Báo cáo Phân tích nhanh Đề tài: Phân tích nhanh STEC trong thực phẩm ăn liền

Độc tố Shiga: Độc tố bền nhiệt Là 1 protein có cấu trúc A1B5, trọng lượng phân tử trên 70kDa, bao gồm 1 tiểu phần A và 5 tiểu phần B Tiểu phần A: có vai trò như 1 enzyme N-glycosidase

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

PHÂN TÍCH NHANH CHẤT LƯỢNG THỰC PHẨM

Phần 1 : Tổng quan về STEC

 STEC là một trong bốn nhóm E coli gây bệnh truyền qua thực phẩm ở người

 Gây nhiễm trùng nguy hiểm với các triệu chứng như tiêu chảy nặng, xuất huyết đường ruột và hội chứng

tán huyết tăng urê máu (HUS)

 Trong đó E coli O157:H7 là kiểu huyết thanh phổ biến nhất trong các vụ dịch trên thế giới

Vi khuẩn E.coli chủng STEC

Cơ chế gây bệnh:

Tạo ra độc tố Stx mã hóa bởi gene stx, với cơ chế ức chế sự sinh tổng hợp protein của

tế bào hoặc dẫn tới chu trình chết tế bào

Độc tố Shiga: Độc tố bền nhiệt

Là 1 protein có cấu trúc A1B5, trọng lượng phân tử trên 70kDa, bao gồm 1 tiểu phần A và 5

tiểu phần B

Tiểu phần A: có vai trò như 1 enzyme N-glycosidase cắt 1 base Adenin ở vị trí 4324 của

tiểu phần 28S- rRNA thuộc ribosome 60s dẫn tới quá trình tổng hợp Pr trong tế bào bị nhiễm dừng lại Quá trình chết của tế bào

Shiga toxin

Tiểu phần B: Đưa độc tố vào trong tế bào chủ, có các vị trí kết hợp với Glycolipit trên

bề mặt tế bào đích tương tự cầu nối trung gian để tiểu phần A xâm nhập vào trong tế

Shiga toxin 2: Được mã hóa bởi gen stx2, một số biến thể là stx2b,stx2c, stx2d nhưng chỉ có stx2c tìm thấy

trong E.coli O157.H7

 Stx1 của STEC có trình tự acid amin tương đồng với Stx, độc tố được tìm thấy trong

Shigella sonnei và Shigella dysenteriae.

Nguyên tắc của Elisa Phương pháp Elisa Sandwich phát hiện

kháng nguyên lông của Ecoli O157 :H7

1 Kháng thể đa dòng chế qua thỏ (Pab) có hàm lượng 16mg/ml

2 Mẫu thực phẩm nghi nhiễm

3 Hai kháng thể đơn dòng ký hiệu A10.16.I và Mab C3.26.IV có hàm lượng tương ứng là 12mg/ml và 11,8mg/ml

4 Kháng thể thứu cấp kháng IgG chuột đánh dấu enzyme alkaline photphatase

5 Cơ chất của Alkaline phosphatase

Thành phần của phản ứng Elisa

Thiết lập phản ứng Elisa sandwich

Phủ giếng bằng kháng thể đa dòng từ thỏ kháng KN H7

Mẫu thực phẩm nghi nhiễm tăng sinh trong m TSB 40oC/10h

Thêm kháng thể đơn dòng từ chuột kháng KN H7

Bổ sung kháng thể thứ cấp kháng IgG chuột đánh dấu alkaline

photphatase

Thêm cơ chất của Alkaline phosphatase vào giếng Ủ trong tối và đo OD ở 405nm

Quy trình phát hiện bằng Elisa Sandwich

25 mẫu thịt bò/ 25ml sữa

Dập mẫu

Tăng sinh trong mTSB

41oC/8h( đối với tịt bò); 41oC/12h( đối với sữa)

Các thông số tối ưu của phản ứng Elisa

Kháng thể đa dòng

phủ đĩa

12,5 µg/ml

Kháng thể đơn dòng A10.16.I và C3.26.IV

+ Mẫu không cần phải được tinh sạch trước khi phân tích.

+ Độ đặc hiệu cao, vì sử dụng hai kháng thể nên các kháng nguyên/ chất

phân tích được bắt và phát hiện đặc hiệu

+ Thích hợp cho các mẫu phức tạp

+ Linh hoạt và độ nhạy cao

+ Thời gian tiến hành thí nghiệm lâu+ Chỉ sử dụng phát hiện kháng nguyên kích thước phân tử lớn+ Vẫn còn hiện tượng dương tính giả

Que thử phát hiện nhanh độc tố bền nhiệt shiga type 2 của

Lựa chọn kháng thể phù hợp cho chế tạo que thử

Nguyên tắc:

Dựa vào nguyên tắc sắc ký miễn dịch kẹp đôi

Chọn 3 loại kháng thể:

2 KT có khả năng bắt cặp đặc hiệu với độc tố:

1 KT cộng hợp hạt nano vàng cố định trên màng cộng hợp ( KT phát hiện)

1 KT kháng lại 1 trong 2 KT được gắn trên vạch kiểm chứng

1 KT được gắn trên vạch thử nghiệm( KT bắt giữ)

Lựa chọn kháng thể

 Chọn kháng thể Stx2-BB12 có khả năng bắt cặp với stx2 tốt

 Stx2-BB12 vừa là KT phát hiện và KT bắt giữ

 Do stx2 có 5 tiểu phần B giống nhau gồm 71 aa Stx2-BB12 có thể bắt cặp tại nhiều vị trí epitope khác nhau trên cùng 1 phân tử độc tố

 Chọn 1 KT đa dòng từ dê kháng IgG của chuột AB6789 được cố định trên màng nitrocellulose ở vạch KC (C)

• Tạo dung dịch hạt nano vàng

 Na khử ion Au(3) về Au(0) sau đó có tác dụng như 1 chất làm bền bao phủ quanh

ngăn quá trình kết tụ hạt vàng

 Hạt vàng được sử dụng làm chất đánh dấu tạo tín hiệu màu trên các vạch của que

thử nhanh phát hiện độc tố stx2

 Hạt vàng nano được tổng hợp theo phương pháp sinh trưởng hạt từ dung dịch

HAuCl4 với Natri citrate là chất khử đồng thời là chất ổn định

Hạt nano vàng

Tổng hợp hạt vàng có kích thước 30nm cho quá trình cộng hợp kháng thể phát hiện và chế tạo que thử

Cộng hợp hạt vàng với kháng thể phát hiện và cố định

trên màng cộng hợp

 Chế phẩm hạt nano vàng có kích thước 30nm sau

khi tổng hợp được cộng hợp với kháng thể

Stx2-BB12 dựa trên liên kết tĩnh điện để tạo dung dịch

 Độ ẩm, nhiệt độ môi trường

 Liều lượng kháng thể phun

Xây dựng quy trình chế tạo que thử sắc ký miễn dịch phát hiện độc tố Stx2

3.Tạo dung dịch hạt vàng và cộng hợp với KT phát hiện

 Tạo hạt vàng nano kích thước 30nm

 Rửa lại bằng PBS 0,01M;pH 7,4; BSA 1%

 Sấy ở 37oC đến khô hoàn toàn

 Cắt màng hút mẫu: 3x22 mm

2.Xử lí màng nitrocellulose

 Ngâm màng với đệm PBS 0,01M,pH 7,4; BSA 1% trong 10 phút

 Rửa bằng đệm PBS 0,01M,pH 7,4; SDS 0,1%

 Rửa lại bằng đệm PBS 0,01M, pH 7,4; BSA 1%

 Sấy khô màng ở 37oC đến khô hoàn toàn

Các thông số kĩ thuật của que thử

100% với mẫu Stx2 tinh khiết

Giới hạn hoạt động: pH từ 6 đến 8; nhiệt độ từ 5 đến 45oC

Phạm vi sử dụng: Que thử có khả năng phát hiện Stx2 ở nồng độ 5ng/mL trong dịch chiết thực phẩm: Sữa, cơm, rau, thịt

bò, thịt lợn

Kỹ thuật LAMP phát hiện chủng vi

khuẩn STEC

 FIP chứa F1c, một đoạn TTTT và một trình tự F2 bổ sung với F2c.

 BIP sẽ chứa trình tự B1c bổ sung cho B1, một đoạn TTTT và B2

 Hai mồi bên ngoài là B3 bổ sung cho đoạn B3c và trình tự F3 bổ sung cho F3c

n đầu là sợi đôi

ADN chứa gen

Bước 6: sợi ADN được tạo ra từ bước 5

sẽ làm khuôn cho mồi BIP tổng hợp

sợi mới và mồi B3 sẽ có chức năng nh

ư F3 là tổng hợp sợi mới và giải phóng

sợi ADN mồi BIP.

+ Bước 7: sợi đôi ADN được hình thàn

h từ mồi B3 và sợi được tổng hợp từ

bước 5;

+ Bước 8: sợi ADN được tổng hợp từ m

ồi BIP và sợi chứa mồi FIP sẽ hình

thành cấu trúc vòng ở 2 đầu do sự bổ

sung của 2 cặp trình tự với nhau.

=> Để khởi đầu ch

o chu kì phản ứng LAMP, FIP bắt cặp b

ổ sung với ADN đầu

vòng ở vị trí F2c để tiến hành tổng hợ

p mạch bổ sung thay thế Mặt khác,

BIP sẽ bổ sung vào đầu kia của mạch

ADN đầu vòng và xảy ra quá trình tổn

g

hợp ADN tương tự Kết quả của phản ứ

ng là hỗn hợp các sợi đôi ADN chứa nhiều trình tự ADN

mục tiêu với kích thước khác nhau.

1.QUY TRÌNH THỰC HIỆN

Click icon to add picture

Thành phần phản ứng LAMP như sau: đệm(10X): 2,5 μl,

O Trước khi tiến hành phản ứng, DNA mẫu được biến

tính ở 94oC trong thời gian 5 phút, sau đó đặt trên đá 3 phút rồi bổ sung thêm enzyme Bst polymerase Phản ứng được tiếp tục ở 63oC trong thời gian từ 30 giây đến 1 giờ Kết quả cho thấy phản ứng LAMP cho kết quả dương tính với vi khuẩn E coli O157:H7, âm tính với vi khuẩn E coli ATCC

Tách chiết cả DNA tổng số Cùng với vi khuẩn E

coliO157:H7, chúng em sử dụng vi khuẩn E coli ATCC

làm đối chứng âm DNA tổng số của hai chủng

được tách theo phương pháp của Sambrook và

Russel Sau đó, DNA tổng số được điện di trên gel

agarose 1%

PHẢN ỨNG LAMP

sẽ cho màu xanh, còn mẫu nào âm tính sẽ cho màu vàng chanh

3 Phát hiện sản phẩm LAMP

O phản ứng LAMP hoàn toàn có thể xảy ra khi chỉ sử dụng duy nhất một cặp mồi BIP/FIP.

O Phương pháp này có thời gian tiến hành phân tích kết quả nhanh và chính xác, trong khi đó kỹ thuật, hóa chất và thiết bị đơn giản, vì vậy, có thể thấy đây là một trong những hướng tạo kít phát hiện

nhanh trong điều kiện làm việc chưa được tốt như ở Việt Nam hiện nay.

O Phương pháp này rất đơn giản và nhanh, sản phẩm của phản ứng RT-LAMP có thể được xác định sau 60 phút phản ứng ở một điều kiện nhiệt độ là 61độC.

O phản ứng LAMP hoàn toàn có thể xảy ra khi chỉ sử

dụng duy nhất một cặp mồi BIP/FIP.

O Phương pháp này có thời gian tiến hành phân tích kết

quả nhanh và chính xác, trong khi đó kỹ thuật, hóa chất và thiết bị đơn giản, vì vậy, có thể thấy đây là một trong những hướng tạo kít phát hiện nhanh trong điều kiện làm việc chưa được tốt như ở Việt Nam hiện nay.

O Phương pháp này rất đơn giản và nhanh, sản phẩm

của phản ứng RT-LAMP có thể được xác định sau 60 phút phản ứng ở một điều kiện nhiệt độ là 61oC.

Kỹ thuật Multiplex-PCR phát hiện chủng vi

khuẩn STEC

B1: là giai đoạn biến tính nhiệt độ thường sử dụng là 94-95°C

B3: giai đoạn kéo dài thường

ở 72°C

B2: là giai đoạn lai ,nhiệt độ dao động trong khoảng 40-70°C

Phản ứng PCR được thực hiện trên cơ sở phản

ứng sinh tổng hợp DNA ; là phản ứng gồm nhiều

chu kỳ nối tiếp nhau

- Mỗi chu kỳ gồm 3 bước

Trình tự mồi sử dụng trong nghiên cứu:

Tên gen Trình tự oligonucleotide Kích thước khuếch đại( bp)

stx1 stx1F: 5’- GAG CGA AAT TTA TAT GTG- 3’

stx1R: 5’- TTG ATG ATG ATT CAG TAT- 3’

520

stx2 Stx2F: 5’ CCA TGA CAA CGG ACA GCA GTT-3’

stx2R: 5’ CCT GTC AAC TGA GCA CTT TGC-3’

780

Mẫu sử dụng: Thịt heo, thịt bò, thịt gà, sữa

Cân 25g mẫu cho vào

túi nilon vô trùng thê

m vào túi 225ml môi trường mTSB ( M

Tất cả các thí nghiệm khuếch đại bằng phản ứng PCR được

thực hiện với dung tích phản ứng là 50µl trong ống eppendorf

0,2ml, thành phần như sau:25µl dung dịch PCR Master

Mix,2ml mỗi mồi với nồng độ 0,5µM, 5µl khuôn DNA, thêm

nước cất để đủ 50,0µl

5µl sản phẩmkhuếch đại trộn với 2,5l đệm tải mẫu

Nạp vào các giếng trên gel agarose 2% đã có chất

nhuộm DNA10,000X.

Điện di ở 130V, 250mAtrong 25 phút

Quan sát và ghi nhận kết quả

Phân tích sản phẩm

KẾT LUẬN

STEC là chủng Escherichia coli có chứa thể thực khuẩn phân giải mang các gen mã hóa sinh độc tố shiga Chúng em đã thực hiện các phương pháp nhanh để phát hiện sự có mặt các gen mã hóa stx bằng PCR ; LAMP và phát hiện độc tố của nó qua phương pháp ELISA và Que thử, qua đó để cho kết quả nhanh với độ đặc hiệu

cao.

THANK YOU

Any questionn?