Báo cáo Phân tích nhanh Đề tài phát hiện norovirus

PHÁT HIỆN NOROVIRUS TRONG NHUYỄN THỂ HAI MẢNH VỎ VÀ RAU QUẢ GVHD: TS... Tách chiết RNAGiải phóng virus Tách chiết RNA... Chuyển cẩn thận pha lỏng vào một ống mới và giữ lại để tách chiết

PHÁT HIỆN NOROVIRUS TRONG NHUYỄN THỂ HAI MẢNH VỎ VÀ

RAU QUẢ

GVHD: TS LÊ QUANG HÒA Nhóm 2:

Dương Thị Hạnh – 20161352 Mai Khánh Huyền – 20161892

1 Giới thiệu về

Norovirus

+ Novorius là 1 loại virút thuộc họ Caliciviridae,rất nhỏ và không có

màng bao quanh với đường kính 27-35 nm.

+ Các norovirus có tính di truyền và đa dạng về kháng nguyên,được chia làm 40 dạng.Bộ gen là RNA sợi đơn được chia thành 3 vùng đọc mở :

• Vùng đọc mở thứ 1 là ORF1 (5kb) mã hóa 1 phân tử polyprotein

• ORF2 chủ yếu mã hóa cho protein vỏ VP1

• Vỏ ORF3 mã hóa 1 pro VP2 cơ bản nhỏ chưa biết chức năng

+ Genogroup I (G1) và G2 là 2 bộ gen phổ biến gây bệnh ở người

Đối tượng thực phẩm có nguy cơ nhiễm Norovirus

 Norovirus là nguyên nhân phổ biến nhất gây ra các ca viêm

dạ dày cấp ở hầu hết các nhóm tuổi.

 Quá trình ủ bệnh thường xảy ra từ 24-48h và các triệu

chứng có thể kéo dài từ 12-60h

2 Tách chiết RNA

Giải phóng virus

Tách chiết RNA

2 Tách chiết RNA

Đối với rau quả:

Lấy 25±0,3g mẫu đại diện, cắt nhỏ cho vào túi lọc màng 400ml

Thêm 40±1ml dd đệm TGBE (thêm pectinase đối với mẫu quả mềm)2.1 Giải phóng virus

Ủ, to phòng, lắc liên lục, (20±1) phút, pH = 9,5±0,1

Gạn phần nổi phía trên vào ống, chỉnh pH = 7,0±0,5

Thêm dung dịch PEG/NaCl, lắc để đồng hóa (60±5)s, ủ và lắc liên tục

(60±5) phút, (5±3)oC

Hòa lại hạt mẫu trong 500±10µl PBS

Ly tâm trong (30±5) phút ở (5±3)oC, sau đó bỏ phần dịch nổi phía trên

Gạn dịch rửa giải vào ống ly tâm, ly tâm 30±5 phút, 5±3oC

Khoảng 3h

Chuyển huyền phù vào ống ly tâm loại hẹp chịu được cloroform, thêm (500 ± 10) µl hỗn hợp cloroform/butanol, vortex, ủ 5 phút(đối với quả mềm thì làm tiếp bước này và bước sau)

Ly tâm trong (15 ± 1) min ở (5 ± 3) °C Chuyển cẩn thận pha lỏng vào

một ống mới và giữ lại để tách chiết ARN

để phân tích phải sống hoặc

nếu đông lạnh thì không bị hư

hỏng Phải loại bỏ bùn bám

trên vỏ Không được ngâm lại

vào trong nước

Dùng dao vô trùng tách vỏ, 10 con

Cắt 2,0±0,2 g tuyến tiêu hóa, sau đó đem đi đồng hóa

Thêm (2,0 ± 0,2) ml dung dịch protease K, Ủ (37±1)oC,

TÁCH CHIẾT RNA SỬ DỤNG HỆ THỐNG BIOMERIEUX NUCLISENS ®

2 Các phương pháp tách chiết

Quá trình tách chiết diễn ra trong khoảng 40 – 60 phút

Dung dịch đệm lysin BioMerieux Nuclisens®

Thuốc thử chiết từ tính BioMerieux Nuclisens® (gồm dung dịch silica từ tính, dung dịch đệm rửa 1, 2, 3 và dung dịch đệm rửa giải)

Thiết bị miniMAG hoặc easyMAG BioMerieux Nuclisens®

Giá từ tính BioMerieux Nuclisens®

2 Các phương pháp tách chiết

TÁCH CHIẾT RNA SỬ DỤNG HỆ THỐNG BIOMERIEUX NUCLISENS ®

Cho (2 ± 0,1) ml dd đệm phân giải NucliSens® + (500 ±

10) µl mẫu (BMS)(lắc nhẹ)

Ly tâm (120 ± 10) s ở 1 500 x g, sau đó loại bỏ lớp

huyền phù phía trên

Thêm (400 ± 10) µl dd đệm rửa 1 và hòa lại các hạt

Thêm (400 ± 10) µl dd đệm rửa 1 Hòa lại các hạt nhỏ,

rửa trong (30 ± 2) s

Để silica lắng xuống

Tách ống khỏi khối từLoại bỏ phần nổi phía trên

Thêm (500 ± 10) µl dd đệm rửa 2 Hòa lại các hạt nhỏ,

rửa trong (30 ± 2) s

Để silica lắng xuống

Tách ống khỏi khối từLoại bỏ phần nổi phía trên

Thêm (500 ± 10) µl dd đệm rửa 3 Hòa lại các hạt nhỏ,

3 Các phương pháp phát hiện Norovirus

3.1 Real time RT-PCR

 Nguyên tắc:

 Dựa trên hoạt tính của enzyme Taq

 Sử dụng mẫu dò có đầu phát huỳnh quang cho phát

hiện NoV GI và phát hiện NoV GII nhờ sự khuếch đại của sản phẩm PCR

 Sau mỗi chu kỳ của phản ứng Real-time PCR, kết

quả thông qua tín hiệu huỳnh quang phát ra theo thời gian tại mỗi chu kỳ của phản ứng PCR

3.1 Real-time RT-PCR

Tổng hợp cDNA

(Do vật liệu di truyền

của Norovirus là RNA)

3.1 Real-time RT-PCR

3.1 Real-time RT-PCR

 Cách tiến hành:

3.1 Real-time RT-PCR

Đối với thành phần hỗn hợp mastermix real-time RT-PCR một bước sử dụng hệ thống intrivitrogen ARN ultrasenseTM[1]) qRT-PCR

một bước

3.1 Real-time RT-PCR

Bảng thông số chu trình

3 Các phương pháp phát hiện Norovirus

3.2 RT - LAMP

Nguyên tắc:

• Kỹ thuật khuếch đại DNA dựa trên cấu trúc vòm

• Sử dụng 9 và 13 mồi được thiết kế đặc biệt có chứa các cơ sở hỗn hợp cho nhóm gen I (GI) và II (GII) tương ứng

• Dùng DNA plymeraza có khả năng chuyển vị mạch (đẩy mạch cản trở ra)

• Chỉ ủ ở một khoảng thời gian xác định (60-65oC)

• Phản ứng có thể khuếch đại rất lớn trong thời gian ngắn ( 109-1010

lần trong 15-60 phút)

• Phản ứng với thiết bị đơn giản, diễn ra nhanh chóng

3.2 RT - LAMP

Mồi:

3.2 RT - LAMP

Kết quả: Đo độ đục ở 650nm bằng LA-320C (Teramecs)

Đánh giá khả năng phản ứng chéo của xét nghiệm RT-LAMP đặc hiệu genogroup giữa các genogroup I và II

3.2 RT - LAMP

Cách tiến hành:

Xét nghiệm RT-LAMP được thực hiện trong 25 μl hỗn hợp

phản ứng với bộ khuếch đại RNA (Eiken Chemical, Tochigi,

Nhật Bản)

12,5 μl hỗn hợp phản ứng 2X

1,0 μl hỗn hợp enzyme

2,5 μl RTmate (gen Nippon, Toyama, Nhật Bản)

5 pmol (mỗi) mồi ngoài F3 và B3, 25 pmol (mỗi) đoạn

mồi FIP1, FIP2, BIP1 và BIP2 cho GI

20 pmol (mỗi) đoạn mồi FIP2, FIP3, BIP2, BIP3 và BIP4

cho GII, 20 các đoạn mồi LF1, LF2 và LF3 cho GI

2 μl chiết xuất RNA

4 So sánh ưu nhược điểm của các phương pháp

Real time RT – PCR RT - LAMP

Ưu

điểm • Đồng thời khuếch đại và phát hiện trong quá

trình khuếch đại theo cấp số nhân

• Giám sát thời gian thực của khuếch đại khi nó xảy ra

• Định lượng, do đó hữu ích để theo dõi tải lượng virus

• Tăng độ nhạy do hóa huỳnh quang

• Phân tích thông lượng cao do hoạt động dựa trên phần mềm

• Thời gian: khoảng 3h không kể thời gian tách chiết RNA

• Ngưỡng phát hiện: 3-5 bản sao/ống

• Khuếch đại gen dựa trên trường đẳng nhiệt mà không cần lặp lại vòng nhiệt

• Sự khuếch đại có thể được thực hiện với bể ổn nhiệt / khối sưởi

• Thời gian thực cũng có thể định lượng

• Hiệu suất khuếch đại và độ nhạy cao hơn

• Theo dõi bằng mắt thường thông qua độ đục hoặc thay đổi màu sắc bằng thuốc nhuộm xen

điểm • Thiết bị đắt tiền

• Yêu cầu cao về đầu dò huỳnh quang

• Real time RT – PCR two – step có thể nhiễm chéo

do chuyển ống thí nghiệm

• Thiết kế mồi phức tạp

• Hạn chế có sẵn thuốc thử và thiết bị ở một số nước

Danh mục tham khảo

1 TIÊU CHUẨN QUỐC GIA, TCVN 10783-1:2015, ISO/TS 15216-1:2013