Parkinson là một trong những bệnh thoái hóa thần kinh phổ biến với các biểu hiện về rối loạn vận động và chết tế bào thần kinh sinh dopamine ở vùng chất đen. Các nghiên cứu trước đây cho thấy, ruồi chuyển gene knockdown duch trên các tế bào thần kinh sinh dopamine biểu hiện các triệu chứng của bệnh Parkinson bao gồm suy giảm vận động và chết tế bào sinh dopamine.
Trang 1ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ ĐIỀU TRỊ BỆNH PARKINSON CỦA CAO CHIẾT RAU SAM
(PORTULACA OLERACEA L.) TRÊN MÔ HÌNH RUỒI GIẤM CHUYỂN GENE
MANG KIỂU HÌNH BỆNH Trương Huỳnh Kim Thoa*
Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh
*Tác giả liên hệ: truongthoa139@gmail.com
TÓM TẮT
Parkinson là một trong những bệnh thoái hóa thần kinh phổ biến với các biểu hiện về rối loạn vận động và chết tế bào thần kinh sinh dopamine ở vùng chất đen Các nghiên cứu trước đây cho thấy, ruồi chuyển gene knockdown duch trên các tế bào thần kinh sinh dopamine biểu hiện các triệu chứng của bệnh Parkinson bao gồm suy giảm vận động và chết tế bào sinh dopamine Các triệu chứng do knockdown duch giảm khi bổ sung thêm hợp chất kháng oxi hóa như curcumin hay vitamin C Các kết quả này cho thấy tiềm năng sử dụng mô hình ruồi knockdown duch trong sàng lọc chất kháng oxi hóa để điều trị bệnh Parkinson Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng ruồi knockdown duch nhằm mục đích kiểm tra khả năng sử dụng cao chiết từ rau sam (Portulaca oleracea L.) để điều trị bệnh Parkinson Kết quả thực nghiệm cho thấy cao chiết rau sam cải thiện triệu chứng suy thoái vận động do knockdown duch gây
ra ở ấu trùng ruồi mô hình và làm chậm tiến trình bệnh ở ruồi trưởng thành Đồng thời, ở mức độ tế bào, cao chiết rau sam cải thiện tình trạng thoái hóa tế bào thần kinh sản sinh dopamine gây ra do knockdown duch ở ruồi giấm
Từ khóa: Bệnh Parkinson, mô hình ruồi giấm, mô hình ruồi knock-down duch, kháng oxy
hóa, rau sam
EFFECT OF PURSLANE EXTRACT (PORTULACA OLERACEA L.) ON
ROSOPHILA MODEL OF PARKINSON’S DISEASE
Truong Huynh Kim Thoa*
University of Science – VNU Ho Chi Minh City
*Corresponding Author: truongthoa139@gmail.com
ABSTRACT
Parkinson’s disease is one of the most common neurodegenerative disoder, which is characterized by progressive deterioration of motor function and loss of dopaminergic neurons in the substantia nigra Previous studies showed that Drosophila which bearing dopaminergic neuron-specific knockdown of duch manifested PD’s symptoms including decreases in locomotor abilities and loss of dopaminergic neurons Noticeably, antioxidants such as curcumin and vitamin C improved these PD symptoms in the fly model These results demonstrated that duch-knockdown flies is a potential model for screening antioxidants which can be used for PD treatment In this study, we utilized duch-knockdown flies in order to evaluate capacity of purslane (Portulaca oleracea L.) extract in using for PD treatment The results showed that purslane extract could improve the locomotor abilities in the larval stage and decelerate disease’s progression in the adult stage Additionally, in cellular base, purslane extract could reduce DA neuron degeneration caused by knockdown of duch
Keywords: Parkinson’s disease, Drosophila model, duch-knockdown Drosophila model,
antioxidants, purslane
TỒNG QUAN
Parkinson là một trong những bệnh thoái hóa
thần kinh phổ biến ở người cao tuổi, với
khoảng 3% dân số trên độ tuổi 65 mắc bệnh
Bệnh có dấu hiệu trẻ hóa và có mức độ gia
tăng nhanh nhất trong các bệnh lý thần kinh
hiện nay Bệnh Parkinson có các biểu hiện lâm sàng về rối loạn vận động như run, cứng
cơ và cử động chậm chạp, đồng thời có dấu hiệu chết tế bào thần kinh sinh dopamine ở vùng liềm đen, thuộc não giữa
Mô hình ruồi giấm có lịch sử lâu đời trong
Trang 2nghiên cứu sinh học và vẫn còn nguyên giá
trị cho đến hiện tại Mang nhiều đặc điểm
thuận lợi cho nghiên cứu như vòng đời ngắn,
số lượng nhiều, chi phí thấp, cũng như có
mức độ tương đồng nhất định so với người
(75% gene bệnh ở người có gene tương đồng
trên ruồi), mô hình ruồi giấm là mô hình tiềm
năng cho sàng lọc thuốc invivo sơ cấp
Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase L1
(UCH-L1) là một protein hoạt động trong hệ
thống phân hủy protein Ubiquitin
proteasome, biểu hiện nhiều ở não và được
biết có liên quan đến bệnh Parkinson Ở ruồi
giấm, gene tương đồng với uch-l1 là duch,
với mức độ tương đồng về trình tự khoảng
46% Các nghiên cứu trước đây của chúng tôi
cho thấy, dòng ruồi chuyển gene làm
knockdown duch tại tế bào thần kinh sinh
dopamine biểu hiện các triệu chứng của bệnh
Parkinson bao gồm suy giảm vận động và
chết tế bào thần kinh sản sinh dopamine
Ngoài ra, khi bổ sung thêm hợp chất kháng
oxi hóa như curcumin, vitamin C vào môi
trường nuôi ruồi, các triệu chứng do
knockdown duch được cải thiện Từ đó,
chúng tôi nhận thấy UCH-L1 có thể có liên
quan tới stress oxi hóa tế bào, đồng thời, mô
hình ruồi knockdown duch là mô hình tiềm
năng trong sàng lọc chất kháng oxi hóa để
điều trị bệnh Parkinson
Nhiều công bố khoa học trước đây cho thấy
rau sam (Portulaca oleracea L.) là thực vật
có nhiều thành phần kháng oxi hóa như
vitamin A, vitamin C, acid béo omega-3,
flavonoid hay alkaloid Bên cạnh đó, rau sam
cũng chứa dopamine và levodopa (tiền chất
của dopamine), là chất dẫn truyền thần kinh
có liên quan mật thiết đến bệnh Parkinson
Nhằm mục đích khảo sát khả năng sử dụng
rau sam như một ứng viên thuốc điều trị
Parkinson, trong nghiên cứu này, chúng tôi
tiến hành các thí nghiệm khảo sát tác động
của cao chiết rau sam lên mô hình ruồi
knockdown duch mang kiểu hình bệnh
Parkison
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Phương pháp chiết cao rau sam
Rau sam (Portulaca oleracea L.) được thu
hái và đông khô đến khi khô hoàn toàn
Trọng lượng mẫu sau khi đông khô được xác
định, xay nhuyễn Chiết cao rau sam bằng
dung môi nước: mẫu bột nghiền rau sam được trộn đều, ngâm dầm với nước cất hai lần, tỷ lệ m:v=1:15, sau đó ly tâm, thu dịch Dịch trích được sấy khô bằng máy đông khô
và được trữ lạnh ở -300C
Cao chiết rau sam được thêm vào môi trường nuôi ruồi thí nghiệm theo các nồng độ khảo
sát, ở 2 dòng ruồi giấm knock-down duch
(Kd) và dòng đối chứng (Dc)
Đánh giá tác động của cao chiết lên sinh lý
Sức ăn: Pha môi trường thường bổ sung cao
chiết rau sam theo các nồng độ thí nghiệm và Comassive-G250 2% Bắt ấu trùng bậc 3 sớm, cho ăn trong vòng 30 phút Thu ấu trùng và rửa sạch bằng PBS, chuyển vào eppendorf 1,5ml mới, đồng hóa mẫu trong PBS Định lượng Commasive bằng đo chỉ số
OD tại bước sóng 595nm
Lượng tồn dư chất kháng oxi hóa: Nghiền 50
cá thể ấu trùng bậc 3 ở các nồng độ cần khảo sát với 500 µl nước cất 2 lần Ly tâm lạnh ở
4oC trong 20 phút, thu dịch nổi Pha loãng tới các nồng độ cần thiết Giữ lạnh và tránh sáng Đặt phản ứng với DPPH 50µM trong
40 phút Đo OD ở bước song 517nm Xác định IC50 của từng dòng theo độ pha loãng
Đánh giá khả năng vận động của ruồi giấm
Các thí nghiệm vận động chỉ thực hiện trên
cá thể đực do sinh sản của ruồi cái sẽ ảnh hưởng đến khả năng vận động
Thử nghiệm bò trườn: Đổ đĩa agar 2% Cho
3-4 cá thể ấu trùng bậc 3 lên đĩa agar/lần, quay lại từ 1-2 phút, đảm bảo cho mỗi cá thể
ấu trùng di động đều đặn ít nhất 40s/đoạn phim Các đoạn phim được xử lý với ImageJ, plugin wrMTrck để thu số liệu vận tốc, biểu
đồ và thống kê (One way-ANOVA) được vẽ
và xử lý với GraphPad 6.01
Thử nghiệm leo trèo: Ruồi trưởng thành
được bắt trong cùng một ngày sau khi thoát kén Sử dụng khoảng 80-100 cá thể ruồi trưởng thành/dòng ruồi Chuẩn bị ống 12cm, chia vạch tính điểm, tính từ đáy mỗi vạch cách nhau 1cm Gây mê, bắt vào mỗi ống 10
cá thể ruồi, mỗi dòng bắt đủ 8 ống Đập theo chiều trọng lực 5 lần, giữ yên ít nhất 60 giây, lặp lại 8 lần Quay phim lại toàn bộ quá trình
từ khi bắt đầu đập Kết quả được đọc thông qua chỉ số leo trèo được tính bằng tỉ lệ phần trăm cá thể vượt vạch 6cm trong 8 lần đập Mỗi ống climbing ghi nhận một số liệu Độ
Trang 3suy giảm khả năng vận động được tính bằng
gốc của đường tuyến tính đi qua các giá trị
trung bình theo ngày của từng dòng Biểu đồ
được vẽ bằng GraphPad 6.01
Định lượng tế bào thần kinh sinh
dopamine
Tách mô não cần nhuộm (não của ấu trùng
bậc 3, não ruồi trưởng thành) trong PBS lạnh
Cố định mô với para-formaldehit 4%
Nhuộm miễn dịch với kháng thể bậc 1 kháng
tyroxyl hydroxylase, kháng thể bậc 2 gắn
chất phát huỳnh quang Kết quả được ghi
nhận dưới kính hiển vi huỳnh quang Nikon
ECLIPSE NI-U ở độ phóng đại 100X Lượng
tế bào được đếm thủ công với phần mềm ImageJ, thu kết quả bằng Microsoft Excel, xử
lý thống kê (One-way ANOVA) và vẽ biểu
đồ bằng phần mềm GraphPad 6.01
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Ảnh hương của cao chiết rau sam tới các quá trình sinh lý của ruồi giấm
Sức ăn: Cao chiết rau sam có xu hướng làm
tăng khả năng ăn của ấu trùng trên cả hai dòng Kd và Dc, nồng độ càng cao, lượng thức ăn tiêu thụ càng lớn
Hình 1 A: Biểu đồ tác động của cao chiết rau sam lên sức ăn của ấu trùng bậc ba dòng đối
chứng và dòng knockdown duch B: Lượng chất kháng oxi hóa hấp thu tính theo lượng thức
ăn so với dòng Dc+1.25mM (thí nghiệm lặp lại 6 lần, 10 cá thể cho mỗi lần khảo sát,
One-way ANOVA test, ** p<0.01, *** p<0.001, **** p<0.0001)
Lượng tích trữ chất kháng oxi hóa:
Hình 2 Đồ thị biểu diễn tương quan lượng chất kháng oxi hóa ở các dòng ăn cao so với dòng
ăn môi trường nồng độ 0mg/ml Dựa vào Hình 2 có thể nhận thấy, khả năng
hấp thụ tốt nhất ở khoảng 0.63mg/ml Ở các
nồng độ cao hơn, lượng chất kháng oxi hóa
tích trữ không tăng nhanh theo nồng độ mà
gần như đạt đến mức bão hòa Kết hợp với
kết quả từ thí nghiệm feeding chúng tôi nhận
thấy: ở dòng Kd duch, trong khoảng nồng độ
từ 1.25mg/ml đến 5mg/ml, tổng lượng chất kháng oxy hóa mà ấu trùng ăn vào tăng khoảng 5-6 lần, đồng thời cũng tăng nhanhh lượng chất kháng oxy hóa tích trữ (Hình 1B
và Hình 2) Từ nồng độ 5mM đến 15mM, lượng chất kháng oxy hóa thu nạp tăng khoảng 4-5 lần nhưng lượng tích trữ gần như
Trang 4không đổi (Hình 1B và Hình 2) Như vậy ở
khoảng nồng độ từ 5 đến 15mg/ml, ấu trùng
đã đạt đến giới hạn hấp thụ, có khả năng gia
tăng bài tiết chất kháng oxi hóa ra ngoài
Tác động của cao chiết rau sam lên khả
năng vận động của ruồi knockdown duch
Ở ấu trùng bậc 3: ấu trùng dòng knockdown
(Kd) có hiện tượng suy giảm khả năng vận
động so với dòng đối chứng (Dc), biểu hiện
qua việc suy giảm tốc độ di chuyển
(p<0.0001) Kết quả này cho thấy việc
knockdown gene duch trên các tế bào thần
kinh sinh dopamine làm suy giảm vận động
Ở dòng Kd, ấu trùng ăn môi trường cao các
nồng độ 2.5, 5 và 10 mg/ml đều cho kết quả
cải thiện khả năng vận động so với dòng Kd
không ăn cao (Hình 4) Ở dòng ấu trùng
Kd+15mg/ml, chúng tôi nhận thấy sự suy
giảm vận động so với dòng Kd+10mM (p<
0.01), điều này có thể do sự ảnh hưởng của
cao chiết rau sam lên các quá trình sinh lý, sức ăn và bài tiết của ruồi giấm ở nồng độ 15mg/ml cao hơn các nồng độ khác, làm ảnh hưởng khả năng vận động của ấu trùng
Ở ruồi trưởng thành: Ở lô không cho ăn môi trường cao, chúng tôi nhận thấy không có sự khác biệt rõ rệt giữa các dòng thí nghiệm Kết quả nhận được tương tự đối với dòng Dc
ăn cao Tuy nhiên, kết quả climbing trên dòng Kd ăn cao cho thấy tốc độ suy giảm vận động có xu hướng giảm từ nồng độ 1.25 mg/ml, thấp nhất ở 2.5 mg/ml và gia tăng trở lại ở nồng độ 10 mg/ml.m Từ các kết quả trên chúng tôi đi đến nhận xét, cao chiết rau sam được bổ sung ở giai đoạn ruồi trưởng thành có khả năng làm giảm tiến triển bệnh ở một số nồng độ, tác động này là chuyên biệt lên dòng knockdown duch Nồng độ cho tác dụng tốt nhất là 2.5mg/ml
Hình 3 Tốc độ bò trườn của ấu trùng bậc 3 (n=30, one-way ANOVA với * p<0.05,
** p<0.01, *** p<0.001, **** p<0.0001)
Hình 4 Tốc độ suy giảm vận động của dòng Kd và dòng Dc từ 0 đến 11 ngày tuổi Tác động của cao chiết rau sam lên tế bào
thần kinh sinh dopamine ở ruồi giấm
Ở ấu trùng ruồi giấm bậc 3: kết quả nhuộm
miễn dịch cho thấy có sự thoái hóa tế bào
thần kinh sinh dopamine ở dòng Kd so với
dòng Dc trên cụm DM (p<0.05), cụm DL2
(p<0.001) và trên tổng số lượng tế bào ở cả
ba cụm DM, DL1 và DL2 (p<0.05) (Hình 5) Xét trên dòng đối chứng, cao chiết rau sam không gây ảnh hưởng đến số lượng tế bào thần kinh sinh dopamine ở cả hai nồng độ 2.5
và 5 mg/ml Xét trên dòng knockdown duch,
Trang 5cả hai nồng độ 2.5 và 5mg/ml đều cho kết
quả cải thiện tổng số tế bào thần kinh sinh
dopamine ở 3 cụm
Ở ruồi trưởng thành: Ở nồng độ 0, kết quả
nhuộm miễn dịch cho thấy có sự thoái hóa tế
bào thần kinh sinh dopamine giữa dòng Kd
và Dc trên cụm PPM3 (p<0.001) và trên tổng
5 cụm (p<0.001) (Hình 6) Xét trên dòng đối
chứng, cao chiết rau sam không gây ảnh
hưởng đến số lượng tế bào thần kinh sinh
dopamine ở cả hai nồng độ 2.5 và 5 mg/ml
(p>0.05) Xét trên dòng knockdown duch,
không có sự khác biệt rõ ràng giữa lượng tế
bào thần kinh sinh dopamine của hai dòng
Kd ăn cao và Kd nồng độ 0 trên từng cụm tế bào thần kinh riêng lẻ (p>0.05) Tuy nhiên, khi so sánh trên tổng số tế bào ở cả 5 cụm khảo sát, có sự khác biệt đáng kể giữa dòng
Kd ăn cao và Kd nồng độ 0 (p<0.01) (Hình 6F), cao chiết rau sam ở nồng độ 2.5 và 5mg/ml cải thiện suy thoái tế bào thần kinh sinh dopamine trên dòng knockdown duch
Do sự cải thiện phân tán rải rác ở nhiều cụm với số lượng nhỏ, nên không nhận thấy khác biệt khi xét từng cụm
Hình 5 1-Biểu đồ số lượng tế bào thần kinh sinh dopamine ở thùy não ấu trùng bậc ba A:
cụm DM, B: cụm DL1, C: cụm DL2, D: tổng số tế bào 3 cụm (DM, DL1, và DL2) (n=8, Kruskal Wallis test, * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001, **** p<0.0001) 2-Hình chụp não ấu
trùng bậc 3
Hình 6 Biểu đồ số lượng tế bào thần kinh sinh dopamine ở não ruồi trưởng thành (n=8, A,
C, D, E, F: One-way ANOVA, B: Kruskal-Wallis test, * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001,
**** p<0.0001)
Trang 6KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
Cao chiết rau sam làm giảm suy thoái vận
động do knockdown duch ở ấu trùng và làm
chậm quá trình tiến triển bệnh ở ruồi trưởng
thành, cũng như làm giảm sự thoái hóa tế bào
thần kinh sản sinh dopamine Nồng độ rau
sam thích hợp cho tác động cải thiện kiểu
hình bệnh PD và hạn chế tác động lên sinh lý
trên mô hình ruồi giấm là 2.5 mg/ml Kết quả
của đề tài đóng góp dữ liệu khoa học cho việc sử dụng cao chiết rau sam trong hỗ trợ điều trị bệnh Parkinson, đặc biệt cho các trường hợp đột biến hoặc giảm biểu hiện gene uch-l1 Đồng thời phát triển ứng dụng
mô hình ruồi giấm knockdown duch sàng lọc thêm hợp chất kháng oxi hóa có tác động tích cực lên cơ thể sống và cải thiện tình trạng bệnh Parkinson
TÀI LIỆU THAM KHẢO
FEIGIN, V.L., et al., Global, regional, and national burden of neurological disorders during 1990-2015: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2015 Lancet
Neurology, 2017 16(11): p 877-897
MARTINS, W.B., et al., Neuroprotective effect of Portulaca oleracea extracts against 6-hydroxydopamine-induced lesion of dopaminergic neurons Anais da Academia
Brasileira de Ciências, 2016 88(3): p 1439-145