trùng do vi khuẩn và viêm mãn tính Phương pháp khảo sát khả năng

ức chế tế bào đại thực bào sinh NO là phương pháp được sử dung phổ biến trong việc thăm

dò hoạt tính kháng viêm đối với các loại thực vật nhằm đánh giá tác nhân ngăn chặn sảnxuất có thể có lợi cho việc điều trị phản ứng viêm Ngoài

ra, các loài gốc tự do cũng chịu trách nhiệm kích hoạt một số yếu tố phiên mã tiền viêm, cóliên quan đến việc thúc đẩy các bệnh viêm [31].

Đến thời điểm nghiên cứu, chưa có công bố nào về khả năng kháng viêm trên đốitượng dịch chiết rễ cây mật nhân, do đó, trong đề tài nghiên cứu này, chúng tôi tiến hànhnghiên cứu, khảo sát khả năng này nhằm tìm ra đặc tính mới, bổ sung giá trị cho nguyênliệu đã lựa chọn nghiên cứu

1.2.3.3 Xác định hoạt tính ức chế enzyme α- glucosidase

Chứng tăng đường huyết sau khi ăn dẫn đến sự tiến triển của bệnh tiểu đường tu p

2, do đó phương pháp ức chế hoạt động của enzyme -glucosidaseglucosidase trong điều trị tiểuđường tu p 2 là phương pháp được sử dụng phổ biến hiện nay

Khảo sát khả năng ức chế enzyme α-glucosidase glucosidase qua đó đánh giá được khả năngkháng bệnh đái tháo đường tuýp 2 của dịch chiết nước Dựa trên phản ứng phân cắt cơ chấtp-glucosidasenitrophenyl-glucosidase-glucosidaseD-glucosidaseglucopyranoside nhờ tác động của enzyme  -glucosidase glucosidase, qua đó giảiphóng sản phẩm là p-glucosidasenitrophenol có màu vàng Độ hấp thụ của hỗn hợp phản ứng tại bướcsóng 410 nm ở thời điểm 30 phút sau phản ứng, phản ánh lượng sản phẩm p-glucosidaseNitrophenolsinh ra, qua đó phản ánh hoạt độ của enzyme  -glucosidase glucosidase [32]

1.2.3.4 Xác định hoạt tính kháng viêm thông qua khảo sát cytokine tiền viêm và cytokine

gây viêm

Viêm là một cơ chế bảo vệ do các yếu tố hóa học khác nhau gây ra, và bao gồm cácthay đổi phức tạp, tuần tự để loại bỏ nguyên nhân ban đầu, nhiều bệnh được theo sau bởicác quá trình viêm cấp tính hoặc mãn tính với sản xuất nhiều chất trung gian hóa học, ch nghạn như xơ vữa động mạch, bệnh Alzheimer, ung thư, hen suyễn và các bệnh nhiễm tr ng,như bệnh lao [31]

Cytokine là các protein hay glycoprotein không phải kháng thể được sản xuất vàphóng thích bởi các tế bào bạch cầu viêm và một số tế bào khác không phải bạch cầu Cácprotein này hoạt động trong vai trò là các chất trung gian điều hòa giữa các tế bào trong cơthể, các nghiên cứu và hiểu biết về vai trò sinh l cũng như sinh l bệnh của cytokine đã đạtđược những thành tựu đáng kể Cytokine tham gia vào rất nhiều quá trình sinh học trong cơthể như tạo phôi, sinh sản, tạo máu, đáp ứng miễn dịch, viêm Tuy nhiên các phân tửnày cũng đóng vai trò khá quan trọng trong các bệnh l như: Bệnh tự miễn, nhiễm trùnghuyết, ung thư

Cytokine tham gia vào nhiều quá trình sinh lý bao gồm điều chỉnh các phản ứng miễndịch và viêm Các phân tử hiệu ứng này được tạo ra tạm thời và cục bộ kiểm soát biên độ vàthời gian của phản ứng Phương pháp xác định hàm lượng cytokine tiền viêm và cytokinegây viêm giúp đánh giá khả năng kháng viêm của tế bào vì nếu quá trình sản xuất quá nhiềuhoặc không đủ cytokine có thể góp phần đáng kể vào sinh lý bệnh của một loạt bệnh tựmiễn dịch, các bệnh truyền nhiễm và đào thải khi ghép tạng (ví dụ, IL-glucosidase1, IL-glucosidase4, IL-glucosidase6, IL-glucosidase10,IL-glucosidase12, TNF-glucosidasealpha) [33].

1.2.3.5 Phương pháp xác định hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định

Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được thực hiện dựa trên phương pháp hệ nồng

độ trong môi trường lỏng tương tự phương pháp nghiên cứu của Hadacek và cộng sự vàonăm 2000 [34]

Đây là phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật và nấm kiểm định nhằm đánh giámức độ kháng khuẩn mạnh yếu của các mẫu thử thông qua các giá trị thể hiện hoạt tính là

concentration -glucosidase nồng độ ức chế 50% , MBC Minimum bactericidal concentration -glucosidase nồng độ

tối thiểu diệt khuẩn Các chủng vi sinh vật kiểm định bao gồm những vi khuẩn và nấm kiểmđịnh gây bệnh ở người như:

-glucosidase Bacillus subtilis là trực khuẩn Gram + , sinh bào tử, thường không gây bệnh

-glucosidase Staphylococcus aureus là cầu khuẩn Gram + , gây mủ các vết thương, vết bỏng, gây viêm

họng, nhiễm tr ng có mủ trên da và các cơ quan nội tạng

-glucosidase Lactobacillus fermentum là vi khuẩn Gram + , vi khuẩn đường ruột lên men có ích, thường có

mặt trong hệ tiêu hoá của người và động vật

-glucosidase Escherichia coli là vi khuẩn Gram (-glucosidase , gây một số bệnh về đường tiêu hoá như viêm dạ dày,

viêm đại tràng, viêm ruột, viêm l trực khuẩn

-glucosidase Pseudomonas aeruginosa là vi khuẩn Gram (-glucosidase , trực khuẩn mủ xanh, gây nhiễm tr ng huyết,

các nhiễm tr ng ở da và niêm mạc, gây viêm đường tiết niệu, viêm màng não, màng trongtim, viêm ruột

-glucosidase Salmonella enterica là vi khuẩn Gram -glucosidase , vi khuẩn gây bệnh thương hàn, nhiễm tr ng đường

ruột ở người và động vật

-glucosidase Candida albicans là nấm men, thường gây bệnh tưa lưỡi ở trẻ em và các bệnh phụ khoa.

Môi trường nuôi cấy: MHB Mueller- Hinton Broth), MHA (Mueller - Hinton Agar); TSB (Tryptic Soy Broth); TSA (Tryptic Soy Agar cho vi khuẩn; SDB (Sabouraud – 2 %

dextrose broth) và SA (Sabouraud – 4 % dextrose agar cho nấm.

Chất tham khảo:

-glucosidase Kháng sinh ampicillin cho các chủng vi khuẩn Gram +

-glucosidase Kháng sinh cefotaxim cho các chủng vi khuẩn Gram -glucosidase)

-glucosidase Kháng nấm nystatin cho chủng nấm

Giá trị MIC được xác định tại giếng có nồng độ chất thử thấp nhất ức chế sự phát

cấy bằng máy quang phổ TECAN:

IC(%)  100x ODtest  ODcontrol() ODcontrol()

 ODcontrol()

Giá trị MBC2đ.ược xác định bằng số khuẩn lạc trên đĩa thạch

1.2.3.6 Xác định hoạt tính kháng oxy hóa

Các phương pháp xác định hoạt tính kháng oxy hóa thường được sử dụng như sau:

a Phương pháp thông qua phản ứng bao vây gốc tự do DPPH

Hoạt tính chống oxy hóa của mẫu được xác định thông qua phản ứng bao vây gốc tự

do Dựa trên nguyên tắc 1,1-glucosidasediphenyl-glucosidase2-glucosidasepicrylhydrazyl (DPPH) có khả năng tạo ra các gốc

tự do bền trong dung dịch ethanol bão hoà Khi cho các chất thử nghiệm vào hỗn hợp này,nếu chất có khả năng làm trung hoà hoặc bao vây các gốc tự do sẽ làm giảm cường độ hấpthụ ánh sáng của các gốc tự do DPPH Hoạt tính chống oxy hoá được đánh giá thông quagiá trị hấp thụ ánh sáng của dịch thí nghiệm so với đối chứng khi đọc trên máy Elisa ở bướcsóng 515 nm – 517 nm [35] Phương pháp này thực hiện nhanh chóng, đơn giản, chính xác

và có thể đo hoạt tính chống oxy hóa của các hợp chất khác nhau

b Phương pháp dựa vào năng lượng khử

Năng lực khử được xác định tương tự theo các phương pháp được sử dụng của nhómnghiên cứu Oyaizu và cộng sự năm 1986, nhóm nghiên cứu Nguyễn Xuân Duy và cộng sự năm

2013 Nguyên tắc: Sử dụng phương pháp khử kali ferricyanide để xác định quá trình khử, phản

đó thêm 0,5 mL TCA 10 % và 2 mL nước cất, cuối c ng 0,4 mL AlCl3 0,1 % được thêm vào

Độ hấp thu quang học được xác định tại bước sóng 700 nm Độ hấp thu quang học càng cao

học lên 0,50 [36] [37]

c Phương pháp xác định khả năng chống oxy hóa trên mô hình dầu - nước

Hệ nhũ tương dầu -glucosidase nước được chuẩn bị gồm: 10 % dầu Olive, 85 % nước và 0,5 % Tween

40 Hỗn hợp được đồng hóa ở tốc độ 10 000 vòng/phút trong 5 phút Lấy chính xác 2 mL dịchchiết được trộn đều với 10 mL hệ nhũ tương dầu – nước chứa trong ống nhựa 50 mL có nắp đậy,

lượng hydroperoxide được xác định trên dịch chiết chất b o theo phương pháp của Bligh and Dyervào năm 1959 Hàm lượng hydroperoxide được xác định theo phương pháp của Richards vàHultin vào năm 2002 Kết quả tính toán hàm lượng hydroperoxide từ đường chuẩn Cumenehydroperoxide (HPO) nồng độ từ 0-glucosidase120 nmol/mL [36] [38] [39]

Ngoài ra, có một số phương pháp xác định khả năng kháng oxy hóa khác [35]:

-glucosidase Phương pháp TEAC Trolox equivalent antioxidant capacity : Xác định hoạt tính kháng oxyhóa so với khả năng chống oxy hóa của Trolox

-glucosidase Phương pháp ORAC oxygen radical absorbance capacity : Xác định khả năng hấp thụ gốc

tự do chứa oxy hoạt động

-glucosidase Phương pháp TRAP (total radical-glucosidasetrapping antioxidant potential : Khả năng kháng oxy hóa bằng cách bẫy các gốc tự do

-glucosidase Phương pháp FRAP ferric reducing-glucosidaseantioxidant power : Lực kháng oxy hóa bằng phương pháp khử sắt

-glucosidase Phương pháp Conjugated Diene: Khảo sát nối đôi liên hợp

Các phương pháp trên có tính đặc hiệu cao, tuy nhiên, phương pháp phức tạp, khóthực hiện, các hóa chất sử dụng đắt tiền, khó cung cấp, đồng thời phòng thí nghiệm khôngđược trang bị đầy đủ các thiết bị phục vụ phân tích

1.2.3.7 Phương pháp thử độc tính

Thử độc tính để biết được nguy cơ gây tác động xấu đến sức khỏe con người khi tiếpxúc, ảnh hưởng xấu đến môi trường cũng như các sinh vật nơi sử dụng các sản phẩm Giúpthiết lập liều lượng trong thử nghiệm lâm sàng để cung cấp thông tin ban

đầu về mẫu thử nghiệm Các phương pháp được sử dụng phổ biến đối với nghiên cứu trênđối tượng thảo dược như sau:

-glucosidase Thử độc tính bất thường: Độc tính bất thường hay còn gọi là độc tính cấp là biểu thị sự tácđộng xấu hay sự tử vong của sinh vật ngay sau khi tiếp xúc với chất độc Độc tính cấp xảy

ra do tiếp xúc với đơn hoặc đa yếu tố trong một thời gian ngắn và tác động cấp tính là tácđộng xảy ra trong vòng một vài ngày hoặc thậm chí là một vài giờ đầu tiên sau khi tiếp xúcvới chất độc, thông thường thời gian gây độc cấp tính phải ít hơn hai tuần Mặt khác, vìnhững tác động mãn tính chỉ xuất hiện sau khi tiếp xúc lặp lại với một chất độc, trong nhiềutrường hợp cần phải tiếp xúc liên tục hàng tháng Trong khi đó, tác nhân gây độc tính cấpđược hấp thụ nhanh chóng vào cơ thể và sản sinh ra ngay lập tức các hiệu ứng độc cho cơthể, song cũng có trường hợp, tiếp xúc cấp tính bị suy giảm độc tính Thử độc tính bấtthường là một phương pháp để xác định tiêu chuẩn của một dạng thuốc nào đó Đó là tiêuchuẩn về độ an toàn của thuốc Trong thử độc tính bất thường quy định rõ: Động vật thử là

gì, tình trạng con vật, cân nặng động vật, số con, liều thử, đường d ng, thời gian theo dõi,không có biểu hiện bệnh l và phải không có con vật nào chết Mục đích: Cung cấp thông tincho việc xếp loại mức độ độc của thuốc, dự đoán triệu chứng và dự kiến biện pháp điều trịngộ độc cấp; thiết lập mức liều cho những thử nghiệm độc tính và tác dụng cũng như phạm

vi an toàn của thuốc nghiên cứu tiếp theo [40] [41]

-glucosidase Thử độc tính bán trường diễn: Thử độc tính dài ngày chỉ được tiến hành sau khi đã có thôngtin về độc tính cấp trên động vật và mẫu thử được dự định sử dụng hoặc tiếp xúc dài ngàytrên người Thử độc tính dài ngày nhằm xác định khả năng dung nạp của động vật thínghiệm khi d ng mẫu thử nhiều lần Thông tin cần xác định có những biểu hiện độc tính saukhi d ng dài ngày, bao gồm:

sống có thể quan sát được trên động vật thí nghiệm;

Quy trình thử độc tính bất thường được thực hiện theo hướng dẫn tại phụ lục 13.5

1.2.3.8 Phương pháp xác định khả năng không gây độc đối với tế bào người

Việc phát triển một loại thảo dược hay thực phẩm mới từ tưởng ban đầu đến khi

đưa ra thành phẩm là một quá trình phức tạp có thể mất 12 ÷ 15 năm và tốn kém Ý tưởngcho một mục tiêu có thể đến từ nhiều nguồn khác nhau bao gồm nghiên cứu học thuật vàlâm sàng và từ lĩnh vực thương mại Xây dựng cơ sở bằng chứng hỗ trợ trước khi chọn mụctiêu cho một chương trình khám phá có thể mất nhiều năm Khi đã chọn được mục tiêu,ngành công nghiệp dược phẩm và gần đây là một số trung tâm học thuật đã đưa ra một sốquy trình ban đầu để xác định các phân tử có các đặc tính phù hợp để tạo ra các loại sảnphẩm được chấp nhận Đánh giá này sẽ xác định mục tiêu ban đầu, thông qua phát triển thửnghiệm, sàng lọc thông lượng cao, tối ưu hóa và cuối cùng là lựa chọn để phát triển lâmsàng [42].

Phương pháp xác định khả năng không gây độc đối với tế bào người nhằm đánh giákhả năng không gây độc của sản phẩm lên tế bào người khi sử dụng sản phẩm, phươngpháp thực hiện trên HEK-glucosidase293 -glucosidase tế bào thận gốc phôi ở người (human embryonic kidneycells)

1.2.4 Tổng quan về quy trình sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe

1.2.4.1 Tổng quan về thực phẩm bảo vệ sức khỏe

a Khái niệm thực phẩm bảo vệ sức khỏe

Căn cứ vào khoản 1, điều 3, Nghị định 15/2018/NĐ-glucosidaseCP quy định: “Thực phẩm bảo vệsức khỏe (Health Supplement, Dietary Supplement) là những sản phẩm được d ng để bổsung thêm vào chế độ ăn uống hàng ngày nhằm duy trì, tăng cường, cải thiện các chức năngcủa cơ thể con người, giảm nguy cơ mắc bệnh”

Thực phẩm bảo vệ sức khỏe chứa một, nhiều hoặc hỗn hợp các chất sau:

-glucosidase Vitamin, khoáng chất, acid amin, acid b o, enzyme, probiotic và chất có hoạt tính sinh học khác;

-glucosidase Chất có nguồn gốc tự nhiên, bao gồm động vật, khoáng vật và thực vật dưới dạng chiết xuất, phân lập, cô đặc hay chuyển hóa;

-glucosidase Các nguồn tổng hợp của những thành phần được đề cập trên

Thực phẩm bảo vệ sức khỏe được trình bày ở dạng chế biến như viên nang, viên hoàn,viên nén, chế phẩm dạng cốm, bột, lỏng và các dạng bào chế khác, được phân liều thành cácđơn vị liều nhỏ để sử dụng

b Lợi ích của thực phẩm bảo vệ sức khỏe

-glucosidase Bổ sung nhanh chóng chất dinh dưỡng và các chất có tác dụng chức năng mà cơ

thể không được cung cấp đầy đủ trong chế độ ăn uống hàng ngày

-glucosidase Có thể tạm thời thay thế bữa ăn khi không có điều kiện ăn uống bình thường như khi ở môi trường thiếu thốn thực phẩm hoặc không thể ăn được vì l do bệnh tật

-glucosidase Các chế phẩm đều ở dạng tinh chế rất tiện lợi, dễ sử dụng và bảo quản

-glucosidase Có nhiều sản phẩm để chọn lựa ph hợp với tình trạng cơ thể từng người

-glucosidase Mua và d ng dễ dàng không cần phải có thầy thuốc khám bệnh kê toa

-glucosidase Khi sử dụng thực phẩm chức năng, người sử dụng sẽ có thức chăm lo cho sức khoẻ, thayđổi thói quen để có chế độ ăn uống hợp l và lối sống lành mạnh có lợi cho sức khoẻ hơn

-glucosidase Nguồn cung cấp dồi dào thường xuyên, mạng lưới rộng khắp

1.2.4.2 Tổng quan nguyên liệu chính sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe của đề tài

-glucosidase Bột rễ mật nhân: Sản xuất cao chiết để sử dụng trực tiếp và bổ sung vào dây chuyền sảnxuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe

-glucosidase Nụ vối: Có tác dụng bình ổn đường huyết lâu dài, hỗ trợ giảm mỡ máu, chống oxy hóa, trịbệnh đái tháo đường Các nghiên cứu trước đây cũng đã chứng minh nụ vối có nhiều tácdụng sinh học như:

-glucosidase Kháng viêm [43];

-glucosidase Kháng khuẩn [44];

-glucosidase Kháng ung thư [45] [46];

-glucosidase Tăng cường và kích thích tiêu hóa [46]

Rau má: Là loại rau tương đối phổ biến, có nhiều hoạt tính sinh học đáng qu đối vớisức khỏe con người, thường thu hái cả lá và dây Rau má được d ng như thực phẩm và thuốctrong dân gian, rau má có vị hơi đắng, ngọt, tính hơi mát, có tác dụng thanh nhiệt giải độc,tán ứ chỉ thống, lương huyết sinh tân, lợi niệu Rau má thường d ng để làm thuốc bổdưỡng, sát trùng, chữa thổ huyết, tả l , khí hư, bạch đới, mụn nhọt, rôm sẩy Trong rau má

có alkaloid là hydrocotulin và các glycosid, asiaticoside và centellosid, có tác dụng tới các

mô liên kết, giúp cho các mô tái tạo nhanh chóng, do đó làm các vết thương mau lành và lên

da non [47]

Vào năm 2009, nhóm nghiên cứu Frederico Pittella và cộng sự đã công bố rằng dịchchiết rau má có hoạt động đáng kể chống lại khối u ác tính ở chuột (B16F1), ung thư vú ởngười (MDA MB-glucosidase231) và các dòng tế bào chuột glioma (C6), với các giá trị

IC50 lần lượt 698 g/mL, 648 g/mL và 1000 g/mL [48].

1.2.4.3 Quy trình sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe

Thực phẩm nói chung và thực phẩm bảo vệ sức khỏe nói riêng để được công nhận vàđược thương mại hóa bắt buộc phải tuân thủ quy định về chất lượng của sản phẩm thựcphẩm theo Luật an toàn thực phẩm 55/2010/QH12 [49]; Nghị định số 15 năm 2018 về việcquy định chi tiết thi hành một số điều của Luật an toàn thực phẩm [50] Bên cạnh đó, hàmlượng chất bổ sung vào sản phẩm phải tuân theo quy định của Thông tư số 43/2014/TT-glucosidaseBYT -glucosidase quy định về quản l thực phẩm chức năng [51]; Thông tư 18/2019/TT-glucosidaseBYT – hướngdẫn thực hành sản xuất tốt GMP trong sản xuất, kinh doanh thực phẩm bảo vệ sức khỏe[52] Vì vậy, quy trình sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe về cơ bản bao gồm các nội dungsau đây:

-glucosidase Khảo sát hàm lượng bổ sung hoạt chất có hoạt tính sinh học;

-glucosidase Xây dựng quy trình công nghệ sản xuất ;

-glucosidase Kiểm tra chất lượng sản phẩm;

-glucosidase Xây dựng dự thảo công bố sản phẩm trình cơ quan quản l nhà nước chuyên ngành thẩm định và phê duyệt

a Khảo sát hàm lượng bổ sung hợp chất có hoạt tính sinh học

Việc bổ sung một lượng hợp chất có hoạt tính sinh học được chiết xuất từ thiên nhiênvào thực phẩm sẽ ảnh hưởng đến chỉ tiêu chất lượng sản phẩm thành phần hóa học, cảmquan v v… , đặc biệt, với mật nhân có vị đắng hậu vị rất khó chịu, phương pháp chế biếnnhằm giảm thiểu sự hao hụt, biến tính hoạt chất Trên cơ sở khảo sát hàm lượng hợp chất cóhoạt tính cần bổ sung, tiến hành xây dựng quy trình sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe

b Xây dựng quy trình sản xuất sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe

Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất của một số sản phẩm thực phẩm bảo vệ sứckhỏe quy mô phòng thí nghiệm với nguyên liệu chính được nêu ở mục 1.2.4.2 và một sốnguyên liệu bổ sung khác

c Kiểm tra chất lượng sản phẩm

Kiểm tra chất lượng sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe nhằm đảm bảo sản phẩmđạt các chỉ tiêu chất lượng với liều lượng chất bổ sung đã xác định, đánh giá cảm quan thịhiếu người d ng, đồng thời, phải đảm bảo các chỉ tiêu an toàn thực phẩm

theo quy định hiện hành.

Đây là cơ sở để nhà sản xuất xây dựng bản công bố chất lượng sản phẩm thực phẩmbảo vệ sức khỏe và là một trong các tiêu chí quan trọng để đưa sản phẩm thực phẩm bảo vệsức khỏe ra thị trường

d Công bố chất lượng sản phẩm

Trường hợp công bố sản phẩm tự sản xuất, căn cứ điều 10, Thông tư 43/2014/TT-glucosidase

BYT, cá nhân, tổ chức cần đảm bảo các yêu cầu sau:

-glucosidase Thành phần chính tạo nên công dụng của sản phẩm phải được liệt kê trước c ng tên đầy đủ

và hàm lượng Các thành phần khác được liệt kê tiếp sau theo thứ tự giảm dần về khốilượng;

-glucosidase Hàm lượng của vitamin, khoáng chất có trong thực phẩm tính theo liều khuyên d ng hằngngày của nhà sản xuất phải đạt được tối thiểu 15 % RNI;

-glucosidase Hàm lượng tối đa của vitamin, khoáng chất có trong thực phẩm tính theo liều khuyên dùnghằng ngày của nhà sản xuất không được vượt quá ngưỡng dung nạp tối đa của các vitamin

và khoáng chất được quy định;

-glucosidase Hàm lượng vitamin và khoáng chất có trong sản phẩm phải được ghi trên nhãn bằng số vàphải được công bố dưới dạng tỷ lệ phần trăm % tính theo RNI, dựa trên liều khuyên d nghằng ngày của sản phẩm hoặc dựa trên một đơn vị sử dụng (serving size)

Trường hợp Việt Nam chưa có mức RNI và ngưỡng dung nạp tối đa thì áp dụng theoquy định của CODEX hoặc các tổ chức quốc tế có liên quan

-glucosidase Công bố khuyến cáo về sức khỏe Health claims :

của thành phần cấu tạo có công dụng chính hoặc công bố công dụng hợp thành của nhữngthành phần cấu tạo khi có bằng chứng khoa học chứng minh và không công bố công dụngtheo cách liệt kê công dụng của các thành phần;

thống nhất và ph hợp với các tài liệu tại hồ sơ;

khoa học chứng minh thì không được công bố công dụng sản phẩm;

liệu khoa học khuyến cáo thì được công bố công dụng nhưng phải chỉ ra đối tượng, liều d

ng ph hợp;

chứng minh về công dụng của thành phần đó c ng khuyến cáo liều d ng khi công bố

-glucosidase Đối tượng sử dụng:

quyền chấp nhận thông qua Bản xác nhận công bố ph hợp quy định an toàn thực phẩm;

1.3 Tổng quan về tình hình nghiên cứu mật nhân trong và ngoài nước

Từ nhiều năm trước, các kết quả nghiên cứu về cây mật nhân ở nước ta và trên thếgiới đã được công bố, đặc biệt là rễ của chúng, các nghiên cứu chủ yếu đề cập đến thànhphần hóa học của các chất phân lập được, khảo sát hoạt tính sinh học của dịch chiết và một

số ứng dụng trong dược phẩm, thực phẩm có lợi cho sức khỏe

1.3.1 Nghiên cứu về thành phần hóa học

Đã có nhiều công trình nghiên cứu trong nước và trên thế giới về phân lập, xác địnhthành phần hóa học của nhiều hợp chất đã được công bố từ những năm 1960 của thế kỷtrước, có thể nêu một số kết quả nghiên cứu sau:

Năm 1968, nhóm nghiên cứu Lê Văn Thới và Nguyễn Ngọc Sương đã phân lập đượchợp chất β-glucosidasesitosterol, campesterol, 2,6-glucosidase dimetoxybenzoquinon và một số hợp chất có vịđắng là eurycomalacton từ cao chiết ête dầu trích từ vỏ và lá cây mật nhân bằng kỹ thuật sắc

ký cột hấp phụ trên alumin [53]

Năm 1982, nhóm nghiên cứu thuộc Trường Đại học Y Dược Hiroshima, Nhật đãphân lập được hai hợp chất quassinoid có số oxy hoá cao có tên là eurycomanone vàeurycomanol từ rễ cây mật nhân có nguồn gốc Indonesia [54]

Năm 1986, nhóm nghiên cứu của K.L.Chan và cộng sự đã tìm thấy hợp chất mớithuộc nhóm quassinoid là 3,4-glucosidasedihyroeurycomalacton, 5,6-glucosidasedehyroeurycomalacton, 6-glucosidasehydroxy-glucosidase5,6-glucosidasedehydroeurycomalacton và nhóm alkaloid có tên là 10-glucosidasehydroxycantin-glucosidase 6-glucosidaseon,tinh thể màu vàng từ cao ête dầu trích từ rễ cây mật nhân Ngoài ra, từ cao chloroform của

rễ cây cũng phát hiện được một hợp chất coumarin là scopoletin [55]

Năm 1989, nhóm nghiên cứu của K L Chan và cộng sự đã phân lập được mộtquassinoid glycoside có tên là eurycomanol-glucosidase2-glucosidaseO-glucosidase  -glucosidaseD-glucosidaseglucopyranosid trích từ cao n-glucosidasebutanol của rễ cây mật nhân [56].

Năm 1982, nhóm nghiên cứu của Nguyễn Ngọc Sương và công sự đã phân lập

được hai hợp chất laurycolactone A và laurycolactone B, chúng là các quassinoid có bộxương cơ bản C18 [57]

Tiếp theo vào năm 1991, nhóm nghiên cứu của K L Chan và cộng sự đã phân lậpđược từ hợp chất 13β,18-glucosidasedihydroeurycomanol, kết tinh trong methanol từ dịch trích từ rễcây với ête dầu [58]

Nhóm Kadono và công sự đã công bố kết quả nghiên cứu các thành phần gây độc tếbào và chống sốt r t của rễ, đã phân lập được bốn alkaloid thuộc nhóm canthin-glucosidase 6-glucosidaseone đó là9-glucosidasemethoxycanthin-glucosidase6-glucosidaseone, 9-glucosidasemethoxycanthin-glucosidase6-glucosidaseone-glucosidaseN-glucosidaseoxide, 9-glucosidase hydroxycanthin-glucosidase6-glucosidaseone và 9-glucosidasehydroxycanthin-glucosidase6-glucosidaseone-glucosidaseN-glucosidaseoxide và -glucosidasecarboline-glucosidase1-glucosidasepropionic acid vào năm 1991 [59]

Cũng vào năm 1991, nhóm nghiên cứu của H Tada và cộng sự đã phân lập được hợpchất paskbumin A eurycomanon và hai hợp chất mới cũng có khung sườn quassinoid làpasakbumin B, pasakbumin C từ cao chiết methanol [60] Nhóm nghiên cứu thuộc trườngđại học y dược, Tokyo -glucosidase Nhật trong quá trình nghiên cứu hoạt tính sinh học của cây mậtnhân đã phân lập được hai hợp chất mới với khung squallan Đây đồng thời là hai đồng phânlập thể của nhau, một là eurylen, một là teurylen, cả hai đều có dạng tinh thể không màu, có

Năm 2015, nhóm nghiên cứu Lê Thị Huyền và cộng sự đã phân lập được 3 chất

thuộc nhóm quassinoid từ dịch chiết methanol của rễ cây mật nhân: Pasakbumin-glucosidaseC, 13α,21-glucosidase

epoxyeurycomanone and eurylactone A [64]

Năm 2017, nhóm nghiên cứu Nguyễn Hữu Tùng và cộng sự đã tìm ra một

quassinoid glycoside mới và thành phần hoạt chất tiềm năng eurycomanone từ E longifolia trong điều trị bệnh bạch cầu từ rễ cây mật nhân ở Malaysia [65].