Xây dựng quy trình công nghệ chiết tách, xác định thành phần hóa học của rễ cây mật nhân (eurycoma longifolia Jack) ở khu vực miền Trung Tây Nguyên và ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm.

Xây dựng quy trình công nghệ chiết tách, xác định thành phần hóa học của rễ cây mật nhân (eurycoma longifolia Jack) ở khu vực miền Trung Tây Nguyên và ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm.Xây dựng quy trình công nghệ chiết tách, xác định thành phần hóa học của rễ cây mật nhân (eurycoma longifolia Jack) ở khu vực miền Trung Tây Nguyên và ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm.Xây dựng quy trình công nghệ chiết tách, xác định thành phần hóa học của rễ cây mật nhân (eurycoma longifolia Jack) ở khu vực miền Trung Tây Nguyên và ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm.Xây dựng quy trình công nghệ chiết tách, xác định thành phần hóa học của rễ cây mật nhân (eurycoma longifolia Jack) ở khu vực miền Trung Tây Nguyên và ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm.Xây dựng quy trình công nghệ chiết tách, xác định thành phần hóa học của rễ cây mật nhân (eurycoma longifolia Jack) ở khu vực miền Trung Tây Nguyên và ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm.

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT

VÕ KHÁNH HÀ

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ CHIẾT TÁCH, XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA

RỄ CÂY MẬT NHÂN (EURYCOMA LONGIFOLIA JACK)

Ở MIẾN TRUNG – TÂY NGUYÊN VÀ ỨNG DỤNG TRONG

CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT

ĐÀ NẴNG, NĂM 2021

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT

VÕ KHÁNH HÀ

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ CHIẾT TÁCH, XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA

RỄ CÂY MẬT NHÂN (EURYCOMA LONGIFOLIA JACK)

Ở MIẾN TRUNG – TÂY NGUYÊN VÀ ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM

Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm

Mã số: 9.54.01.01

ĐÀ NẴNG, NĂM 2021

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác Việc tham khảo các nguồn tài liệu đã được trích dẫn và ghi nguồn tài liệu tham khảo đúng quy định.

Người cam đoan

Võ Khánh Hà

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN TRANG TÓM

TẮT MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC

BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Đối tượng, phạm vi nghiên cứu 2

4 Phương pháp nghiên cứu 2

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 4

6 Bố cục của luận án 5

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 6

1.1 Tổng quan về cây mật nhân 6

1.1.1 Đặc điểm sinh thái, phân bố 6

1.1.2 Thành phần hóa học của cây mật nhân 7

1.1.3 Tác dụng dược lý của cây mật nhân và ứng dụng trong dân gian 9

1.2 Tổng quan về các phương pháp nghiên cứu 12

1.2.1 Tổng quan về phương pháp chiết 12

1.2.2 Tổng quan về phương pháp phân lập và xác định cấu trúc hóa học 15

1.2.3 Tổng quan về phương pháp thăm dò hoạt tính sinh học 16

1.2.4 Tổng quan về quy trình sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe 23

1.3 Tổng quan về tình hình nghiên cứu mật nhân trong và ngoài nước 27

1.3.1 Nghiên cứu về thành phần hóa học 27

1.3.2 Nghiên cứu về hoạt tính sinh học 31

1.3.3 Nghiên cứu về phương pháp chiết 32

1.3.4 Nghiên cứu về ứng dụng mật nhân trong thực phẩm 33

1.4 Đánh giá tình hình nghiên cứu cây mật nhân 36

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39

2.1 Nguyên liệu 39

2.1.1 Thu hái và định danh mẫu rễ cây mật nhân 39

2.1.2 Xử lý nguyên liệu 39

2.2 Hóa chất, vật tư, thiết bị, dụng cụ 39

2.2.1 Hóa chất, vật tư 40

2.2.2 Thiết bị, dụng cụ 40

2.3 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát 41

2.4 Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm 42

2.4.1 Khảo sát, lựa chọn nguyên liệu 42

2.4.2 Phương pháp phân lập, xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất từ rễ cây mật nhân 43

2.4.3 Phương pháp xây dựng quy trình chiết rễ mật nhân 48

2.4.4 Khảo sát hoạt tính sinh học của dịch chiết rễ cây mật nhân 54

2.4.5 Nghiên cứu ứng dụng bổ sung mật nhân trong sản xuất một số thực phẩm bảo vệ sức khỏe 55

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 60

3.1 Định danh mẫu thực vật và lựa chọn nguyên liệu nghiên cứu 60

3.1.1 Kết quả định danh mẫu thực vật 60

3.1.2 Đánh giá, lựa chọn vùng nguyên liệu nghiên cứu 60

3.2 Kết quả phân lập và xác định cấu trúc hóa học 65

3.2.1 Kết quả phân lập, xác định cấu trúc các hợp chất nhóm alkaloid 65

3.2.2 Kết quả phân lập, định danh các hợp chất không thuộc nhóm alkaloid 71

3.3 Xây dựng quy trình chiết rễ cây mật nhân 77

3.3.1 Xây dựng quy trình chiết rễ cây mật nhân bằng phương pháp chưng ninh hồi lưu trong dung môi ethanol 80 % 77 3.3.2 Xây dựng quy trình chiết rễ cây mật nhân bằng phương pháp chưng ninh hồi lưu trong nước 79

3.4 Kết quả thử hoạt tính sinh học của dịch chiết rễ cây mật nhân 85

3.4.1 Kết quả thử khả năng gây độc tế bào ung thư của dịch chiết nước và dịch chiết ethanol 80 % từ rễ cây mật nhân 85 3.4.2 Kết quả thử khả năng kháng viêm thông qua khảo sát cytokine tiền viêm và cytokine gây viêm 88

3.4.3 Kết quả thử khả năng ức chế đại thực bào sản sinh NO 90

3.4.4 Khả năng ức chế enzyme -glucosidaseglucosidase 91

3.4.5 Kết quả thử khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của dịch chiết nước 91

3.4.6 Kết quả thử khả năng kháng oxy hóa của dịch chiết nước 93

3.4.7 Kết quả thử độc tính bất thường của dịch chiết nước rễ cây mật nhân 94

3.4.8 Kết quả thử khả năng không gây độc đối với tế bào thận gốc phôi ở người HEK-glucosidase293 94

3.5 Nghiên cứu ứng dụng sản xuất một số sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe 96

3.5.1 Sản phẩm cao chiết mật nhân 96

3.5.2 Sản phẩm trà thảo mộc mật nhân 100

3.5.3 Nghiên cứu sản xuất sản phẩm nước rau má mật nhân 105

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 112

CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ TÀI LIỆU THAM

KHẢO

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

EU Liên minh châu Âu The European Union

QCVN Quy chuẩn kỹ thuật Quốc gia

DĐVN Dược điển Việt Nam

TCVN Tiêu chuẩn kỹ thuật Việt Nam

MKN7 Ung thư dạ dày ở người Human Gastric Carcinoma SW626 Ung thư buồng trứng ở người Human Ovarian Adenocarcinoma

HL Ung thư bạch cầu cấp tính

leukemic ở người

Human Acute Leukemia

SK-glucosidaseMel-glucosidase2 Ung thư da người Human Malignant Melanoma NIH/3T3 Nguyên bào sợi của gốc phôi chuột Mouse Embryo Fibroblast

Lu Ung thư phổi ở người Human Lung Carcinoma MCF-glucosidase7 Ung thư vú ở người Human Breast Carcinoma

IC 50 Nồng độ ức chế tối đa 50 % Half Maximal Inhibitory

Concentration

IL Interleukine

MBC Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu Minimum Bactericidal

Concentration MIC Nồng độ ức chế tối thiểu Minimal Inhibited Concentration NCI Viện Ung thư quốc gia Hoa Kỳ National Cancer Institute

LPS Lipopolysaccharide

TNF Yếu tố hoại tử khối u alpha Tumor Necrosis Factor

RNI Nhu cầu dinh dưỡng khuyến nghị Recommended Nutrition Intakes CODEX Cơ sở dữ liệu về an toàn thực phẩm Codex Alimentarius

DPPH 2,2-glucosidaseDiphenyl-glucosidase1-glucosidasepicrylhydrazyl

NMR Cộng hưởng từ hạt nhân Nuclear Magnetic Resonance

HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao High-glucosidaseperformance liquid

chromatography

IR Phổ hồng ngoại Infrared spectroscopy

TLC Sắc ký lớp mỏng Thin Layer Chromatography NOESY Phổ hiệu ứng hạt nhân Overhauser Nuclear Overhauser Effect

Spectroscopy DEPT Phổ DEPT Distortionless Enhancement by

Polarization Transfer COSY Phổ tương quan proton – Proton Correlation spectroscopy HSQC Phổ tương tác dị nhân đơn liên kết Heteronuclear single quantum

coherence spectroscopy HMBC Phổ tương tác dị nhân đa liên kết Heteronuclear Multiple Bond

Correlation QPA Phân tích chương trình chất lượng Quality Program Analysis ESI Ion hóa đầu phun điện tử Electrospray Ionization GMP Thực hành sản xuất tốt Good Manufacturing Practice HMP Pectin methoxyl hóa cao High Methoxyl Pectin

ATVSTP An toàn vệ sinh thực phẩm

SKC Sắc ký cột

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Danh mục các hợp chất được phân lập từ cây mật nhân 30 Bảng 1.2 Một số sản phẩm mật nhân được bán trên thị trường ở một số nước trên thế giới 34 Bảng 1.3 Một số sản phẩm và liều lượng mật nhân sử dụng tại EU 34 Bảng 2.1 Khoảng biến thiên các yếu tố thực nghiệm 51

Bảng 2.3 Bố trí thí nghiệm khảo sát yếu tố nhiệt độ 52 Bảng 2.4 Bố trí thí nghiệm khảo sát yếu tố tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu 52 Bảng 2.5 Bố trí thí nghiệm khảo sát yếu tố thời gian chiết 53

Bảng 3.3 Khả năng gây độc tế bào ung thư của dịch chiết ethanol 80 % rễ cây mật nhân tại huyện

Phước Sơn, tỉnh Quảng Nam

62 Bảng 3.4 Giá trị IC 50 của dịch chiết rễ mật nhân và vitamin C 64 Bảng 3.5 Số liệu phổ 1 H-glucosidase và 13 C-glucosidaseNMR của chất 1 65 Bảng 3.6 Số liệu phổ 1 H-glucosidase và 13 C-glucosidaseNMR của chất 2 67 Bảng 3.7 Số liệu phổ 1 H-glucosidase và 13 C-glucosidaseNMR của chất 3 68 Bảng 3.8 Số liệu phổ 1 H-glucosidase và 13 C-glucosidaseNMR của chất 4 70 Bảng 3.9 Số liệu phổ 1 H-glucosidase và 13 C-glucosidaseNMR của chất 5 71 Bảng 3.10 Số liệu phổ 1 H-glucosidase và 13 C-glucosidaseNMR của chất 6 và chất 7 74 Bảng 3.11 Bảng tổng hợp kết quả phân lập và xác định cấu trúc hóa học các chất từ rễ cây mật nhân 76 Bảng 3.12 Khả năng gây độc tế bào ung thư của dịch chiết ethanol 80 % rễ cây mật nhân 86 Bảng 3.13 Khả năng gây độc tế bào ung thư của dịch chiết nước rễ cây mật nhân 87 Bảng 3.14 Khả năng ức chế sản sinh NO của dịch chiết nước ở các nồng độ khác nhau 90 Bảng 3.15 Khả năng ức chế enzyme -glucosidaseglucosidase của dịch chiết nước 91 Bảng 3.16 Giá trị IC 50 kháng vi sinh vật kiểm định của dịch chiết nước 92 Bảng 3.17 Kết quả đo ABS đối với dịch chiết rễ cây mật nhân và acid ascorbic 93 Bảng 3.18 Bảng giá trị IC 50 của dịch chiết rễ cây mật nhân và acid ascorbic 93 Bảng 3.19 Kết quả thử độc tính bất thường của dịch chiết nước rễ mật nhân 94 Bảng 3.20 Khả năng gây độc tế bào HEK-glucosidase293 của dịch chiết rễ cây mật nhân 94 Bảng 3.21 Kết quả các chỉ tiêu chất lượng cao chiết mật nhân 97 Bảng 3.22 Kết quả định tính một số hợp chất thiên nhiên trong cao chiết mật nhân 98 Bảng 3.23 Kết quả kiểm tra an toàn vệ sinh thực phẩm cao mật nhân 99

Bảng 3.25 Kết quả kiểm tra chất lượng mẫu trà thảo mộc mật nhân 104 Bảng 3.26 Chiều cao cột lắng qua mỗi ngày theo từng nồng độ pectin 105 Bảng 3.27 Điểm đánh giá cảm quan thị hiếu người tiêu dùng 109

Bảng 3.28 Kết quả kiểm tra chất lượng mẫu nước rau má mật nhân 110

DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Hình ảnh cây mật nhân tại vùng núi Gia Lai 6

Hình 2.4 Sơ đồ phân lập các chất không thuộc nhóm alkaloid 47

Hình 3.2 Khả năng bắt gốc tự do DPPH của vitamin C, dịch chiết rễ mật nhân Gia Lai và dịch chiết

rễ mật nhân Quảng Nam

63 Hình 3.3 Đường xu hướng của khả năng bắt gốc tự do DPPH của vitamin C, dịch chiết rễ mật nhân

Gia Lai và dịch chiết rễ mật nhân Quảng Nam.

63

Hình 3.4 Sự ảnh hưởng đồng thời của nhiệt độ chiết và thời gian chiết đến hiệu suất chiết rễ cây mật

nhân trong dung môi ethanol 80 %

79 Hình 3.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hàm lượng EL4 80 Hình 3.6 Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu đến hàm lượng EL4 81 Hình 3.7 Ảnh hưởng của thời gian chiết đến hàm lượng EL4 82 Hình 3.8 Sơ đồ quy trình chiết mật nhân trong ethanol 84 Hình 3.9 Sơ đồ quy trình chiết mật nhân trong nước 85 Hình 3.10 Khả năng ức chế sản sinh TNF-glucosidaseanpha của dịch chiết nước tại các nồng độ khác nhau 88 Hình 3.11 Khả năng ức chế sản sinh IL-glucosidase6 của dịch chiết nước tại các nồng độ khác nhau 89 Hình 3.12 Khả năng ức chế sản sinh IL-glucosidase8 ở dịch chiết nước tại các nồng độ khác nhau 89 Hình 3.13 Sơ đồ quy trình sản xuất cao mật nhân 96 Hình 3.14 Sơ đồ quy trình sản xuất trà thảo mộc mật nhân 102 Hình 3.15 Biểu đồ mạng nhện thể hiện mức độ ưa thích đối với sản phẩm trà thảo mộc mật nhân 103 Hình 3.16 Sự biến đổi chiều cao cột lắng theo thời gian 106 Hình 3.17 Quy trình công nghệ sản xuất nước rau má mật nhân 108 Hình 3.18 Biểu đồ mạng nhện thể hiện mức độ ưa thích đối với sản phẩm nước rau má mật nhân 109

d ng để khôi phục năng lượng và sinh khí, tăng cường lưu thông máu và có vai trò tốt đối với phụ nữ sau khi sinh con Bên cạnh đó, chiết xuất này còn chứa các hợp chất có hoạt tính chống khối u và chống k sinh tr ng, chống lo t Trong đó, được biết đến nhiều nhất là tác dụng làm tăng cường lượng hormone nội sinh testosterol ở nam giới.

Ở nước ta, hiện nay, mật nhân không những được sử dụng trong các bài thuốc cổ truyền mà còn có một số công trình nghiên cứu khoa học được công bố, khá nhiều hợp chất có giá trị được tìm thấy và đã ứng dụng mật nhân vào sản xuất một số sản phẩm Tại khu vực miền Trung -glucosidase Tây Nguyên, đặc biệt là vùng núi các tỉnh như Gia Lai, Quảng Nam, Huế, cây mật nhân phát triển rất nhiều, người dân khai thác và sử dụng chúng như một loại thuốc bổ rất phổ biến, đặc biệt là rễ Tuy nhiên, các nghiên cứu được công bố trên đối tượng tại những địa phương này không mang tính hệ thống, chưa có công trình nghiên cứu nào công bố chi tiết và đầy đủ về phân lập, ứng dụng những hoạt tính sinh học quý có trong rễ mật nhân để làm cơ sở ứng dụng trong công nghệ sản xuất sản phẩm thực phẩm.

Ngoài ra, ứng dụng mật nhân chủ yếu trong lĩnh vực dược phẩm, trong khi đó, ứng dụng bổ sung mật nhân vào sản xuất thực phẩm chưa nhiều và đa dạng, đặc biệt, chưa có nhiều sản phẩm nghiên cứu làm giảm vị đắng khó chịu khi bổ sung mật nhân

để tạo thành sản phẩm có giá trị dược lý và có giá trị cảm quan.

Với những tác dụng to lớn như trên của mật nhân, một loại dược liệu qu và tình hình thực trạng nghiên cứu về mật nhân tại miền Trung -glucosidase Tây Nguyên hiện nay, đồng thời nhằm đa dạng hóa sản phẩm thực phẩm, nâng cao giá trị kinh tế và khuyến khích công tác bảo tồn nguồn nguyên liệu thiên nhiên này của địa phương, chúng tôi tiến hành nghiên cứu: “Xây dựng quy trình công nghệ

chiết tách, xác định thành phần hóa học của rễ cây mật nhân (eurycoma longifolia Jack) ở khu vực miền Trung -glucosidase Tây Nguyên và ứng

dụng trong công nghiệp thực phẩm”.

2 Mục tiêu nghiên cứu

Tìm kiếm, phát hiện và xác định những hợp chất có hoạt tính sinh học đáng qu trong rễ cây mật nhân ở miền Trung – Tây Nguyên Từ đó, ứng dụng bổ sung vào quy trình sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe.

3 Đối tượng, phạm vi nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu: Rễ cây mật nhân được thu nhận tại vùng nguyên liệu được lựa chọn ở khu vực vùng núi tỉnh Gia Lai và Quảng Nam.

Phạm vi nghiên cứu: Khảo sát, đánh giá lựa chọn nguyên liệu để phục vụ toàn bộ quá trình nghiên cứu, sử dụng các phương pháp phân lập, định danh xác định thành phần các hợp chất chính Thăm dò một số hoạt tính sinh học của dịch chiết rễ cây mật nhân Ứng dụng sản xuất một số sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe với quy mô phòng thí nghiệm.

4 Phương pháp nghiên cứu

4.1 Phương pháp nghiên cứu lý thuyết

Thu thập, tổng hợp các tài liệu, tư liệu, sách báo, các công trình nghiên cứu trong nước và quốc tế về đặc điểm, cấu trúc, thành phần, các phương pháp thu nhận cao chiết, khảo sát hoạt tính sinh học và ứng dụng của rễ cây mật nhân trong nước và trên thế giới.

4.2 Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

4.2.1 Phương pháp phân lập, định danh và xác định cấu trúc hóa học

ít phân cực để chiết các hợp chất chủ yếu tan nhiều trong dung môi ít phân cực hoặc không phân cực.

Phân lập các chất bằng phương pháp sắc ký, tinh chế bằng phương pháp kết tinh phân đoạn, trong đó, cao chiết trong các dung môi khác nhau được tách và tinh chế bằng phương pháp sắc ký cột kết hợp với sắc ký lớp mỏng với các hệ dung môi thích hợp Sắc ký cột gồm sắc ký cột thường và sắc ký cột nhanh (flash chromatography) sử dụng silicagel Đối với các chất phân cực có thể sử dụng Sephadex LH–20 hoặc ngược pha RP–18 Kiểm tra độ tinh khiết của các chất cũng như theo dõi quá trình tách chất trên cột bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi thích hợp.

4.2.1.2 Phương pháp định danh, xác định cấu trúc hóa học của các chất

Các phương pháp định danh, xác định cấu trúc hóa học phổ biến: Kết hợp giữa các phương pháp vật lý (to

nc , [] D ) và các phương pháp phổ hiện đại: Phổ hồng ngoại (IR), phổ khối va chạm electron (EI-glucosidaseMS), phổ khối ion hóa bằng bụi electron (ESI-glucosidase MS), phổ khối có độ phân giải cao (HR-glucosidaseESI-glucosidaseMS , phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều ( 1 H-glucosidaseNMR, 13 C-glucosidaseNMR, DEPT) và hai chiều (HSQC, HMBC, 1 H-glucosidase 1 H COSY, NOESY).

4.2.1.3 Phương pháp tối ưu hóa một số yếu tố ảnh hưởng bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm trực giao cấp 1, 2 mức với

k yếu tố ảnh hưởng

- Xây dựng quy trình tối ưu để chiết những hợp chất có lợi bổ sung vào quy trình công nghệ sản xuất thực phẩm bảo vệ sức

khỏe

- Khảo sát các điều kiện thu nhận cao chiết bằng phương pháp chưng ninh hồi lưu.

- Tối ưu hóa một số yếu tố ảnh hưởng phương pháp chưng ninh hồi lưu Sử dụng phương pháp quy hoạch thực nghiệm trực

giao cấp 1, 2 mức với k yếu tố ảnh hưởng (TYT 2 k ).

- Các yếu tố khảo sát gồm: Thời gian chiết, nhiệt độ chiết và tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu

4.2.2 Phương pháp xác định hoạt tính sinh học của các dịch chiết

- Phương pháp xác định khả năng gây độc tế bào ung thư

- Phương pháp xác định khả năng ức chế sản sinh NO

- Phương pháp xác định hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase glucosidase

- Phương pháp xác định hoạt tính kháng viêm thông qua khảo sát cytokine tiền

viêm và cytokine gây viêm

- Phương pháp xác định hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định

- Phương pháp xác định hoạt tính kháng oxy hóa

- Phương pháp thử độc tính

- Phương pháp thử khả năng không gây độc đối với tế bào người

4.2.3 Phương pháp sản xuất sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe

Nghiên cứu quy trình sản xuất của một số sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe quy mô phòng thí nghiệm, xây dựng quy trình công nghệ tạo ra sản phẩm đáp ứng quy định hiện hành của Nhà nước đối với thực phẩm bảo vệ sức khỏe.

4.2.4 Phương pháp đánh giá mức độ an toàn thực phẩm

Xác định hàm lượng kim loại nặng, vi sinh vật gây bệnh trong nguyên liệu và sản phẩm bằng các thiết bị và phương pháp phân tích hiện đại.

4.2.5 Phương pháp phân tích và đánh giá cảm quan sản phẩm thực phẩm

Sản phẩm thực phẩm mới, đặc biệt là trong sản phẩm có vị đắng của mật nhân đòi hỏi phải được người tiêu dùng chấp nhận, do đó, yêu cầu sản phẩm phải được đánh giá cảm quan là cần thiết và quan trọng Sử dụng phương pháp cho điểm thị hiếu để đánh giá mức độ chấp nhận của người tiêu d ng đối với sản phẩm.

4.2.6 Phương pháp xử lý số liệu

Sử dụng các phần mềm xử lý số liệu: TableCurve 2Dv4, Matlab R2016a, Anova, Excel.

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

* Ý nghĩa khoa học

- Cung cấp các thông tin khoa học về thành phần và hoạt tính sinh học của rễ cây mật nhân được thu hái tại Gia Lai Góp

phần làm phong phú nguồn dữ liệu về hợp chất thiên nhiên của thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng.

- Cung cấp các thông tin khoa học của những sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe được ứng dụng từ rễ mật nhân

* Ý nghĩa thực tiễn

- Đặt cơ sở cho việc xây dựng quy trình công nghệ sản xuất thực phẩm bổ sung cao chiết mật nhân có hiệu quả cao, thúc đẩy

sự phát triển đa dạng của ngành công nghiệp sản xuất thực phẩm có lợi cho sức khỏe người tiêu d ng.

- Góp phần nâng cao giá trị kinh tế của rễ cây mật nhân tại v ng núi các tỉnh miền Trung và Tây Nguyên

- Làm cơ sở để phát triển ngành công nghiệp khai thác và ứng dụng các loại thảo dược qu tại địa phương.

6 Bố cục của luận án

Luận án gồm 123 trang (không kể phần phụ lục), kết cấu bao gồm: Mở đầu có 5 trang trình bày tính cấp thiết, mục tiêu, nội dung, nghĩa khoa học, nghĩa thực tiễn của luận án.

Nội dung chính gồm 3 chương:

Chương 1: Tổng quan tài liệu gồm 32 trang;

Chương 2: Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu, gồm có 18 trang; Chương 3: Kết quả nghiên cứu gồm

có 52 trang;

Phần kết luận và kiến nghị gồm 3 trang;

Các công trình nghiên cứu đã công bố 1 trang.

Ngoài ra phần các công trình công bố và tài liệu tham khảo gồm 12 trang.

Trong luận án tổng cộng có 37 bảng, 28 hình vẽ và đồ thị Có 114 tài liệu tham khảo tiếng Việt, tiếng Anh và trang web.

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về cây mật nhân

1.1.1 Đặc điểm sinh thái, phân bố

Mật nhân, còn gọi là bá bệnh, hậu phác, tho nan Lào , antongsar Campuchia , danh pháp khoa học: Eurycoma longifolia Jack, là loại cây có hoa thuộc họ Thanh Thất Simaroubaceae, loài bản địa ở Malaysia, Indonesia, Việt Nam, mật nhân phân bố ít hơn

ở Thái Lan, Lào và Ấn Độ Ở Indonesia, cây mật nhân tự nhiên mọc duy nhất ở Sumatra và Kalimanta [1] [2].

Cây mật nhân (hình 1.1) là loại cây nhỏ có cành, bụi thân mảnh, sinh trưởng ở tầng rừng thấp, trên đất sỏi, ưa chua và dẫn lưu nước tốt Cây có kích thước trung bình, có thể cao đến 10 m, thường không phân nhánh Lá kép lông chim chẵn có thể dài đến 1m, cuống lá màu nâu đỏ Mỗi lá k p gồm 30 – 40 lá ch t, hình mũi mác hoặc hình trứng ngược Mỗi lá ch t dài khoảng (5 – 20) cm, rộng (1,5 – 6) cm, mặt trên của lá màu xanh, mặt dưới màu trắng Hoa mọc thành cụm hình ch y ở nách lá, màu đỏ nâu, có nhiều lông tơ mịn Hoa lưỡng tính, cánh hoa nhỏ, rất mềm Quả hạch cứng, hình trứng, nâu vàng khi còn non và trở thành nâu đỏ khi chín Vỏ

và rễ của mật nhân thường có màu trắng hoặc vàng ngà [1] [2].

Hình 1.1 Hình ảnh cây mật nhân tại vùng núi Gia Lai

Mật nhân thường mọc ở v ng đồi núi có sườn dốc cao, v ng đất cát có tính acid, nghèo chất dinh dưỡng mọc dưới tán cây, thích hợp ở những nơi có nhiệt độ trung bình 25 0 C và độ ẩm khoảng 80 – 90 % mọc trong các khu rừng ven bờ biển hoặc rừng nguyên sinh, rừng tái sinh và các khu rừng hỗn tạp, rừng thưa, cây ưa acid và đất cát ở độ cao khoảng 700 m so với mực nước biển [1] [2].

Mật nhân được xem là loại thảo dược quý, các bộ phận của cây mật nhân gồm lá, quả, thân, đặc biệt là rễ có tác dụng điều trị nhiều bệnh Hiện nay, mật nhân được d ng rộng rãi ở rất nhiều nơi trên thế giới, trong đó, có ở cả ở châu Âu, Hoa Kỳ, dưới dạng thực phẩm bổ sung và nước uống [1].

Cây mật nhân mọc nhiều nơi ở nước ta, nhưng phổ biến nhất là ở miền Trung và một số v ng Tây Nguyên như: Quảng Nam, Thừa Thiên Huế, Gia Lai, trong đó, ở v ng núi tỉnh Gia Lai như huyện Kbang, huyện Ia-glucosidaseGrai, cây mật nhân mọc tự nhiên rất nhiều và được khai thác với số lượng lớn [1] [2].

1.1.2 Thành phần hóa học chính của cây mật nhân

Thành phần hóa học của mật nhân rất đa dạng, mỗi bộ phận của cây thì có các thành phần khác nhau, bao gồm những hợp chất thuộc nhóm triterpen với ba khung sườn quassinoid, squallan và tirucallan Ngoài ra, còn có alkaloid (các dẫn chất có khung cơ bản canthin-glucosidase6-glucosidaseone và β-glucosidasecarbolin), steroid, coumarin, acetic acid, benzoic acid, menthol… Trong đó, quassinoid và alkaloid đóng vai

trò quan trọng và là hoạt chất chủ yếu của các cây họ Thanh Thất (Simarubaceae) nói chung và cây mật nhân nói riêng [3].

Quassinoid là thành phần chất đắng đặc trưng của những thực vật thuộc họ Thanh Thất Các hợp chất quassinoid đều là dẫn xuất của các hợp chất triterpenoid và hầu như đa phần đều có dẫn xuất từ tetracyclic triterpend Đa số các quassinoid đều có dược

tính; xu hướng phổ biến của các quassinoid là được sử dụng trong điều trị viêm khớp, chống sốt, điều trị bệnh viêm đường ruột, [4] Nhiều hợp chất quassinoid được tìm thấy ở phần thân và rễ Trong đó, eurycomanone và eurycomanol là hai quassinoid điển hình trong rễ mật nhân Các hợp chất này làm tăng nội tiết tố testosterone và lượng tinh dịch ở chuột đực [5] Ba dạng quassinoid Eurycolactone D, E và F cũng được phân lập từ phần rễ theo báo cáo vào năm 2002 của Ang và cộng sự [6] Vào năm 2009, nhóm nghiên cứu Miyake và cộng sự đã phân lập được 34 loạiquassinoid từ phần thân đồng thời đã khám phá ra 10 hợp chất mới và chứng minh hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất này [7].

Quassinoid có thể được phân loại thành năm loại chính dựa theo bộ khung carbon cấu tạo nên hợp chất đó, bao gồm nhóm quassinoid có 18 nguyên tử carbon

C18 , 19 nguyên tử carbon C19 , loại có 20 nguyên tử carbon C20 , loại có 22 nguyên tử cacbon C22 và loại có 25 nguyên tử carbon C25 trong công thức phân tử Cấu trúc của quassinoid phụ thuộc nhiều vào bộ khung carbon chính [4].

Alkaloid là một chất hữu cơ có chứa nitơ, đa số có nhân vòng, có phản ứng kiềm, thường gặp trong thực vật và đôi khi có trong động vật, thường có dược tính mạnh, cho kết tủa và phản ứng màu với một số thuốc thử gọi là thuốc thử của alkaloid Alkaloid

là một hợp chất hữu cơ chứa nitơ đa số có nhân vòng Các alkaloidtrong cây mật nhân là các dẫn xuất có khung cơ bản canthin-glucosidase6-glucosidaseone

và β-glucosidasecarboline Một số alkaloid được tìm thấy trong rễ mật nhân như n -glucosidasepentyl β-glucosidasecarboline-glucosidase1-glucosidasepropionate, 5-glucosidase hydroxymethyl-glucosidase9-glucosidase

methoxycanthin-glucosidase6-glucosidaseone và 1-glucosidasehydroxy-glucosidase9-glucosidasemethoxycanthin-glucosidase6-glucosidaseone, các hợp chất này có hoạt tính gây độc tế bào và chống sốt r t Bên cạnh đó, nghiên cứu về hoạt tính gây độc tế bào sợi nhân HT-glucosidase1080 của các hợp chất trong mật nhân, nhóm tác giả Miyake và cộng

sự vào năm 2010 đã nghiên cứu và công bố hợp chất 9,10-glucosidase dimethoxy-glucosidasecanthin-glucosidase6-glucosidaseone hiển thị hoạt động gây độc tế bào này mạnh nhất với nồng độ tác dụng IC 50 = 5,0 μMM [5].

Alkaloid thường là các hợp chất có trọng lượng phân tử cao; ở thế rắn khi ở nhiệt độ thường, một vài alkaloid ở dạng lỏng Một số alkaloid không đo được độ chảy do nó bị phá huỷ ở nhiệt độ thấp hơn độ chảy Đa số các alkaloid thường không màu hoặc màu trắng, một số có màu vàng Ngoài ra, có một số alkaloid ở dạng bazơ không màu nhưng muối của nó với acid lại có màu Các alkaloid thường có vị đắng Do cấu trúc của phân tử alkaloid phức tạp có chứa cacbon bất đối nên có tác dụng với ánh sáng phân cực Alkaloid tự nhiên thường có tác dụng quay mặt ph ng ánh sáng phân cực sang trái [8].

Alkaloid thường chứa trong các bộ phận của cây như hoa, lá, rễ, hạt, vỏ Có trường hợp, trong c ng một cây, bộ phận này rất giàu alkaloid nhưng bộ phận khác lại không có Lượng alkaloid và tỷ lệ thành phần các alkaloid trong cây có thể thay đổi tuỳ theo m a thu hái, tuổi của cây, điều kiện khí hậu, thổ nhưỡng Trong c ng mộtcây thường chứa các alkaloid có cấu trúc hoá học gần giống nhau Đặc biệt, trong một số cây có chứa đến vài chục alkaloid Các alkaloid trong cây tồn tại dưới dạng muối của các acid hữu cơ [8].

1.1.3 Tác dụng dược lý của cây mật nhân và ứng dụng trong dân gian

Mật nhân là một loại thảo dược có giá trị, theo Đông y, cây mật nhân có vị đắng, tính ấm, có thể chữa nhiều bệnh nên còn

có tên là bá bệnh như: Ăn không tiêu, tiêu chảy, nôn mữa, kiết l … Nước sắc lá cây trị ghẻ lở, mụn nhọt Các quassinoid từ rễ có tác

dụng diệt kí sinh trùng sốt rét Plasmodium [9].

Theo nội dung trong sách Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam của Đỗ Tất Lợi, trong vỏ cây mật nhân có chứa một chất đắng gọi là quassin Vỏ cây d ng để chữa những trường hợp ăn uống không tiêu, đau mỏi lưng Quả của cây này d ng để chữa l [2].

Theo từ điển cây thuốc Việt Nam của Võ Văn Chi, người ta dùng rễ cây mật nhân thái nhỏ, tẩm rượu sao để làm thuốc, có

vị đắng, tính mát Thường dùng chữa khí hư, huyết k m, ăn uống không tiêu, tức ngực, gân xương yếu, tay chân tê đau, tả l , nôn mửa Ngoài ra, rễ mật nhân còn d ng để chữa tứ thời cảm mạo [10].

Tại Việt Nam, rễ, vỏ và quả cây được dùng sắc thuốc, vị rất đắng Thuốc được dùng trị tẩy giun, sốt rét, kiết l , ngộ độc, đầy bụng, và cả say rượu Khi dùng ngoài da có thể trị ghẻ lở Có lẽ vì đa dụng nên cây này còn được gọi là bách bệnh Ngoài ra mật nhân còn có khả năng tăng cường tetosterone bên trong nam giới, cây d ng như vị thuốc bổ giúp năm giới tăng cường chức năng sinh l và sức khỏe tình dục, bổ sung năng lượng cho cơ thể, giúp giảm stress, mệt mỏi, tăng cường miễn dịch, ngăn ngừa khối u và phòng chống lão hóa, giúp tăng năng lượng hoạt động và sức bền cơ thể [11].

Các kết quả nghiên cứu đã được chứng minh rõ ràng trên phương diện khoa học và đã được công bố rộng rãi cho thấy, mật nhân các tác dụng dược lý linh hoạt bao gồm hoạt tính chống ung thư, chống sốt rét, kháng khuẩn, chống oxy hóa, kích thích tình dục, chống viêm, chống loét, chống đái tháo đường.

Hoạt tính kháng sốt rét: Một nghiên cứu tiến hành với dịch chiết rễ mật nhân trên Plasmodium falciparum với mô hình

lactate dehydrogenase cho thấy bốn quassinoid gồm eurycomalactone; 13,21-glucosidasedihydroeurycomanone; 13-glucosidaseα-glucosidase(21)-glucosidase epoxyeurycomanone; eurycomanone đều có tác dụng kháng sốt r t, trong đó,

eurycomanone cho tác dụng mạnh nhất [9].

Tác dụng trị tiểu đường: Bệnh đái đường (hay tiểu đường) là một bệnh mãn tính, do rối loạn chuyển hoá hydrat cacbon vì

thiếu insulin ở các mức độ khác nhau, do đó, nó gây tăng đường huyết và nếu vượt quá ngưỡng thì có đường niệu nước tiểu có đường) Insulin là hormone do tụy tiết ra, khi dòng máu mang glucose đến các cơ quan, insulin sẽ giúp glucose đi vào trong tế bào và giúp tế bào sử dụng glucose để sinh ra năng lượng cho hoạt động của các tế bào Khi thiếu insulin, cơ thể sẽ không sử dụng được glucose, hậu quả là glucose trong máu sẽ tăng cao và xuất hiện trong nước tiểu Do đó, để điều trị bệnh này có thể bằng các cách làm chậm hấp thu đường glucose từ ruột vào máu, tăng hoạt tính của insulin, kích thích tế bào bêta của tụy tăng sản xuất insulin… Một trong những nguyên nhân làm tăng lượng glucose vào máu đó là do sự có mặt của enzyme α-glucosidaseglucosidase Lá và rễ cây mật nhân đã được d ng để kiểm soát đường huyết Năm 2004, nhóm nghiên cứu của Husen và cộng sự đã thử dịch chiết nước của rễ mật nhân ở

ba liều (50 mg/kg; 100 mg/kg và 150 mg/kg) theo mô hình steptozotocin trên chuột bình thường và chuột có đường huyết cao, kết quả cho thấy ở nồng độ 150 mg/kg cao nước rễ mật nhân có khả năng làm hạ đường huyết ở lô thử và không gây giảm có nghĩa ở lô đối chứng [12].

Tác dụng kháng khuẩn: Hoạt tính kháng khuẩn là hoạt tính sinh học cho thấy khả năng tiêu diệt hoặc ức chế hoàn toàn sự

phát triển của vi sinh vật Hầu hết các loại vi sinh vật gây độc đối với sức khỏe con người thường được sử dụng trong việc nghiên

cứu về hoạt tính kháng khuẩn của thực vật như: Tụ cầu vàng (S.aureus), E.coli, Samonella, P.aeruginosa … Năm 2007, nhóm

nghiên cứu Farouk cùng cộng sự đã thử nhiều dịch chiết khác nhau methanol, ethanol, acetone, nước) từ lá, thân và rễ mật nhân trên hoạt tính kháng khuẩn Gram (-glucosidase) và (+) Kết quả cho thấy dịch chiết lá và thân có tác dụng trên cả vi khuẩn Gram (-glucosidase) và (+), ngoại trừ

hai chủng Gram (-glucosidase) là Escherichia coli và Salmonella typhi Dịch chiết nước từ lá cũng có tác dụng kháng khuẩn trên các chủng

Staphylococcus aureus và Serratia marscesens [9].

Tác dụng kích thích sinh dục: Đây là tác dụng chính, vượt trội của cây mật nhân, đã được chứng nhận và công bố rộng rãi

với nhiều đề tài nghiên cứu khoa học trên thế giới Đó là khả năng tăng cường sức khoẻ tình dục cho nam giới, kích thích cơ thể tăng tiết hormone giới tính nam (testosterone) một cách tự nhiên, duy trì sự hưngphấn và phong độ tình dục ở nam giới, ngăn chặn các dấu hiệu suy giảm khi bước vào tuổi trung niên Theo kết quả nghiên cứu vào năm 2010 của nhóm Mohd Ismail Bin và cộng sự cho thấy, 76 trong số 320 bệnh nhân mắc chứng suy sinh dục khởi phát muộn

LOH đã được cung cấp 200 mg dịch chiết mật nhân tiêu chuẩn trong 1 tháng Các triệu chứng lão hóa nam giới AMS theo thang đánh giá tiêu chuẩn và nồng độ testosterone trong huyết thanh đã được theo dõi Kết quả cho thấy điều trị bệnh nhân LOH với chiết xuất mật nhân này P <0,0001 đã cải thiện điểm AMS cũng như nồng độ testosterone trong huyết thanh [13].

Tác dụng kháng ung thư: Năm 2018, nhóm tác giả Thu Hnin E và cộng sự đã công bố, eurycomanone là một trong những

hợp chất dược liệu mạnh nhất của mật nhân, chúng thể hiện được hiệu quả cao trong việc chống ung thư biểu mô phổi (tế bào A-glucosidase549

và ung thư vú tế bào MCF-glucosidase7) và cho thấy hiệu quả trung bình chống lại ung thư dạ dày (tế bào MGC-glucosidase803 và ung thư biểu mô đường ruột (tế bào HT-glucosidase29) [14].

Bên cạnh đó, năm 2018, nhóm tác giả Chunxin Zou và cộng sự đã công bố, tám hợp chất trong mật nhân thuộc các dẫn xuất squalene, biphenyl, neolignans và alkaloids được dự đoán là có tiềm năng hoạt động ức chế ung thư gan [15].

Hoạt tính kháng viêm: Năm 2018, nhóm nghiên cứu Lê Thanh Liêm cùng cộng sự đã công bố kết quả: Chiết xuất alkaloid

từ rễ cây mật nhân tại Kỳ Sơn – Nghệ An đã cho thấy tác dụng chống viêm đáng kể ở cả mẫu in vitro và in vivo Dịch chiết này thể

hiện hoạt động chống viêm thông qua việc ức chế các chất trung gian gây viêm như NO, iNOS và COX-glucosidase2 và bảo vệ chuột khỏi tử vong do LPS gây ra trong mô hình sốc nhiễm trùng [16].

Hoạt tính kháng oxy hóa: Khả năng kháng oxy hóa của một chất là khả năng làm ức chế quá trình oxy hóa của các phân tử

khác Oxy hóa là một phản ứng hóa học có thể tạo ra các gốc tự do, dẫn đến các phản ứng dây chuyền có thể làm hỏng các tế bào Các chất kháng oxy hóa như thiolis hay vitamin C có thể chấm dứt các phản ứng dây chuyền này để ngăn cản quá trình oxy hóa xảy

ra Năm 2013, nhóm nghiên cứu của Varghese và cộng sự đã nghiên cứu về hoạt tính kháng oxy hóa và kết luận rằng dịch chiết mật nhân trong cồn thể hiện hoạt động kháng oxy hóa ở tất cả các nồng độ (10, 25, 50, 100 và 250 μMg/mL Khả năng kháng oxy hóa của chiết xuất này được so sánh với các giá trị của ascorbic acid [17].

Ngoài ra, theo phát hiện của nhóm nghiên cứu Hulol Saleh Alruhaimi và cộng sự vào năm 2019 ở Malaysia cho thấy, mật nhân có tác dụng bảo vệ thần kinh đối với giảm máu đến não mãn tính (chronic cerebral hypoperfusion) bằng cách tăng cường khả năng chống oxy hóa và giảm peroxide hóa và viêm, có thể cải thiện chức năng nhận thức ở chuột [18].

1.2 Tổng quan về các phương pháp nghiên cứu

1.2.1 Tổng quan về phương pháp chiết

Chiết là phương pháp sử dụng dung môi để lấy các chất tan ra khỏi các mô thực vật, sản phẩm thu được của quá trình chiết xuất là dịch chiết Trong phạm vi công nghệ thì có rất nhiều phương pháp chiết khác nhau từ phương pháp gián đoạn đến phương pháp liên tục, từ phương pháp đơn giản đến phức tạp, từ phương pháp truyền thống đến hiện đại với các loại dung môi khác nhau Các yếu tố ảnh hưởng quá trình chiết: Bản chất của chất tan, dung môi, nhiệt độ, áp suất, cấu tạo của vách tế bào, kích thước tiểu phân bột dược liệu, thời gian chiết [19].

Có rất nhiều kỹ thuật và thiết bị chiết khác nhau như chiết ở nhiệt độ thường

ngâm lạnh, ngâm kiệt ở nhiệt độ thường hoặc chiết ở nhiệt độ cao chiết nóng, hãm, sắc, ngấm kiệt nóng , chiết với các thiết bị khác nhau như: Soxhlet, Kumagawa tùy yêu cầu, điều kiện mà chọn kỹ thuật chiết thích hợp

Phương pháp chưng ninh hồi lưu: Nguyên liệu được ngâm cùng dung môi trong một bình cầu đáy tròn được nối với hệ thống ngưng tụ Đun nóng bình cầu chứa nguyên liệu và dung môi đến nhiệt độ sôi, dung môi bốc hơi sẽ ngưng tụ và quay trở lại Phương pháp chưng ninh hồi lưu có ưu điểm: Đơn giản, dễ thực hiện, thiết bị đơn giản, rẻ tiền Tuy nhiên, có những nhược điểm chung của phương pháp chiết xuất gián đoạn: Năng suất thấp, thao tác thủ công giai đoạn tháo bã và nạp liệu), chiết nhiều lần nên tốn dung môi, thời gian [19].

Phương pháp chiết Soxhlet: Nguyên liệu được cho vào một ống giấy lọc rồi đặt vào ngăn chiết Dung môi mới được cho vào bình cầu và đun hồi lưu Dung môi bốc hơi lên được ngưng tụ xuống ngăn chiết và khi tràn sẽ chảy qua ống xi -glucosidase phông xuống bình cầu bên dưới, mang theo chất hòa tan từ nguyên liệu Ở bình cất, chất tan được giữ lại, dung môi bốc hơi được ngưng tụ xuống bình chiết và đi qua lớp nguyên liệu để hòa tan các chất còn lại Quá trình được tiếp tục đến khi nguyên liệu được chiết hoàn toàn Phương pháp chiết Soxhlet thuộc loại phương pháp chiết bán liên tục, nguyên liệu cho vào bộ Soxhlet và đứng yên trong khi dung môi chuyển động liên tục Phương pháp chiết Soxhlet có ưu điểm: Chiết kiệt, tiết kiệm được dung môi thu hồi dung môi) Tuy nhiên, có những nhược điểm: Lượng nguyên liệu chiết phụ thuộc nhiều vào thể tích thiết bị, tiến hành phức tạp, thiết bị đắt tiền [19].

Ngoài ra, phương pháp chiết còn được phân loại dựa vào các yếu tố sau:

- Dựa vào chế độ làm việc có các phương pháp chiết sau: Gián đoạn, bán liên tục, liên tục

- Dựa vào chiều chuyển động tương hỗ giữa hai pha, có các phương pháp: Ngược dòng, xuôi dòng, chéo dòng.

- Dựa vào áp suất làm việc, có các phương pháp chiết ở: Áp suất thường, áp suất giảm áp suất chân không , áp suất cao làm

việc có áp lực

- Dựa vào trạng thái làm việc của hai pha, có các phương pháp chiết sau: Ngâm, ngấm kiệt

Dựa vào những biện pháp kỹ thuật đặc biệt: Phương pháp siêu âm, phương pháp tạo dòng xoáy, phương pháp mạch nhịp [19].

Trong đề tài nghiên cứu này, sử dụng phương pháp chiết Soxhlet và chưng ninh trong quá trình chiết mẫu thực vật phục vụ việc phân lập, định danh, xác định thành phần, cấu trúc hóa học Lựa chọn phương pháp chưng ninh hồi lưu để xây dựng quy trình chiết tạo ra cao chiết bổ sung vào quy trình công nghệ sản xuất thực phẩm.

1.2.1.1 Phương pháp chưng ninh hồi lưu

Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã sử dụng phương pháp chưng ninh hồi lưu, cây mật nhân cũng từng là đối tượng được nghiên cứu trước đó Phương pháp chưng ninh hồi lưu được định hướng từ các nghiên cứu của nhóm tác giả Anisa Rahmalia và cộng

sự vào năm 2011, nhóm tác giả Zakia Khanam và cộng sự vào năm 2015 [20] [21].

1.2.1.2 Phương pháp chiết Soxhlet

Lựa chọn phương pháp Soxhlet được định hướng từ các nghiên cứu của nhóm Tee Thiam Tsui và cộng sự vào năm 2005, nhóm nghiên cứu Đào H ng Cường và cộng sự năm 2010 và nhóm nghiên cứu Nursyazura Khari và cộng sự vào năm 2014 [22] [23] [24].

1.2.1.3 Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết

a Những yếu tố thuộc về thành phần, cấu tạo của nguyên liệu

- Màng tế bào dược liệu

- Chất nguyên sinh

- Một số tạp chất có thể có trong nguyên liệu

Những yếu tố này thì không thể thay đổi được trong quá trình sản xuất, mà phụ thuộc vào nguyên liệu sử dụng, do vậy, trong phạm vi nghiên cứu này, chúng tôi không nghiên cứu sâu về nội dung này [8].

b Những yếu tố thuộc về dung môi

- Độ phân cực của dung môi: Dung môi ít phân cực thì dễ hòa tan các chất không phân cực và khó hòa tan các chất có nhiều

nhóm phân cực Ngược lại, dung môi phân cực mạnh thì hòa tan các chất có nhiều nhóm phân cực và khó hòa tan các chất ít phân cực [8].

- Theo tác giả Rajeev Bhat và cộng sự, trong thành phần rễ cây mật nhân thành phần chủ yếu là các quassinoid và alkaloid,

trong đó, các alkaloid là những hợp chất có tính chất phân cực mạnh, còn các quassioid là những dẫn xuất của triterpen, là những hợp chất phân cực vừa Do đó, những thành phần này có thể hòa tan tốt trong các dung môi phân cực như nước Mặt khác, nước là một dung môi rẻ tiền, dễ kiếm, an toàn khi bổ sung vào thực phẩm, lại không gây m i vị khó chịu đối với thực phẩm Ngoài ra, dung môi ethanol 80 % trong nước được xem là dung môi vạn năng, có thể hòa tan hầu hết các hợp chất từ phân cực mạnh đến ít phân cực, ethanol cũng có thể sử dụng trong thực phẩm Vì vậy, lựa chọn nước và ethanol 80 % trong nước làm dung môi trong nghiên cứu sau này [25].

- Độ nhớt, sức căng bề mặt của dung môi: Dung môi có độ nhớt càng thấp hoặc có sức căng bề mặt càng nhỏ thì dung môi

càng dễ thấm vào dược liệu, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình chiết xuất và ngược lại [8].

c Những yếu tố về kỹ thuật

Yếu tố về kỹ thuật là những yếu tố có thể thay đổi được bằng các biện pháp kỹ thuật khác nhau, nhằm tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình chiết xuất Đó có thể là những yếu tố như nhiệt độ, thời gian, độ mịn của dược liệu, khuấy trộn, siêu âm [8].

- Sự chênh lệch nồng độ giữa hai pha: Trong quá trình trích ly, sự chênh lệch nồng độ giữa hai pha là động học của quá trình

trích ly, do đó sự chênh nồng độ giữa hai pha càng lớn thì quá trình trích ly diễn ra càng nhanh và thuận lợi Chính vì thế, trong quá trình trích ly người ta luôn tìm mọi cách để tăng sự chênh lệch nồng độ giữa hai pha: Trích ly ngược chiều, tuần hoàn dung môi, bổ sung dung môi trong quá trình trích ly, thay mới dung môi cuối quá trình trích ly [8].

- Nhiệt độ chiết: Theo công thức tính hệ số khuếch tán của Einstein, khi nhiệt độ tăng thì hệ số khuếch tán cũng tăng, do đó,

theo định luật Fick, lượng chất khuếch tán cũng tăng lên Hơn nữa khi nhiệt độ tăng thì độ nhớt của dung môi giảm nên tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình chiết Tuy nhiên, khi nhiệt độ tăng sẽ gây ra bất lợi cho những hợp chất k m bền ở nhiệt độ cao, gây phá hủy một số hoạt chất như vitamin, glycosid, alkaloid, Một số bất lợi khác có thể kể đến như khi nhiệt độ tăng làm tăng độ hòa tan của tạp chất, dung môi dễ bị hao hụt và đối với một số chất đặc biệt có quá trình hòa tan tỏa nhiệt, độ hòa tan của chúng giảm khi nhiệt

độ tăng Vì vậy, tùy trường hợp cụ thể, chúng ta cần lựa chọn nhiệt độ sao cho ph hợp [8].

- Thời gian chiết: Khi bắt đầu chiết, các chất có phân tử lượng nhỏ sẽ được hòa tan và khuếch tán vào dung môi trước,

sau đó mới đến các chất có phân tử lượng lớn Do đó nếu thời gian chiết quá ngắn sẽ không chiết được hết các hoạt chất trong dược liệu Nếu thời gian chiết quá dài, dịch chiết sẽ bị lẫn nhiều tạp chất, gây bất lợi cho quá trình tinh chế và bảo quản Nhưng đến một giới hạn nào đó thì quá trình chiết sẽ đến trạng thái cân bằng d có k o dài thời gian thì quá trình trích ly cũng không tiếp tục diễn ra Vì vậy, cần thiết phải lựa chọn thời gian chiết sao cho ph hợp với thành phần dược liệu, dung môi và phương pháp chiết [8].

Ngoài những yếu tố kể trên, còn nhiều yếu tố khác cũng gây ảnh hưởng đến quá trình chiết như độ mịn, khuấy trộn, áp suất, pH môi trường, chấn động cơ học, dòng điện cao áp [8].

Những yếu tố về kỹ thuật là những yếu tố có thể thay đổi được bằng các biện pháp kỹ thuật khác nhau, thay đổi các yếu tố này trong quá trình sản xuất là dễ dàng thực hiện Vì vậy, trong nghiên cứu này, chúng tôi lựa chọn ba yếu tố của quá trình chiết xuất

là tỷ lệ giữa dung môi và nguyên liệu, nhiệt độ chiết và thời gian chiết để tiến hành quá trình khảo sát các yếu tố ảnh hưởng bằng quy hoạch thực nghiệm và tối ưu hóa quá trình chiết rễ mật nhân bằng phương pháp chưng ninh hồi lưu [26].

1.2.2 Tổng quan về phương pháp phân lập và xác định cấu trúc hóa học

Sau quá trình chiết từ các dung môi khác nhau, dịch chiết được cô khô tạo thành

cao chiết, tách và tinh chế các hợp chất có trong cao chiết bằng phương pháp sắc ký cột kết hợp với sắc ký bản mỏng với các hệ dung môi thích hợp.

Sắc ký cột (CC): Nhằm phân lập các đơn chất từ hỗn hợp Nguyên tắc: Sắc ký hấp phụ có thể được tiến hành trên một cột thủy tinh th ng đứng với chất hấp phụ đóng vai trò pha tĩnh, dung môi rửa cột đóng vai trò pha động chảy qua chất hấp phụ dưới tác động của trọng lực Đối với mỗi chất riêng biệt trong hỗn hợp cần tách, tùy theo khả năng hấp phụ và khả năng hòa tan của nó đối với dung môi rửa cột để lấy ra lần lượt trước hoặc sau Sắc ký cột gồm sắc ký cột thường và sắc ký cột nhanh sử dụng silicagel Đối với các chất phân cực có thể sử dụng sephadex LH-glucosidase20 hoặc ngược pha RP-glucosidase18 Trường hợp cần thiết có thể chạy cột lặp lại nhiều lần hoặc

d ng phương pháp kết tinh phân đoạn, kết tinh lại để tinh chế [19].

Sắc ký bản mỏng (Thin Layer Chromatography -glucosidase TLC): Nhằm xác định hệ dung môi để chạy sắc ký cột, kiểm tra thành phần

độ tinh khiết của các hỗn hợp, các phân đoạn của sắc ký cột Nguyên lý: Sắc ký bản mỏng TLC là sắc ký hấp phụ được tiến hành trên một bản mỏng, chất hấp phụ là silicagel hay oxýt nhôm Sau khi nhúng bản mỏng vào dung dịch chiết, lấy ra sấy nhẹ, sẽ phát hiện các vết Sắc ký bản mỏng được sử dụng để kiểm tra độ tinh khiết cũng như theo dõi quá trình tách chất trên cột bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi thích hợp [19].

Cấu trúc hóa học của các hợp chất được xác định bằng sự kết hợp giữa các phương pháp vật lý (t o nc, [] D và các phương pháp phân tích hóa lý:

- Sắc k lỏng khối phổ LC-glucosidaseMS, LC-glucosidaseMS/MS : Sử dụng cho các đối tượng là những hợp chất có khối lượng phân tử lớn,

khó bay hơi

- Hồng ngoại IR : Sử dụng định danh các nhóm chức có trong hợp chất

- Phổ khối va chạm electron EI-glucosidaseMS);

- Phổ khối ion hóa bằng bụi electron ESI-glucosidaseMS);

- Phổ khối có độ phân giải cao HR-glucosidaseESI-glucosidaseMS);

- Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều 1 H-glucosidaseNMR, 13 C-glucosidaseNMR, DEPT và hai chiều HSQC, HMBC, 1 H-glucosidase 1 H COSY, NOESY) [27] [28].

1.2.3 Tổng quan về phương pháp thăm dò hoạt tính sinh học

1.2.3.1 Phương pháp thử khả năng gây độc tế bào ung thư

Phương pháp thử khả năng gây độc tế bào ung thư in vitro được Viện Ung thưQuốc gia Hoa Kỳ (National Cancer Institute

– NCI) xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế

bào ung thư ở điều kiện in vitro Phương pháp thử nghiệm xác định tính độc tế bào ung thư cytotoxic assay đối với tế bào nuôi cấy

dạng đơn lớp và đối với các dòng tế bào nuôi cấy hỗn dịch [29] [30].

a Xác định khả năng gây độc tế bào ung thư (cytotoxic assay) đối với tế bào nuôi cấy dạng đơn lớp

Phương pháp xác định khả năng gây độc tế bào ung thư cytotoxic assay đối với tế bào nuôi cấy dạng đơn lớp là phương pháp dạng SRB Phương pháp này được thực hiện tương tự theo phương pháp của Monks (1991) Phép thử tiến hành xác định hàm lượng protein tế bào tổng số dựa vào mật độ quang học (OD – Optical Density đo được khi thành phần protein của tế bào được nhuộm bằng sulforhodamine B (SRB) Giá trị OD máy đo được tỷ lệ thuận với lượng SRB gắn với phân tử protein, do đó lượng tế bào càng nhiều lượng protein càng nhiều) thì giá trị OD càng lớn [29].

b Xác định tính độc tế bào đối với các dòng tế bào nuôi cấy hỗn dịch

Phương pháp xác định tính độc tế bào đối với các dòng tế bào nuôi cấy hỗn dịch là phương pháp dạng MTT Phương pháp này được thực hiện tương tự theo phương pháp của Mosmann Bernardes và cộng sự vào năm 1983 Nhóm tác giả sử dụng muối tetrazolium MTT-glucosidase(3-glucosidase(4,5-glucosidasedimethylthiazol-glucosidase2-glucosidaseyl)-glucosidase2,5-glucosidasediphenyltetrazolium)) làm thuốc thử trong ph p so màu, qua đó đánh giá về sự sống sót và khả năng phát triển của tế bào Vòng tetrazolium của thuốc thử bám chặt vào ti thể của tế bào hoạt động Dưới tác dụng của enzyme dehydrogenase trong tế bào, màu vàng của MTT biến đổi thành màu tím formazan Như vậy, càng nhiều formazan thì tỷ lệ

tế bào sống sót càng cao [30].

1.2.3.2 Xác định khả năng ức chế đại thực bào sản sinh NO

Việc sản xuất NO sinh lý là cực kỳ quan trọng để bảo vệ cơ thể, tuy nhiên, sản xuất quá mức và các chất chuyển hóa của

nó có liên quan đến sự phát triển của các bệnh lý, ch ng hạn như sốc nhiễm trùng do vi khuẩn và viêm mãn tính Phương pháp khảo sát khả năng ức chế tế bào đại thực bào sinh NO là phương pháp được sử dung phổ biến trong việc thăm dò hoạt tính kháng viêm đối

với các loại thực vật nhằm đánh giá tác nhân ngăn chặn sản xuất có thể có lợi cho việc điều trị phản ứng viêm Ngoài ra, các loài gốc

tự do cũng chịu trách nhiệm kích hoạt một số yếu tố phiên mã tiền viêm, có liên quan đến việc thúc đẩy các bệnh viêm [31].

Đến thời điểm nghiên cứu, chưa có công bố nào về khả năng kháng viêm trên đối tượng dịch chiết rễ cây mật nhân, do đó, trong đề tài nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu, khảo sát khả năng này nhằm tìm ra đặc tính mới, bổ sung giá trị cho nguyên liệu đã lựa chọn nghiên cứu.

1.2.3.3 Xác định hoạt tính ức chế enzyme α- glucosidase

Chứng tăng đường huyết sau khi ăn dẫn đến sự tiến triển của bệnh tiểu đường tu p 2, do đó phương pháp ức chế hoạt động của enzyme -glucosidaseglucosidase trong điều trị tiểu đường tu p 2 là phương pháp được sử dụng phổ biến hiện nay.

Khảo sát khả năng ức chế enzyme α-glucosidase glucosidase qua đó đánh giá được khả năng kháng bệnh đái tháo đường tuýp 2 của dịch chiết nước Dựa trên phản ứng phân cắt cơ chất p-glucosidasenitrophenyl-glucosidase-glucosidaseD-glucosidaseglucopyranoside nhờ tác động của enzyme  -glucosidase glucosidase, qua

đó giải phóng sản phẩm là p-glucosidasenitrophenol có màu vàng Độ hấp thụ của hỗn hợp phản ứng tại bước sóng 410 nm ở thời điểm 30 phút sau phản ứng, phản ánh lượng sản phẩm p-glucosidaseNitrophenol sinh ra, qua đó phản ánh hoạt độ của enzyme  -glucosidase glucosidase [32].

1.2.3.4 Xác định hoạt tính kháng viêm thông qua khảo sát cytokine tiền viêm và cytokine gây viêm

Viêm là một cơ chế bảo vệ do các yếu tố hóa học khác nhau gây ra, và bao gồm các thay đổi phức tạp, tuần tự để loại bỏ nguyên nhân ban đầu, nhiều bệnh được theo sau bởi các quá trình viêm cấp tính hoặc mãn tính với sản xuất nhiều chất trung gian hóa học, ch ng hạn như xơ vữa động mạch, bệnh Alzheimer, ung thư, hen suyễn và các bệnh nhiễm tr ng, như bệnh lao [31].

Cytokine là các protein hay glycoprotein không phải kháng thể được sản xuất và phóng thích bởi các tế bào bạch cầu viêm

và một số tế bào khác không phải bạch cầu Các protein này hoạt động trong vai trò là các chất trung gian điều hòa giữa các tế bào trong cơ thể, các nghiên cứu và hiểu biết về vai trò sinh l cũng như sinh l bệnh của cytokine đã đạt được những thành tựu đáng kể Cytokine tham gia vào rất nhiều quá trình sinh học trong cơ thể như tạo phôi, sinh sản, tạo máu, đáp ứng miễn dịch, viêm Tuy nhiên các phân tử này cũng đóng vai trò khá quan trọng trong các bệnh l như: Bệnh tự miễn, nhiễm trùng huyết, ung thư.

Cytokine tham gia vào nhiều quá trình sinh lý bao gồm điều chỉnh các phản ứng miễn dịch và viêm Các phân tử hiệu ứng này được tạo ra tạm thời và cục bộ kiểm soát biên độ và thời gian của phản ứng Phương pháp xác định hàm lượng cytokine tiền viêm

và cytokine gây viêm giúp đánh giá khả năng kháng viêm của tế bào vì nếu quá trình sản xuất quá nhiều hoặc không đủ cytokine có thể góp phần đáng kể vào sinh lý bệnh của một loạt bệnh tự miễn dịch, các bệnh truyền nhiễm và đào thải khi ghép tạng (ví dụ, IL-glucosidase1, IL-glucosidase4, IL-glucosidase6, IL-glucosidase10, IL-glucosidase12, TNF-glucosidasealpha) [33].

1.2.3.5 Phương pháp xác định hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định

Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được thực hiện dựa trên phương pháp hệ nồng độ trong môi trường lỏng tương tự phương pháp nghiên cứu của Hadacek và cộng sự vào năm 2000 [34].

Đây là phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật và nấm kiểm định nhằm đánh giá mức độ kháng khuẩn mạnh yếu của

các mẫu thử thông qua các giá trị thể hiện hoạt tính là MIC Minimum inhibitor concentration - nồng độ tối thiểu ức chế), IC50 (50 %

inhibitor concentration -glucosidase nồng độ ức chế 50% , MBC Minimum bactericidal concentration -glucosidase nồng độ tối thiểu diệt khuẩn Các chủng

vi sinh vật kiểm định bao gồm những vi khuẩn và nấm kiểm định gây bệnh ở người như:

- Bacillus subtilis là trực khuẩn Gram + , sinh bào tử, thường không gây bệnh

- Staphylococcus aureus là cầu khuẩn Gram + , gây mủ các vết thương, vết bỏng, gây viêm họng, nhiễm tr ng có mủ trên da

và các cơ quan nội tạng

- Lactobacillus fermentum là vi khuẩn Gram + , vi khuẩn đường ruột lên men có ích, thường có mặt trong hệ tiêu hoá của người

và động vật

- Escherichia coli là vi khuẩn Gram (-glucosidase , gây một số bệnh về đường tiêu hoá như viêm dạ dày, viêm đại tràng, viêm ruột,

viêm l trực khuẩn

- Pseudomonas aeruginosa là vi khuẩn Gram (-glucosidase , trực khuẩn mủ xanh, gây nhiễm tr ng huyết, các nhiễm tr ng ở da và niêm

mạc, gây viêm đường tiết niệu, viêm màng não, màng trong tim, viêm ruột

- Salmonella enterica là vi khuẩn Gram -glucosidase , vi khuẩn gây bệnh thương hàn, nhiễm tr ng đường ruột ở người và động vật

- Candida albicans là nấm men, thường gây bệnh tưa lưỡi ở trẻ em và các bệnh phụ khoa.

Môi trường nuôi cấy: MHB Mueller- Hinton Broth), MHA (Mueller - Hinton Agar); TSB (Tryptic Soy Broth); TSA (Tryptic Soy Agar cho vi khuẩn; SDB (Sabouraud – 2 % dextrose broth) và SA (Sabouraud – 4 % dextrose agar cho nấm.

Chất tham khảo:

- Kháng sinh ampicillin cho các chủng vi khuẩn Gram +

- Kháng sinh cefotaxim cho các chủng vi khuẩn Gram -glucosidase)

- Kháng nấm nystatin cho chủng nấm

Giá trị MIC được xác định tại giếng có nồng độ chất thử thấp nhất ức chế sự phát triển của vi sinh vật Giá trị IC 50 được tính dựa trên số liệu đo độ đục của môi trường nuôi cấy bằng máy quang phổ TECAN:

IC(%)  100x ODtest  ODcontrol() ODcontrol()  ODcontrol()

Giá trị MBC2đ.ược xác định bằng số khuẩn lạc trên đĩa thạch

1.2.3.6 Xác định hoạt tính kháng oxy hóa

Các phương pháp xác định hoạt tính kháng oxy hóa thường được sử dụng như sau:

a Phương pháp thông qua phản ứng bao vây gốc tự do DPPH

Hoạt tính chống oxy hóa của mẫu được xác định thông qua phản ứng bao vây gốc tự do Dựa trên nguyên tắc 1,1-glucosidasediphenyl-glucosidase 2-glucosidasepicrylhydrazyl (DPPH) có khả năng tạo ra các gốc tự do bền trong dung dịch ethanol bão hoà Khi cho các chất thử nghiệm vào hỗn hợp này, nếu chất có khả năng làm trung hoà hoặc bao vây các gốc tự do sẽ làm giảm cường độ hấp thụ ánh sáng của các gốc tự

do DPPH Hoạt tính chống oxy hoá được đánh giá thông qua giá trị hấp thụ ánh sáng của dịch thí nghiệm so với đối chứng khi đọc trên máy Elisa ở bước sóng 515 nm – 517 nm [35] Phương pháp này thực hiện nhanh chóng, đơn giản, chính xác và có thể đo hoạt tính chống oxy hóa của các hợp chất khác nhau.

b Phương pháp dựa vào năng lượng khử

Năng lực khử được xác định tương tự theo các phương pháp được sử dụng của nhóm nghiên cứu Oyaizu và cộng sự năm

1986, nhóm nghiên cứu Nguyễn Xuân Duy và cộng sự năm 2013 Nguyên tắc: Sử dụng phương pháp khử kali ferricyanide để xác định quá trình khử, phản ứng chuyển hóa Fe 3+ thành Fe 2+ Nhiều thể tích khác nhau của dịch chiết được trộn với đệm phosphate pH = 6,6 để đạt thể tích cuối c ng 1,5 mL trước khi thêm 0,5 mL K 3 (Fe[CN 3 1 % Hỗn hợp được ủ ở 50 o C trong 20 phút, sau

đó thêm 0,5 mL TCA 10 % và 2 mL nước cất, cuối c ng 0,4 mL AlCl 3 0,1 % được thêm vào Độ hấp thu quang học được xác định tại bước sóng 700 nm Độ hấp thu quang học càng cao thì năng lực khử càng mạnh Tính toán giá trị IC 50 , là lượng mẫu làm tăng độ hấp thu quang học lên 0,50 [36] [37].

c Phương pháp xác định khả năng chống oxy hóa trên mô hình dầu - nước

Hệ nhũ tương dầu -glucosidase nước được chuẩn bị gồm: 10 % dầu Olive, 85 % nước và 0,5 % Tween 40 Hỗn hợp được đồng hóa ở tốc độ 10 000 vòng/phút trong 5 phút Lấy chính xác 2 mL dịch chiết được trộn đều với 10 mL hệ nhũ tương dầu – nước chứa trong ống nhựa 50 mL có nắp đậy, được đặt trong tủ ổn nhiệt ở 50 o C, quá trình oxy hoá chất b o được quan sát hàng ngày Hàm lượng hydroperoxide được xác định trên dịch chiết chất b o theo phương pháp của Bligh and Dyer vào năm 1959 Hàm lượng hydroperoxide được xác định theo phương pháp của Richards và Hultin vào năm 2002 Kết quả tính toán hàm lượng hydroperoxide

từ đường chuẩn Cumene hydroperoxide (HPO) nồng độ từ 0-glucosidase120 nmol/mL [36] [38] [39].

Ngoài ra, có một số phương pháp xác định khả năng kháng oxy hóa khác [35]:

- Phương pháp TEAC Trolox equivalent antioxidant capacity : Xác định hoạt tính kháng oxy hóa so với khả năng chống

oxy hóa của Trolox

- Phương pháp ORAC oxygen radical absorbance capacity : Xác định khả năng hấp thụ gốc tự do chứa oxy hoạt động

- Phương pháp TRAP (total radical-glucosidasetrapping antioxidant potential : Khả năng kháng oxy hóa bằng cách bẫy các gốc tự do

- Phương pháp FRAP ferric reducing-glucosidaseantioxidant power : Lực kháng oxy hóa bằng phương pháp khử sắt

- Phương pháp Conjugated Diene: Khảo sát nối đôi liên hợp

Các phương pháp trên có tính đặc hiệu cao, tuy nhiên, phương pháp phức tạp, khó thực hiện, các hóa chất sử dụng đắt tiền, khó cung cấp, đồng thời phòng thí nghiệm không được trang bị đầy đủ các thiết bị phục vụ phân tích.

1.2.3.7 Phương pháp thử độc tính

Thử độc tính để biết được nguy cơ gây tác động xấu đến sức khỏe con người khi tiếp xúc, ảnh hưởng xấu đến môi trường cũng như các sinh vật nơi sử dụng các sản phẩm Giúp thiết lập liều lượng trong thử nghiệm lâm sàng để cung cấp thông tin banđầu về mẫu thử nghiệm Các phương pháp được sử dụng phổ biến đối với nghiên cứu trên đối tượng thảo dược như sau:

- Thử độc tính bất thường: Độc tính bất thường hay còn gọi là độc tính cấp là biểu thị sự tác động xấu hay sự tử vong của

sinh vật ngay sau khi tiếp xúc với chất độc Độc tính cấp xảy ra do tiếp xúc với đơn hoặc đa yếu tố trong một thời gian ngắn và tác động cấp tính là tác động xảy ra trong vòng một vài ngày hoặc thậm chí là một vài giờ đầu tiên sau khi tiếp xúc với chất độc, thông thường thời gian gây độc cấp tính phải ít hơn hai tuần Mặt khác, vì những tác động mãn tính chỉ xuất hiện sau khi tiếp xúc lặp lại với một chất độc, trong nhiều trường hợp cần phải tiếp xúc liên tục hàng tháng Trong khi đó, tác nhân gây độc tính cấp được hấp thụ nhanh chóng vào cơ thể và sản sinh ra ngay lập tức các hiệu ứng độc cho cơ thể, song cũng có trường hợp, tiếp xúc cấp tính bị suy giảm độc tính Thử độc tính bất thường là một phương pháp để xác định tiêu chuẩn của một dạng thuốc nào đó Đó là tiêu chuẩn về độ

an toàn của thuốc Trong thử độc tính bất thường quy định rõ: Động vật thử là gì, tình trạng con vật, cân nặng động vật, số con, liều thử, đường d ng, thời gian theo dõi, không có biểu hiện bệnh l và phải không có con vật nào chết Mục đích: Cung cấp thông tin cho việc xếp loại mức độ độc của thuốc, dự đoán triệu chứng và dự kiến biện pháp điều trị ngộ độc cấp; thiết lập mức liều cho những thử nghiệm độc tính và tác dụng cũng như phạm vi an toàn của thuốc nghiên cứu tiếp theo [40] [41].

- Thử độc tính bán trường diễn: Thử độc tính dài ngày chỉ được tiến hành sau khi đã có thông tin về độc tính cấp trên động

vật và mẫu thử được dự định sử dụng hoặc tiếp xúc dài ngày trên người Thử độc tính dài ngày nhằm xác định khả năng dung nạp của động vật thí nghiệm khi d ng mẫu thử nhiều lần Thông tin cần xác định có những biểu hiện độc tính sau khi d ng dài ngày, bao gồm:

 Mức liều không hoặc có gây thay đổi đáng kể tới chức năng, cơ quan hoặc một số biểu hiện sống có thể quan sát được trên động vật thí nghiệm;

 Những độc tính có thể quan sát được trên động vật và khả năng hồi phục nếu có [40].

Quy trình thử độc tính bất thường được thực hiện theo hướng dẫn tại phụ lục 13.5

– Dược điển Việt Nam.

1.2.3.8 Phương pháp xác định khả năng không gây độc đối với tế bào người

Việc phát triển một loại thảo dược hay thực phẩm mới từ tưởng ban đầu đến khi

đưa ra thành phẩm là một quá trình phức tạp có thể mất 12 ÷ 15 năm và tốn kém Ý tưởng cho một mục tiêu có thể đến từ nhiều nguồn khác nhau bao gồm nghiên cứu học thuật và lâm sàng và từ lĩnh vực thương mại Xây dựng cơ sở bằng chứng hỗ trợ trước khi chọn mục tiêu cho một chương trình khám phá có thể mất nhiều năm Khi đã chọn được mục tiêu, ngành công nghiệp dược phẩm và gần đây là một số trung tâm học thuật đã đưa ra một số quy trình ban đầu để xác định các phân tử có các đặc tính phù hợp để tạo ra các loại sản phẩm được chấp nhận Đánh giá này sẽ xác định mục tiêu ban đầu, thông qua phát triển thử nghiệm, sàng lọc thông lượng cao, tối ưu hóa và cuối cùng là lựa chọn để phát triển lâm sàng [42].

Phương pháp xác định khả năng không gây độc đối với tế bào người nhằm đánh giá khả năng không gây độc của sản phẩm lên tế bào người khi sử dụng sản phẩm, phương pháp thực hiện trên HEK-glucosidase293 -glucosidase tế bào thận gốc phôi ở người (human embryonic kidney cells).

1.2.4 Tổng quan về quy trình sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe

1.2.4.1 Tổng quan về thực phẩm bảo vệ sức khỏe

a Khái niệm thực phẩm bảo vệ sức khỏe

Căn cứ vào khoản 1, điều 3, Nghị định 15/2018/NĐ-glucosidaseCP quy định: “Thực phẩm bảo vệ sức khỏe (Health Supplement, Dietary Supplement) là những sản phẩm được d ng để bổ sung thêm vào chế độ ăn uống hàng ngày nhằm duy trì, tăng cường, cải thiện các chức năng của cơ thể con người, giảm nguy cơ mắc bệnh”

Thực phẩm bảo vệ sức khỏe chứa một, nhiều hoặc hỗn hợp các chất sau:

- Vitamin, khoáng chất, acid amin, acid b o, enzyme, probiotic và chất có hoạt tính sinh học khác;

- Chất có nguồn gốc tự nhiên, bao gồm động vật, khoáng vật và thực vật dưới dạng chiết xuất, phân lập, cô đặc hay chuyển

hóa;

- Các nguồn tổng hợp của những thành phần được đề cập trên

Thực phẩm bảo vệ sức khỏe được trình bày ở dạng chế biến như viên nang, viên hoàn, viên nén, chế phẩm dạng cốm, bột, lỏng và các dạng bào chế khác, được phân liều thành các đơn vị liều nhỏ để sử dụng.

b Lợi ích của thực phẩm bảo vệ sức khỏe

- Bổ sung nhanh chóng chất dinh dưỡng và các chất có tác dụng chức năng mà cơthể không được cung cấp đầy đủ trong chế

độ ăn uống hàng ngày

- Có thể tạm thời thay thế bữa ăn khi không có điều kiện ăn uống bình thường

như khi ở môi trường thiếu thốn thực phẩm hoặc không thể ăn được vì l do bệnh tật

- Các chế phẩm đều ở dạng tinh chế rất tiện lợi, dễ sử dụng và bảo quản

- Có nhiều sản phẩm để chọn lựa ph hợp với tình trạng cơ thể từng người

- Mua và d ng dễ dàng không cần phải có thầy thuốc khám bệnh kê toa

- Khi sử dụng thực phẩm chức năng, người sử dụng sẽ có thức chăm lo cho sức khoẻ, thay đổi thói quen để có chế độ ăn

uống hợp l và lối sống lành mạnh có lợi cho sức khoẻ hơn

- Nguồn cung cấp dồi dào thường xuyên, mạng lưới rộng khắp

1.2.4.2 Tổng quan nguyên liệu chính sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe của đề tài

- Bột rễ mật nhân: Sản xuất cao chiết để sử dụng trực tiếp và bổ sung vào dây chuyền sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe.

- Nụ vối: Có tác dụng bình ổn đường huyết lâu dài, hỗ trợ giảm mỡ máu, chống oxy hóa, trị bệnh đái tháo đường Các nghiên

cứu trước đây cũng đã chứng minh nụ vối có nhiều tác dụng sinh học như:

- Kháng viêm [43];

- Kháng khuẩn [44];

- Kháng ung thư [45] [46];

- Tăng cường và kích thích tiêu hóa [46].

Rau má: Là loại rau tương đối phổ biến, có nhiều hoạt tính sinh học đáng qu đối với sức khỏe con người, thường thu hái

cả lá và dây Rau má được d ng như thực phẩm và thuốc trong dân gian, rau má có vị hơi đắng, ngọt, tính hơi mát, có tác dụng thanh nhiệt giải độc, tán ứ chỉ thống, lương huyết sinh tân, lợi niệu Rau má thường d ng để làm thuốc bổ dưỡng, sát trùng, chữa thổ huyết, tả l , khí hư, bạch đới, mụn nhọt, rôm sẩy Trong rau má có alkaloid là hydrocotulin và các glycosid, asiaticoside và

centellosid, có tác dụng tới các mô liên kết, giúp cho các mô tái tạo nhanh chóng, do đó làm các vết thương mau lành và lên da non [47].

Vào năm 2009, nhóm nghiên cứu Frederico Pittella và cộng sự đã công bố rằng dịch chiết rau má có hoạt động đáng kể chống lại khối u ác tính ở chuột (B16F1), ung thư vú ở người (MDA MB-glucosidase231) và các dòng tế bào chuột glioma (C6), với các giá trị

IC 50 lần lượt 698 g/mL, 648 g/mL và 1000 g/mL [48].

1.2.4.3 Quy trình sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe

Thực phẩm nói chung và thực phẩm bảo vệ sức khỏe nói riêng để được công nhận và được thương mại hóa bắt buộc phải tuân thủ quy định về chất lượng của sản phẩm thực phẩm theo Luật an toàn thực phẩm 55/2010/QH12 [49]; Nghị định số 15 năm

2018 về việc quy định chi tiết thi hành một số điều của Luật an toàn thực phẩm [50] Bên cạnh đó, hàm lượng chất bổ sung vào sản phẩm phải tuân theo quy định của Thông tư số 43/2014/TT-glucosidaseBYT -glucosidase quy định về quản l thực phẩm chức năng [51]; Thông tư 18/2019/ TT-glucosidaseBYT – hướng dẫn thực hành sản xuất tốt GMP trong sản xuất, kinh doanh thực phẩm bảo vệ sức khỏe [52] Vì vậy, quy trình sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe về cơ bản bao gồm các nội dung sau đây:

- Khảo sát hàm lượng bổ sung hoạt chất có hoạt tính sinh học;

- Xây dựng quy trình công nghệ sản xuất ;

- Kiểm tra chất lượng sản phẩm;

- Xây dựng dự thảo công bố sản phẩm trình cơ quan quản l nhà nước chuyên ngành thẩm định và phê duyệt

a Khảo sát hàm lượng bổ sung hợp chất có hoạt tính sinh học

Việc bổ sung một lượng hợp chất có hoạt tính sinh học được chiết xuất từ thiên nhiên vào thực phẩm sẽ ảnh hưởng đến chỉ tiêu chất lượng sản phẩm thành phần hóa học, cảm quan v v… , đặc biệt, với mật nhân có vị đắng hậu vị rất khó chịu, phương pháp chế biến nhằm giảm thiểu sự hao hụt, biến tính hoạt chất Trên cơ sở khảo sát hàm lượng hợp chất có hoạt tính cần bổ sung, tiến hành xây dựng quy trình sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe

b Xây dựng quy trình sản xuất sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe

Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất của một số sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe quy mô phòng thí nghiệm với nguyên liệu chính được nêu ở mục 1.2.4.2 và một số nguyên liệu bổ sung khác.

c Kiểm tra chất lượng sản phẩm

Kiểm tra chất lượng sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe nhằm đảm bảo sản phẩm đạt các chỉ tiêu chất lượng với liều lượng chất bổ sung đã xác định, đánh giá cảm quan thị hiếu người d ng, đồng thời, phải đảm bảo các chỉ tiêu an toàn thực phẩm theo quy định hiện hành.

Đây là cơ sở để nhà sản xuất xây dựng bản công bố chất lượng sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe và là một trong các tiêu chí quan trọng để đưa sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe ra thị trường

d Công bố chất lượng sản phẩm

Trường hợp công bố sản phẩm tự sản xuất, căn cứ điều 10, Thông tư 43/2014/TT-glucosidaseBYT, cá nhân, tổ chức cần đảm bảo các

yêu cầu sau:

- Thành phần chính tạo nên công dụng của sản phẩm phải được liệt kê trước c ng tên đầy đủ và hàm lượng Các thành phần

khác được liệt kê tiếp sau theo thứ tự giảm dần về khối lượng;

- Hàm lượng của vitamin, khoáng chất có trong thực phẩm tính theo liều khuyên d ng hằng ngày của nhà sản xuất phải đạt

được tối thiểu 15 % RNI;

- Hàm lượng tối đa của vitamin, khoáng chất có trong thực phẩm tính theo liều khuyên dùng hằng ngày của nhà sản xuất

không được vượt quá ngưỡng dung nạp tối đa của các vitamin và khoáng chất được quy định;

- Hàm lượng vitamin và khoáng chất có trong sản phẩm phải được ghi trên nhãn bằng số và phải được công bố dưới dạng tỷ

lệ phần trăm % tính theo RNI, dựa trên liều khuyên d ng hằng ngày của sản phẩm hoặc dựa trên một đơn vị sử dụng (serving size).

Trường hợp Việt Nam chưa có mức RNI và ngưỡng dung nạp tối đa thì áp dụng theo quy định của CODEX hoặc các tổ chức quốc tế có liên quan.

- Công bố khuyến cáo về sức khỏe Health claims :

 Công bố khuyến cáo về sức khỏe phải đúng bản chất của sản phẩm, chỉ công bố công dụng của thành phần cấu tạo có công dụng chính hoặc công bố công dụng hợp thành của những thành phần cấu tạo khi có bằng chứng khoa học chứng minh và không công bố công dụng theo cách liệt kê công dụng của các thành phần;

 Công bố khuyến cáo về sức khỏe, liều lượng, đối tượng sử dụng và cách d ng ph hợp phải thống nhất và ph hợp với các tài liệu tại hồ sơ;

 Khi hàm lượng vitamin, khoáng chất, các hoạt chất sinh học nhỏ hơn mức trong các tài liệu khoa học chứng minh thì không được công bố công dụng sản phẩm;

 Khi hàm lượng vitamin, khoáng chất, các hoạt chất sinh học đạt như trong tài liệu khoa học khuyến cáo thì được công

bố công dụng nhưng phải chỉ ra đối tượng, liều d ng ph hợp;

 Khi hàm lượng các thành phần cấu tạo chưa có mức RNI thì phải cung cấp tài liệu khoa học chứng minh về công dụng của thành phần đó c ng khuyến cáo liều d ng khi công bố

- Đối tượng sử dụng:

 Đối tượng phải ph hợp với công dụng đã công bố và được cơ quan nhà nước có thẩm quyền chấp nhận thông qua Bản xác nhận công bố ph hợp quy định an toàn thực phẩm;

 Phải cảnh báo đối tượng không được sử dụng nếu có

1.3 Tổng quan về tình hình nghiên cứu mật nhân trong và ngoài nước

Từ nhiều năm trước, các kết quả nghiên cứu về cây mật nhân ở nước ta và trên thế giới đã được công bố, đặc biệt là rễ của chúng, các nghiên cứu chủ yếu đề cập đến thành phần hóa học của các chất phân lập được, khảo sát hoạt tính sinh học của dịch chiết

và một số ứng dụng trong dược phẩm, thực phẩm có lợi cho sức khỏe.

1.3.1 Nghiên cứu về thành phần hóa học

Đã có nhiều công trình nghiên cứu trong nước và trên thế giới về phân lập, xác định thành phần hóa học của nhiều hợp chất đã được công bố từ những năm 1960 của thế kỷ trước, có thể nêu một số kết quả nghiên cứu sau:

Năm 1968, nhóm nghiên cứu Lê Văn Thới và Nguyễn Ngọc Sương đã phân lập được hợp chất β-glucosidasesitosterol, campesterol, 2,6-glucosidase dimetoxybenzoquinon và một số hợp chất có vị đắng là eurycomalacton từ cao chiết ête dầu trích từ vỏ và lá cây mật nhân bằng

kỹ thuật sắc ký cột hấp phụ trên alumin [53].

Năm 1982, nhóm nghiên cứu thuộc Trường Đại học Y Dược Hiroshima, Nhật đã phân lập được hai hợp chất quassinoid có

số oxy hoá cao có tên là eurycomanone và eurycomanol từ rễ cây mật nhân có nguồn gốc Indonesia [54].

Năm 1986, nhóm nghiên cứu của K.L.Chan và cộng sự đã tìm thấy hợp chất mới thuộc nhóm quassinoid là 3,4-glucosidase dihyroeurycomalacton, 5,6-glucosidasedehyroeurycomalacton, 6-glucosidasehydroxy-glucosidase5,6-glucosidasedehydroeurycomalacton và nhóm alkaloid có tên là 10-glucosidase hydroxycantin-glucosidase 6-glucosidaseon, tinh thể màu vàng từ cao ête dầu trích từ rễ cây mật nhân Ngoài ra, từ cao chloroform của rễ cây cũng phát hiện được một hợp chất coumarin là scopoletin [55].

Năm 1989, nhóm nghiên cứu của K L Chan và cộng sự đã phân lập được một quassinoid glycoside có tên là eurycomanol-glucosidase

2-glucosidaseO-glucosidase  -glucosidaseD-glucosidaseglucopyranosid trích từ cao n-glucosidase butanol của rễ cây mật nhân [56].

Năm 1982, nhóm nghiên cứu của Nguyễn Ngọc Sương và công sự đã phân lập

được hai hợp chất laurycolactone A và laurycolactone B, chúng là các quassinoid có bộ xương cơ bản C18 [57].

Tiếp theo vào năm 1991, nhóm nghiên cứu của K L Chan và cộng sự đã phân lập được từ hợp chất 13β,18-glucosidase dihydroeurycomanol, kết tinh trong methanol từ dịch trích từ rễ cây với ête dầu [58].

Nhóm Kadono và công sự đã công bố kết quả nghiên cứu các thành phần gây độc tế bào và chống sốt r t của rễ, đã phân lập được bốn alkaloid thuộc nhóm canthin-glucosidase 6-glucosidaseone đó là 9-glucosidasemethoxycanthin-glucosidase6-glucosidaseone, 9-glucosidasemethoxycanthin-glucosidase6-glucosidaseone-glucosidaseN-glucosidaseoxide, 9-glucosidase hydroxycanthin-glucosidase6-glucosidaseone và 9-glucosidasehydroxycanthin-glucosidase6-glucosidaseone-glucosidaseN-glucosidaseoxide và -glucosidasecarboline-glucosidase1-glucosidasepropionic acid vào năm 1991 [59].

Cũng vào năm 1991, nhóm nghiên cứu của H Tada và cộng sự đã phân lập được hợp chất paskbumin A eurycomanon và hai hợp chất mới cũng có khung sườn quassinoid là pasakbumin B, pasakbumin C từ cao chiết methanol [60] Nhóm nghiên cứu thuộc trường đại học y dược, Tokyo -glucosidase Nhật trong quá trình nghiên cứu hoạt tính sinh học của cây mật nhân đã phân lập được hai hợp chất mới với khung squallan Đây đồng thời là hai đồng phân lập thể của nhau, một là eurylen, một là teurylen, cả hai đều có dạng tinh thể không màu, có công thức phân tử là C 34 H 58 O 8 [61].

Năm 1993, nhóm nghiên cứu của H Itokawa và cộng sự đã phân lập được một hợp chất mang khung squallan tên là longilen peroxide, là một hợp chất không màu, có công thức phân tử là C H O [62].

Vào năm 2014, nhóm nghiên cứu của Seon Ju Park và cộng sự đã phân lập và định danh cấu trúc của năm hợp chất thuộc nhóm quassinoid: Eurylactone E, eurylactone F, eurylactone G, eurycomalide D, and eurycomalide E [63].

Năm 2015, nhóm nghiên cứu Lê Thị Huyền và cộng sự đã phân lập được 3 chất thuộc nhóm quassinoid từ dịch chiết

methanol của rễ cây mật nhân: Pasakbumin-glucosidaseC, 13α,21-glucosidaseepoxyeurycomanone and eurylactone A [64].

Năm 2017, nhóm nghiên cứu Nguyễn Hữu Tùng và cộng sự đã tìm ra một quassinoid glycoside mới và thành phần hoạt chất tiềm năng eurycomanone từ E longifolia trong điều trị bệnh bạch cầu từ rễ cây mật nhân ở Malaysia [65].

Bảng 1.1 Danh mục các hợp chất được phân lập từ cây mật nhân

1 β-glucosidasesitosterol, campesterol, 2,6-glucosidase dimethoxy benzoquinone, 5,6-glucosidase

10 15 -glucosidasehydroxyklaineaone, longilactone, 2-glucosidasehydroxylongilactone-glucosidase

4(18)-glucosidaseene, eurycomaoside, 13,21-glucosidasedihydroeurycomaone, 14,15

–dihydroxyklaineanone

[65]

11 12-glucosidaseacetyl-glucosidase13, 21-glucosidasedihydroeurycomanone, longilene peroxide,

eurylene, 14,15p-glucosidasedihydroxyklaineanone, triperpenes, 14-glucosidase

deaacteyl eurylene, eurycomalactone E, 9-glucosidasemethoxycanthin 6-glucosidase

one-glucosidaseN-glucosidaseoxid, eurycomalactone F, 9-glucosidasehydroxycanthin-glucosidase6-glucosidaseone, 5-glucosidase

iso-glucosidaseeurycomadilactone, 9-glucosidasehydroxycanthin-glucosidase6-glucosidaseone-glucosidaseN-glucosidaseoxid, 6-glucosidase

dehydroxylongilactone, biphenylneolignans, 7 -glucosidase

hydroxyeurycomalactone, eurycomalactone D, 6 -glucosidaseacetoxy-glucosidase

14,15 -glucosidasedihydroxyklaineanone, 18-glucosidasedehydro-glucosidase6 -glucosidase

hydroxyeurycomalactone, 12-glucosidaseepi-glucosidase11-glucosidasedehydroklaineanone,

eurycomalactone, 11-glucosidasedehyroklaineanone, dihydroniloticin, 9-glucosidase

metoxycanthin-glucosidase6-glucosidaseone, eurycomalide B, eurycomalide A, 15 -glucosidase

O-glucosidaseacetyl-glucosidase14-glucosidasehydroxyklaineanone, hispidone, piscidinol,

bourjotinolone, 14-glucosidaseep-glucosidase13,21-glucosidasedihydro eurycomaone, 3-glucosidase

episapeline, 6 -glucosidase14,15 -glucosidasetrihydroxyklaineanone, melianone, 9,10-glucosidase

dimetoxycanthin-glucosidase6-glucosidaseone, 7-glucosidasemethoxyinfractin, 13 ,21-glucosidase

dihydroeurycomaone, 2,3-glucosidasedihyroxy-glucosidase1-glucosidase propan-glucosidase1-glucosidaseone,

dehydrolongilactone, 7-glucosidasemethoxy-glucosidase -glucosidasecarboline-glucosidase1-glucosidasepropionic acid,

2,3-glucosidasedehydro-glucosidase4a-glucosidasehydroxylongilactone, pasakbumin D

[66]

Kết quả tổng hợp từ bảng 1 1 cho thấy, thành phần hoá học của mật nhân rất phong phú và đa dạng, chúng đã được phân lập và chứng minh có nhiều hoạt tính sinh học đáng qu

1.3.2 Nghiên cứu về hoạt tính sinh học

Bên cạnh những nghiên cứu về thành phần hóa học, trong nước và trên thế giới cũng có nhiều nghiên cứu có giá trị về hoạt tính sinh học của dịch chiết từ cây mật nhân, trong đó, dịch chiết từ rễ chiếm đa số.

Năm 1989, K L Chan và cộng sự đã thử nghiệm dịch chiết của rễ cây mật nhân cho thấy có họat tính chống ký sinh trùng

sốt rét Plasmodium falciparum trong điều kiện in vitro Các hợp chất phân lập trong cây mật nhân là: 10-glucosidasehydroxycanthin-glucosidase6-glucosidaseone,

eurycomalactone, eurycomanone và eurycomanol cho tác dụng chống sốt rét [56].

Năm 1991, nhóm nghiên cứu của Kardono và cộng sự đã phân lập được năm thành phần có khả năng gây độc tế bào từ rễ mật nhân từ vùng Kalimantan, Indonesia, có một quassinoid là eurycomanone có tác dụng gây độc tế bào chống một số dòng tế bào ung thư như: Vú, đại tràng, phổi, da, các dòng tế bào kháng thuốc KB, KB-glucosidaseV1 và bệnh bạch cầu (P-glucosidase388) Ngoài ra các hợp chất

eurycomanone và 7-glucosidasemethoxy-glucosidaseP-glucosidase carboline-glucosidase1-glucosidasepropionic acid cho thấy chống lại ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum [59].

Năm 1991, nhóm nghiên cứu của H.Itokawa và cộng sự đã phát hiện một số hợp chất thuộc nhóm triterpen với khung tirucallan, niloticin, hydroniloticin, piscidinol A, bourjotinolon A, 3-glucosidaseepisapelin A, melianon, hispidon, các hợp chất này được công

bố có độc tính đối với một số loại tế bào ung thư [61].

Năm 2004, nhóm nghiên cứu của Kuo và cộng sự đã phân lập và xác định được gần 65 hợp chất từ rễ mật nhân Trong đó tám hợp chất đã chứng minh khả năng gây độc mạnh đối với dòng tế bào ung thư phổi (A-glucosidase549), bảy hợp chất tác chống lại dòng tế

bào ung thư vú MCF-glucosidase7 Hai trong số các hợp chất có tác dụng mạnh với ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum [68].

Năm 2009, nhóm nghiên cứu của Dương Thị Ly Hương và cộng sự đã nghiên cứu hoạt tính androgen trên chuột cống trắng

ở dịch chiết nước rễ cây mật nhân nhận thấy rằng ở liều uống 10 mL/kg thể trọng, trọng lượng các cơ quan sinh dục cơ nâng hậu môn, tinh hoàn, túi tinh đều tăng hoặc có xu hướng tăng ở các lô chuột uống dịch chiết rễ mật nhân Mức độ tăng ở lô dùng testosterol cao hơn rất nhiều so với lô dùng mậtnhân (p < 0,0001) [69].

Khoảng thời gian từ năm 2010 đến năm 2012, nhóm nghiên cứu Tambi và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu trực tiếp trên người, tiến hành cho 76 người trong 320 người bệnh nhân bị suy giảm testosterol uống mật nhân với liều 200 mg trong vòng một tháng Kết quả là có sự tăng testosterol trong huyết thanh [70] [71].

Năm 2015, nhóm nghiên cứu của Khanam và cộng sự đã nghiên cứu và chỉ ra rằng: Các hợp chất phenolic, flavonoid, terpenoid, alkaloid, protein trong chiết xuất từ thân cây và từ rễ thể hiện hoạt động kháng khuẩn, tuy nhiên, hoạt tính kháng khuẩn cao nhất đã được quan sát chống lại vi khuẩn gram dương bằng cả chiết xuất từ thân và rễ Tuy nhiên, chiết xuất từ thân cây mạnh

hơn chiết xuất từ rễ chống lại Bacillus cereus và Staphylococcus aureus [21].

Năm 2017, nhóm tác giả Trần Thu Trang và cộng sự đã khảo sát hoạt tính sinh học của cao chiết methanol từ rễ tơ và rễ tự nhiên cây bá bệnh tại vườn quốc gia Bái Tử Long, khu bảo tồn thiên nhiên Đồng Sơn -glucosidase Kỳ Thượng, Hoành Bồ, Quảng Ninh Kết quả cho thấy cao chiết methanol từ rễ tơ và rễ tự nhiên ức chế sản xuất cytokine gây viêm IL-glucosidase6 kích thích bởi lipopolysaccharide (LPS) ở dòng tế bào THP-glucosidase1 với IC 50 tương ứng là 3,6 và 6,6 (µg/mL) Cao chiết methanol từ rễ tơ và rễ tự nhiên có hoạt tính gây độc tế bào ung thư ở mức trung bình trên các dòng tế bào HepG2, LU-glucosidase1, MCF-glucosidase7 với IC 50 tương ứng là 77,4; 61,1; 88,2 (µg/mL) và 63,8, 46,2, 54,8 (µg/mL) Tuy nhiên, cả hai loại cao chiết nghiên cứu đều không có khả năng ức chế quá trính peroxy hoá lipid (IC 50 > 100) [72].

Năm 2018, nhóm tác giả Lê Thanh Liêm và cộng sự đã phân lập và chứng minh hoạt tính kháng viêm của hợp chất 9,10-glucosidase dimethoxy-glucosidasecanthin-glucosidase6-glucosidaseone có trong rễ cây mật nhân tại Kỳ Sơn – Nghệ An [16].

Năm 2020, nhóm nghiên cứu Ying Zhang và cộng sự đã nghiên cứu khả năng ức chế tế bào đại thực bào sinh NO của dịch chiết nước từ rễ cây mật nhân tại Thái Lan [73].

Với những kết quả nghiên cứu nêu trên cho thấy, cây mật nhân, đặc biệt là rễ rất có giá trị, chúng thể hiện hoạt tính sinh học phong phú và giá trị cao.

1.3.3 Nghiên cứu về phương pháp chiết

Đối với việc chiết các hợp chất hữu cơ thiên nhiên, hiện có hai phương pháp

được các tác giả trong và ngoài nước sử dụng phổ biến trong các nghiên cứu là Soxlet và chưng ninh

Nhóm nghiên cứu của Thiam Tsui Tee và cộng sự vào năm 2005 đã khảo sát hoạt tính kháng tế bào ung thư vú ở người MCF-glucosidase7 từ dịch chiết rễ cây mật nhân bằng phương pháp chiết Soxhlet [24].

Nhóm nghiên cứu của Đào H ng Cường và cộng sự năm 2010 đã so sánh hai phương pháp chiết Soxhlet và chưng ninh vỏ quả măng cụt, kết quả phương pháp chưng ninh cho hiệu quả tối ưu hơn [22].

Nhóm nghiên cứu của Anisa và cộng sự năm 2011 đã sử dụng phương pháp chưng ninh trong dung môi ethanol 96 % trong 24 giờ để định tính hợp chất alkaloid và terpenoid trong rễ và thân của cây mật nhân [20].

Nhóm nghiên cứu của Zakia Khanam và cộng sự vào năm 2015 đã nghiên cứu việc chiết các chất từ methanol, acetone, ethyl acetate, chloroform và ete dầu hỏa của thân và rễ cây mật nhân bằng phương pháp chưng ninh để thử hoạt tính sinh học của các dịch chiết [21].

Nhóm nghiên cứu của Nursyazura Khari và cộng sự vào năm 2014 đã sử dụng phương pháp chưng ninh trong nước rễ cây mật nhân để xác định hàm lượng eurycomanone bằng HPLC, từ đó, ứng dụng vào sản xuất thương mại [23].

Năm 2015, nhóm nghiên cứu của Trương Thị Minh Hạnh và cộng sự đã công bố kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết của rễ cây mật nhân ở Thừa Thiên-glucosidase Huế bằng phương pháp chưng ninh [26].

Năm 2017, nhóm nghiên cứu của Trương Thị Minh Hạnh và cộng sự đã nghiên cứu quá trình chiết rễ cây mật nhân ở Thừa Thiên Huế bằng phương pháp ngâm chiết và chưng ninh [74].

Từ các nghiên cứu trên nhận thấy, hầu hết các tác giả sử dụng phương pháp chiết Soxhlet và chưng ninh để khảo sát thành phần hóa học, thăm dò hoạt tính sinh học và ứng dụng bổ sung vào thực phẩm.

1.3.4 Nghiên cứu về ứng dụng mật nhân trong thực phẩm

Nhiều nước trên thế giới đã nghiên cứu sản xuất các sản phẩm chứa các thành phần có lợi từ chiết xuất từ rễ cây mật nhân

và bán ra thị trường: Mỹ, Canada, Nhật, Singapore, Nga, Hong Kong, Malaysia [75].

Bảng 1.2 Một số sản phẩm mật nhân được bán trên thị trường ở một số nước trên thế giới

Tên quốc gia/ vùng

lãnh thổ Đối tượng sản phẩm thị trường Thời gian bắt đầu đưa vào

Bảng 1.3 Một số sản phẩm và liều lượng mật nhân sử dụng tại EU

(a) Viên giải độc gan Tuệ Linh [76] (b) Sâm Alipas [77]

(c) Rocket 1h [78] (d) Viên hộ gan KingPhar [79]

(d) PQA mật nhân [80] (e) Hadariki Tongkat Ali [81]

Hình 1.2 Một số sản phẩm hỗ trợ sức khỏe có chứa thành phần mật nhân

- Viên giải độc gan Tuệ Linh với thành phần có chứa 250 mg/100 g cao mật nhân kết hợp với cao cà gai leo, là sản phẩm

giúp hỗ trợ điều trị viêm gan siêu vi nhất là viêm gan siêu vi B mãn tính thể hoạt động, hỗ trợ điều trị men gan tăng cao, làm thuyên giảm các triệu chứng của bệnh gan như đau tức hạ sườn, vàng da, mệt mỏi [76].

- Sâm Alipas có nguồn gốc 100 % từ thiên nhiên với 160 mg/100 g tinh chất thảo

dược qu mật nhân, có công dụng kích thích quá trình sản sinh nội tiết tố nam testosterone tự nhiên, tăng cường sức khỏe sinh l ở nam giới; hỗ trợ lợi mật, tăng cường chức năng gan và điều hòa đường huyết ở người mắc bệnh tiểu đường [77].

- Rocket 1h giúp tăng sinh testosterone, giúp bổ thận dương, tăng cường sinh lực, sức bền sinh l , giúp làm chậm quá trình

mãn dục ở nam giới như: Người mệt mỏi, đau lưng, mỏi gối, rối loạn cương dương, xuất tinh sớm Trong mỗi viên chứa 121 mg/100

g tinh chất mật nhân [78].

- Viên hộ gan Kingphar với thành phần mỗi viên chứa cao cà gai leo: 300 mg, cao mật nhân: 120 mg, cao diệp hạ châu: 100

mg, cao xuyên tâm liên: 50 mg trong 100 g, hỗ trợ điều trị các bệnh l về gan, giúp tăng cường chức năng giải độc gan và bảo vệ tế bào gan [79].

- PQA mật nhân có chứa 400 mg/100 g mật nhân mỗi viên có tác dụng bổ thận, tráng dương, dưỡng khí huyết, mạnh gân

cốt; hỗ trợ điều trị bệnh yếu sinh l , giúp tăng cường sinh lực; cải thiện trí lực, giúp cho đầu óc luôn minh mẫn và bớt căng th ng [80].

- Viên uống Tongkat Ali Swanson Passion 400 mg/100 g có khả năng điều trị rối loạn chức năng cương dương ED , cải

thiện khả năng tình dục, hỗ trị vô sinh ở nam giới, tăng khả năng vận động ở nam giới, nâng cao khả năng miễn dịch và giảm mỡ cơ thể [81].

Năm 2018, Bộ Khoa học và Công nghệ đã phê duyệt danh mục đặt hàng nhiệm vụ khoa học và công nghệ về quỹ gen cấp quốc gia thuộc chương trình bảo tồn và sử dụng bền vững nguồn gen đến năm 2025, định hướng đến năm 2030: “Nghiên cứu bảo

tồn, phát triển và sử dụng bền vững nguồn gen mật nhân eurycoma longifolia jack tại Nam Trung bộ và Tây Nguyên làm nguyên liệu

sản xuất thuốc” [82].

1.4 Đánh giá tình hình nghiên cứu cây mật nhân

Từ những thông tin tổng hợp ở trên cho thấy, nghiên cứu về cây mật nhân, đặc biệt là rễ của chúng đã được triển khai và công bố ở nhiều nơi trên thế giới, trong đó có Việt Nam chúng ta Nhiều hợp chất mới được phát hiện trong thành phần hóa học và nhiều đặc tính dược lý có giá trị đã được khảo sát và công bố trên các tạp chí khoa học uy tín Rất nhiều nước trên thế giới đã công

bố các sản phẩm thực phẩm hỗ trợ sức khỏe được chế biến từ mật nhân, trong đó có Mỹ, một số nước châu Âu, Nhật, Singapore, Malaysia.v.v [75].

Tại Việt Nam, các nghiên cứu về mật nhân đã công bố tương đối nhiều, kết quả được thực hiện trên nhiều nguồn nguyên liệu trên cả nước Tuy nhiên, đa phần là những nghiên cứu quy mô nhỏ, dưới dạng các bài báo khoa học chuyên ngành, chưa có nghiên cứu nào mang tính hệ thống và tính định hướng từ khảo sát nguyên liệu, chiết tách, thăm dò hoạt tính sinh học và ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm, đặc biệt đối với mật nhân tại khu vực miền Trung và Tây Nguyên, mặc dù thực tế, rễ cây mật nhân được bày bán khá phổ biến, đặc biệt là ở Quảng Nam, Huế và Gia Lai Bên cạnh đó, trên thị trường đã có một số sản phẩm dược phẩm, thực phẩm bảo vệ sức khỏe từ loài cây này, tuy nhiên, hiện chưa nhiều các sản phẩm ứng dụng mật nhân được sản xuất và kinh doanh mang tính thị hiếu vừa có tác dụng hỗ trợ sức khỏe, vừa có chức năng giải khát.

Chính vì vậy, với mong muốn bảo tồn và sử dụng nguồn gen quý cây mật nhân tại Tây Nguyên, góp phần bảo tồn và phát triển nguồn dữ liệu về loại thảo dược tại v ng này, đa dạng sản phẩm thực phẩm có tính ứng dụng, chúng tôi lựa chọn nghiên cứu

đề tài Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ chiết tách, xác định thành phần hóa học của rễ cây mật nhân (eurycoma longifolia jack) ở khu vực miền Trung - Tây Nguyên và ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm với những nội dung nghiên cứu cụ thể sau:

- Khảo sát khả năng kháng độc tế bào ung thư, kháng oxy hóa của dịch chiết rễ cây mật nhân ở huyện Phước Sơn -glucosidase tỉnh

Quảng Nam và huyện Ia Grai -glucosidase tỉnh Gia Lai nhằm đánh giá, lựa chọn nguồn nguyên liệu rễ cây mật nhân phục vụ nghiên cứu.

- Phân lập các hợp chất từ các cao chiết dung môi phân cực, phân cực trung bình và ít phân cực Định danh các hợp chất đã

phân lập, xác định thành phần, cấu trúc hóa học của các hợp chất thuộc nhóm alkaloid và những hợp chất không thuộc nhóm alkaloid.

- Tối ưu hóa một số yếu tố ảnh hưởng quy trình chiết trong dung môi nước và ethanol 80 % để xây dựng các quy trình chiết

tách, từ đó, sản xuất cao chiết mật nhân và bột mật nhân để bổ sung vào quy trình sản xuất sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe.

- Thăm dò hoạt tính kháng độc tế bào ung thư, kháng viêm, kháng vi sinh vật kiểm định, kháng oxy hóa, thử độc tính bất

thường, khả năng gây độc tế bào người của dịch chiết rễ cây mật nhân.

- Ứng dụng mật nhân để sản xuất sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe, đánh giá cảm quan, đánh giá an toàn vệ sinh thực

phẩm và công bố chất lượng các sản phẩm.

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu

2.1.1 Thu hái và định danh mẫu rễ cây mật nhân

Mẫu rễ cây mật nhân được thu hái tại v ng đồi núi tỉnh Gia Lai và Quảng Nam, các vùng này có rất nhiều loại cây dược liệu

a Chưa qua xử l b Sau khi cắt nhỏ c Bột rễ mật nhân

Hình 2.1 Một số hình ảnh của rễ mật nhân

Nguyên liệu chính sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe: Cỏ ngọt, la hán quả và cam thảo khô được mua tại nhà thuốc Đông y tại thành phố Đà Nẵng Nụ vối được thu hái tại v ng đất trồng ở Tràng An, Ninh Bình và được phơi khô Rau má được mua tại siêu thị ở Đà Nẵng.

2.2 Hóa chất, vật tư, thiết bị, dụng cụ

2.2.1 Hóa chất, vật tư

Một số hóa chất, vật tư chính d ng trong nghiên cứu như sau:

-glucosidase Ethanol, xuất xứ: Việt Nam, độ tinh khiết: 96%

-glucosidase Methanol, xuất xứ: Đức, độ tinh khiết: 99,9%

-glucosidase n-glucosidaseHexane, xuất xứ: Đức, độ tinh khiết: 99,9%

-glucosidase Ethyl acetate, xuất xứ: Đức, độ tinh khiết: 99,9%

-glucosidase Maltodextrin, xuất xứ: Trung Quốc, DE từ 10 ÷ 15

-glucosidase Đường tinh luyện, xuất xứ: Việt Nam, độ tinh khiết: 99,8%, độ màu ≤ 20 Icumsa.

-glucosidase Pectin, xuất xứ: Đức, HMP, DE > 50%, MI > 7%, DA = 0

Một số hóa chất, vật tư khác d ng trong nghiên cứu được nêu ở Phụ lục 1.

2.2.2 Thiết bị, dụng cụ

Các thiết bị, dụng cụ được sử dụng trong nghiên cứu như sau:

-glucosidase Cân phân tích, d = 0,0001 g (Model: TDX-glucosidaseA300, Marcus, Đức ;

-glucosidase Tủ sấy Model: UNB-glucosidase400, Memmert, Đức ;

-glucosidase Sắc k lớp mỏng: Bản mỏng nhôm tráng sẵn silicagel Meck 60 F 254 , dày 0,2 mm Quan sát dưới ánh sáng tử ngoại ở bước

sóng  = 254 nm và 365 nm, thuốc thử hiện màu vanilin/HSO (vanilin 1,2 g; MeOH 200 mL; CH COOH 25 mL; H SO 11 mL);

Đánh giá cảm quan Đánh giá cảm quan

Dịch chiết nướcXây dựng quy trình chiết:

Lựa chọn phương pháp chiết và khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng quá trình chiết Tối ưu hóa một số yếu tố ảnh hưởng quy trình chiết trong dung môi nước và ethanol 80 %

Dịch chiết ethanol 80 %

Thăm dò hoạt tính sinh học:

Kháng tế bào ung thư, kháng viêm, kháng oxy hóa, kháng khuẩn, kháng sinh Thử độc tính bất thường, độc tính với tế bào người Sản xuất bột mật nhân

Trà thảo mộc mật nhân Sản xuất cao chiết mật nhânNước rau má mật nhân

Bổ sung cao mật nhân Đánh giá ATVSTP Bổ sung bột mật nhân Chiết phân đoạn

Công bố chất lượng Đánh giá ATVSTP

Công bố chất lượng

Đánh giá ATVSTP Công bố chất lượng

-glucosidase Sắc k cột thường: Silicagel cỡ hạt 197 – 400 mesh (0,040 mm – 0,063 mm) cho cột đầu, sắc k cột nhanh: Silicagel

cỡ hạt 70 – 200 mesh, sắc k cột pha đảo: RP-glucosidase 18, sắc k lọc gel: sephadex LH-glucosidase20 Merck, nhựa Dianion HP-glucosidase20.

-glucosidase Thiết bị cô quay chân không Model: Hei-glucosidaseVAP precision, Heidolph, Đức ;

-glucosidase Hệ thống sắc k lỏng hiệu năng cao HPLC Model: Hitachi, Nhật ;

Các thiết bị, dụng cụ khác được sử dụng trong nghiên cứu được nêu ở phụ lục 1.

Hình 2.2 Sơ đồ tổng quát nội dung nghiên cứu

Rễ cây mật nhân được thu nhận từ vùng núi huyện Ia Grai -glucosidase tỉnh Gia Lai và vùng núi huyện Phước Sơn -glucosidase tỉnh Quảng Nam, nguyên liệu được khảo sát, đánh giá, lựa chọn nhằm sử dụng cho toàn bộ quá trình nghiên cứu Rễ cây mật nhân được xử lý sơ bộ, xay nhỏ thành bột, sau đó, chiết trong các hệ dung môi có độ phân cực khác nhau tạo thành dịch chiết để phân lập và định danh, xác định thành phần hóa học, cấu trúc hóa học của các hợp chất Từ kết quả đó, chúng tôi nghiên cứu chọn hàm mục tiêu để tối ưu hóa các thông số nhằm xây dựng quy trình chiết Ngoài ra, chúng tôi khảo sát hoạt tính sinh học các dịch chiết thu được để làm cơ sở cho quá trình ứng dụng bổ sung trong quy trình công nghệ sản xuất thực phẩm có lợi cho sức khỏe người tiêu dùng ở mô phòng thí nghiệm, đánh giá chất lượng và an toàn thực phẩm của các sản phẩm thu được Sản xuất cao chiết mật nhân và bột mật nhân để bổ sung vào quy trình công nghệ sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe, đánh giá cảm quan, an toàn thực phẩm, thời gian bảo quản và công bố chất lượng sản phẩm.

2.4 Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

2.4.1 Khảo sát, lựa chọn nguyên liệu

Các tiêu chí được sử dụng để đánh giá, lựa chọn nguyên liệu bao gồm:

-glucosidase Đánh giá sơ bộ thành phần hóa học và các chỉ tiêu hóa l được thực hiện tại các phòng thí nghiệm của Trung tâm kỹ thuật tiêu chuẩn đo lường chất lượng 2 – Tổng cục tiêu chuẩn đo lường chất lượng với các phương pháp phân tích sau:

 Phương pháp lấy mẫu thực vật: TCVN 8551:2010

 Phương pháp xác định hàm lượng protein: TCVN 8125:2015

 Phương pháp xác định hàm lượng lipit: TCVN 6555:2017

 Phương pháp xác định hàm lượng xơ thô: TCVN 5103:1990

 Phương pháp xác định hàm lượng đường tổng: KT2 K2 TN-glucosidase15/TP

 Phương pháp xác định hàm lượng kim loại nặng: AOAC 999 11

-glucosidase Sàng lọc một số hoạt tính sinh học của dịch chiết như:

 Thử khả năng kháng độc tế bào ung thư: Sử dụng phương pháp xác định khả năng gây độc tế bào ung thư cytotoxic assay đối với tế bào nuôi cấy dạng đơn lớp [29] Thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm của Viện sinh học – Viện hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam.

 Thử khả năng kháng oxy hóa: Sử dụng phương pháp đánh giá thông qua phản ứng bao vây gốc tự do DPPH để đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết vì

Cô quay chân không (Áp suất: 72 mbar, nhiệtđộ: 60 0C, số vòng quay: 40 vòng/phút

Cao chiết nước

+ Tỷ lệ dung môi/

nguyên liệu: 20 mL/1 g

Hình 2.3 Sơ đồ chưng cất tạo cao chiết nước

Lọc

Cao chiết nước (40 g)

F8 (1,7 g)(F8 + F9)

F3 (17 g)(F3 + F7)

F8.1F8.19chọn F8.12 (200 mg) F3.1F3.15

chọn F3.6 (0,12 g)

F3.1F3.15chọn F3.2 (1,2 g)

F8.12.1F8.12.7

chọn F3.6.2 F3.2.1F3.2.14chọn F3.2.12

EL1B (10 mg) (trắng)

EL1C (5 mg) (trắng)

EL5 (6 mg) (trắng)

EL4 (6 mg) (vàng)

SKC Sephadex (2 lần) SKC

Sephadex

SKC Sephadex (2 lần)

SKC silicagel, hệ dung môi DCM:MeOH 95:5 , thu được 4 phân đoạn

SKC silicagel, hệ dung môi CH2Cl2:MeOH 95:5 tăng dần đến tỷ lệ 1:1 , thu được 14 phân đoạn SKC Sephadex, rửa giải bằng MeOH, thu được 7 phân đoạn

SKC silicagel, hệ dung môi CH2Cl2:MeOH 9:1tăng dần đến 1:1), rửa giải bằng hệ dung môi MeOH:H2O (1:1), thu được 15 nhóm phân đoạn SKC silicagel, hệ dung môi CH2Cl2:MeOH

98:2 tăng dần đến 1:1), thu được 19 phân đoạn

SKC silica gel, hệ dung môi rửa giải 100% H2O; MeOH:H2O (9:1); MeOH:H2O (8:2);

MeOH:H2O (5:5) và MeOH 100%thu được 15 phân đoạn F1-F15)

Hình 2.4 Sơ đồ phân lập các chất nhóm alkaloid

Tiến hành chưng ninh hồi lưu trong nước 4 kg bột rễ cây mật nhân ở nhiệt độ 70 oC

trong 120 phút với tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu là 20 mL/g theo sơ đồ hình 2.3 Sau khi loại

bỏ dung môi bằng phương pháp cô quay chân không thu được 40 g cặn chiết nước Cho 40

g cặn chiết nước qua hệ thống sắc ký cột với chất hấp phụ là Diaion đường kính cột d = 60

mm; chiều dài lớp Diaion l = 800 mm); hệ dung môi rửa giải 100% H2O; MeOH:H2O

(9:1); MeOH:H2O (8:2); MeOH:H2O (5:5) và

MeOH 100 %, thu được 15 nhóm phân đoạn chính, ký hiệu từ F1 đến F15

Phân đoạn F8 và F9 được gộp lại ký hiệu F8 (1,7 g được tách bằng sắc ký cột,chất hấp phụ silicagel Merck (cỡ hạt 0,043 mm -glucosidase 0,063 mm) rửa giải bằng hệ dung môi

CH2Cl2:MeOH 98:2 sau đó, tăng dần đến tỷ lệ 1:1, thu được 19 phân đoạn, được ký hiệu

là F8 1 đến F8 19 Phân đoạn F8 12 200 mg được tách qua sắc ký cột sephadex rửa giảibằng MeOH thu được 7 nhóm phân đoạn ký hiệu từ F8.12.1 đến F8 12 7 Phân đoạn F8.12.3sau hai lần được tách bằng sắc ký cột sephadex thu được 10 mg chất sạch rắn, màu trắng k

hiệu là EL1B (chất 1) và 5 mg chất rắn màu trắng EL1C (chất 4).

Phân đoạn F3 và F7 được gộp lại ký hiệu F3 17 g và được tách bằng sắc ký cột, chấthấp phụ silicagel Merck (cỡ hạt 0,043-glucosidase0,063 mm) rửa giải bằng hệ dung môi

CH2Cl2:MeOH 9:1 sau đó, tăng dần đến tỷ lệ 1:1 và cuối cùng rửa giải cột bằng hệ dungmôi MeOH:H2O 1:1 , thu được 15 nhóm phân đoạn ký hiệu từ F3.1 đến F3 15

Phân đoạn F3.2 (1.2 g được tách bằng sắc ký cột silicagel rửa giải bằng hệ dung môi

CH2Cl2:MeOH 95:5 sau đó, tăng dần đến tỷ lệ 1:1, thu được 14 phân đoạn ký hiệu từ F 3

2 1 đến F3.2.14

Phân đoạn F3.2.12 (20 mg) sau hai lần qua cột Sephadex thu được 6 mg chất

sạch dạng rắn màu vàng ký hiệu EL4 (chất 2) Phân đoạn F3.6 (0,12 g) tách bằng sắc ký

cột silicagel hệ dung môi DCM:MeOH 95:5 thu được 4 phân đoạn Phân đoạn F3.6.2

được tách bằng sắc k thu được 4 mg chất sạch màu trắng ký hiệu EL5 (chất 3).

Quá trình phân lập các hợp chất từ cao chiết nước của rễ cây mật nhân được mô tả ởhình 2.3 và hình 2.4 [5]

Chiết trong ethyl acetate

Hình 2.5 Sơ đồ tạo cao chiết n-henxane và cao chiết ethyl acetate

PĐE 34 550 mg

PĐE 34 1 PĐE 34 5chọn PĐE 34 2 1,2 g

MN.34.2 (6 mg) (trắng)

SKC, dung môi rửa giải là MeOH/H2O 1/1 thu được 5 phân đoạn PĐE 34 1- PĐE 34 5

PĐE 25

SKC silica gel, hệ dung môi rửa giải CH2Cl2/MeOH 9,5:0,5 tăng dần đến 8:2 thu được 92 phân đoạn PĐE 1- PĐE 92

Cao chiết n-hexane (4,1 g)

PĐH 1…PĐH 10chọn PĐH6

MNH1 (6 mg)(vàng)

SKC silica gel, hệ dung môi rửa giải CH2Cl2/MeOH 9,5:0,5 tăng dần đến 9:1 thu được 10 phân đoạn PĐH1- PĐH10

MN.25.10 (20 mg)(trắng)

Cao chiết ethyl acetate (35 g)

Hình 2.6 Sơ đồ phân lập các chất không thuộc nhóm alkaloid

Tiến hành chiết Soxhlet trong n-glucosidasehexane 3 kg bột rễ cây mật nhân trong 7 lít dung môitrong 24 giờ, dịch chiết được lọc, gộp lại và cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được 4,1

g cặn Phần bã được ngâm chiết với ethanol 85 % 3 kg bã được chiết trong 8 lít dung môitrong 3 giờ), khuấy ở nhiệt độ 50 oC và tiếp tục để ngâm qua đêm Sau ba lần chiết, dịch chiếtđược lọc và quay cất dưới áp suất giảm đến thể tích khoảng 500 mL Cho ethyl acetate vào,chiết phân lớp ba lần (mỗi lần 250 mL) Dịch chiết ethyl acetate được gộp lại, cất loại dungmôi dưới áp suất giảm thu được 69,1 g cặn chiết ethyl acetate

Cao chiết n-glucosidasehexane 4,1 g được phân tách bằng sắc ký cột silicagel với hệ dung môirửa giải là CH2Cl2:MeOH (9,5:0,5 tăng dần đến 9:1 thu được 10 phân đoạn Ở phân đoạn 6

thu được 6 mg một chất sạch màu vàng hình kim kết tinh được ký hiệu là MNH1 (chất 5).

Cao chiết ethyl acetate 35 g được phân tách bằng cột silicagel với hệ dung môi rửagiải là CH2Cl2:MeOH 9,5:0,5 tăng dần đến 8:2 thu được 92 phân đoạn ký hiệu từ PĐE 1 đếnPĐE 92 Phân đoạn PĐE 25 có 20 mg chất sạch dạng bột màu trắng kết