Nghiên cứu tạo virus PRRS (Hội chứng hô hấp và sinh sản ở heo) nhược độc và đánh giá khả năng làm việc giống như vắc xin sản xuất

Xem Luận văn: Quay lại | Ý kiến ​​| nguyenthinga.39179.zip Luận văn / 2022: 39179 Luận văn Góp ý Reference source Gửi cho bạn bè Tải xuống nội dung Title Nghiên cứu tạo virus PRRS (Hội chứng hô hấp và sinh sản ở heo) nhược độc và đánh giá khả năng làm việc giống như vắc xin sản xuất Tác giả: Nguyễn Thị Nga Chuyên ngành: / Khác ứng dụng nghệ thuật / Công nghệ sinh học Nguồn phát hành: Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Sơ lược: THÔNG TIN VỀ LUẬN ÁN ĐƯA LÊN MẠNG Tên đề tài: Nghiên cứu tạo virus PRRS (Porcine Reproduction and Respiratory Syndrome) nhược điểm và đánh giá khả năng làm việc giống như vắc xin sản xuất. Chuyên ngành: Hóa sinh học Mã số: 9 42 01 16 Họ và tên Nghiên cứu sinh: Nguyễn Thị Nga Họ và tên Bộ định hướng: PGS.TS. Đinh Duy Kháng và PGS.TS. Tô Long Thành Cơ sở đào tạo: Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam TÓM TẮT KẾT LUẬN THÀNH CỦA LUẬN ÁN 1. Reaser for the type of the unique level and select the virus PRRS 02HY cường độc có đặc điểm riêng, hình dạng điển hình của virus PRRS gây rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn với khả năng ứng dụng, phát triển ổn định định dạng trên môi trường tế bào dòng Marc 145 đạt hiệu quả virus là 106,63TCID50, đạt được các yêu cầu làm ứng dụng tạo ra giống virus gốc PRRS nhược điểm. 2. Đã tạo ra giống virus gốc Hanvet1.vn. . 3. Đã giải quyết hệ thống tự do của chủng Hanvet1.vn. Kết quả phân tích để so sánh 2 chủng loại nucleotide biến 89 và 51 gen biến dạng rải rác trong 7 gen và 7 protein tương ứng. Các gen có sự thay đổi làm chủng loại Hanvet1.vn thành nhược độc nhưng gen mã hóa protein kháng nguyên GP5 kích hoạt cảm kháng thể trung hòa trên lợn không thay đổi tính kháng nguyên. 4. Đã phân tích, so sánh gen ORF5 và protein GP5 chủng loại Hanvet1.vn nhược điểm với 29 chủng virus PRRS thu nhận từ hơn 20 tỉnh thành trong nước và các khu vực trong cơ sở dữ liệu trên Genbank cho thấy có cao tương tự từ 94% - 99%. This is an important mean about the same same kháng kháng cự và hiệu quả bảo hộ của vắc xin được tạo ra. 5. NCĐT đánh giá giống virus gốc PRRS Hanvet1.vn nhược điểm tiêu chuẩn về tính thuần khiết, an toàn, tính kháng nguyên cao kích hoạt tạo đáp ứng miễn dịch trên lợn ở mức miễn phí dịch vụ 105TCID50, hiệu ứng kháng đạt đến 1 / 4305,389, tối ưu điều kiện nuôi virus đạt năng suất cao, hoạt động ổn định đạt 106,5TCID50, ổn định giống trong 24 tháng. Vaccine PRRS mode create from same root Hanvet1.vn có bảo hộ miễn dịch độ dài trên lợn đến 6 tháng. Luận điểm nghiên cứu thành công tạo ra virus gây rối loạn sinh và hô hấp thụ các nhược điểm từ virus cường độc gây rối loạn sinh sản và hô hấp trên lợn tại Việt Nam đạt tiêu chuẩn làm giống cho chế tạo vaccine phòng hội rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn. Cung cấp thông tin về gen học chủng virus PRRS tại Việt Nam, là tài liệu tham khảo, tham chiếu cho các nghiên cứu khác về virus PRRS và vắc xin PRRS. Khoa học hướng dẫn

NGUYỄN THỊ NGA

NGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG VIRUS PRRS (PORCINE REPRODUCTIVE AND RESPIRATORY SYNDROME) NHƯỢC ĐỘC VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG LÀM GIỐNG

PHỤC VỤ SẢN XUẤT VACCINE

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

HÀ NỘI - 2022

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGUYỄN THỊ NGA

NGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG VIRUS PRRS (PORCINE REPRODUCTIVE AND RESPIRATORY SYNDROME) NHƯỢC ĐỘC VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG LÀM GIỐNG

PHỤC VỤ SẢN XUẤT VACCINE

Chuyên ngành: Hóa sinh học

Mã số: 9 42 01 16

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: 1 PGS.TS Đinh Duy Kháng

Viện Công nghệ sinh học

2 PGS.TS Tô Long Thành

Trung tâm Chẩn đoán Thú Y Trung ương

HÀ NỘI - 2022

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan:

Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các cộng sự khác;

Các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận án là trung thực, khách quan, một phần đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả;

Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tôi cam đoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận án đều được chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày tháng 02 năm 2022

Tác giả luận án

Nguyễn Thị Nga

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận án, ngoài sự cố gắng của bản thân, tôi đã nhận được sự giúp đỡ tận tình và tạo điều kiện của nhiều cá nhân và tập thể đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu, học tập

Cho phép tôi được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS.Đinh Duy nguyên Trưởng phòng Vi sinh phân tử, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Thầy trực tiếp hướng dẫn khoa học đã tâm huyết, tận tình, hướng dẫn tôi, định hướng, động viên tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận án

Kháng-Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS.Tô Long Thành-nguyên Giám đốc Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương, Cục Thú y Thầy đồng hướng dẫn khoa học đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức, chỉ bảo và động viên tôi trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới tập thể cán bộ phòng Vi sinh phân tử, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và tập thể cán bộ Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương, Cục Thú y đã tạo mọi điều kiện thuận lợi, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu thực hiện đề tài khoa học

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban Lãnh đạo, tập thể cán bộ Trung tâm Nghiên cứu và sản xuất sinh phẩm dược thú y Hanvet đã tạo mọi điều kiện thuận lợi, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu hoàn thành luận án

Tôi xin được cảm ơn:

- Ban Lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện cho tôi được học tập và nghiên cứu

- Ban Lãnh đạo Viện Khoa học và Công nghệ, Bộ Công an và các đồng nghiệp cơ quan, nơi tôi hiện đang công tác đã tạo điều kiện cho tôi trong quá trình thực hiện nhiệm vụ học tập

Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới gia đình tôi và bạn bè đã chia sẻ khó khăn, động viên, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi, giúp tôi hoàn thành quá trình học tập và nghiên cứu

Nội, ngày tháng năm 2022

Tác giả luận án

Nguyễn Thị Nga

MỤC LỤC

Trang

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

1.1 Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn 5

1.1.1 Lịch sử xuất hiện hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS) 5

1.1.2 Tình hình PRRS trên thế giới và ở Việt Nam 5

1.1.3 Triệu chứng lâm sàng của lợn mắc PRRS 9

1.1.4 Bệnh tích PRRS 11

1.1.5 Tác nhân gây bệnh và con đường truyền lây PRRS 11

1.1.6 Cơ chế bệnh sinh 12

1.2 Virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn 13

1.2.1 Nguồn gốc, phân loại virus PRRS 13

1.2.2 Cấu trúc, chức năng hệ gen virus PRRS 15

1.2.3 Đa dạng di truyền hệ gen virus PRRS 18

1.2.4 Các protein kháng nguyên quan trọng của virus PRRS 19

1.2.5 Đáp ứng miễn dịch của lợn khi virus PRRS xâm nhiễm 21

1.2.6 Sức đề kháng của virus PRRS 23

1.2.7 Đặc điểm nuôi cấy virus PRRS 23

1.3 Nghiên cứu tạo vaccine PRRS 24

1.3.1 Khái niệm 24

1.3.2 Các loại vaccine được nghiên cứu phòng PRRS 25

1.3.3 Một số nghiên cứu về vaccine PRRS ở Việt Nam 29

1.3.4 Nghiên cứu tạo vaccine nhược độc phòng PRRS 31

1.3.5 Giống gốc trong sản xuất vaccine 32

1.3.6 Yêu cầu của giống gốc 32

1.3.7 Một số phương pháp bảo quản giống gốc virus PRRS 33

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35

2.1 Đối tượng, vật liệu nghiên cứu 35

2.2 Phương pháp nghiên cứu 36

2.2.1 Phương pháp mổ khám 36

2.2.2 Lấy mẫu xét nghiệm kháng nguyên 36

2.2.3 Lấy mẫu xét nghiệm kháng thể 36

2.2.4 Xử lý bệnh phẩm 37

2.2.5 Phương pháp làm tiêu bản vi thể 37

2.2.6 Phương pháp nuôi cấy tế bào 38

2.2.7 Phương pháp nhân virus PRRS 39

2.2.8 Phương pháp xác định hiệu giá virus 39

2.2.9 Phương pháp cấy truyền virus PRRS 40

2.2.10 Phương pháp xác định quy luật sinh trưởng của virus 40

2.2.11 Phương pháp trung hòa virus (phương pháp virus cố định và huyết thanh pha loãng) 41

2.2.12 Phương pháp Realtime RT-PCR 42

2.2.13 Phương pháp thiết kế mồi 42

2.2.14 Phương pháp RT-PCR 44

2.2.15 Phương pháp tách dòng và giải trình tự gen 44

2.2.16 Phương pháp so sánh trình tự gen và tạo cây phả hệ 45

2.2.17 Phương pháp điện di 45

2.2.18 Phương pháp IPMA xác định hiệu giá kháng thể 45

2.2.19 Phương pháp đếm tế bào Marc 145 47

2.2.20 Phương pháp kiểm tra vô trùng thuần khiết và an toàn của virus giống gốc 47

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 50

3.1 Nghiên cứu đánh giá độc lực và đặc tính sinh học 2 chủng virus PRRS 02HY và 05TB 50

3.1.1 Biểu hiện triệu chứng lâm sàng ở lợn gây nhiễm chủng virus PRRS 02HY và 05TB 50

3.1.2 Khả năng tăng trọng của lợn thí nghiệm 52

3.1.3 Kết quả kiểm tra bệnh tích ở lợn thí nghiệm 53

3.1.4 Kiểm tra virus huyết ở lợn thí nghiệm 55

3.1.5 Khả năng kích thích sinh kháng thể ở lợn của 2 chủng virus PRRS 02HY và 05TB 57

3.1.6 Kiểm tra đặc tính nhân lên của virus PRRS 02HY trên tế bào Marc 145 59

3.2 Nghiên cứu tạo chủng virus PRRS nhược độc bằng cấy truyền liên tiếp 80 đời trên môi trường tế bào Marc 145 60

3.2.1 Đánh giá đặc tính nhân lên của chủng virus PRRS 02HY qua các đời cấy truyền trên tế bào Marc 145 61

3.2.2 Khả năng kích thích sinh kháng thể ở lợn của chủng virus PRRS 02HY qua các đời cấy truyền 62

3.2.3 Kiểm tra độc lực của chủng virus PRRS 02HY qua các đời cấy truyền

ở các đời cấy truyền P1, P50, P60, P70, P80 64

3.3 Nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử của chủng virus Hanvet1.vn nhược độc và chủng 02HY cường độc 66

3.3.1 Khuếch đại các đoạn gen thuộc hệ gen virus PRRS 66

3.3.2 Tách dòng các đoạn gen khuếch đại 67

3.3.3 Kết quả giải mã, phân tích hệ gen chủng Hanvet1.vn nhược độc và 02HY cường độc 68

3.3.4 Phân tích so sánh gen chủng Hanvet1.vn nhược độc với các chủng virus PRRS lưu hành ở Việt Nam và thế giới 73

3.4 Đánh giá đặc tính giống gốc chủng virus PRRS Hanvet1.vn nhược độc 76

3.4.1 Kiểm tra thuần khiết 77

3.4.2 Kết quả kiểm tra tính an toàn của giống gốc Hanvet1.vn trên lợn 78

3.4.3 Khả năng kích thích sinh kháng thể của giống gốc Hanvet1.vn nhược độc 79

3.4.4 Đánh giá đặc tính ổn định của giống gốc virus PRRS Hanvet1.vn 83

3.4.5 Nghiên cứu điều kiện bảo quản giống gốc (Master seed) 92

3.4.6 Đáp ứng miễn dịch và độ dài miễn dịch ở lợn sau khi tiêm vaccine nhược độc được chế tạo từ giống gốc Hanvet1.vn 94

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN KẾT QUẢ 100

4.1 Về nghiên cứu đánh giá độc lực chủng virus PRRS 02HY cường độc Việt Nam chọn làm chủng ứng viên để tạo virus giống gốc PRRS nhược độc 100

4.2 Về nghiên cứu tạo chủng virus PRRS nhược độc bằng cấy truyền liên tiếp trên môi trường tế bào Marc 145 102

4.3 Về đánh giá giống gốc Hanvet1.vn nhược độc sử dụng cho chế tạo vaccine PRRS 107

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 112

NHỮNG CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI 113

THESIS SUMMARY 114

TÀI LIỆU THAM KHẢO 121 PHỤ LỤC 1PL

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AEC 3- amino-9-ethylcarbazole

CPE Cytopathogenic effect

DNA Deoxyribonucleic acid

DMEM Dulbecco's modified eagle's medium

ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay

FBS Enzyme-linked immunosorbent assay

HE Haematoxylin-eosin

IHC Immuno histochemistry

IPMA Immunoperoxidase monolayer assay

MARC-145 Meat animal research center-145

MDS Mystery swine disease

MLV Modiffied live vaccine

MOI Multiplicity of infection

MSD Mystery swine disease

NSP Non structural protein

OD Optical density

OIE Office International des Epizooties

ORF Open reading frame

PAM Porcine alveolar macrophage

PCR Polymerase chain reaction

PCV2 Porcine circovirus type 2

PEARS Porcine endemic abortion and respiratory syndrome PRRS Porcine reproductive and respiratory syndrome PRRSV Porcine reproductive and respiratory syndrome virus RNA Ribonucleic acid

RT- PCR Reverse transcriptase polymerase chain reaction

rRT- PCR Realtime reverse transcriptase polymerase chain reaction

SP Structural protein

TCID50 50% Tissue culture infective dose

TPB Triptose phosphas broth

VNT Virus neutralization test

02HY Virulent virus in Hung Yen, Vietnam

05TB Virulent virus in Thai Binh, Vietnam

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Tổng hợp các ổ dịch PRRS xảy ra ở Việt Nam từ 2007-2016 8Bảng 1.2 So sánh đặc điểm hệ gen của các chủng virus PRRS trên thế giới 15Bảng 1.3 Hệ gen của virus PRRS và các thông tin liên quan 18Bảng 1.4 Phát hiện kháng thể đặc hiệu kháng virus PRRS qua các

phương pháp xét nghiệm 21Bảng 1.5 Một số vaccine thế hệ mới 26Bảng 2.1 Các cặp mồi dùng trong khuếch đại 15 đoạn gen của hệ gen

chủng virus PRRS 02HY và Hanvet1.vn 43Bảng 3.1 Kết quả biểu hiện lâm sàng của lợn gây nhiễm virus PRRS

chủng 02 HY và 05 TB 50Bảng 3.2 Kết quả theo dõi khả năng tăng trọng của lợn 52Bảng 3.3 Bệnh tích đại thể ở lợn gây nhiễm virus PRRS 53Bảng 3.4 Virus PRRS trong huyết thanh lợn thí nghiệm tại các thời điểm

thu huyết thanh 55Bảng 3.5 Hàm lượng kháng thể trong huyết thanh lợn được gây nhiễm

bằng chủng virus 02 HY và 05 TB 58Bảng 3.6 Hiệu giá virus thu được tại các thời điểm thu hoạch 59Bảng 3.7 Hiệu giá virus PRRS 02HY sau mỗi 10 đời cấy truyền trên môi

trường tế bào Marc 145 61Bảng 3.8 Hiệu giá kháng thể kháng virus PRRS trên lợn sau gây nhiễm

virus 02HY ở các đời cấy truyền 63Bảng 3.9 Thân nhiệt và triệu chứng lâm sàng của lợn gây nhiễm virus

PRRS 02HY ở các đời cấy truyền P1, P50, P60, P70, P80 64Bảng 3.10 Phân lập virus từ huyết thanh lợn đã gây nhiễm virus ở các đời

cấy truyền 65Bảng 3.11 Mức độ tương đồng trình tự nucleotide và axit amin chủng

virus PRRS Hanvet1.vn nhược độc so với chủng virus PRRS 02HY cường độc 70Bảng 3.12 Mức độ tương đồng trình tự axit amin các protein chủng virus

PRRS Hanvet1.vn nhược độc so với các chủng virus PRRS tham chiếu trên Genbank 73

Bảng 3.13 Kiểm tra vô trùng giống gốc virus PRRS Hanvet1.vn 77

Bảng 3.14 Kết quả kiểm tra thuần khiết giống gốc Hanvet1.vn 78

Bảng 3.15 Mức độ an toàn của giống gốc Hanvet1.vn trên lợn 78

Bảng 3.16 Mức tăng trọng của lợn 79

Bảng 3.17 Hiệu giá kháng thể của lợn ở các liều miễn dịch với virus giống gốc PRRS Hanvet1.vn nhược độc 80

Bảng 3.18 Kiểm tra virus huyết bằng rRT-PCR và phân lập tại các thời điểm sau công cường độc 81

Bảng 3.19 Hiệu giá giống gốc Hanvet1.vn qua 10 đời cấy truyền 83

Bảng 3.20 Độ an toàn của giống gốc Hanvet1.vn nhược độc với lợn khi tiếp truyền liên tục trên 5 đời lợn 85

Bảng 3.21 Nhiệt độ của lợn ở các đời tiếp truyền giống gốc Hanvet1.vn trong 7 ngày 85

Bảng 3.22 Năng suất nhân lên của tế bào Marc 145 trên các loại môi trường khác nhau 86

Bảng 3.23 Năng suất nhân lên của tế bào Marc 145 khi bổ sung một số chất vào môi trường nuôi cấy 87

Bảng 3.24 Hiệu giá virus đạt được khi sử dụng môi trường duy trì ở pH khác nhau 88

Bảng 3.25 Mức độ thể hiện CPE của các liều gây nhiễm khác nhau 89

Bảng 3.26 Hiệu giá virus thu được ở các liều nhiễm khác nhau 90

Bảng 3.27 Hiệu giá sau khi gây nhiễm với liều 0,1 MOI ở các thời điểm thu hoạch khác nhau 91

Bảng 3.28 Bảo quản giống gốc virus Hanvet1.vn nhược độc trong điều kiện đông khô 93

Bảng 3.29 Bảo quản giống gốc virus Hanvet1.vn nhược độc trong điều kiện -80oC 94

Bảng 3.30 Hiệu giá kháng thể xác định bằng IPMA và phản ứng trung hòa sau gây miễn dịch ở các thời điểm khác nhau 95

Bảng 3.31 Kết quả xác định virus trong huyết thanh nhóm lợn đối chứng sau khi công cường độc 98

Bảng 3.32 Khối lượng của lợn được tiêm vaccine Hanvet1.vn và lợn đối chứng không được tiêm vaccine 99

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Sự phân bố của các type PRRSV trên thế giới 6

Hình 1.2 Cây phả hệ của virus PRRS 14

Hình 1.3 Cấu trúc thông tin di truyền của virus PRRS 17

Hình 1.4 Cấu trúc Protein của virus PRRS 21

Hình 1.5 Đáp ứng miễn dịch của lợn sau khi nhiễm virus PRRS 22

Hình 3.1 Hình ảnh bệnh tích đại thể ở phổi và hạch lympho 54

Hình 3.2 Hình ảnh bệnh tích vi thể 55

Hình 3.3 Đường cong sinh trưởng của chủng virus 02HY độc lực 60

Hình 3.4 Hiệu giá virus trung bình của PRRS 02HY sau mỗi 10 đời cấy truyền (P1-P80) 62

Hình 3.5 Phân lập virus từ huyết thanh lợn đã gây nhiễm với virus ở các đời cấy truyền P1, P50, P60, P70, P80 65

Hình 3.6 Khuếch đại 15 đoạn gen thuộc hệ gen của chủng virus PRRS Hanvet1.vn nhược độc 67

Hình 3 7 Sản phẩm cắt các plasmid với enzyme hạn chế EcoRI 68

Hình 3.8 So sánh trình tự nucleotide gen ORF5 chủng Hanvet1.vn nhược độc với chủng 02HY cường độc 72

Hình 3.9 So sánh trình tự axit amin của protein GP5 chủng Hanvet1.vn nhược độc với của chủng 02HY cường độc 72

Hình 3.10 Cây phả hệ phản ánh mối quan hệ họ hàng của chủng Hanvet1.vn nhược độc với các chủng virus PRRS lưu hành ở các tỉnh thành khác nhau của Việt Nam dựa trên trình tự nucleotide gen ORF5 75

Hình 3.11 Cây phả hệ phản ánh mối quan hệ họ hàng của chủng virus PRRS Hanvet1.vn nhược độc với các chủng virus PRRS lưu hành ở các tỉnh thành khác nhau của Việt Nam dựa trên trình tự axit amin protein GP5 76

Hình 3.12 Điện di kiểm tra giống Hanvet1.vn tạp nhiễm với một số loại virus 77

Hình 3.13 Hiệu giá virus PRRS Hanvet1.vn nhược độc ở 10 đời cấy truyền (P1-P10) 84

Hình 3.14 Bệnh tích tế bào (CPE) ở liều gây nhiễm 0,1MOI giống gốc virus 02HY nhược độc trên tế bào Marc 145 sau 96 giờ 90

Hình 3.15 Biểu đồ hiệu giá virus tại các liều nhiễm khác nhau 91Hình 3.16 Đồ thị sinh trưởng của giống gốc Hanvet1.vn (Hiệu giá virus) 92Hình 3.17 Biến động hiệu giá kháng thể sau khi tiêm vaccine PRRS

nhược độc sử dụng chủng giống gốc virus PRRS Hanvet1.vn 95Hình 3.18 Biến động thân nhiệt của lợn sau khi công cường độc 97Hình 3.19 Bệnh tích đặc trưng ở phổi lợn không được tiêm vaccine sau

khi công cường độc và được mổ khám khi kết thúc thời gian theo dõi 99

BẢN TRÍCH YẾU LUẬN ÁN

Tên tác giả: NGUYỄN THỊ NGA

Tên luận án: Nghiên cứu tạo chủng virus PRRS (Porcine Reproductive and

Respiratory Syndrome) nhược độc và đánh giá khả năng làm giống phục vụ sản xuất

vaccine

Ngành: Sinh học Chuyên ngành: Hóa sinh học Mã số: 9 42 01 16

Tên cơ sở đào tạo: Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công

nghệ Việt Nam

1 Mục đích và đối tượng nghiên cứu của luận án

Mục đích: Tạo được chủng virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp

nhược độc từ chủng virus cường độc gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp trên lợn tại Việt Nam đạt tiêu chuẩn làm giống cho chế tạo vaccine phòng hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn

Đối tượng nghiên cứu: Chủng virus PRRS (Porcine Reproductive and

Respiratory Syndrome)

2 Các phương pháp nghiên cứu sử dụng

+ Phương pháp mổ khám

+ Phương pháp lấy mẫu xét nghiệm kháng nguyên

+ Phương pháp lấy mẫu xét nghiệm kháng thể

+ Phương pháp xử lý bệnh phẩm

+ Phương pháp làm tiêu bản vi thể

+ Phương pháp nuôi cấy tế bào

+ Phương pháp phân lập virus PRRS

+ Phương pháp xác định hiệu giá virus

+ Phương pháp cấy truyền virus PRRS

+ Phương pháp xác định quy luật sinh trưởng của virus

+ Phương pháp trung hòa virus

+ Phương pháp RT-PCR, Realtime RT-PCR

+ Phương pháp thiết kế mồi

+ Phương pháp tách dòng và giải trình tự gen

+ Phương pháp so sánh trình tự gen và tạo cây phả hệ

+ Phương pháp điện di

+ Phương pháp IPMA xác định hiệu giá kháng thể

+ Phương pháp đếm tế bào Marc 145

+ Phương pháp kiểm tra vô trùng thuần khiết và an toàn của virus giống gốc + Phương pháp đánh giá đáp ứng miễn dịch và độ dài miễn dịch trên lợn + Phương pháp thống kê, xử lý số liệu

3 Các kết quả chính và kết luận

1) Đã nghiên cứu đánh giá độc lực và chọn được chủng virus PRRS 02HY cường độc có đặc điểm điển hình, đặc trưng của virus PRRS gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn với khả năng thích ứng, phát triển ổn định trên môi trường

tế bào dòng Marc 145 đạt hiệu giá virus là 106,63TCID50, có đủ các yêu cầu làm ứng viên tạo giống gốc virus PRRS nhược độc

2) Đã tạo được giống gốc virus Hanvet1.vn nhược độc sau 80 đời cấy truyền tiếp virus 02HY trên tế bào Marc 145 có các đặc tính sinh học và sinh học phân tử đáp ứng tiêu chuẩn của giống gốc cho chế tạo vaccine PRRS

3) Đã giải trình tự hệ gen của chủng Hanvet1.vn nhược độc (mã số trên Genbank KU842720) và hệ gen của chủng 02HY cường độc ban đầu (số đăng Genbank Submission 2490633) Kết quả phân tích so sánh 2 chủng đã phát hiện 89 đột biến nucleotide và 51 đột biến axit amin nằm rải rác trong 7 gen và 7 protein tương ứng Các gen có biến đổi làm chủng Hanvet1.vn thành nhược độc nhưng gen

mã hóa protein kháng nguyên GP5 kích thích sinh kháng thể trung hòa trên lợn không thay đổi tính kháng nguyên

4) Đã phân tích, so sánh trình tự gen ORF5 và protein GP5 chủng Hanvet1.vn nhược độc với 29 chủng virus PRRS thu nhận từ hơn 20 tỉnh thành trong nước và các nước khu vực trong cơ sở dữ liệu gen trên Genbank cho thấy có

sự tương đồng cao từ 94% - 99% Điều này có ý nghĩa quan trọng về tính tương đồng kháng nguyên và hiệu quả bảo hộ của vaccine tạo ra

5) Đã nghiên cứu đánh giá giống gốc virus PRRS Hanvet1.vn nhược độc đạt tiêu chuẩn về tính thuần khiết, an toàn, tính kháng nguyên cao kích thích tạo đáp ứng miễn dịch trên lợn ở liều miễn dịch 105TCID50, hiệu giá kháng thể đạt đến 1/4.305,389, tối ưu được điều kiện nuôi cấy virus đạt năng suất cao, hoạt lực ổn định đạt 106,5TCID50, ổn định giống trong 24 tháng Vaccine PRRS chế tạo từ giống gốc Hanvet1.vn có độ dài miễn dịch bảo hộ trên lợn đến 6 tháng

Luận án đã nghiên cứu thành công tạo được chủng virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp nhược độc từ chủng virus cường độc gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp trên lợn tại Việt Nam đạt các tiêu chuẩn làm giống cho chế tạo vaccine phòng hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn Cung cấp thông tin về gen học chủng virus PRRS ở Việt Nam, là tài liệu tham khảo, tham chiếu cho các nghiên cứu khác về virus PRRS và vaccine PRRS

Công bố 4 bài báo khoa học bằng tiếng Việt và tiếng Anh

MỞ ĐẦU

1 TÍNH CẤP THIẾT

Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (Porcine Reproductive and

Respiratory Syndrome-PRRS) đã trở thành bệnh dịch địa phương ở nhiều nước trên

thế giới, kể cả các nước có ngành chăn nuôi lợn phát triển như Pháp, Đức, Mỹ, Hà Lan và gây ra những tổn thất rất lớn về kinh tế cho ngành chăn nuôi Bệnh do virus thuộc họ Arteriviridae gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp trên lợn được phát

hiện ở Bắc Mỹ vào năm 1987 (Benfield et al., 1992) Bệnh được xếp vào nhóm các

bệnh nguy hiểm trong danh mục các bệnh thú y của Tổ chức Thú y Thế giới (OIE)

Ở Việt Nam, từ năm 2007 đến năm 2010, hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp diễn biến phức tạp, bùng phát thành dịch và tiếp diễn rải rác ở một số địa phương trong

cả nước những năm sau đó Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn gây thiệt hại lớn về kinh tế trong chăn nuôi lợn ở Việt Nam cũng như các nước trên thế giới

Ở nước ta, chăn nuôi lợn chủ yếu vẫn ở hình thức quy mô nhỏ lẻ, chăn nuôi quy mô lớn, chăn nuôi an toàn sinh học còn rất hạn chế nên việc kiểm soát dịch bệnh gặp nhiều khó khăn Để phòng hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp thì tiêm phòng vaccine là công cụ hữu hiệu để ngăn chặn, kiểm soát dịch bệnh cho đàn lợn Tuy nhiên, ở nước ta vaccine phòng hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS) chủ yếu phải nhập ngoại, giá thành cao, thiếu chủ động Hơn nữa, do sự khác biệt lớn về di truyền giữa các chủng virus PRRS lưu hành ở các vùng địa lý khác nhau nên vaccine nhập ngoại chưa thực sự đạt hiệu quả bảo hộ như mong đợi Chủng virus Bắc Mỹ và chủng Châu Âu đều gây ra các triệu chứng lâm sàng giống nhau trên lợn, tuy nhiên lại thuộc genotype khác nhau Toàn bộ hệ gen của hai

chủng này khác biệt tới 40% (Thiel et al.,1993) Việc nghiên cứu phát triển vaccine

sử dụng chung cho đàn lợn ở các vùng địa lý khác nhau trên thế giới gặp rất nhiều

khó khăn (Kapur et al.,1996; Nelsen et al.,1999) Bên cạnh đó, hiệu lực bảo hộ của

vaccine hiện có theo các công nghệ chế tạo cũng có những hạn chế khác nhau Trong đó, vaccine nhược độc được sản xuất theo công nghệ tạo nhược độc bằng nuôi cấy virus PRRS trên tế bào dòng Marc 145 từ chủng virus cường độc có

nhiều ưu thế hơn về hiệu lực bảo hộ trên lợn so với các loại vaccine khác Vì vậy, việc chế tạo vaccine nhược độc từ nguồn chủng virus PRRS thu nhận từ thực địa Việt Nam nhằm tạo đáp ứng miễn dịch đặc hiệu cao, bảo vệ lợn chống lại virus PPRS gây bệnh là vô cùng cấp thiết và quan trọng

Vì vậy, đề tài luận án: “Nghiên cứu tạo chủng virus PRRS (Porcine

Reproductive and Respiratory Syndrome) nhược độc và đánh giá khả năng làm giống phục vụ sản xuất vaccine” đã được triển khai thực hiện

3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

+ Nghiên cứu đánh giá độc lực và đặc tính sinh học 2 chủng virus PRRS 02HY và 05TB

- Gây nhiễm hai chủng trên lợn để đánh giá độc lực thông qua biểu hiện triệu chứng lâm sàng, khả năng tăng trọng, bệnh tích và virus huyết

- Xác định khả năng gây đáp ứng miễn dịch, kích thích sinh kháng thể trên lợn sau gây nhiễm 2 chủng virus để lựa chọn chủng độc lực cao

- Đánh giá đặc tính nhân lên thích ứng của chủng độc lực cao 02HY lựa chọn đạt các tiêu chí để làm ứng viên tạo giống gốc vaccine PRRS

+ Nghiên cứu tạo chủng virus PRRS nhược độc trên môi trường tế bào Marc 145

- Cấy truyền liên tiếp 80 đời chủng virus PRRS độc lực trên môi trường tế bào Marc 145 để tạo chủng virus PRRS nhược độc

- Nghiên cứu đánh giá độc lực, đặc tính nhân lên, khả năng kích thích sinh miễn dịch tạo kháng thể của chủng 02HY qua các đời cấy truyền

+ Nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử của chủng nhược độc tạo được làm giống gốc

- Nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử của chủng 02HY cường độc và chủng Hanvet1.vn nhược độc tạo được làm giống gốc

- Đánh giá sự biến đổi di truyền của chủng Hanvet1.vn nhược độc so với chủng 02HY cường độc ban đầu

- So sánh sự tương đồng gen và kháng nguyên chủng Hanvet1.vn nhược độc

với các chủng virus PRRS lưu hành tại Việt Nam và khu vực

+ Đánh giá khả năng làm giống gốc của chủng virus Hanvet1.vn nhược độc tạo được

- Đánh giá tính thuần khiết, an toàn, tính sinh miễn dịch trên lợn và tính ổn định của giống virus PRRS nhược độc

- Nghiên cứu, đánh giá một số đặc tính virus học của giống gốc PRRS nhược độc: Liều gây nhiễm virus, điều kiện nuôi cấy, đặc tính nhân lên của giống gốc và thời điểm thu hoạch virus đạt hiệu giá cao

- Đánh giá giống gốc thông qua đáp ứng miễn dịch và khả năng bảo hộ của vaccine PRRS được chế tạo từ giống gốc Hanvet1.vn tạo được trên lợn nuôi thực địa

4 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN

- Nghiên cứu tạo được chủng virus giống gốc Hanvet1.vn nhược độc từ chủng virus PRRS 02HY cường độc lưu hành tại Việt Nam

- Đã nghiên cứu đánh giá các đặc tính sinh học, đặc tính sinh học phân

tử, sự biến đổi hệ gen sau quá trình nhược độc hóa và tính sinh miễn dịch của giống gốc Hanvet1.vn nhược độc tạo được đạt các yêu cầu cho chế tạo vaccine PRRS tại Việt Nam

5 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN

Về ý nghĩa khoa học

Kết quả nghiên cứu của luận án phản ánh khá đầy đủ đặc tính sinh học, đặc tính sinh học phân tử, tính kháng nguyên kích thích sinh miễn dịch của chủng virus lưu hành ở Việt Nam Cung cấp các thông tin tham khảo, tham chiếu cho các nghiên cứu

về gen học chủng virus PRRS ở Việt Nam Luận án là tài liệu khoa học, tài liệu tham khảo có giá trị cho nghiên cứu và giảng dạy

Về ý nghĩa thực tiễn

- Giống gốc virus PRRS Hanvet1.vn nhược độc được sử dụng để sản xuất thành công vaccine PRRS nhược độc bảo hộ tốt cho lợn nuôi tại Việt Nam Chủng giống gốc vaccine có tính tương đồng gen và tương đồng kháng nguyên cao đến 99% khi so sánh với 29 chủng virus PRRS độc lực lưu hành ở 20 tỉnh thành ở Việt Nam và khu vực

- Kết quả nghiên cứu có giá trị ứng dụng thực tiễn cao, góp phần khẳng định

sự phát triển công nghệ nghiên cứu chế tạo vaccine PRRS nội địa Việt Nam đảm bảo yêu cầu chất lượng để thay thế vaccine nhập khẩu

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn

1.1.1 Lịch sử xuất hiện hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS)

Khái niệm: Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn do virus thuộc họ Arteriviridae gây ra Lợn bị nhiễm virus này có biểu hiện rối loạn hô hấp và sinh sản trên mọi lứa tuổi với các triệu chứng chủ yếu là bỏ ăn hàng loạt, hắt hơi, sổ mũi, tăng tần số hô hấp, thở khó, lợn con thường có tỷ lệ chết cao, lợn trưởng thành tỷ lệ chết thấp hơn nhưng thường bị đồng nhiễm thêm các loại vi khuẩn gây bệnh khác, đặc biệt là vi khuẩn gây bệnh ở hệ hô hấp

Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn được ghi nhận vào năm 1987 ở

Mỹ tại vùng bắc của bang California, bang Iowa và Minnesota Năm 1988 bệnh lan sang Canada Sau đó bệnh xuất hiện ở Đức năm 1990; Hà Lan, Tây Ban Nha, Bỉ và

Anh năm 1991 và ở Pháp năm 1992 (Benfield D et al., 1999)

Từ khi xuất hiện đến nay, bệnh đã được gọi với nhiều tên khác nhau Thời gian đầu do chưa xác định được nguyên nhân nên gọi bệnh này là Bệnh bí hiểm ở lợn (MDS) Một số tác giả khác căn cứ vào bệnh tích ở tai gọi tên bệnh Tai xanh (BED) hoặc căn cứ vào các đặc điểm trên lợn mắc virus PRRS như sảy thai, đẻ non, chết non, sức sống yếu ớt, tỷ lệ chết của lợn con cao và rối loạn hô hấp trên đàn lợn (Keffaber, 1989; Loula, 1991) gọi tên là Hội chứng hô hấp và sảy thai ở lợn (PEARS) Đến năm 1992, tại Hội nghị Quốc tế tổ chức tại Minesota (Mỹ), tổ chức Thú y thế giới (OIE) đã thống nhất tên là Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn

(Porcine respiratory and reproductive syndrome-PRRS), đây là tên gọi chính thức

của bệnh Hàng năm ước tính chi phí ngành công nghiệp chăn nuôi lợn ở Mỹ là 560

triệu USD cho PRRS (Neumann et al., 2005)

1.1.2 Tình hình PRRS trên thế giới và ở Việt Nam

+Tình hình PRRS trên thế giới

Theo báo cáo của tổ chức Thú y thế giới (2014), virus PRRS type 2 xuất hiện ở Trung Quốc và lan rộng khắp Châu Á (Đông, Nam và Bắc Á): Bhutan,

Campuchia, Trung Quốc, Indonesia, Lào, Malaysia, Myanmar, Philippine, Nga, Singapore, Việt Nam

Hình 1.1 Sự phân bố của các type PRRSV trên thế giới

Trung Quốc thuộc chủng Bắc Mỹ thể cường độc gây ra (Tian et al., 2007)

Ở Hàn Quốc, PRRS ở lợn chủ yếu do 2 chủng virus thuộc type EU-1 và type

2 (Bắc mỹ) gây ra (Yeom et al., 2015)

Từ 4/2012 đến 8/2013 (Marinou et al., 2015) đã thu thập 359 mẫu huyết

thanh từ lợn rừng tại các địa phương khác nhau thuộc Hy Lạp để xác định tỷ lệ lưu hành một số mầm bệnh truyền nhiễm nguy hiểm trong đó có hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn Kết quả cho thấy 5,6% số mẫu dương tính với virus PRRS

Từ năm 2008 đến năm 2013 (Jantafong et al., 2015) cho biết: hàng năm có

khoảng 13,86% số lợn ở Thái Lan nhiễm virus hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp

Năm 2008, virus PRRS lần đầu tiên được phát hiện ở Thái Lan và Campuchia, 2 năm sau đó, nó trở thành nguyên nhân gây bùng phát dịch tại 2 nước này

Tornimbene et al., (2015) cho biết, năm 2006 Trung Quốc và Việt Nam đã

báo cáo về một biến thể mới xuất hiện gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (virus HP-PRRS) Các vụ dịch hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn thường xuyên diễn ra ở Trung Quốc và Việt Nam gây nguy cơ lây nhiễm cao đến đàn lợn của Campuchia Năm 2010, các tác giả đã nghiên cứu tình hình bệnh PRRS

ở lợn tại tỉnh Takeo giáp biên giới Việt Nam và cho biết trên 85% số đàn lợn được điều tra có lợn nhiễm virus PRRS

Trong vòng 3 năm, tại 140 trang trại thuộc miền Bắc Italia (Salogni et al.,

2016) đã phát hiện 323 lợn bị xảy thai do virus, có nhiều loại virus đã được đề cập đến trong đó có 108 lợn bị xảy thai do nhiễm virus PRRS

Từ năm 2005 trở lại đây, 25 nước và vùng lãnh thổ trên hầu hết các châu lục đều đã báo cáo về sự lưu hành của virus PRRS Đặc biệt, kể từ năm 2006-2007, một biến chủng mới của virus PRRS xuất hiện ở Trung Quốc có độc lực cao và nhanh

chóng lan rộng ra nhiều nước ở Châu Á gây ra hàng loạt vụ dịch (Tian et al., 2007)

Vụ dịch PRRS làm chết hàng triệu lợn đã bùng phát từ năm 2006 (Zhou and Yang, 2010) Trường hợp PRRS đầu tiên xuất hiện gây bùng phát dịch ở Việt Nam vào

đầu năm 2007 (Feng et al., 2008; Metwally et al., 2010) sau đó lan sang các nước Đông Nam Á khác như Lào, Philippines, Cambodia v.v… (Jantafong et al., 2015;

Ni et al., 2012; Tornimbene et al., 2015)

Hiện nay, Tổ chức Thú Y thế giới đã có qui trình chẩn đoán, giám sát và dự phòng đối với hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn

(Nguồn: http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Ourscientificexpertise/docs/pdf/PRRS guide web bulletin.pdf)

+ Tình hình PRRS tại Việt Nam

Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn tại Việt Nam được phát hiện đầu tiên trên đàn lợn nhập từ Mỹ vào các tỉnh phía Nam năm 1997, kết quả kiểm tra huyết thanh học cho thấy 10/51 lợn giống nhập khẩu đó có huyết thanh dương tính với PRRS, toàn bộ số lợn này đã được xử lý Từ tháng 3/2007 đến 2008, PRRS gây thành đại dịch tại nhiều địa phương trên cả nước làm tổn thất lớn về kinh tế cho

người chăn nuôi, hàng triệu con lợn đã mắc PRRS và bị tiêu hủy Kết quả chẩn đoán

và nghiên cứu virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn tại Việt Nam từ

2007 đến 2008 cho thấy, số lợn mắc PRRS tăng lên, các virus PRRS phân lập từ các

ổ dịch lợn mắc PRRS có mức độ tương đồng cao so với virus PRRS chủng độc lực cao của Trung Quốc Bệnh phẩm chứa virus có khả năng gây chết lợn thí nghiệm 100% cũng cho thấy virus hoặc vi khuẩn đồng nhiễm đóng vai trò quan trọng, gây

tỷ lệ chết cao trên thực địa (Tô Long Thành và cs., 2008)

Từ 2009 đến 2015 tình hình dịch PRRS diễn ra vẫn phức tạp, dịch còn xảy ra

ở nhiều tỉnh trên cả nước

Từ 2016 đến 2019 cả nước không xuất hiện dịch PRRS, tuy nhiên còn tiềm

ẩn và nguy cơ phát sinh cao do virus PRRS vẫn tồn tại trong môi trường chăn nuôi, vận chuyển buôn bán, giết mổ, tiêu thụ thịt lợn ngày càng gia tăng Biện pháp phòng bệnh hiệu quả là tổ chức tiêm phòng triệt để cho đàn lợn và áp dụng nghiêm ngặt các biện pháp vệ sinh phòng bệnh, chăn nuôi an toàn sinh học

Tháng 10/2020 xuất hiện trở lại ổ dịch PRRS tại huyện Lý Nhân tỉnh Hà Nam, tại Nghệ An trong năm 2020 cũng có ổ dịch thuộc các huyện: Nam Đàn, Tân

Kỳ, Nghĩa Đàn và thị xã Thái Hòa Các Sở, ngành, địa phương nơi xảy ra dịch đã tập trung triển khai quyết liệt, đồng bộ các biện pháp cấp bách phòng PRRS

Bảng 1.1 Tổng hợp các ổ dịch PRRS xảy ra ở Việt Nam từ 2007-2016

Năm Tỉnh Quận/Huyện Xã/Phường Số lợn mắc

PRRS

Số lợn bị tiêu hủy

Dịch lây lan nhanh chủ yếu là do phát hiện chậm hoặc dấu dịch, người chăn nuôi bán lợn mắc bệnh, do không kiểm soát được vận chuyển lợn ốm từ vùng có dịch sang vùng không có dịch

Nguyên nhân chính là do chăn nuôi lợn ở nước ta chủ yếu là nhỏ lẻ nên khó kiểm soát dịch, nhận thức của người chăn nuôi, buôn bán, giết mổ lợn về công tác phòng, chống dịch còn nhiều hạn chế Nhiều chủ gia súc chăn nuôi không tiêm phòng hoặc tiêm phòng các bệnh đỏ (dịch tả lợn, tụ huyết trùng, đóng dấu lợn và phó thương hàn lợn) đạt tỷ lệ thấp, hầu hết các hộ chăn nuôi không áp dụng các biện pháp an toàn sinh học, việc chấp hành Pháp lệnh Thú y chưa triệt để

Hiện nay, với công tác phòng dịch bằng vaccine và xử lý kịp thời khi có dấu hiệu dịch nên hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn đã được kiểm soát

Ở Việt Nam cũng đã ban hành qui trình chẩn đoán, giám sát hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (TCVN 8400-21: 2014)

1.1.3 Triệu chứng lâm sàng của lợn mắc PRRS

Triệu chứng bệnh thể hiện rất khác nhau, theo ước tính, cứ 3 đàn đầu tiên tiếp xúc với mầm bệnh thì một đàn không có biểu hiện bệnh, một đàn có biểu hiện ở mức độ vừa và một đàn ở mức độ nặng Lý do cho việc này vẫn chưa có lời giải, tuy nhiên với những đàn khoẻ mạnh thì mức độ bệnh cũng giảm nhẹ hơn, và cũng có thể do virus tạo nhiều biến chủng với độc lực khác nhau Thực tế nhiều đàn có huyết thanh dương tính nhưng không có biểu hiện lâm sàng Mức độ lâm sàng thay đổi tuỳ chủng virus, sự biến động khả năng gây bệnh của virus, hàm lượng virus tăng trong máu và các mô, khả năng của các chủng có độc lực cao có thể tái sản trong cơ thể ký chủ

+ Biểu hiện bệnh

Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp có biểu hiện đặc trưng là vô sinh, chết thai muộn, sảy thai, đẻ non và sinh ra lợn con yếu ớt, lợn con thường chết sớm sau khi sinh do bệnh đường hô hấp Lợn lớn hơn có thể biểu hiện các triệu chứng nhẹ của bệnh đường hô hấp, thường phức tạp thêm do đồng nhiễm virus, vi khuẩn khác gây bệnh trên lợn Ở lợn nọc và lợn nái (hậu bị) có thể quan sát thấy sốt và biếng ăn tạm thời, khó thở (thoi thóp), lờ đờ Mọi lứa tuổi lợn đều cảm nhiễm với virus, mầm

bệnh thường tồn tại lâu trong đàn nái Lợn nái thường truyền mầm bệnh cho bào thai Lợn rừng mọi lứa tuổi đều cảm nhiễm virus, có thể phát bệnh, nhưng cũng có thể không phát bệnh, đây có thể coi là nguồn tàng trữ bệnh tự nhiên rất nguy hiểm Người và các động vật khác không mắc bệnh, trong thiên nhiên có loài vịt trời

(Mallard duck) có mẫn cảm với virus (Zimmerman et al.,1997), đây là nguồn gieo

rắc mầm bệnh trên diện rộng rất khó kiểm soát

- Lợn nái

Các triệu chứng chủ yếu là tím âm hộ, sảy thai, thai chết lưu, thai gỗ hàng loạt, đẻ non, lợn con đẻ ra yếu ớt, tỷ lệ tử vong cao Tỷ lệ thai chết tăng lên theo độ tuổi của thai: Thai dưới 2,5 tháng tuổi tỷ lệ chết 20%, thai trên 2,5 tháng tỷ lệ chết

là 93,75% (Phạm Ngọc Thạch và cs, 2007) Lợn nái trong giai đoạn nuôi con thường lười uống nước, viêm vú, mất sữa, viêm tử cung âm đạo, mí mắt sưng, có thể táo bón hoặc ỉa chảy, viêm phổi Triệu chứng điển hình đặc trưng ở lợn nái khi mắc hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp là hiện tượng sảy thai ồ ạt ở giai đoạn lợn

có chửa thời kỳ 2 (giai đoạn bào thai đã hình thành đầy đủ các bộ phận của cơ thể) Điều này này đã gây thiệt hại lớn về kinh tế cho người chăn nuôi lợn nái sinh sản và gây cản trở cho việc áp dụng công nghệ sinh sản gây động dục đồng loạt để có được lượng lớn lợn nái chửa và đẻ đồng loạt cho lượng lớn lợn con cùng một thời điểm

có rỉ và mí mắt sưng húp là biểu hiện phổ biến thứ 3, kết hợp với triệu chứng lạc giọng, khản tiếng, thở khó, thở thể bụng, chảy nước mũi, khớp đau, sưng nên chân thường choãi ra, đi lại khó khăn, tỷ lệ tử vong cao (Lê Văn Năm, 2007)

- Ở lợn con sau cai sữa và lợn thịt

Ở lợn con sau cai sữa, mí mắt thường sưng húp, có màu đỏ thâm, làm cho mắt lõm sâu tạo nên một quầng thâm xung quanh mắt nên nhìn lợn giống như được

“đeo kính râm” Tỷ lệ táo bón ở lợn loại này rất cao nhưng tỷ lệ tiêu chảy thấp hơn lợn con theo mẹ (Lê Văn Năm, 2007)

Ở lợn thịt, các triệu chứng tập trung chủ yếu ở đường hô hấp Lợn bị viêm phổi nặng, ho nhiều, thở rất khó khăn, thở dốc, thở thể bụng, ngồi thở, hắt hơi, chảy nước mắt Do phổi bị viêm nặng nên hiện tượng da xanh, đặc biệt là tai xanh xuất hiện sớm, điển hình và chiếm tỷ lệ lớn ở loại lợn này Tỷ lệ chết đôi khi lên đến

12%-20% do viêm phổi và đồng nhiễm với vi khuẩn (Rossow et al., 1995)

PRRS đã được tác giả Tô Long Thành tổng hợp rõ và khẳng định rằng lợn ở các lứa tuổi đều mắc bệnh, nhưng nặng nhất ở lợn nái và lợn con Tác giả đã đưa ra biện pháp phòng hội chứng PRRS, trong đó nhấn mạnh việc phòng bệnh bằng vaccine (Tô Long Thành, 2007)

1.1.4 Bệnh tích PRRS

Bệnh tích biến đổi phổ biến trên lợn chủ yếu ở phổi, phổi bị mủ hóa và chắc đặc, nhục hoá, thuỳ phổi bị bệnh màu đỏ xám, mặt cắt ngang của thuỳ phổi lồi ra,

khô và xuất hiện những nốt loét trên các cơ quan nội tạng (Lê Văn Năm, 2007)

Virus PRRS gây ức chế miễn dịch nên khi lợn nhiễm virus trong tử cung, lợn con sinh ra nếu không chết thì có thể nhiễm virus tiềm tàng với bệnh tích như viêm gian thuỳ phổi, sưng hạch lympho, teo tuyến ức và có những tổn thương do đồng nhiễm vi khuẩn, dấu hiệu đặc trưng là hiện tượng lợn nhiễm virus huyết và kéo dài (Tô Long Thành, 2007)

1.1.5 Tác nhân gây bệnh và con đường truyền lây PRRS

Tác nhân gây bệnh là virus PRRS, chúng được phát hiện từ nhiều loại chất tiết và các chất thải của lợn bệnh bao gồm: máu, tinh dịch, nước bọt, phân, hơi thở, sữa Sau cảm nhiễm, lợn bệnh có thể chứa virus trong huyết thanh đến 210 ngày, trong tinh dịch 92 ngày, trong dịch mũi 21 ngày và trong dịch hầu họng đến

157 ngày Trong đó, tinh dịch và dịch mũi là hai nguồn lây nhiễm đáng quan tâm

Virus xâm nhiễm ở các cơ quan như: đại thực bào phế nang, phổi, tim,

thận, não, lách, hạch lympho, tuyến ức, amidan, tuỷ xương, bạch cầu mạch máu ngoại vi, huyết thanh của lợn nhiễm bệnh Virus huyết có thể phát hiện ngay 1

ngày sau khi tiêm nhiễm, nhưng phổ biến hơn ở 28 ngày (Halbur et al., 1995a)

Virus PRRS chủ yếu truyền lây qua hai đường chính đó là lây truyền trực tiếp và lây truyền gián tiếp:

- Đường truyền lây trực tiếp: Virus gây PRRS trên lợn lây qua đường hô

hấp, gieo tinh, tiêu hoá, chất chứa mầm bệnh Virus PRRS lây trực tiếp trong và giữa các quần thể lợn qua gieo tinh Sự truyền lây theo chiều dọc xảy ra trong suốt giai đoạn giữa đến giai đoạn cuối của thời kỳ mang thai Lây truyền theo chiều ngang qua tiếp xúc trực tiếp giữa lợn nhiễm bệnh và qua tinh dịch từ những lợn đực nhiễm bệnh

- Đường truyền lây gián tiếp: Virus PRRS chủ yếu qua các dụng cụ, thiết bị chăn

nuôi như: thức ăn, nước uống, ủng, giày dép, quần áo bảo hộ, kim tiêm và các phương tiện vận chuyển có mang virus PRRS là một đường lây lan cơ học tiềm năng Virus có thể theo gió đi xa tới 3 km, do vậy virus có khả năng phát tán rất rộng thông qua việc vận chuyển lợn ốm, lợn đã nhiễm PRRS

được giải phóng ồ ạt rồi xâm nhiễm sang các tế bào khác Ở giai đoạn đầu của quá trình xâm nhiễm của virus PRRS, dường như hiệu giá kháng thể kháng lại các loại virus và vi khuẩn khác không liên quan trong cơ thể của lợn tăng cao do sự kích hoạt của đại thực bào trong hệ thống miễn dịch Điều này rất dễ gây ra sự nhầm lẫn trong việc đánh giá mức độ miễn dịch đối với các bệnh truyền nhiễm ở cơ thể lợn

Tác động phá huỷ đại thực bào phế nang, đặc biệt trên lợn con, làm giảm khả năng đề kháng của vật chủ chống lại xâm nhập đồng nhiễm của các virus, vi khuẩn khác Hầu hết sự đồng nhiễm được quan sát sau ổ dịch PRRS là bệnh đường hô hấp Những tế bào bảo vệ đầu tiên như PAM bị phá huỷ thì nó sẽ ảnh hưởng rất lớn đến khả năng của vật chủ chống lại vi khuẩn và virus gây bệnh (Hoàng Văn Năm, 2001) Khi tế bào đại thực bào bị virus phá hủy, đại thực bào không còn các "chân giả", mất khả năng bắt giữ và tiêu diệt tác nhân gây bệnh, các phản ứng miễn dịch không xảy ra được, lợn rơi vào trạng thái suy giảm miễn dịch từ đó dễ dàng mắc các bệnh nhiễm trùng thứ phát, điều này có thể thấy rõ ở đàn lợn vỗ béo chuẩn bị giết thịt, khi bị nhiễm virus PRRS sẽ có sự tăng đột biến về tỷ lệ viêm kẽ phổi kế phát do những vi khuẩn vốn có sẵn trong đường hô hấp, PRRS suy giảm miễn dịch mở đường cho những vi sinh vật như: Pasteurella multosida, Haemophilus parasuis, Streptococcus suis, A pleuropneumoniae, Chlamydia psittaci, Leptospira interrogans, virus giả dại, virus cúm, Enterovirus, Parvovirus

Trong nghiên cứu gần đây, Ma H et al, 2021 đã làm sáng tỏ sự lây nhiễm

Virus PRRS-2 qua trung gian CD163 và giúp chúng ta hiểu sâu hơn về cơ chế bệnh sinh của virus, điều này sẽ cung cấp manh mối để phòng ngừa và kiểm soát PRRS

1.2 Virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn

1.2.1 Nguồn gốc, phân loại virus PRRS

Virus PRRS là một RNA chuỗi đơn dương, được xếp vào bộ Nidovirales, họ

Arteriviridae, chi Arterivirus (Collins et al., 1992) Các thành viên khác trong họ

Arteriviridae còn có virus viêm động mạch ngựa (EAV), virus nâng mức khử hidro lactate (LDV) của chuột lang và virus sốt xuất huyết khỉ (SHFV) Dựa vào sự tương

đồng về mặt định hướng hệ gen và cơ chế nhân lên, họ Arteriviridae cùng với các họ

Coronaviridae, Roniviridae và Mesoniviridae được xếp vào bộ Nidovirales (Dea et al.,

1992), trong hệ thống phân loại ICTV (International committee on taxonomy of

viruses) (Christianson et al., 1992)

Hình 1.2 Cây phả hệ của virus PRRS

(Nguồn: Amonsin et al., 2009)

Khi phân tích cấu trúc và nguồn gốc hệ gen các nhà khoa học đã chia virus làm

2 nhóm:

Nhóm 1 gồm những virus thuộc chủng Châu Âu (thường gọi là Lelystad

Virus-LV)

Nhóm 2 gồm những virus thuộc chủng Bắc Mỹ mà đại diện là VR-2332

(Collins, 1991; Murtaugh et al., 1995)

Hai nhóm virus này có sự tương đồng đến 60% về cấu trúc các ribonucleotide

(Han et al., 2006) Sự khác biệt về 40% cấu trúc gen dẫn đến tính đa dạng về di truyền

và kháng nguyên Các nhà khoa học còn cho biết virus PRRS phân lập được từ các vùng địa lý khác nhau đều có dấu hiệu khác biệt về tính di truyền Hơn nữa virus của cùng một nhóm cũng có sự khác nhau đến 20% về trình tự và số lượng nucleotide, điển

hình là các chủng virus thuộc dòng Bắc Mỹ (Tian et al., 2007; Charerntantanakul,

2012), sự đa dạng và khả năng biến đổi cấu trúc di truyền của virus PRRS đó tạo ra sự phức tạp của mầm bệnh lưu hành trên thế giới và gây nhiều khó khăn cho việc tạo

ORF 1a

ORF 1b

(Hà Lan) 15.111 221 14.763 7.191 4.392 750 798 552 606 522 387 127 VR2332

(Nguồn: Nielsenet et al.,1999)

(Ghi chú: Độ dài gen và hệ gen tính bằng bp (base pair), đầu 5’ và đầu 3’ là phần không mã hóa ở đầu và cuối hệ gen)

Tổng độ dài của hệ gen của chủng virus VR2332 phân lập tại Mỹ (số đăng ký: AY150564) thuộc genotype II, đại diện dòng Bắc Mỹ là 15.451 bp, trong đó

phần mã hóa sử dụng cho 7 khung đọc mở là 15.071 bp (Nielsen et al., 1999) Hệ

gen của virus PRRS chủng GD (Quảng Đông) (số đăng ký: EU109503) đại diện cho một nhóm virus PRRS mới phân lập có độc lực rất cao ở Trung Quốc, cũng thuộc genotype II, dòng Bắc Mỹ, có độ dài là 15.353 bp, trong đó phần mã hóa sử dụng

cho 7 khung đọc mở là 14.981 bp (Tian et al., 2007)

Độ dài các gen và trình tự xắp xếp các nucleotide trên gen khác nhau giữa các chủng virus PRRS đã tạo ra khoảng cách về di truyền và sự sai khác về mức độ tương đồng kháng nguyên giữa các chủng virus PRRS Đây cũng chính là tính phức tạp về mặt bệnh nguyên của PRRS

1.2.2 Cấu trúc, chức năng hệ gen virus PRRS

Cấu trúc virus PRRS quan sát dưới kính hiển vi điển tử có dạng hình cầu, có

vỏ bọc, trên bề mặt có nhiều gai nhô ra, kích thước 45-80 nm và chứa nhân nucleocapside kích thước 25-35nm

Hệ gen của virus PRRS là một chuỗi RNA đơn dương, dài khoảng 15 kb và chứa 9 khung đọc mở (ORF) ORF1a và ORF1b chiếm khoảng 80% hệ gen virus và được dịch thành hai polyprotein lớn là protein sao chép pp1a và pp1b Những protein này sau khi dịch mã bởi 4 protease thành 14 protein phi cấu trúc (NSPs), NSP1α, NSP1β và NSP2 đến NSP12 NSP9 mã hóa cho RNA polymerase phụ thuộc RNA và NSP10 mã hóa cho helicase, là hai protein phi cấu trúc chính chịu trách nhiệm sao chép và phiên mã của hệ gen virus Người ta đã chứng minh được rằng có một vùng đặc biệt thuộc protein NSP11 đóng vai trò quan trọng trọng chu

trình sao chép của tất cả các virus thuộc chi Arterivirus (Bautista et al., 2002; Fang

and Snijder, 2010) ORFs 2a, 2b và ORF3-7 nằm ở đầu 3’ của hệ gen virus, sau dịch

mã được phân cắt thành các protein cấu trúc của virus PRRS (Dea et al., 1996; Meulenberg et al., 1995; Wu et al., 2001) Các protein cấu trúc được biểu hiện ra từ

các đoạn mRNA nằm ở đầu 3’ của hệ gen virus và có cùng trình tự điều khiển nằm

ở đầu 5’ của các đoạn này (Snijder and Meulenberg, 1998) Glycoprotein 5 (GP5), protein màng (M) và nucleoprotein (N) được mã hóa bởi các ORFs 5-7, là các thành

phần chính của hạt virus (Dea et al., 2000)

ORF 2a, 3 và 4 mã hóa cho các protein khác thuộc hạt virus bao gồm GP2a, GP3 và GP4 Các protein này tương tác với nhau và tụ hội thành virion như một phức hệ đa thành phần và cũng tham gia vào quá trình nhiễm trùng của virus

(Wissink et al., 2005) ORF 2b mã hóa cho protein vỏ (E)

ORF2a, ORF2b và ORFs 3-7 mã hóa lần lượt cho protein cấu trúc virus GP2a, GP2b (E), GP3, GP4, GP5, M và N (Snijder and Meulenberg, 1998); GP2b là một ORF nhỏ ở bên trong, nằm hoàn toàn trong ORF2 GP2a, GP3, và GP4 là các protein vỏ phụ bị glycosyl hóa ở đầu N, tạo thành dị tam hợp bằng liên kết

disulphide (Wieringa et al, 2003a; Wissink et al, 2004)

Hình 1.3 Cấu trúc thông tin di truyền của virus PRRS

(Nguồn: http://www.porcilis-prrs.com/microbiology-Virus PRRS-structure.asp)

Bảng 1.3 Hệ gen của virus PRRS và các thông tin liên quan

nsp 2 Cystein protease, giống papain Chất đối kháng IFN mạnh nsp 3 Protein chuyển màng Chưa có số liệu - chưa biết

huyết thanh học về sự cảm nhiễm virus

nsp 7  Chưa biết

nsp 9 Polymerase RNA phụ thuộc Chưa biết

GP2a Protein vỏ nhỏ, tương tác với

8 ORF5 GP5 Protein vỏ chính, tương tác với

8 ORF6 M protein Protein vỏ chính, tương tác với

1.2.3 Đa dạng di truyền hệ gen virus PRRS

Virus PRRS có hai genotype với sự tương đồng về nucleotide là 60%, tuy nhiên các tính chất về sinh học của virus PRRS thuộc hai genotype lại rất giống

nhau (Kim et al., 2008) Sự tương đồng về nucleotide giữa các chủng phân lập ở

Mỹ và vùng Lelystad của Hà Lan chỉ là 45,7% trong ORF1b, 65%-67% trong ORF2, 61%-64% trong ORF3, 63%-66% trong ORF4, và 61%-63% trong ORF5

(Meng et al., 1995a; Meng et al., 1995b)

Các gen thuộc khung đọc ORF6 và ORF7 là tương đối bảo thủ giữa các

chủng phân lập ở Mỹ hoặc giữa các chủng phân lập ở Châu Âu, tuy nhiên có sự bến đổi di truyền khá mạnh trong các gen thuộc khung đọc ORF6 và ORF7 giữa các chủng phân lập ở Châu Âu và Mỹ Sự khác biệt giữa các chủng ở Mỹ chỉ là 2,5%-7,9%, trong khi đó sự khác biệt giữa các chủng ở Mỹ và vùng Lelystad là

35% (Kapur et al., 1996)

Trình tự ORF1 cũng có sự sai khác rất lớn giữa các chủng phân lập ở Châu

Âu và Mỹ, sự tương đồng chỉ đạt 55% (Allende et al., 1999; Nelsen et al., 1999)

ORF1b có tính bảo thủ cao hơn ORF1a và độ tương đồng về nucleotide đạt 63,4%

Sự biến đổi nhiều nhất được tìm thấy trong vùng NSP2 của hệ gen virus Độ tương đồng về axit amin chỉ đạt 47% giữa các mẫu phân lập ở Châu Âu và Mỹ Sự đa hình gen lớn nhất được tìm thấy trong vùng NSP2 của virus LV Khái niệm về nhóm virus

có liên quan với nhau được hình thành bởi một hoặc nhiều đột biến giống nhau (quasispecies) khi virus đồng nhiễm ở động vật đã được Goldberg và công sự (2003)

đề xuất khi phân tích trình tự các chủng virus PRRS khác nhau nhiễm trùng lây lan giữa các loài Đã có các bằng chứng về sự xuất hiện các quần thể phụ của virus PRRS biến đổi về mặt di truyền các chủng phân lập từ cơ quan sinh sản của lợn sau khi có

tiến hóa kiểu quasispecies (quasispecies evolution) (Rowland et al., 1999) Điều quan

trọng là việc xuất hiện các quần thể phụ của virus PRRS biến đổi về mặt di truyền sẽ gây khó khăn cho việc tiêm chủng phòng PRRS do vaccine sẽ không còn hiệu lực

hoặc giảm hiệu lực chống lại các chủng virus PRRS biến đổi di truyền (Domingo et

al., 1998; Duarte et al., 1994; Domingo and Holland, 1992)

1.2.4 Các protein kháng nguyên quan trọng của virus PRRS

Hiểu biết về vai trò của protein trong sự sao chép của virus và sự gây bệnh còn chưa đầy đủ Vai trò của protein N, M, GP5 rất quan trọng với sự hình thành các hạt virus, nhưng các protein phụ cũng cần thiết cho sự lây nhiễm của virus

(Wissink et al., 2004)

Các phân tử glycoprotein nhỏ GP2, GP3, GP4 và protein E tương tác với nhau

để tạo thành một cấu trúc heterotetrameric phức hợp trong các tế bào bị nhiễm Việc hình thành phức hợp này là cần thiết trong việc truyền nhiễm của virion (Das, 2011)

Glycoprotein 5 (GP5), protein màng (M) và nucleoprotein (N) được mã hóa bởi

các ORFs 5-7, là các thành phần chính của hạt virus (Dea et al., 2000) Protein N tương

tác với hệ gen virus để hình thành nucleocapsid M6 tương tác với GP5 để hình thành heterodimer cần thiết cho việc lắp ráp hạt virus Hạt virus sẽ không giải phóng ra nếu

thiếu protein M hoặc GP5 (Mardassi et al.,1996; Wissink et al., 2005)

Protein M (membrane protein) có khối lượng phân tử khoảng 18-19 kDa, không được glycosyl hoá, là protein liên kết vỏ bọc, mang tính kháng nguyên và có tính bảo tồn cao nhất với mức độ tương đồng axit amin giữa hai nhóm châu Âu và Bắc Mỹ đạt đến 78%-81% (Mardassi, 1995) Protein M có cấu trúc tương tự như cấu trúc protein M của các virus thuộc nhóm Coronavirus Protein M hình thành cầu nối disunfit với GP5 cấu thành một phần virus và được tìm thấy trong tế bào nhiễm nhưng cầu nối sunfit này không cấu thành hạt virus (Meulenberg, 1997) Mặc dù chức năng của nó được biết rất ít nhưng nó được xem như có vai trò trong sự kết hợp với thụ thể trên tế bào đích, vì protein M kết hợp GP5 tạo phức hợp M-GP5 để kết hợp với thụ thể trên tế bào đích

Protein N là một protein nhỏ, có khối lượng phân tử khoảng 14-15 kDa, đây

là protein vỏ bọc nhân, có tính kháng nguyên và tính kiềm cao, điều này có thể giúp

nó tương tác dễ dàng hơn với bộ gen RNA Protein N hiện diện ở mức độ cao trong những tế bào bị nhiễm virus PRRS và chiếm từ 20%- 40% lượng protein của phân

tử virus (Snijder et al., 1998)

Glycoprotein GP5 là vỏ bọc kết hợp glycogen, đây là protein biến đổi nhất của virus PRRS, mức độ tương đồng axit amin giữa hai nhóm châu Âu và Bắc Mỹ chỉ

khoảng 50-55% (Mardassi et al., 1995; Meng et al., 1995b) Kháng nguyên GP5 kích

thích tạo đáp ứng kháng thể trung hòa chính vì thế do áp lực chọn lọc bởi kháng thể tồn lưu, kháng nguyên bắt buộc phải thay đổi để virus có thể thoát khỏi sự trung hòa của kháng thể tồn lưu Các kháng thể trung hòa chủ yếu liên kết trực tiếp với các epitope có trên bề mặt của protein GP5 để trung hòa virus Những epitope trung hòa này nằm sát ngay cạnh các vị trí glycosyl hoá Có ba vị trí epitope kích thích tế bào lympho B đã được xác định, một epitope trung hòa chính nằm ở giữa của ectodomain GP5 (aa 36-52), một epitope không trung hòa (epitope A) và một epitope trung hòa

(epitope B) trong ectodomain của protein GP5 (Ostrowski, 2002)

Hình 1.4 Cấu trúc Protein của virus PRRS

(Nguồn: http://www.porcilis-prrs.com/microbiology-Virus PRRS-structure.asp)

1.2.5 Đáp ứng miễn dịch của lợn khi virus PRRS xâm nhiễm

Sau khi bị nhiễm virus PRRS, lợn có đáp ứng miễn dịch ngay, tuy nhiên sự sản sinh kháng thể có những đặc điểm khác thường ở cả miễn dịch dịch thể và miễn dịch tế bào Sự xuất hiện kháng thể này sớm hay muộn có biến động khác nhau ở từng cá thể lợn và cả theo tuổi lợn cũng như sự tồn tại kháng thể này kéo dài cũng rất khác nhau

Bảng 1.4 Phát hiện kháng thể đặc hiệu kháng virus PRRS qua các

phương pháp xét nghiệm Phương pháp

xét nghiệm

Ngày phát hiện được sau nhiễm virus

Tuần đạt đỉnh cao sau nhiễm virus

Ngày cuối phát hiện được sau nhiễm virus

(Nguồn: Yoon et al., 1995)

Nghiên cứu về đáp ứng miễn dịch dịch thể ở lợn kháng lại virus PRRS đã cho thấy lợn xuất hiện kháng thể trực tiếp kháng lại protein N sớm nhất, tiếp theo là kháng thể kháng protein M rồi đến kháng thể kháng glycoprotein GP5 Hầu hết các test chẩn đoán phát hiện các kháng thể kháng lại các protein N của virus khoảng sau

1 tuần nhiễm bệnh và tồn tại nhiều tháng nhưng hầu như không có tác động đến sự bảo vệ cho lợn khỏi bị bệnh Các kháng thể đặc hiệu sinh ra ở giai đoạn đầu này

không trung hòa được virus PRRS in vitro cũng như khi thí nghiệm in vivo dùng

kháng thể này tiêm cho lợn gây miễn dịch thụ động, lợn vẫn không được bảo hộ khi

công cường độc (Lopez et al., 2004)

Sự xuất hiện sớm các kháng thể đặc hiệu không trung hòa, có ảnh hưởng lớn đến sự phát triển PRRS Các kháng thể không trung hòa này vô tình tạo điều kiện cho virus PRRS tăng cường sinh sản trong đại thực bào Hiện tượng này miễn dịch học gọi là "Sự tăng cường bệnh phụ thuộc vào kháng thể" (ADE: Antibody-Dependent Enhancement), nên đáp ứng kháng thể này lại trở thành có hại cho vật chủ Đáp ứng dịch thể không trung hòa của virus PRRS đã che bọc cho virus và

thúc đẩy sự tiếp thu phân tử virus vào trong đại thực bào (Mateu et al., 2008) Đó là

một chiến lược virus dùng để xâm nhập gây bệnh Vì vậy các test chẩn đoán phát hiện kháng thể đặc hiệu trong máu không liên quan đến kháng thể bảo vệ, nó không phải là kháng thể trung hòa virus

Hình 1.5 Đáp ứng miễn dịch của lợn sau khi nhiễm virus PRRS

(Nguồn: Lopez et al., 2004)

Sự tương quan khác thường của virus PRRS với các phản ứng miễn dịch của lợn theo thời gian Ở giai đoạn nhiễm đầu, khi có virus huyết lợn sản sinh kháng thể đặc hiệu không trung hòa, virus và các kháng thể này song song tồn tại cho đến 4 tuần sau nhiễm các tế bào sản sinh IFN- và kháng thể trung hòa virus mới phát triển Những kháng thể trung hòa này chủ yếu chống lại protein GP5 nơi bao gồm

chủ yếu các epitope trung hòa (Lei et al., 2014) Đáp ứng miễn dịch chống GP5 yếu

và chậm là do mức N-glycosyl hóa bao quanh epitope trung hòa, một hiện tượng gọi

là rào chắn N-glycan Hơn nữa epitope tại vị trí axit amin 27-30 trên GP5 của virus

PRRS type 2 không bị tác động trung hòa mà ngược lại, có chức năng làm giảm đáp ứng miễn dịch dịch thể, dẫn đến việc làm chậm sản sinh kháng thể trung hòa chống virus PRRS Sự xuất hiện sớm các kháng thể không phải trung hòa có vai trò lớn trong sự tiến triển của hội chứng Cụ thể nó thúc đẩy sự nhân lên của virus trong đại

thực bào ở phế nang thông qua các yếu tố bám dính (Duan et al., 1998) giữa virus

PRRS và đại thực bào hay còn được gọi là sự tăng cường yếu tố phụ thuộc kháng

thể (Yoon et al., 1997) Người ta nhận thấy đáp ứng miễn dịch của lợn đối với

PRRS có ảnh hưởng đến khả năng đáp ứng miễn dịch của dịch tả lợn Ở những lợn mắc PRRS, virus sẽ làm giảm khả năng đáp ứng miễn dịch đối với việc tiêm phòng vaccine dịch tả lợn (Lý Thị Liên Khai và cs., 2012)

1.2.6 Sức đề kháng của virus PRRS

Virus PRRS có vỏ bọc ngoài, sự sống sót của virus bên ngoài vật chủ chịu tác động của nhiệt độ, pH và sự tiếp xúc với các chất sát trùng Các chất sát trùng thông thường và môi trường có pH axit dễ dàng tiêu diệt virus Ánh sáng mặt trời và tia tử ngoại vô hoạt virus nhanh chóng

Virus PRRS có khả năng sống sót trong khoảng thời gian dài hơn 4 tháng ở nhiệt

độ dao động trong khoảng -70oC đến -20oC, 20 phút ở 56oC, 24 giờ ở 30oC và 6 ngày ở

21oC Tuy nhiên khả năng sống của virus PRRS giảm nhanh khi nhiệt độ tăng lên

Virus PRRS bền vững ở trong khoảng từ pH 6,5-7,5, tuy nhiên tính gây nhiễm

giảm ở pH < 6,0 hoặc pH > 7,65 (Paton et al., 1991)

Ngoài ra virus cũng bị vô hoạt bởi các điều kiện bất lợi của môi trường ngoài như ánh sáng mặt trời, tia tử ngoại

1.2.7 Đặc điểm nuôi cấy virus PRRS

Có nhiều dòng tế bào có thể sử dụng để nuôi cấy virus như: Đại thực bào phế nang lợn Porcine Alveolar Macrophage (PAM), dòng tế bào CL 2621, tế bào MA

104, tế bào Marc 145

PAM là môi trường tốt nhất cho phân lập virus vì nó có độ nhạy cao nhất, virus

có thể nhân lên với số lượng lớn và có thể nuôi cấy tất cả các chủng virus PRRS lưu hành trên thế giới Nhược điểm của PAM là phải chuẩn bị môi trường từ những con lợn khỏe mạnh và PAM không phải là tế bào dòng nên sự nhân lên của tế bào là có giới

hạn do đó không thể lưu giữ virus trong thời gian lâu dài (Kim et al., 1993)

Với các dòng tế bào như: MA-104, Marc 145, CL-2621 hiện đang được sử dụng nhiều hơn và khắc phục được nhược điểm của tế bào PAM Trong đó Marc

145 có thể phân lập được 11 dòng virus của cả 2 chủng Châu Âu và Bắc Mỹ, hơn nữa thời gian và mức độ gây bệnh tích tế bào, số lượng virus thu được sau khi phân lập đều đảm bảo yêu cầu nên dòng tế bào này đang được ứng dụng nhiều cho chẩn đoán và nghiên cứu

Hiện nay, nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới đang dùng loại tế bào Marc

145 để phân lập virus PRRS, sau 12, 24, 36, 72 giờ nuôi cấy, quan sát các CPE (Cytopathic effect hay cytopathogenic effect) để đánh giá sự nhân lên của virus, đã

có công bố về những nghiên cứu tác động của virus PRRS lên tế bào Marc 145

Virus xâm nhập vào tế bào bằng con đường nội bào (endocytosis) qua trung gian receptor Người ta đã xác định heparan sulfate là thụ thể của đại thực bào phế nang đối với virus và trên Marc 145 là vimentin Vimentin là một yếu tố quan trọng trong việc làm ổn định cấu trúc của tế bào chất trong nhiều loại tế bào khác nhau

Những thay đổi có tính thoái hoá do apoptosis gây ra trong tế bào bao gồm nhân tế bào cô đặc lại, vỡ ra, không bào bị thoái hoá, tế bào chất cô đặc, nhiễm sắc thể bị đứt ra từng mảnh

Quá trình nhân lên của virus PRRS trên môi trường tế bào Marc 145, hiệu giá virus có thể đạt tối đa 108,5 TCID50/0,1ml sau 48-72 giờ nuôi cấy Hiệu giá virus đạt

đỉnh cao lúc 24-48 giờ và có thể duy trì tới 60-70 giờ sau nuôi cấy (Kim et al., 1993)

1.3 Nghiên cứu tạo vaccine PRRS

Vaccine là một trong những công cụ can thiệp phòng và dập dịch bệnh hữu hiệu nhất, việc giám sát virus PRRS trên cơ sở thông tin di truyền, đặc điểm cấu