Báo cáo Phân tích nhanh Đề tài: Phát hiện staphylococal enterotoxins trong thịt và sữa

Giới thiệu chung VK hình cầu, không di động, gram dương, đường kính 0,5-1,5 µm, tế bào xếp thành hình chùm nho, không di động  Thành tế bào kháng với lysozyme và nhạy với lysotaphin, m

Dương Đức Duy - 20160751

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

Viện CNSH và CNTP

I Giới thiệu chung về S aureus

II Sắc ký miễn dịch

III Phương pháp ELISA SANDWICH

IV Chất ức chế miễn dịch hóa phát quang dựa trên hạt nano vàng

TỔNG QUAN

I Giới thiệu chung

 VK hình cầu, không di động, gram dương,

đường kính 0,5-1,5 µm, tế bào xếp thành

hình chùm nho, không di động

 Thành tế bào kháng với lysozyme và nhạy

với lysotaphin, một chất có thể phá hủy cầu

nối pentaglycin của tụ cầu

1 Vi khuẩn starphylococus aureus

chúng có tính chịu nhiệt và không bị protease thông thường như pepsin, trypsin,

chymotrypsin, papain, … thủy phân vì thế chúng giữ nguyên được cấu trúc trong đường tiêu hóa của người.

 ĐKT, tụ cầu vàng phát triển đạt số lượng khoảng 106 cfu/g là đã có thể tạo ra độc tố

 Nhiệt độ tối thiểu cho sản sinh độc tố ruột tụ cầu là 10 o C và nhiệt độ tối đa là 48 0 C, khoảng tối ưu là từ 40 đến 45 0 C.

 Nồng độ muối tối đa 12%, từ 12% trở lên thì sự sản xuất độc tố bị ức chế.

 ĐK thích hợp nhất cho quá trình hình thành độc tố là pH trung tính.

d Nhiễm khuẩn huyết:

Biểu hiện thường đột ngột với:

- Sốt cao

- Buồn nôn và ói mửa

- Phát ban trên lòng bàn tay và lòng bàn chân, tương tự như bị cháy nắng

KỸ THUẬT SẮC KÝ MIỄN DỊCH

Sắc ký miễn dịch cạnh tranh

1 Cấu trúc hệ thống sắc ký miễn dịch

cạnh tranh

Bao gồm

• Điểm tra mẫu

• Cộng hợp: Kháng nguyên gắn với hạt màu

(hạt nano vàng hoặc nanocacbon)

Màng nitrocellulose

Cộng hợp KN-Hạt màu

2 CẤU TRÚC QUE THỬ

PHÁT HIỆN ĐỘC TỐ TỤ CẦU

Kháng thể IgY có khả năng kháng được 5 loại độc tố ruột tụ cầu (A,B,C1,D,E)

YY Y

Kháng thể IgY kháng BSA Phức hợp Kháng

nguyên - nanocacbon

- Tại vị trí vạch thử nghiệm một kháng thể IgY có khả năng bắt cặp với kháng nguyên cần phân tích được cố định

- Nếu độc tố không có mặt trong mẫu phân tích thì khi dung dịch chuyển động

lên trên que thử đi về phía vùng chứa các kháng thể cố định (vạch thử

nghiệm), kháng nguyên cộng hợp sẽ tương tác với kháng thể tạo thành phức hợp kháng thể - kháng nguyên cộng hợp có màu ở vị trí vạch thử nghiệm

(Âm tính)

- Ngược lại, nếu trong mẫu phân tích có độc tố ruột tụ cầu thì chúng cạnh

tranh với kháng nguyên cộng hợp về việc bị giữ lại ở vị trí vạch thử nghiệm

=> Không xuất hiện vạch màu ở vị trí vạch thử nghiệm (Dương tính)

3 NGUYÊN TẮC

4 Các bước tiến hành

Nghiền mẫu

Hòa tan mẫu vào nước vô trùng 5p

Đọc kết quả Nhúng que thử vào mẫu

ĐỘ NHẠY

phân tích bằng mắt

thường, độ nhạy phát hiện

của que thử là khoảng

30-100 ng/ml.

phát hiện của que thử là

PHƯƠNG PHÁP ELISA SANDWICH

Hiện nay trên thị trường có rất nhiều bộ kit thử nhanh áp dụng ELISA

vàng A, B, C, D và E trong thức ăn lỏng và rắn cũng như trong môi

trường nuôi cấy vi khuẩn.

NGUYÊN TẮC

Cơ sở của xét nghiệm là phản ứng

kháng nguyên-kháng thể Các giếng A -

E và H trong dải microtiter được phủ

kháng thể đặc hiệu chống lại các loại

THÀNH PHẦN

BỘ KIT

T I Ế N H À N H

Chuẩn bị mẫu Các mẫu phải được bảo quản ở 5 và tiến hành xử lý  

Tăng sinh

Chuẩn bị kit thử

Tiến hành kiểm tra

Các chủng của loài S aureus có khả năng hình thành

độc tố phải được làm giàu trước trong

Brain-Heart-Infusion (BHI) để

đảm bảo hình thành tối ưu các enterotoxin.

Chuẩn bị pha loãng dung dịch đệm 10 lần ở nhiệt độ phòng

Kết luận

Theo chỉ dẫn của bộ Kit

CHUẨN BỊ MẪU

Đồng nhất hóa 10 - 25 g mẫu với 1,5

ml dung dịch đệm PBS (pH 7,4) trên mỗi g mẫu

T I Ế N H À N H K I Ể M T R A

Xếp các dải giếng vào khay đựng giếng tương ứng số mẫu

Thêm 100 µl mẫu vào mỗi giếng A đến G, 100 µl mẫu dương tính vào giếng H

Lắc nhẹ, đậy nắp và ủ 1 giờ ở 35-37oC

Đổ các dịch từ giếng, đập 3 lần mặt trên khay đựng giếng vào khăn lọc sạch

Rửa mỗi giếng bằng 300 µl đệm rửa rồi đổ, lặp lại bước rửa 4 lần

Thêm 100 µl conjugate 1 vào mỗi giếng Lắc nhẹ, đậy nắp và ủ 1 giờ ở 35-37oC

Đổ các dịch từ giếng, đập 3 lần mặt trên khay đựng giếng vào khăn lọc sạch

Rửa mỗi giếng bằng 300 µl đệm rửa rồi đổ, lặp lại bước rửa 4 lần

Thêm 100 µl conjugate 2 vào mỗi giếng Lắc nhẹ, đậy nắp và ủ 0,5 giờ ở

KẾT QUẢ

RIDA®SOFT Win (Art No Z9999) là một phần mềm đặc biệt được phát triển cho RIDASCREEN® để xét nghiệm miễn dịch enzyme có sẵn từ R-Biopharm

KẾT QUẢ

Kiểm soát chất lượng của kiểm tra (phạm vi hợp lệ cho các kiểm soát)

1 Giá trị độ hấp thụ đối với mẫu dương tính phải bằng hoặc lớn hơn 1.0.

2 Giá trị độ hấp thụ trung bình của các mẫu âm tính phải bằng hoặc nhỏ hơn hơn 0,2 đơn vị

Nếu các tiêu chí này chưa được đáp ứng, cần kiểm tra các bước sau và sửa chữa trước khi lặp lại bài kiểm tra:

- Kiểm tra hạn sử dụng bộ Kit

- Đảm bảo đủ thời gian cho phép các dung dịch bộ dụng cụ đạt đến nhiệt

KẾT QUẢ

Xác định giá trị ngưỡng

Giá trị độ hấp thụ trung bình của các giá trị kiêmr soát âm trong giếng F và G được xác định riêng cho từng mẫu Thêm 0,15 vào giá trị trung 0.159 bình của giá trị kiểm soát âm để lấy giá trị ngưỡng.

Example:

Negative control 1 (well F) = 0.008

Negative control 2 (well G) = 0.010

Mean value = 0.009

Threshold value = 0.009 + 0.15 =0.159

1 Một mẫu được coi là dương tính nếu thử nghiệm hợp lệ Và độ hấp thụ đo được ở 450/630 ± 10nm trong giếng thích hợp cao hơn hoặc bằng giá trị ngưỡng.

2 Một mẫu được coi là âm tính nếu thử nghiệm hợp lệ Và độ hấp thụ đo được ở

450/630 ± 10nm trong giếng thích hợp thấp hơn giá trị ngưỡng.

ƯU ĐIỂM

 Mẫu không cần phải được tinh sạch

trước khi phân tích

 Độ đặc hiệu cao, vì sử dụng hai

kháng thể nên các kháng nguyên/

chất phân tích được bắt và phát

hiện đặc hiệu

 Thích hợp cho các mẫu phức tạp

 Thời gian tiến hành thí nghiệm lâu

 Chỉ sử dụng phát hiện kháng nguyên

kích thước phân tử lớn

 Vẫn còn hiện tượng dương tính giả

Danh mục tham khảo

1 Tạp chí công nghệ sinh học 15(3): 461-469,2017

2 Tạp chí công nghệ sinh học 14(1): 23-28,2018