Tài liệu Niên luận sinh học khóa 33 “Pseudomonas stutzeri khử đạm trong môi trường nước” docx

Theo một số tác giả nghiên cứu chất lượng của môi trường nước ở khu vực Đồng Bằng Sông Cửu Long thì việc quản lý chất lượng môi trường nước là một khâu vô cùng quan trọng và có ý nghĩa q

ĐỀ TÀI

“Pseudomonas stutzeri khử

đạm trong môi trường nước”

Giáo viên hướng dẫn : Sinh viên thực hiện : Đỗ Minh Liêu

GIỚI THIỆU SƠ LƯỢC

Xã hội loài người càng phát triển nhu cầu xã hội ngày càng cao đòi hỏi con người sử dụng nhiều biện pháp khác nhau để tăng năng suất sản lượng sản phẩm Với công cụ lao động ngày càng cải tiến cùng nhịp độ phát triển của khoa học kỹ thuật, những hoạt động nhằm mục đích kinh tế này cũng là nguyên nhân cơ bản làm ô nhiễm môi trường Ở Việt Nam cho đến bây giờ người ta có thể nhận định rằng: nhịp độ phát triển của xã hội cũng là một thước đo về sự ô nhiễm của môi trường, và vấn đề quản lý càng trở nên càng khó kiểm soát Chẳng hạn như trong môi trường nuôi trồng thuỷ sản từ các chất hữu cơ dư thừa như: thức ăn, rác thải, phân,… tích thụ dưới đáy ao nuôi Các nghiên cứu của Boyd, 1985, Gross và cộng

sự, 1998 cho thấy cá da trơn chỉ hấp thu được 27 -30% nitrogen, 16 – 30% photpho và khoảng 25% chất hữu cơ đưa vào từ thức ăn. Ngoài ra, các sản phẩm thuốc, hóa chất được sử dụng trong quá trình nuôi trồng thủy sản chưa phân hủy hoàn toàn Đây là các nguyên nhân gây ra các khí độc như: ammoniac, nitrite, hydrogen sulfua,… có ảnh hưởng không ít đến con người và các sinh vật khác có thể bằng con đường trực tiếp hay gián tiếp

Theo một số tác giả nghiên cứu chất lượng của môi trường nước ở khu vực Đồng Bằng Sông Cửu Long thì việc quản lý chất lượng môi trường nước là một khâu vô cùng quan trọng và có ý nghĩa quyết định đến sự thành công trong nuôi trồng thủy sản đặc biệt với các mô hình thâm canh Ngoài ra, còn có thể gây nên một số nguy hiểm cho người sử dụng, nitrate có thể tạo ra triệu chứng thiếu vitamin và kết hợp với các amin khác để tạo nên hiện tượng phú dưỡng làm cho môi trường ô nhiễm nặng Nitơ amon có mặt trong nước cũng làm giảm hiệu quả của khâu khử trùng bằng clorin, ngay cả trong môi trường đất khi hàm lượng nitơ quá nhiều, đất cũng sẽ bị chay cứng,… Chính vì vậy, việc nghiên cứu ứng dụng những vi sinh vật có tiềm năng sinh học khử được các hợp chất chứa nitơ vô cơ là

rất cần thiết, điển hình là vi khuẩn Pseudomonas stutzeri là loài có tính đa dạng

cao và phân bố ở vùng địa lý rộng Vi khuẩn Pseudomonas stutzeri Vi khuẩn

Pseudomonas stutzeri có khả năng khử đạm, quá trình này làm giảm tác hại ô

nhiễm môi trường Hiện nay, vi khuẩn này đã và đang được nhiều nhà khoa học nghiên cứu, nhưng ở tại Việt Nam những nghiên cứu và ứng dụng về loài vi khuẩn này còn rất nhiều hạn chế Vì vậy, thực hiện đề cương niên luận sinh học về

“Pseudomonas stutzeri khử đạm trong môi trường nước” là điều cần thiết.

I NỘI DUNG

1. Giới thiệu về đạm

Đạm tồn tại dưới dạng đơn chất hay hợp chất chứa nitrogen (N), N là một nguyên tố quan trọng đối với đời sống sinh vật hay trong sinh quyển; cuộc sống không thể tồn tại nếu không có nitơ Nó chiếm tới 78% thành phần của khí quyển Nitơ là thành phần cấu tạo nên các axit amin, protein

Trong đời sống của thực vật, nó được thực vật hấp thụ trước hết là dạng NH4+

và dạng NO3-, nhưng các hợp chất này thường có rất ít trong các thủy vực Do đó, trong các thủy vực đạm thường là nhân tố giới hạn cho đời sống các sinh vật Sự tạo thành các hợp chất hữu cơ trong thủy vực phụ thuộc đáng kể vào hàm lượng

NH4 và NO3- trong thủy vực Trong các thủy vực hầu như toàn bộ N được liên kết với các protein trong cơ thể sống Tuy nhiên các hoạt động của động vật thủy sinh ammonia (NH3) luôn được bài tiết ra hoặc sau khi chúng bị chết đi bị các vi sinh vật phân hủy giải phóng NH3 ra môi trường, trả N lại cho thủy vực Đây chính là nguồn dinh dưỡng cung cấp trực tiếp sau khi NH3 bị oxy hóa thành nitrate

Nói một cách ngắn gọn hơn hơn ở môi trường thủy sản, amoni tồn tại dưới dạng NH3 hoặc NH4+ tùy thuộc vào môi trường có pH cao thì amoni dễ chuyển thành NH3 , có độc tính cao NH3 có độc tính cao hơn NH4+ vì NH3 không mang điện tích dễ dàng thấm qua mang cá, đồng thời có khả năng hòa tan chất béo, còn

NH4+ là ion có kích thước lớn hơn nên khó thấm qua tế bào mang cá Chỉ số NH3

cho phép trong môi trường ao nuôi cá, tôm là 3.0 mg/l Do đó, nếu nước thải có hàm lượng amoni cao thải vào môi trường sẽ làm chết tôm cá trong thời gian ngắn

Amoni sẽ chuyển thành nitrite nhờ vi khuẩn oxy hóa amon kết hợp với oxy trong nước (Phạm Văn Tuy, Vũ Nguyên Thành, 2007)

NH3 + 3O2 HNO2 + 2H2O

Ngoài ra, sự hiện diện của nitrite và ion nitrate trong nước uống là mối hiểm họa tiềm tàng đe dọa sức khỏe cộng đồng

Trong môi trường nước, nitrogen có thể tồn tại dưới dạng N2, hay dưới dạng hợp chất vô cơ, hữu cơ hòa tan hoặc không hòa tan Các hợp chất vô cơ hòa tan quan trọng như là: NH3, NH4+, NO2-, NO3-

Dạng N2 chủ yếu là khuếch tán ngoài không khí vào hoặc còn có thể được hình thành trong quá trình của phản ứng Nitrate hóa Các hợp chất vô cơ dưới dạng albumine, dưới tác động của vi sinh vật đạm albumine sẽ biến thành đạm ammonia (NH4 )

NH3 và muối của nó sẽ biến thành dạng đạm nitrite (NO2-) và nitrate (NO3-) nhờ hoạt động của vi khuẩn nitrite và nitrate hóa Tuy nhiên một số loài vi khuẩn

và tảo cũng có khả năng đồng hóa nitơ phân tử

NH3 trong thủy vực cung cấp từ quá trình phân hủy bình thường từ các protein xác bả thực vật phù du, sản phẩm bài tiết của động vật hay từ phân bón vô cơ, hữu cơ

(NH2)2CO + 2H2O (NH4)2CO3

(NH4)2CO3 2 NH3 + CO2 + H2O

NH3 là loại khí độc đối với cá, khi tạo thành sẽ phản ứng nước sinh ra ion

NH4 cho đến khi cân bằng được thiết lập Theo Colt và Armstrong (1979) (trích dẫn bởi Boyd, 1990) tác động độc hại của NH3 đối với cá khi hàm lượng của nó trong nước cao, thì cá khó bài tiết NH3 từ máu ra môi trường ngoài NH3 trong máu

và các mô làm tăng pH máu tăng lên dẫn tới các rối loạn những phản ứng xúc tác enzyme và độ bền vững của màng tế bào, làm thay đổi độ thẩm thấu của màng tế bào đưa đến cá chết vì không điều khiển được quá trình trao đổi muối giữa cơ thể

vi khuẩn oxy hóa amon

và môi trường ngoài NH3 cao cũng làm tiêu hao oxy của mô, làm tổn thương mang và giảm khả năng vận chuyển oxy của máu

NH4 trong nước cũng rất cần thiết cho sự phát triển của các sinh vật làm thức

ăn tự nhiên nhưng nếu hàm lượng NH4+ quá cao sẽ làm cho thực vật phù du phát triển quá mức sẽ không có lợi cho cá (thiếu oxy vào sáng sớm, pH dao động,…) Trong các thủy vực nitrite đươch tạo thành từ quá trình oxy hóa ammonia và

ammonium nhờ hoạt động của nhóm vi khuẩn hóa tổng hợp Nitrosomonas theo

phản ứng sau:

NH4+ + 3O2 NO2- + 2H+ + H2O + 76 kcal

Trong điều kiện không có oxy, nhiều loài vi sinh vật có thể sử dụng nitrate bằng một dạng oxy hóa khác của nitrogen (thay vì oxy) như một chất hiện diện trong quá trình hô hấp Quá trình này được gọi là quá trình phản ứng nitrate hóa, các hợp chất trung gian trong quá trình chuyển hóa thường là những dạng độc nên không có lợi cho thủy sinh vật

Nitrate trong thủy vực là sản phẩm của nitrate hóa nhờ hoạt động của một số

vi khuẩn hóa tự dưỡng như Nitrobacter (nước ngọt) hay Nitrospina,

Nitrosococcus (nước mặn và lợ).

NO2- + 1/2O2 NO3- + 24 kcal

Nitrate là một trong những dạng đạm được thực vật hấp thu dễ nhất, không độc với thủy sinh vật Hàm lượng thích hợp cho các ao nuôi cá từ 0.1 – 10 mg/1 Hàm lượng nitrate cao không gây độc cho cá nhưng có thể làm thực vật phù du nở hoa gây biến đổi chất lượng nước không có lợi cho tôm, cá nuôi

(Trương Quốc Phú, 2006)

2 Giới thiệu về Pseudomonas stutzeri

Vi khuẩn Pseudomonas stutzeri đầu tiên được phân lập bởi Burri và Stutzer vào năm 1895 (Burri, Stutzer, 1895) và được xem như Bacillus denitrificans II, sau đó Van Niel và Allen đặt tên là Pseudomonas stutzeri (Van Niel, Allen, 1952).

P.stutzeri thuộc họ Pseudomonadaceae, ngành Proteobacteria, lớp Gammaproteobacteria Các nghiên cứu về trình tự 16S rRNA cho thấy chúng

tương đồng với các loài như P.mendocinia, P.alcaligenes, P.pseudoalcaligenes và

P.balearica Tế bào có hình que, dài 1 đến 3μm, rộng 0.5 μm Khuẩn lạc có hình

dạng không kiên định khi được phân lập trực tiếp, khuẩn lạc có dạng sần, khô,

bám chặc với nhau P.stutzeri có gram âm, hình que, di chuyển bằng một cực của

chiên mao Nó không có sắc tố và có khả năng loại nitow từ NO3- giải phóng N2

P.stutzeri có thể tăng trưởng trong môi trường amylase, maltose và tinh bột nhưng

không phát triển trong gelatinase Vi khuẩn P.stutzeri hiếu khí, phân bố rộng rãi

trong các vùng địa lý nhưng được tìm thấy chủ yếu trong đất và nước Nhiều dòng được phân lập từ các mẫu bệnh lý Chúng có khả năng chuyển hóa, làm giảm các chất độc cho môi trường và các hợp chất có trọng lượng phân tử cao như polyethylene glycols (Obradors et al., 1991)

Pseudomonas stutzeri là loại vi khuẩn khử nitrate, không phát quỳnh quang.

Gần đây nhiều nhà khoa học đang chú ý đến khả năng chuyển hóa chuyên biệt của nó:

- Một vài dòng có thể chuyển hóa các hợp chất thơm như naphthalene và mathylnapthalenes Hai hợp chất thơm này hiện diện nhiều trong dầu thô, là chất

có tiềm năng gây độc (Cerniglia, 1984)

- P.stutzeri được đề cập như một hệ thống khử nitrate vì nó có khả năng là

giảm nitrate chuyển khí N2 (Cuypers, Zumft, 1992)

- Một số loài có khả năng biến đổi tự nhiên, là đối tượng thích hợp cho các

nghiên cứu về sự biến đổi gen trong môi trường P.stutzeri được phân lập từ động

vật, môi trường bệnh viện và các mẫu bệnh ở người (Balows et al 1991)

Ớ Việt Nam ta, các chủng vi khuẩn địa phương khử đạm mạnh, phù hợp với điều kiện sinh thái địa phương có thể ứng dụng vào xử lý môi trương nước đã được các nhà khoa học nghiên cứu, đặc biệt gần đây nhất là đề tài phân lập vi

khuẩn Pseudomomas stutzeri có khả năng khử đạm mạnh trong nước thải ao cá tra

ở Đồng Bằng Sông Cửu Long và ứng dụng nó vào xử lý nước thải (Cao Ngọc Điệp et al., 2009)

3 Mối quan hệ giữa vi khuẩn Pseudomonas stutzeri và Đạm

3.1 Chu trình nitrogen trong bể nuôi cá

Chu trình nitơ luôn diễn ra trong các bể nuôi Phân cá hoặc các thành phần hữu cơ (thức ăn thừa) sẽ bị chuyển hóa thành ammonia (NH3) hoặc ammonium (NH4 ) rồi thành nitrite (NO2-) hay nitrate (NO3-) trước khi được chuyển hóa tiếp thành khí nitơ bởi các cây thủy sinh hoặc một số vi khuẩn trong bể

Amonia (NH3) là một chất độc với cá ngay cả ở hàm lượng thấp, NO2- cũng độc với cá dù không độc như NH3 Nitrate (NO3-) không độc ở hàm lượng thấp, tuy nhiên độc ở hàm lượng cao và với thời gian tiếp xúc dài Do đó, nếu không có

sự chuyển hóa các thành phần độc này thành khí nitơ khuyếch tán ra khỏi nước, môi trường nước sẽ không thích hợp cho cá sống

Vì vậy khi nuôi cá chúng ta cần để ý để tạo ra một chu trình chuyển hóa nitơ trong bể nuôi

3.2 Ảnh hưởng của nitrogen

Nitơ là một thành phần rất quan trọng trong sinh quyển; cuộc sống không thể tồn tại nếu không có nitơ Nó chiếm tới 78% thành phần của khí quyển Nitơ là thành phần cấu tạo nên các axit amin, protein

Mọi cơ thể sống đều chứa các dạng nitơ hữu cơ đã được đồng hóa nên bất kì thành phần nào (cá cảnh, cây thủy sinh hay ngay cả thức ăn) khi đặt vào bể nuôi đều sẽ bổ sung lượng nitơ đáng kể trong bể Ngoài ra nitơ vô cơ cũng được bổ sung vào bể nuôi từ không khí (khí nitơ) bởi các vi khuẩn cố định nitơ, vi khuẩn lam; hoặc khi chúng ta thay nước Các vi khuẩn lam có khả năng quang hợp (như cây xanh) để sinh trưởng; một vài loại vi khuẩn lam có thể cố định khí nitơ- một thành phần thực vật không thể trực tiếp sử dụng thành NH3, NO2- hoặc NO3-, những thành phần này có thể được thực vật hấp thụ để sản xuất axit amin và protein cần thiết

3.3.1 Vi khuẩn nitrate hóa

Các vi khuẩn nitrate hóa là các loại vi khuẩn tự dưỡng, thuộc họ

Nitrobacteraceae, lấy năng lượng trực tiếp từ quá trình chuyển hóa hóa học NH3

thành NO3- hoặc từ NO2- thành NO3- Những vi khuẩn này sử dụng CO2 làm nguồn carbon chính và cần oxy để sinh trưởng

Là quá trình chuyển hóa NO3- thành nitơ để khuyếch tán vào không khí Qúa trình này thường xảy ra trong môi trường không có oxy do các vi khuẩn yếm khí, thường thấy dưới lớp cát, sỏi hay bùn

3.3.3 Quá trình tạo nitrate (NO3-)

Khi các sinh vật chết, thành phần nitơ hữu cơ trong chúng sẽ bị chuyển hóa thành NH3 vô cơ bởi quá trình phân hủy do vi khuẩn tiến hành (còn gọi là quá trình khoáng hóa)

Ở trạng thái trung hòa, NH3 có thể được chuyển hóa qua lại thành NH4 ; tuy nhiên khi pH tăng (môi truờng nước bị kiềm hóa), NH4+ có xu hướng chuyển hóa ngược lại thành NH3 Trên thị trường có bán các sản phẩm để hạn chế quá trình kiềm hóa

NH3 được đồng hóa theo nhiều cách Một số loài rong nước hoặc tảo có thể đồng hóa NH3 và NH4 trực tiếp cho quá trình sinh tổng hợp Một số ví khuẩn thì

sử dụng một quá trình gọi là sự nitrate hóa (nitrification) Trước hết NH4+ được chuyển hóa thành NO2- bởi Nitrosomonas, sau đó một nhóm vi khuẩn khác (gọi là

nitrobacter) sử dụng men nitrite oxidase để chuyển hóa NO2- thành NO3- :

Giai đoạn nitrite hóa: NH4 + 3/2O2 NO2- + H2O + 2H + Q

Giai đoạn nitrate hóa: NO2- + 1/2O2 NO3- + Q

Từ đó mà NO3- này có thể được các cây thủy sinh sử dụng như là một nguồn dinh dưỡng hoặc có thể bị chuyển hóa tiếp thành khí nitơ (N2) qua hoạt động của

các vi khuẩn yếm khí như Pseudomonas Các quá trình chuyển hóa NH3 đều cần

sự tham gia của oxy nên nếu không có O2 không quá trình nào ở trên có thể được thực hiện

4 Cơ chế khử đạm của pseudomonas stutzeri

Theo kết quả phân tích mẫu nước thu được từ các ao cá cho thấy hàm lượng đạm và lân tổng số khá cao, tổng chất rắn lơ lửng cao trong khi vi khuẩn colifrom vẫn còn trong giới hạn cho phép theo qui dịnh số 02/2006 của Bộ Thủy Sản

Có 15 dòng vi khuẩn được phân lập từ chất thải ao nuôi cá tra dọc theo sông Tiền và sông Hậu bằng môi trường SW – LB (môi trường nước biển nhân tạo Luria – Britani) bổ sung với 10 mM NH4 và NO3 11 dòng xác định là vi khuẩn

Pseudomomas stutzeri dựa trên mức độ tương đồng PCR – 16S rRNA dùng các

primers phổ biến và chuyên dụng Có 4 dòng là có hiệu quả trong việc làm giảm các mức N hòa tan (NH4, NO2 and NO3) trong nước ao cá từ mức ban đầu là 10mg/L xuống gần bằng 0 sau 4 ngày xử lý Các thí nghiệm khác đang được tiến hành để xác định phương thức mà N bị mất từ dung dịch và nồng độ ammonia bị

oxy hóa, và nồng độ của nitrite và nitrate bị khử bị khử bởi dòng Pseudomomas

stutzeri..

Quá trình khử đạm được coi như là một tiến trình then chốt trong chu trình nitơ (Lee et al., 2002) Quá trình này hầu như là sự tập hợp của sự hô hấp nitrate, nitrite, kết hợp với sự khủ oxit và hô hấp nitơ oxit

Nitrate Nitrite Nitrite oxit Dinitơ oxit Khí nitơ

(NO3-) (NO2-) (NO) (N2O) (N2)↑

Dạng oxy hóa khử:

2NO3 + 10e- + 12H+ N2↑ + 6H2O

Các loài vi khuẩn tham gia là Paracoccus denitrificans, Thiobaccillus

denitrificans, và những loài Pseudomonas, clostrium

Dưới tác dụng của các loài vi sinh vật:

HNO3 HNO2 HNO NO2 N2 + H

NH4Cl + HNO2 HCl + H2O + N2

R-NH2 + HNO2 R-OH + H2O + N2

R-CH(NH2)COOH + HNO2 R-CHOHCOOH + H2O + N2

R-CO-NH2 + HNO2 R-COOH + H2O + N2

5. Ứng dụng

Hiện nay phương pháp xử lý vi sinh đang được các nhà khoa học trong nước

ta đặc biệt chú ý vì có nhiều ưu điểm xử lý hiệu quả của nó Những nghiên cứu này đã chứng minh cho ta thấy được chất lượng nước kênh rạch đã được cải thiện