Với mục tiêu phân lập, tuyển chọn và khảo sát đặc điểm sinh học của các dòng thực khuẩn thể làm tiền đề cho những nghiên cứu ứng dụng để kiểm soát bệnh xuất huyết trên cá tra gây ra do A. hyrophila, 26 dòng thực khuẩn thể đã được phân lập bằng phương pháp Plaque Assay từ 100 mẫu nước ao nuôi cá ở tỉnh Tiền Giang.
Trang 1Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 Kỷ yếu khoa học
PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH XÂM NHIỄM VI KHUẨN
AEROMONAS HYDROPHILA CỦA THỰC KHUẨN THỂ TỪ CÁC AO
NUÔI CÁ TRA Ở TIỀN GIANG
Lê Bửu Kỳ*, Bùi Thế Huy
Trường Đại học Tiền Giang
*Tác giả liên lạc: lebuuky1006@gmail.com
TÓM TẮT
Cá tra là một trong những đối tượng thủy sản xuất khẩu chủ lực của Việt Nam Tuy nhiên, dịch bệnh và tình hình đề kháng kháng sinh của vi khuẩn Aeromonas hydrophila đang là thách thức với ngành công nghiệp nuôi cá tra xuất khẩu Với mục tiêu phân lập, tuyển chọn và khảo sát đặc điểm sinh học của các dòng thực khuẩn thể làm tiền đề cho những nghiên cứu ứng dụng để kiểm soát bệnh xuất huyết trên cá tra gây ra do A hyrophila, 26 dòng thực khuẩn thể đã được phân lập bằng phương pháp Plaque Assay từ 100 mẫu nước ao nuôi cá ở tỉnh Tiền Giang Ba thực khuẩn thể pAh17.5TG, pAh18.1TG, pAh19.1TG được tuyển chọn thông qua kết quả về phần trăm thực khuẩn thể không xâm nhiễm lần lượt 44,4%, 58,5% và 52,9% và chu kỳ xâm nhiễm được xác định là 15 phút Phổ xâm nhiễm đối với 36 chủng vi khuẩn A hydrophila của 3 dòng thực khuẩn thể pAh17.5TG, pAh18.1TG, pAh19.1TG dao động từ 77,2% đến 80,6% Cả 3 dòng thực khuẩn thể trên đều thuộc họ Myoviridae và có tính đặc hiệu cao khi không xâm nhiễm các vi khuẩn gây bệnh trên thủy sản và vi khuẩn Probiotics được khảo sát
Từ khóa: Aeromonas hydrophila, bacteriophages, kháng kháng sinh
ISOLATION AND CHARACTERIZATIONS OF BACTERIOPHAGES
INFECTED AEROMONAS HYDROPHILA FROM TIEN GIANG
PROVINCE VIETNAM
Le Buu Ky*, Bui The Huy
Tien Giang University
*Corresponding Author: lebuuky1006@gmail.com
ABSTRACT
Catfish (Pangasianodon hypophthalmus) is one of the most exported products of Vietnam Nonetheless, the epidemic and the antibiotic resistance status of Aeromonas hydrophila are a challenge for the catfish industry The aim of this study was isolation, selection and investigation of the biological characteristics
of the bacteriophages as the basis for applied research to control hemorrhage disease caused by A hyrophila The results showed 26 strains of bacteriophage was isolated by Plaque Assay Methodology from 100 catfish ponds in Tien Giang Province Three phages including pAh17.5TG, pAh18.1TG, pAh19.1TG were selected via the un-absorption rate for 44.4%, 58.5% and 52.9% respectively The time of lytic cycle was determined to be 15 minutes Host range with 36 A hydrophila strains of pAh17.5TG, pAh18.1TG, pAh19.1TG ranged from 77.2%
to 80.6% All three strains belong to the Myoviridae Family and have high specific due to not infect the other aquatic pathogens and probiotics bacteria
Keywords: Aeromonas hydrophila, antibiotic resistance, bacteriophages
Trang 2Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 Kỷ yếu khoa học
TỔNG QUAN
Trong những năm gần đây ngành công
nghiệp nuôi cá tra (Pangasianodon
hypophthalmus) xuất khẩu đang phát
triển mạnh và đã đưa cá tra trở thành sản
phẩm thủy sản xuất khẩu chủ lực của
nước ta Tuy nhiên, dịch bệnh trên cá tra
nuôi xảy ra ngày càng nhiều và khó kiểm
soát Theo khảo sát của Từ Thanh Dung
và ctv (2012), các bệnh gan thận mủ do
vi khuẩn Edwardsiella ictaluri, bệnh trắng
đuôi do Flavobacterium columnare và
bệnh xuất huyết do A hydrophila gây ra
thường xuất hiện trong quá trình nuôi cá
tra thương phẩm Hiện nay, việc phòng và
điều trị bệnh trên cá tra chủ yếu vẫn phụ
thuộc vào các loại thuốc kháng sinh và
hóa chất Người sử dụng thuốc kháng
sinh không đúng cách và không đúng quy
định là nguyên nhân gây ra hiện tượng vi
khuẩn kháng kháng sinh và dư lượng
kháng sinh trong cá tra thành phẩm
Trước thực trạng đó, đòi hỏi phải nhanh
chóng tìm ra các giải pháp hạn chế hoặc
thay thế việc sử dụng chất kháng sinh
Liệu pháp thực khuẩn thể trong phòng và
trị bệnh cho cá là một xu hướng mới có
nhiều triển vọng được các trung tâm khoa
học trên thế giới tập trung nghiên cứu và
phát triển Để có những hiểu biết cụ thể
hơn về thực khuẩn thể có khả năng xâm
nhiễm vi khuẩn gây bệnh xuất huyết trên
cá tra nuôi công nghiệp và những đặc tính
sinh học của thực khuẩn thể này, nghiên
cứu được thực hiện với mục tiêu đóng
góp nghiên cứu nền tảng tại Việt Nam
nhằm ứng dụng liệu pháp thực khuẩn thể
để kiểm soát bệnh do A hydrophila gây
ra trên động vật thủy sản nói chung và cá
tra nói riêng
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
Vật liệu
Vi khuẩn A hydrophila M, Bacillus
subtilis natto, được cung cấp từ Đại học
Bách Khoa, Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh Chủng Lactobacillus fermentum VTCCB-1051, Lactobacillus plantarum VTCCB-890 được cung cấp bởi Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus, Vibrio campellii, E ictaluri được cung cấp bới Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 2
Vi khuẩn Lactobacillus acidilactici được cung cấp bởi Viện nghiên cứu Ứng dụng Công nghệ TP.HCM Vi khuẩn Aeromonas veronii, Flavobacterium columnare được cung cấp bởi Trường Đại học Chulalongkorn, Thái Lan Mẫu nước dùng để phân lập thực khuẩn thể được thu nhận tại các ao nuôi cá tra thuộc Công ty Cổ phần Long An ở Huyện Cai Lậy và Công ty TNHH Phước Hòa ở Huyện Tân Phước tỉnh Tiền Giang
Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp thu mẫu: mẫu nước ao nuôi được thu cách mặt nước 30 cm ở 4 góc và
ở giữa của ao nuôi cá tra, mỗi góc cách bờ khoảng 2 m, bảo quản trong thùng đá, phân tích trong 24 giờ Phân lập thực khuẩn thể, khảo sát đặc điểm vòng sinh tan, hoạt tính xâm nhiễm bằng dược thực hiện bằng kỹ thuật Plaque Assay (Jin Woo Jun et al., 2014) Phổ xâm nhiễm và tính đặc hiệu được thực hiện bằng phương pháp Plaque Drop Assay (Oda et al., 2004; Namura et al., 2008) Đặc điểm hình thái được xác định thông qua kính hiển vi điện tử truyền qua TEM, thực khuẩn thể được phân loại theo Tổ chức phân loại Virus quốc tế ICTV và Ackerman et al (2007)
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Kết quả phân lập thực khuẩn thể có khả năng xâm nhiễm vi khuẩn A hydrophila bằng phương pháp Plaque Assay
Tại 2 huyện Cai Lậy và Tân Phước thu được 100 mẫu nước ao nuôi Trong đó 30
Trang 3Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 Kỷ yếu khoa học mẫu nước thu từ ao cá thương phẩm nuôi
thâm canh quy mô công nghiệp và 70
mẫu thu tại các ao sản xuất cá giống nuôi
quy mô công nghiệp Kết quả từ 100 mẫu
nước phân lập bằng kỹ thuật Plaque
Assay thu được 26 dòng thực khuẩn thể
có khả năng xâm nhiễm A hydrophila M
tương đương với tỷ lệ 26% Các dòng
thực khuẩn thể sau khi phân lập bằng kỹ
thuật Plaque Assay sẽ được tiến hành
sàng lọc dựa vào độ mờ, rõ của vòng sinh
tan và đường kính vòng sinh tan Các
dòng thực khuẩn thể cho vòng sinh tan rõ
có kích thước đường kính vòng sinh tan
lớn hơn 1mm, ngược lại các dòng thực
khuẩn thể có vòng sinh tan mờ có kích
thước nhỏ hơn 1mm Các dòng thực
khuẩn thể ở vị trí TG17.5, TG18.1 và
TG19.1 có kích thước vòng sinh tan lớn
nhất tương ứng với 1,28±0,02 mm,
1,26±0,06 mm, 1,28±0,08 mm, khác biệt
không có ý nghĩa về mặt thống kê với
nhau nhưng khác biệt có ý nghĩa về mặt
thống kê với 23 dòng thực khuẩn thể còn
lại
Từ thí nghiệm phần trăm thực khuẩn thể
không xâm nhiễm cho kết quả 3 dòng
thực khuẩn thể pAh17.5TG, pAh18.1TG
và pAh19.1TG có phần trăm không xâm
nhiễm ở thời điểm 15 phút lần lượt là
44,2%, 58,5% và 52,9%, khác biệt không
có ý nghĩa về mặt thống kê với nhau Khi
so sánh kết quả nghiên cứu này với các
công trình đã được công bố bởi các nhóm
tác giả Taruna Anand et al (2015) cho
thấy: phần trăm thực khuẩn thể không
xâm nhiễm của pAh17.5TG (44,2%) và
pAh19.1TG (52,9%) là thấp hơn Đồng
thời phần trăm không xâm nhiễm của
dòng thực khuẩn thể pAh17.5TG cũng
thấp hơn so với kết quả 51% khi nhóm tác
giả El Araby et al (2016)
Ở thời điểm 30 phút, nồng độ của 3 dòng
thực khuẩn thể pAh17.5TG, pAh18.1TG
và pAh19.1TG tăng đột biến với tỷ lệ
phần trăm lần lượt là 123,7%, 79,8% và
409,9% Từ các thời điểm khảo sát và số
lượng thực khuẩn thể không xâm nhiễm, xác định chu kỳ xâm nhiễm của 3 dòng thực khuẩn thể pAh17.5TG, pAh18.1TG
và pAh19.1TG này là 15 phút Chu kỳ xâm nhiễm của các dòng thực khuẩn thể phân lập tại Tiền Giang tương đương với chu kỳ trong nghiên cứu của Jian-Bin Wang et al (2016) và ngắn hơn chu kỳ 30 phút của Jin Woo Jun et al (2013)
Kết quả thí nghiệm khảo sát phổ xâm nhiễm của các dòng thực khuẩn thể
Các dòng thực khuẩn thể sau khi được phân lập và tuyển chọn ở Tiền Giang sẽ được tiến hành thử phổ xâm nhiễm với 36 chủng vi khuẩn A hydrophila được phân lập và định danh ở các vùng khác nhau tại Tiền Giang và Bến Tre từ bộ sưu tập giống của Đại học Tiền Giang
Kết quả thí nghiệm cho thấy: phổ xâm nhiễm của 3 dòng thực khuẩn thể pAh17.5TG, pAh18.1TG và pAh19.1TG trên 36 chủng vi khuẩn A hydrophila phân lập được dao động từ 72,2% đến 80,6% Trong đó dòng thực khuẩn thể pAh19.1TG có phổ xâm nhiễm rộng nhất
là 80,6% Khi so sánh với kết quả phổ xâm nhiễm của Jin Woo Jun et al thì kết quả của 3 dòng thực khuẩn thể phân lập ở Tiền Giang có kết quả hẹp hơn Tuy nhiên, khi so sánh với kết quả của nhóm tác giả Jian-Bin Wang et al vào năm
2016, phổ xâm nhiễm của các dòng thực khuẩn thể pAh17.5TG, pAh18.1TG và pAh19.1TG rộng hơn
Dựa vào kết quả phần trăm tỷ lệ xâm nhiễm của thực khuẩn thể đối với vi khuẩn A hydrophila thấy rằng khi tiến hành tổ hợp các dòng thực khuẩn thể với nhau thành từng cặp như sau pAh17.5TG
và pAh18.1TG, pAh17.5TG và pAh19.1TG, pAh18.1TG và pAh19.1TG thì cho kết quả phổ xâm nhiễm lần lượt là 77,8%, 80,6% và 80,6% Khi tổ hợp cả 3 dòng thực khuẩn thể trên với nhau thì cho kết quả phổ xâm nhiễm là 80,6% Từ kết quả trên, có thể sử dụng riêng lẻ thực khuẩn thể pAh19.1TG, tổ hợp của dùng
Trang 4Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 Kỷ yếu khoa học thực khuẩn thể này với một trong hai
dòng thực khuẩn thể còn lại hoặc cả ba
dòng thực khuẩn thể Tuy nhiên, để mở
rộng nghiên cứu phổ xâm nhiễm đối với
các vi khuẩn A hydrophila phân lập trên
các đối tượng thủy sản và các vùng nuôi
thủy sản khác ở Đồng bằng Sông Cửu
Long, tổ hợp 3 dòng thực khuẩn thể
pAh17.5TG, pAh18.1TG và pAh19.1TG
sẽ được đề xuất lựa chọn làm nguyên liệu
cho các nghiên cứu tiếp theo
Kết quả phân loại các dòng thực khuẩn
theo ICTV dựa vào kết quả chụp TEM
Dựa vào kết quả ảnh chụp TEM của 3
dòng thực khuẩn thể được phân lập từ các
ao nuôi cá tra ở Tiền Giang, tiến hành ghi
nhận kích thước đầu, cổ và đuôi Kết hợp
với các tiêu chuẩn phân loại theo họ thực
khuẩn thể của ICTV
Từ kết quả ảnh chụp TEM của 3 dòng
thực khuẩn thể pAh17.5TG, pAh18.1TG
và pAh19.1TG cho thấy cả 3 dòng thực
khuẩn thể trên đều có cùng một loại cấu
trúc cơ thể bao gồm đầu, cổ và đuôi Từ
cấu trúc cơ thể trên có thể xếp các dòng
thực khuẩn thể thể pAh17.5TG,
pAh18.1TG và pAh19.1TG vào họ
Myoviridae Kết quả phân loại của 3 dòng
thực khuẩn thể phân lập được ở tỉnh Tiền
Giang trong nghiên cứu này cũng tương
đồng với công bố của nhóm tác giả
Taruna Anand et al (2015)
Kết quả thí nghiệm khảo sát tính đặc
hiệu của các dòng thực khuẩn thể
Tiến hành khảo sát tính đặc hiệu của các
dòng thực khuẩn thể được phân lập và
tuyển chọn trước đó trên các chủng vi
khuẩn gây bệnh trên động vật thủy sản A
veronii, E ictaluri, F columnare, V
parahaemolyticus, V campellii, và các
chủng vi khuẩn có đặc tính probiotics
đang được ứng dụng trong nuôi trồng
thủy sản bao gồm: L fermentum, L
plantarum, L acidilactici, B subtilis
natto Kết quả thí nghiệm khảo sát độ đặc
hiệu của 3 dòng thực khuẩn thể thể
pAh17.5TG, pAh18.1TG và pAh19.1TG
đối với các dòng vi khuẩn gây bệnh điển hình trong nuôi trồng thủy sản và vi khuẩn có đặc tính probiotics cho thấy: tất
cả các dòng thực khuẩn thể đều không xâm nhiễm Kết quả khảo sát độ đặc hiệu của các dòng thực khuẩn thể được phân lập ở Tiền Giang thì tương đồng với kết quả của Jin Woo Jun et al vào năm 2013
và Jian-Bin Wang et al vào năm 2017 Từ kết quả này có thể kết luận các dòng thực khuẩn thể đã phân lập và tuyển chọn bao gồm pAh17.5TG, pAh18.1TG và pAh19.1TG có tính đặc hiệu cao đối với
vi khuẩn A hydrophia
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận
Sau quá trình tuyển chọn 26 dòng thực khuẩn thể phân lập từ 100 mẫu nước ở 20
ao nuôi cá tra ở Tiền Giang cho kết quả
ba dòng thực khuẩn thể được đặt tên là pAh17.5TG, pAh18.1TG và pAh19.1TG
có vòng sinh tan rõ, đường kính vòng sinh tan lớn nhất lần lượt là 1,28±0,02 mm, 1,26±0,06 mm, 1,28±0,08 mm Chu kỳ xâm nhiễm của 3 dòng thực khuẩn thể pAh17.5TG, pAh18.1TG và pAh19.1TG
là 15 phút, phần trăm thực khuẩn thể không xâm nhiễm lần lượt là 44,2%, 58,5% và 52,9%, phổ xâm nhiễm rộng dao động từ 72,2% đến 80,6% Trong đó, dòng thực khuẩn thể pAh19.1TG có phổ xâm nhiễm rộng nhất Cả 3 dòng pAh17.5TG, pAh18.1TG và pAh19.1TG đều thuộc họ Myoviridae dựa và kết quả ảnh chụp dưới kính hiển vi điện tử truyền qua TEM và có độ đặc hiệu cao với vi khuẩn A hydrophila khi không xâm nhiễm một số chủng vi khuẩn gây bệnh thường gặp trên thủy sản và các chủng vi khuẩn Probiotics
Kiến nghị
Tiếp tục nghiên cứu xây dựng đường cong sinh trưởng và khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến mật độ thực khuẩn thể theo thời gian Đồng thời, phân lập vi khuẩn A hydrophila tại các vùng nuôi
Trang 5Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 Kỷ yếu khoa học khác tại ĐBSCL và trên các đối tượng
thủy sản khác để mở rộng thí nghiệm
khảo sát phổ xâm nhiễm nhằm làm tiền
đề cho những nghiên cứu tiếp theo nhằm
ứng dụng thực khuẩn thể như một tác nhân kiểm soát sinh học bệnh do A hydrophila gây ra
TÀI LIỆU THAM KHẢO
ACKERMANN, H.W 2007 5500 Phages examined in the electron microscope
Archives of Virology Vol.152: 227-243
EL-ARABY DA, GAMAL EL-DIDAMONY AND MARIHAN MEGAHED TH
2016 New approach to use phage therapy against Aeromonas hydrophila induced motile Aeromonas Septicemia in Nile Tilapia Journal of Marine
Science: Research & Development Vol.6 (3): 1-6
JIAN-BIN WANG, NIEN TSUNG LIN, YI HSIUNG TSENG, SHU FEN WEN
2016 Genomic Characterization of the Novel Aeromonas hydrophila Phage Ahp1 Suggests the Derivation of a New Subgroup from phiKMV-Like Family
PLoS ONE Vol.11 (9): 1-20
TỪ THANH DUNG, M CRUMLISH, NGUYỄN THỊ NHƯ NGỌC, NGUYỄN
QUỐC THỊNH VÀ ĐẶNG THỤY MAI THY 2004 Xác định vi khuẩn gây bệnh trắng gan trên cá Tra (Pangasius hypophthalmus) Tạp chí Khoa học Đại
học Cần Thơ Chuyên ngành Thủy Sản 137-142