Epstein-Barr virus (EBV) và sự methyl hóa vượt mức trên các gene ức chế khối u là hai nguyên nhân chủ yếu gây nên ung thư vòm họng (UTVH). Mục tiêu chính của nghiên cứu này là xây dựng một kỹ thuật chẩn đoán sớm UTVH dựa trên việc phát hiện đồng thời sự xâm nhiễm của EBV và tính chất methyl hóa vượt mức trên các gene ức chế khối u.
Trang 1NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI TÍNH CHẤT XÂM NHIỄM EPSTEIN-BARR VIRUS VÀ TÍNH CHẤT METHYL HÓA VƯỢT MỨC TRÊN GENE
ỨC CHẾ KHỐI U Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ VÒM HỌNG VIỆT NAM
Phan Thị Hiếu Nghĩa*, Bùi Thị Nhã Phương, Nguyễn Văn Yên, Lâm Hồng Ngọc
Khoa Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Mở thành phố Hồ Chí Minh
*Tác giả liên hệ: hieunghia189@gmail.com
TÓM TẮT
Epstein-Barr virus (EBV) và sự methyl hóa vượt mức trên các gene ức chế khối u là hai nguyên nhân chủ yếu gây nên ung thư vòm họng (UTVH) Mục tiêu chính của nghiên cứu này
là xây dựng một kỹ thuật chẩn đoán sớm UTVH dựa trên việc phát hiện đồng thời sự xâm nhiễm của EBV và tính chất methyl hóa vượt mức trên các gene ức chế khối u Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã xây dựng cơ sở dữ liệu cho thực nghiệm phát hiện sớm UTVH dựa trên hai yếu tố xâm nhiễm EBV và methyl hóa vượt mức trên các gene ức chế khối u bằng kỹ thuật PCR và MSP với các cặp mồi được đánh giá tốt về mặt lý thuyết Về mặt thực nghiệm, chúng tôi đã xây dựng thành công quy trình phát hiện các gene EBNA1, EBNA2, LMP1, LMP2 của EBV và tính chất methyl hóa vượt mức trên vùng promoter của các gene ức chế khối u E-cadherin và Blu trên các mẫu bệnh phẩm Sự hiện diện các gene mục tiêu của EBV và tính chất methyl hóa của các gene E-cadherin và Blu có mối tương quan có ý nghĩa với sự hình thành và phát triển khối u vòm họng (p<0,05) Việc xác định đồng thời sự hiện diện của một trong các gene EBNA1, EBNA2, LMP1 và LMP2 và tính chất methyl hóa của một trong hai gene E-cadherin và Blu là một dấu chứng sinh học tiềm năng cho việc chẩn đoán sớm UTVH
ở người bệnh Việt Nam
Từ khóa: Epstein-Barr virus, methyl hóa vượt mức, ung thư vòm họng
STUDYING OF CO-DETECTION OF EPSTEIN-BARR VIRUS INFECTION AND TUMOR SUPPRESSOR GENES’ HYPERMETHYLATION IN VIETNAMESE
NASOPHARYNGEAL CANCER PATIENTS Phan Thi Hieu Nghia*, Bui Thi Nha Phuong, Nguyen Van Yen, Lam Hong Ngoc
Faculty of Biotechnology, Ho Chi Minh city Open University
*Corresponding Author: hieunghia189@gmail.com
ABSTRACT
Epstein-Barr virus (EBV) and promoter hypermethylation of tumour suppressor genes (TSGs) are two main causes leading to nasopharyngeal carcinoma (NPC) The main purpose of this study is early diagnosis establishment for NPC based on co-detection EBV infection and hypermethylation of TSGs In this study, we built database for experimental research in order
to detect NPC early relied on two factors including EBV infection and hypermethylation of TSGs by polymerase chain reaction (PCR) and methylation-specific polymerase chain reaction (MSP) methods with primers were evaluated well about theory In experimental aspect, we successfully established the process to detect EBNA1, EBNA2, LMP1, and LMP2 genes of EBV and hypermethylation of E-cadherin and Blu genes promoter in clinical samples The presence of EBV genes and methylation of E-cadherin and Blu genes were significant associated with NPC (p<0.05) The simultaneous determination on presence about one of the EBNA1, EBNA2, LMP1, and LMP2 genes and methylation about one of E-cadherin and Blu genes are potential biomarker for early diagnosis of NPC in Vietnamese patients
Keywords: Epstein-Barr virus, hypermethylation, nasopharyngeal carcinoma
GIỚI THIỆU
Ung thư vòm họng (UTVH) là khối u ác tính
xuất phát từ tế bào biểu mô vòm họng (Lung
et al., 2012) Đây là dạng ung thư phổ biến
nhất trong các bệnh ung thư đầu và cổ Tỷ lệ UTVH có sự khác biệt giữa các khu vực địa
lý, trong đó Việt Nam là một trong năm quốc gia có tỷ lệ mắc bệnh và tử vong do UTVH
Trang 2cao nhất khu vực Đông Nam Á (Mahdavifar
et al., 2016) Cụ thể, theo thống kê của
Globocan vào năm 2012, tỷ lệ mắc bệnh
UTVH là 3,9% và tỷ lệ tử vong do UTVH là
3,0% Các phương pháp chẩn đoán UTVH
hiện nay chủ yếu dựa vào các triệu chứng
lâm sàng, nội soi vòm họng, xét nghiệm mô
bệnh học, chẩn đoán huyết thanh EBV… Tuy
nhiên, khi phát hiện UTVH bằng các phương
pháp này thì khối u vòm họng đã phát triển
đến một mức độ nhất định Do đó, việc xây
dựng một phương pháp tiên lượng, chẩn đoán
sớm UTVH là một yêu cầu cấp thiết nhằm
tầm soát UTVH, đưa ra những biện pháp
điều trị kịp thời, nâng cao hiệu quả điều trị và
tỷ lệ sống sót ở bệnh nhân UTVH
Epstein-Barr virus (EBV) và sự methyl hóa
vượt mức trên các gene ức chế khối u là hai
nguyên quan trọng gây bệnh UTVH (Chu et
al., 2008; Thompson et al., 2004; Tsao et al.,
2014) EBV xâm nhiễm, tồn tại, nhân lên và
gây bệnh cho tế bào chủ nhờ vào sự hoạt
động của các gene thuộc họ EBNAs (EBNA1,
EBNA2, EBNA3), LMPs (LMP1, LMP2), …
(Chou et al., 2008; Korcum et al., 2006) Bên
cạnh đó, theo nghiên cứu của Tsai và cộng sự
(2002), EBV còn có khả năng gây ung thư
gián tiếp qua bất hoạt sự hoạt động một số
gene ức chế khối u của tế bào chủ Cụ thể,
trong nghiên cứu này, protein LMP1 của
EBV được chứng minh có chức năng hoạt
hóa de novo methyltransferase dẫn đến sự
methyl hóa vượt mức trên vùng promoter của
Ecadherin, từ đó ức chế biểu hiện gene này
Trong các gene ức chế khối u, Ecadherin và
Blu được chú ý đến bởi đây là các gene có
chức năng điều tiết các quá trình sinh học cơ
bản của tế bào như sự di chuyển, tăng sinh,
biệt hóa, chết theo chương trình tế bào
(apoptosis) và đóng vai trò quan trọng trong
việc ức chế sự tăng sinh của tế bào khối u ác
tính Sự methyl hóa bất thường trên các gene
ức chế khối u E-cadherin, Blu đã được chứng
minh là nguyên nhân hình thành, phát triển
và di căn tế bào UTVH (Bossche et al., 2012;
Hutajulu et al., 2011; Richards et al., 2006;
Zhang et al 2012) Do đó, việc kết hợp phát
hiện sự xâm nhiễm của EBV và tính chất
methyl hóa trên các gene ức chế khối u có ý
nghĩa ứng dụng phát triển thành một dấu
chứng sinh học nhằm tiên lượng cho bệnh
UTVH Nghiên cứu này được thực hiện với
mục tiêu thiết lập cơ sở dữ liệu, xây dựng quy trình phát hiện đồng thời EBV và tính chất methyl hóa trên các gene ức chế khối u
E-cadherin, Blu trên bệnh UTVH; đánh giá
mối tương quan giữa tính chất nhiễm EBV và
methyl hóa trên các gene E-cadherin và Blu
trong quá trình hình thành bệnh UTVH; từ
đó, hướng đến xây dựng một kỹ thuật chẩn đoán sớm UTVH
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Thu nhận mẫu
Tổng số 50 mẫu gồm 36 mẫu mô sinh thiết UTVH và 14 mẫu dịch phết lành do Bệnh viện Chợ Rẫy thành phố Hồ Chí Minh cung cấp năm 2015 Các mẫu này được bảo quản trong dung dịch PBS ở -20oC
Tách chiết DNA, biến đổi bisulfite, phản ứng PCR, MSP
DNA được tách chiết bằng phương pháp Phenol/Chloroform theo quy trình tách chiết của Chomczynski và Sacchi (1987) có thay đổi chỉ số pH của phenol từ 4 thành 8 DNA sau tách chiết được chia làm 2 phần: 1 phần dùng làm khuôn để thực hiện phản ứng PCR khuếch đại các gene mục tiêu của EBV, phần còn lại sẽ được xử lý bằng bộ kit biến đổi bisulfite MethylEdge® của hãng Promega, rồi tiến hành phản ứng MSP để khảo sát sự methyl hóa của các gene ức chế khối u Sản phẩm PCR, MSP được điện di trên gel agarose 1,5%
Phân tích kết quả thực nghiệm
Tần số phát hiện các gene EBNA1, EBNA2,
LMP1, LMP2 và tần số methyl, unmethyl hóa
các gene E-cadherin, Blu được tính toán và
so sánh bằng phương pháp kiểm định Chi bình phương (Chi-square test) Sự khác biệt
về tần số các gene giữa các nhóm được xem
là có ý nghĩa với p ≤ 0,05 Bên cạnh đó, các giá trị tỷ suất chênh (OR), nguy cơ (RR)… cũng được tính toán bằng phần mềm Medcalc®version 16
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Khảo sát sự hiện diện các gene EBNA1,
EBNA2, LMP1, LMP2 của EBV
Kết quả điện di sản phẩm PCR cho các băng sáng rõ với kích thước 269 bp, 219 bp, 104
bp và 69 bp, tương ứng lần lượt với gene
EBNA1, EBNA2, LMP1 và LMP2 (hình 1)
Trang 3Hình 1 Kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại các gene của EBV trên mẫu mô UTVH
Ghi chú: L: thang chuẩn, N: chứng âm, 1 - 10: mẫu mô sinh thiết UTVH
Bảng 1 Kết quả phân tích thống kê các gene EBNA1, EBNA2, LMP1, LMP2
Ghi chú: PI ≥ 0,25: ít nhất 1 trong 4 gene EBNA1, EBNA2, LMP1 và LMP2 được phát hiện
Giá trị AUC (Accuracy) thể hiện độ chính
xác của phương pháp Giá trị K (kappa) thể
hiện độ phù hợp của phương pháp chẩn đoán
lâm sàng và phương pháp chẩn đoán phân tử
Se (Sensitivity): độ nhạy Sp (Specificity): độ
đặc hiệu OR (Odds ratio): tỷ suất chênh RR
(Relative risk): nguy cơ tương đối
Tần số phát hiện các gene EBNA1, EBNA2,
LMP1, LMP2 trong các mẫu bệnh lần lượt là
88,9%, 86,1%, 66,7% và 66,7%; trên các
mẫu lành, tần số phát hiện các gene này lần
lượt là 7,1%, 0%, 0% và 0% Trong trường
hợp phát hiện ít nhất 1 trong 4 gene, tần số
phát hiện được nâng lên là 91,7%, do đó làm tăng độ nhạy so với trường hợp phát hiện đơn gene Sự hiện diện 1 trong các gene của EBV
có mối tương quan có ý nghĩa với UTVH (p<0,05) Các giá trị độ chính xác AUC, độ phù hợp K trong trường hợp phát hiện đa gene EBV cao hơn so với đơn gene (bảng 1), bên cạnh đó, các giá trị này cũng cho phép khẳng định phương pháp chấn đoán UTVH dựa trên phát hiện đa gene EBV là hoàn toàn phù hợp với độ chính xác rất cao
Khảo sát tính chất methyl hóa trên gene
E-cadherin và gene Blu
Hình 2 Kết quả điện di sản phẩm MSP khuếch đại gene E-cadherin, Blu trên các mẫu mô đã
biến đổi bisulfite
Ghi chú: L: thang chuẩn, (N): chứng âm, (1) - (3): mẫu bệnh, (5), (6): mẫu lành
Trang 4Kích thước sản phầm của E-cadherin là 204
bp đối với mồi methyl và 211 bp đối với mồi
unmethyl
Đối với Blu, kích thước sản phẩm lần lượt là
231 bp và 235 bp đối với cặp mồi methyl và
unmethyl
Tần số methyl hóa của gene E-cadherin trên
mẫu bệnh là 97,2%, trên mẫu lành là 42,9%
Đối với gene Blu, tần số methyl hóa trên mẫu
bệnh là 100%, trên mẫu lành là 64,3% (hình
2)
Trạng thái methyl hóa được xác định bằng
phương pháp giải trình tự và được phân tích bằng phần mềm Bioedit Kết quả phân tích cho thấy đoạn trình tự khuếch đại trên gene
E-cadherin có 19 vị trí CG, trong đó có 7 vị
trí CG bị methyl hóa, 12 vị trí CG không bị methyl hóa Đoạn trình tự khuếch đại trên
gene Blu có 12 vị trí CG và cả 12 vị trí CG
này đều bị methyl hóa Do đó, chúng tôi kết
luận rằng trình tự promoter trên gene
E-cadherin methyl hóa không hoàn toàn, trình
tự promoter trên gene Blu bị methyl hóa hoàn
toàn (kết quả không trình bày)
Bảng 2 Kết quả phân tích thống kê trường hợp methyl trên gene E-cadherin và Blu
Ghi chú: MI ≥ 0,5: có sự methyl hóa trên ít nhất 1 trong 2 gene E-cadherin và Blu
Sự kết hợp xác định tính chất methyl hóa trên
gene E-cadherin, Blu cho tần số methyl hóa
là 100% và unmethyl hóa là 94,4% trên mẫu
bệnh, cao hơn tần số methyl hóa của từng
gene Tính chất methyl hóa của các gene
E-cadherin và Blu có mối tương quan có ý
nghĩa với UTVH (p<0,05) Bên cạnh đó, các
giá trị AUC, kappa, độ nhạy, độ đặc hiệu,
OR, RR cũng được tính toán, thể hiện ở bảng
2 Mặc dù các giá trị AUC, kappa và độ đặc
hiệu của phương pháp chẩn đoán UTVH dựa trên xác định tính chất methyl hóa ở trường hợp đa gene thấp hơn so với trường hợp đơn gene, nhưng độ nhạy của phương pháp chẩn đoán dựa trên đa gene được nâng lên mức cao nhất (Se = 100%)
Kết hợp phát hiện yếu tố nhiễm EBV và tính chất methyl hóa trên hai gene ức chế khối u
Bảng 3 Kết quả phân tích thống kê kết hợp giá trị PI và MI
PI (PI ≥ 0,25) kết hợp MI (MI ≥ 0,5)
Mẫu bệnh (n = 36) 36 (100,0) 0 (0,0)
Mẫu lành (n = 14) 11 (78,6) 3 (21,4)
Trang 5Kết quả phân tích thống kê đồng thời giá trị
PI và MI cho tần số phát hiện là 100% trên
mẫu bệnh và 78,6% trên mẫu lành Kết quả
này cho thấy giữa sự hiện diện các gene mục
tiêu của EBV, tính chất methyl hóa của các
gene E-cadherin, Blu với UTVH có mối liên
hệ chặt chẽ với nhau (p < 0,05) Dù được tiến
hành trên cỡ mẫu nhỏ nhưng nghiên cứu đã
xây dựng được một kỹ thuật chẩn đoán đạt
được độ nhạy cao (Se = 100%) Độ chính xác
AUC ở mức tương đối (AUC = 0,61), do đó
chúng tôi đề nghị tăng cỡ mẫu nhằm tăng độ
tin cậy của dữ liệu Giá trị độ đặc hiệu Sp =
21,4% cho thấy trong nhiều nguyên nhân dẫn
đến UTVH, yếu tố nhiễm EBV và tính chất
methyl hóa vượt mức trên gene ức chế khối u
E-cadherin và Blu đóng góp 21,4% trong quá
trình hình thành bệnh ở các mẫu bệnh khảo
sát Bên cạnh đó, chỉ số thuộc khoảng mức
độ phù hợp nhẹ ( 0,28) cho thấy về
mặt thực nghiệm, việc sử dụng tính chất
nhiễm EBV và methyl hóa trên gene
E-cadherin và Blu trong chẩn đoán ở mức hỗ
trợ tương đối Điều này cũng phù hợp về mặt
lý thuyết khi hiện nay chưa có nhiều công bố
về mối tương quan giữa 2 yếu tố nhiễm EBV
và tính chất methyl hóa trên gene E-cadherin
và Blu trong UTVH Dù vậy, sự xâm nhiễm
của EBV và tính chất methyl hóa trên các
gene ức chế khối u này đều có ý nghĩa trong
quá trình hình thành UTVH và hỗ trợ chẩn
đoán trong lâm sàng
Phương pháp phát hiện đồng thời sự hiện
diện một trong bốn gene EBNA1, EBNA2,
LMP1, LMP2 và tính chất methyl hóa trên
một trong hai gene E-cadherin và Blu cho tần
số phát hiện, độ nhạy cao hơn so với trường
hợp phát hiện đơn gene Bên cạnh đó,
phương pháp sử dụng trong nghiên cứu là
PCR và MSP, đây là phương pháp có tính an
toàn, không tổn hại đến bệnh nhân và dễ thực
hiện Ngoài ra, phương pháp này còn cho
phép phát hiện đồng thời các dấu hiệu DNA của EBV và tính chất methyl hóa trên hai gene ức chế khối u một cách nhanh chóng với độ chính xác cao trên nhiều loại mẫu, kể
cả xâm lấn và không xâm lấn Do đó, phương pháp xác định đồng thời tính chất xâm nhiễm EBV và methyl hóa trên gene ức chế khối u
có thể được ứng dụng trong sàng lọc, chẩn đoán sớm UTVH và lựa chọn những liệu phát trị liệu phù hợp đối với những bệnh nhân mắc UTVH
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
Xây dựng thành công quy trình phát hiện đồng thời yếu tố nhiễm EBV và tính chất methyl hóa trên các gene ức chế khối u ở bệnh nhân UTVH Việt Nam Sự hiện diện các gene mục tiêu của EBV và tính chất
methyl hóa của các gene E-cadherin và Blu
có mối tương quan với sự hình thành và phát triển khối u vòm họng (p < 0,05) Việc xác định đồng thời sự hiện diện của một trong
các gene EBNA1, EBNA2, LMP1 và LMP2
và tính chất methyl hóa của một trong hai
gene E-cadherin và Blu là một dấu chứng
sinh học tiềm năng cho việc chẩn đoán sớm
UTVH ở người bệnh Việt Nam Nhằm hướng
tới việc xây dựng một phương pháp chẩn đoán không xâm lấn, nghiên cứu tiếp theo sẽ được tiến hành trên các mẫu không xâm lấn như dịch phết vòm họng; hoặc trên các mẫu bệnh phẩm ít xâm lấn như mẫu máu toàn phần hay huyết thanh Bên cạnh đó, mở rộng
cỡ mẫu thí nghiệm để tăng độ tin cậy của dữ
liệu
Lời cảm ơn
Nhóm tác giả chân thành cảm ơn ThS Lao Đức Thuận đã tận tình hướng dẫn, góp ý và chỉnh sửa đề tài Cảm ơn trường Đại học Mở
TP HCM đã hỗ trợ kinh phí và tạo điều kiện cho việc thực hiện đề tài
TÀI LIỆU THAM KHẢO
BOSSCHE, V J., MALISSEN, B., MANTOVANI, A., BAETSELIER, P D.,
GINDERACHTER, J A V (2012) Regulation and function of the E-cadherin/catenin complex in cells of the monocyte- macrophage lineage and DCs, Blood, 119(7),
1623-1633
KHOSRAVI, B., SALEHINIYA, H (2016) Epidemiology and Inequality in the
Incidence and Mortality of Nasopharynx Cancer in Asia, Osong Public Health Res
Perspect, 7(6), 360 - 372
Trang 6TSAO, S W., YIP, Y L., TSANG, C M., PANG, P S., LAU, V M., ZHANG, G., LO, K
W (2014) Etiological factors of nasopharyngeal carcinoma, Oraloncology, 50(5),
330-338
ZHANG, X., LIU, H., LI, B., HUANG, P., SHAO, J AND HE, Z (2012) Tumor suppressor
BLU inhibits proliferation of nasopharyngeal carcinoma cells by regulation of cell cycle,
c-Jun N-terminal kinase and the cyclin D1 promoter, BMC Cancer, 12, 267