Phương pháp truyền thống Phương pháp ELISA Phương pháp PCR -Thời gian lâu, cần 3-5 ngày để phát hiện -Cho kết quả nhanh và độ nhạy cao -Đòi hỏi độ tinh sạch cao -Tăng sinh Độc tố ản
Trang 1Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội
Viện Công nghệ Sinh học & Công nghệ Thực phẩm
Phát hiện nhanh Clostridium
perfringens trong các thực
phẩm đóng hộp
GVHD:TS.LÊ QUANG HÒA
Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Trang 20164164 Nguyễn Thị Anh Đào 20160891 Bùi Thị Quỳnh 20163454
Trang 202
Trang 4ĐẶC ĐIỂM CỦA CLOSTRIDIUM PERFRINGENS
- Là trực khuẩn gram (+) , có
vỏ, sinh bào tử, không có tiên
mao, kích thước 0,8 - 1x4 -
8μm.m
- Thuộc loại vi khuẩn ôn
nhiệt, nhiệt độ phát triển tối
NaCl từ 6-8% hoặc nhiệt độ
nuôi cấy thấp hơn 12⁰C
Trang 5ĐẶC ĐIỂM SINH HÓA C.PERFRINGENS
• C perfringens có khả năng lên men các loại đường như glucose, lactose, saccharose
• Làm đông tụ sữa, làm tan gelatin do chúng sản sinh enzym
gelatinase, tinh bột và glycogen
• C perfringens còn có khả năng khử nitrate thành nitrite
Vi khuẩn này không có khả năng phá vỡ indole
Trang 6Phân loại
C.Perfringens
• C perfringens có khả năng tiết ra khoảng 20 loại độc tố, trong đó có
4 độc tố chính là alpha, beta, epsilon, iota
• Được xếp nó thành 5 nhóm là C Perfringens nhóm A, B, C, D và E
• C perfringens nhóm A phổ biến nhất là tác nhân chính gây ra ngộ độc thực phẩm Còn nhóm C gây hoại tử ruột non
Trang 7TÁC HẠI GÂY NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM
- Nôn mửa, đau bụng, tiêu chảy ra máu
- Có thể bị viêm ruột, nhiễm trùng máu => Tử vong
- Đau bụng cấp tính và nôn mửa trong 8-16 giờ
Trang 8Đồ hộp: môi trường kị khí Quá trình chế biến,
bảo quản NGUYÊN NHÂN
Trang 10Phương pháp truyền
thống Phương pháp ELISA Phương pháp PCR
-Thời gian lâu, cần
3-5 ngày để phát hiện -Cho kết quả nhanh và độ nhạy cao
-Đòi hỏi độ tinh sạch cao
-Tăng sinh Độc tố ảnh hưởng đến hiệu quả sử dụng
-Độ nhạy và đặc hiệu cao
-Thời gian thực hiện ngắn
-Không đòi hỏi độ tinh sạch cao
PH ƯƠ NG PH Á P Đ Ể X ÁC ĐỊN H C.PER FRING EN S T RO NG Đ Ồ H Ộ P:
=> Lựa chọn kĩ thuật PCR để phát hiện C.Perfringens trong đồ hộp
Trang 122 ƯU ĐIỂM, NHƯỢC ĐIỂM CỦA PCR
- Nhanh, có thể phát hiện được các
vsv khó nuôi cấy
- Dụng cụ, môi trường không phức
tạp, hoá chất dễ tìm dễ tồn trữ
- Có thể tự động hoá, giảm chi phí
- Cho phép phát hiện bào tử dạng tiềm
sinh, hay tế bào đã chết của vsv gây
bệnh
- Hoạt tính của Taq DNA polymerase
có thể bị ức chế bởi thành phần phức tạp của mẫu thực phẩm
- Mật độ vsv thấp nên cần tăng sinh
- Không phân biệt được tế bào sống
và tế bào chết
Trang 133.CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG TỚI PCR
- DNA bản mẫu: Để đạt được kết quả tối ưu, cần sử dụng DNA bản mẫu có độ tinh sạch cao
Nồng độ DNA rất thấp tránh tình trạng nhân bản sao không chuyên biệt
- DNA polymerase: Enzym phải chịu được nhiệt độ (Taq DNA polymerase)
- Mồi và nhiệt độ bắt cặp của mồi: cặp mồi được thiết kế phải đặc trưng cho đoạn DNA cần khuếch đại, không trùng với các trình tự lặp lại trên gen, kích thước 20-30 base, nhiệt độ bắt cặp giữa 2 mồi không quá chênh lệch
+ Số lượng chu kì phản ứng : Không quá 40 chu kì
+ Thiết bị, dụng cụ cho phản ứng: Nên dùng thiết bị dụng cụ mới, giữa các lần khảo sát nên dùng cùng 1 loại
Trang 144 QUY TRÌNH PHÁT HIỆN C.PERFRINGENS TRONG ĐỒ HỘP BẰNG PCR
Hóa chất dung cho phản ứng PCR
+ Đệm TE IX
+ Đệm PCR 10X
+ Nước cất
+ dNTP
+ Mồi (primer): cặp mồi sử dụng
trong nghiên cứu này là PL3 Trình
+ Taq DNA polymerase
Hóa chất dung cho điện di+ Đệm tải mẫu điện di+ Đệm TAE IX
+ Agarose + Thang DNA + Ethidium bromide
Trang 154 QUY TRÌNH PHÁT HIỆN C.PERFRINGENS TRONG ĐỒ HỘP BẰNG
Thực hiện phản ứng PCR
Li tâm 5000 vòng/phút trong 5 phút, thu phần dịch
trong bên trên
Huyền phù sinh khối tế bào trong 100µl
TE, xử lí nhiệt ở 100 o C trong 10 phút
Li tâm 5000 vòng/phút trong 5 phút để thu sinh khối tế bào
Rửa sinh khối tế bào bằng nước cất vô trùng
Hút 1ml dịch tăng sinh vào Eppendorf, li tâm 5000
vòng/ phút trong 5 phút
Ủ tăng sinh 37 o C qua đêm Mẫu thực phẩm 10g (10ml) + 90ml SPW
Đồng nhất mẫu
Trang 16THỰC HIỆN PHẢN ỨNG PCR
Phản ứng PCR được thực hiện theo chương trình khuếch đại:
+Biến tính DNA ở 95°C trong 5 phút; +Phản ứng PCR gồm 35 chu kì, mỗi chu kì gồm 3 bước: 94°C trong
30 giây, 55°C trong 40 giây, 72°C trong 45 giây
Thành phần sử dụng trong
phản ứng PCR phát hiện
Trang 174 QUY TRÌNH PHÁT HIỆN C.PERFRINGENS TRONG ĐỒ HỘP BẰNG PCR
Trang 18PHẠM VI ỨNG DỤNG
- Trong công nghệ sinh học, PCR được sử dụng trong
việc lập bản đồ gen, phát hiện gen, dòng hóa gen, giải
mã trình tự DNA
- Trong y học: chẩn đoán bệnh ung thư, nghiên cứu về
hệ kháng nguyên bạch cầu người
- Trong vi sinh học: phát hiện các tác nhân vi sinh gây bệnh trong các trường hợp như tác nhân không thể nuôi cấy thường quy, tác nhân nuôi cấy thường quy cho kết quả chậm, tác nhân nuôi cấy thất bại vì có
mặt rất ít trong bệnh phẩm, đã bị điều trị kháng sinh trước đó
- Ngoài ra PCR cũng được dung để xác định độc tố của
vi sinh vật, nghiên cứu tính kháng thuốc của vi khuẩn
Trang 201 NGUYÊN TẮC
- Kĩ thuật LAMP dựa vào sự tổng hợp DNA thay thế chuỗi tự xoay vòng được thực hiện bởi 1 DNA polymerase và 2 cặp mồi trong và mồi ngoài được thiết kế đặc biệt diễn ra ở 60-65 độ C trong khoảng 40-45 phút.
- Cặp mồi trong gồm 2 mồi là mồi xuôi (FIP) và mồi ngược (BIP) Trình tự FIP và BIP sẽ thiết kế như sau:
+FIP chứa F1c, một đoạn TTTT và một trình tự F2 bổ sung với F2c.
+BIP sẽ chứa trình tự B1c bổ sung cho B1, một đoạn TTTT và B2.
- Hai đoạn mồi ngoài là bổ sung cho đoạn B3c và trình tự F3 bổ sung cho F3c
- Cơ chế phản ứng LAMP gồm 3 bước:
+ Bước 1 : Tạo vật liệu khởi đầu
+ Bước 2: Chu kỳ tái bản và kéo dài
+ Bước 3 : Lặp lại chu kì
Trang 212 QUY TRÌNH PHÁT HIỆN C.PERFRINGENS TRONG ĐỒ HỘP BẰNG PHƯƠNG PHÁP LAMP
Hóa chất dung cho phản ứng LAMP
Trang 222 QUY TRÌNH PHÁT HIỆN C.PERFRINGENS TRONG ĐỒ HỘP BẰNG PHƯƠNG PHÁP LAMP
Mẫu nghiên cứu
2 Thêm AND của mẫu nghiên cứu
3 Khuếch đại LAMP
4 Phát hiện:
Khoảng 30p
Khoảng
60 phút Thời gian thực hiện
Trang 232 QUY TRÌNH PHÁT HIỆN C.PERFRINGENS TRONG ĐỒ HỘP BẰNG PHƯƠNG PHÁP LAMP
Khuếch đại LAMP
- Trong phản ứng ban đầu nước không có nuclease, đệm Bsm (× 10), hỗn hợp dNTP và mẫu được thêm vào ống ependorff với sự biến tính ban đầu ở 95 ° C trong 5 phút.
- Sau đó làm lạnh các mẫu trong 30 giây đến 1 phút, các mồi bên ngoài, mồi bên trong và enzyme đã được thêm vào.
- Phản ứng khuếch đại LAMP được thực hiện trong bể nước nóng ở 55 ° C trong 60
phút.Enzyme bất hoạt được thực hiện sau khi hoàn thành phản ứng ở 80 ° C trong 10 phút.
- Các sản phẩm LAMP được khuếch đại được lưu trữ ở −20 ° C.
Master mix 25 µl bao gồm:
Trang 242 QUY TRÌNH PHÁT HIỆN C.PERFRINGENS TRONG ĐỒ HỘP BẰNG PHƯƠNG PHÁP LAMP
Một cách phát hiện sản phẩm LAMP bằng mắt thường là sử dụng SYBR Green I Phản ứng sau khi diễn ra, chúng ta bổ sung thêm 1%
SYBR Green I Những mẫu nào dương tính sẽ cho màu xanh, còn mẫu nào âm tính sẽ cho màu vàng chanh
Trang 253 TÍNH ƯU VIỆT CỦA KĨ THUẬT LAMP SO VỚI PCR
- LAMP là một phương pháp khuếch đại ADN mới, có độ đặc hiệu cao, độ nhạy cũng như độ nhanh của phản ứng cao
- Thời gian thực hiện LAMP nhanh hơn so với PCR Theo đó, thời gian thực hiện PCR trung bình khoảng 2,5 – 3 giờ, trong khi thời gian thực hiện LAMP trung bình khoảng 1-1,5 giờ Điều này có ý nghĩa đặc biệt quan trọng trong việc chuẩn đoán và xác định bệnh nhanh ở động vật, đặc biệt là trên người
- Kết quả của phản ứng LAMP có thể được quan sát ngay dưới ánh sáng thường hoặc soi dưới tia UV
- Hệ thống LAMP không yêu cầu nhiều thiết bị như máy luân nhiệt và chu trình nhiệt,hệ thống này không cần đến năng lượng điện
Trang 26KẾT LUẬN
- Do C.Perfrigens là 1 vi khuẩn gây bệnh nghiêm trọng nên việc phát hiện nhanh để phòng chống và đưa ra phương án chữa trị kip thời là rất cần thiết
- Hiện nay có rất nhiều phương pháp phát hiện C.Perfringens, mỗi phương pháp đều có ưu nhược điểm riêng Tuy nhiên cần phải phát hiện nhanh để đảm bảo về thời gian cũng như sức khỏe Do đó chúng em đã lựa chọn phương pháp PCR và
LAMP
Trang 27TÀI LIỆU THAM KHẢO
- https://123doc.org/document/3206154-xay-dung-quy-trinh-phat-hien-clostridium-perfringens-trong-thuc-pham-bang-ki-thuat-pcr-polymerase-chain-reaction-va-thu-nghiem-ung-dung.htm
lid=IwAR2ArSfNMuu7AOAKwxsjknEzbtKi_D44-lwD5nba3VTbA83TgyaNAUtEDWk
Trang 28Thanks for your listening!