Nghiên cứu này đã chứng minh rằng miR-141 tăng biểu hiện 9,38 lần và biểu hiện PTEN giảm đáng kể trong các mẫu sinh thiết UTVH so với mẫu dịch phết lành tính. Trong nghiên cứu tiếp theo, nhóm nghiên cứu sẽ mở rộng số lượng mẫu, cũng như nghiên cứu trên các giai đoạn khác nhau của bệnh ung thư.
Trang 1Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 Kỷ yếu khoa học
NGHIÊN CỨU TÍNH CHẤT BIỂU HIỆN CỦA MIRNA-141 VÀ GENE
ĐÍCH PTEN TRÊN BỆNH NHÂN UNG THƯ VÒM HỌNG Ở VIỆT NAM
Lao Đức Thuận*, Nguyễn Hoàng Danh, K’ Trọng Nghĩa,
Quang Trọng Minh, Nguyễn Hoàng Nhật Minh,
Hoàng Văn Nam, Lê Huyền Ái Thúy
Trường Đại học Mở TP Hồ Chí Minh
*Tác giả liên lạc: thuan.ld@ou.edu.vn
TÓM TẮT
Gần đây, nhiều bằng chứng cho thấy rằng microRNA-141 (miR-141) có liên quan với ung thư vòm họng (UTVH) do khả năng điều hòa sự biểu hiện của các gene điều chỉnh khối u Tuy nhiên, công trình nghiên cứu về biểu hiện miR-141 ở bệnh nhân UTVH tại Việt Nam vẫn còn giới hạn Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã
sử dụng các công cụ Tin-Sinh học, bao gồm: Pictar, TargetScan, miRDB, để
dự đóa n gene đích của miR-141 Kết quả là, PTEN (phosphatase and homolog tensin), đóng vai trò gây ung thư và liên quan đến quá trình sinh học dẫn đến UTVH, được xác định là đích trực tiếp của miR-141 Sau đó, nhóm nghiên cứu đánh giá biểu hiện miR-141 và PTEN trong các mẫu sinh thiết UTVH và các mẫu dịch phết lành tính Nghiên cứu này đã chứng minh rằng miR-141 tăng biểu hiện 9,38 lần và biểu hiện PTEN giảm đáng kể trong các mẫu sinh thiết UTVH so với mẫu dịch phết lành tính Trong nghiên cứu tiếp theo, nhóm nghiên cứu sẽ mở rộng số lượng mẫu, cũng như nghiên cứu trên các giai đoạn khác nhau của bệnh ung thư Từ đó, làm cơ sở để tiếp tục áp dụng các đặc tính miR-141 và PTEN trong chẩn đóa n, tiên lượng cũng như liệu pháp điều trị UTVH
Từ khóa: Ung thư vòm họng, microRNA-141, PTEN
INITIAL STUDY OF MiRNA-141 AND ITS POTENTIAL TARGETED
PTEN EXPRESSION IN VIETNAMESE IN NASOPHAYNGEAL
CARCINOMA PATIENTS Lao Duc Thuan*, Nguyen Hoang Danh, K’ Trong Nghia,
Quang Trong Minh, Nguyen Hoang Nhat Minh,
Hoang Van Nam, Le Huyen Ai Thuy
Ho Chi Minh City Open University
*Corresponding Author: thuan.ld@ou.edu.vn
ABSTRACT
Recently, accumulating evidences indicated that microRNA-141 (miR-141) is associated with nasopharyngeal carcinoma (NPC) due to their abilities to affect the expression of genes that modulate tumorigenesis Unfortunately, there are still limit publication about miR-141 expression in Vietnamese nasopharyngeal cancer patients In this study, we adopted bioinformatics tools, such as Pictar, TargetScan, miRDB, etc to predict its target gene As the results, PTEN (phosphatase and tensin homolog gene), acts oncogenic role associated with biological processes lead to the nasopharyngeal carcinogenesis, was identified
as the direct target of miR-141 Experimentally, we reported the evaluation of miR-141 and PTEN expression in NPC biopsy samples and non-cancerous swab
Trang 2samples The present study demonstrated that miR-141 was upregulated 9,38 times and PTEN expression was significantly lowered in NPC biopsy samples compared to non-cancerous epithelial swab samples Our finding demonstrated that the miR-141 was upregulated and PTEN was down-regulated in NPC biopsy samples In the upcoming research, a larger clinical sample size from patients at each stage of the NPC will be performed to understand the expression pattern of the miR-141 and PTEN for further applied in early diagnosis and prognosis as well as therapeutic of NPC
Keywords: Nasopharyngeal carcinoma, mircoRNA-141, PTEN
TỔNG QUAN
Ở Việt Nam, UTVH nằm trong 5 loại
ung thư phổ biến nhất, với 86.691
trường hợp (Age-standardized rate -
ASR = 1,2/100.000) và 50,831 ca
(ASR = 0,7/100.000) tử vong hàng
năm ở Việt Nam1,2 Mặc dù, các
phương pháp chẩn đóa n UTVH đã
được cải thiện trong thời gian gần đây
Tuy nhiên, hầu hết bệnh nhân UTVH
vẫn được chẩn đóa n với giai đoạn
muộn, do các triệu chứng ban đầu
không rõ ràng Do đó, việc tìm ra một
dấu chứng sinh học tiềm năng cho
UTVH không chỉ cần thiết cho sự phát
triển của các phương pháp chẩn đóa n
mới mà còn là phương pháp điều trị
đầy hứa hẹn MiRNA (microRNA) là
phân tử RNA ngắn khoảng 20-23
nucleotide, không mã hóa; liên quan
đến quá trình điều hòa sau phiên mã
của nhiều gene3,4 MiRNA được bảo
tồn cao và được phát hiện rộng rãi ở
động vật, thực vật và virus, tham gia
vào nhiều quá trình tế bào bao gồm
tăng sinh tế bào, sự biệt hóa, chuyển
hóa, phản ứng stress và quá trình
apoptosis4,5 miRNA điều hòa chức
năng tế bào bằng cách gắn vào các
trình tự trong vùng 3'-UTR (3’
untranslated region) của các mRNA
đích, dẫn đến tăng cường hoặc ức chế
biểu hiện mRNA3,4,6 Trong thập kỷ
vừa qua, các bằng chứng cho thấy
miRNA có vai trò là “oncogene” hoặc
“tumor suppressor”, những biểu hiện
bất thường (tăng hoặc giảm biểu hiện)
của miRNA góp phần vào quá trình sinh ung ở người4,7-9 Sự biểu hiện vượt mức của các miRNA gây ung thư, được gọi là onco-miRNA, được phát hiện trong nhiều loại ung thư ở người, bao gồm ung thư vòm họng, không chỉ
là các phân tử mục tiêu cho điều trị mà còn là dấu chứng sinh học quan trọng cho chẩn đóa n và tầm sóa t ung thư
10-12 Trong số các onco-miRNA,
miR-141, là một thành viên của họ phân tử miR-200, nằm tại vị trí 12p13.31 (nt: 6964097-6964191, [+]), có vai trò quan trọng trong quá trình sinh ung thư
ở người13-17 Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu đã cho thấy các kết quả trái ngược nhau về vai trò của miR-141 là một miRNA gây ung thư hay miRNA ức chế khối u ở các loại ung thư khác nhau Vì vậy, xác định rõ vai trò của miR-141, đặc biệt là trên các mẫu lâm sàng, có thể phát triển một dấu chứng sinh học tiềm năng cho chẩn đóa n và tiên lượng, cũng như ứng dụng vào điều trị trong lâm sàng Trong các nghiên cứu về miR-141 trên bệnh nhân UTVH, chỉ có một vài nghiên cứu đã được công bố MiR-141 được khẳng định là tăng biểu hiện trong mẫu UTVH so với mẫu lành, ảnh hưởng đến chu kỳ tế bào, quá trình apoptosis, tăng trưởng tế bào, di cư và xâm lấn trong các tế bào UTVH13 Mặt khác, dự đóa
n gene đích của miR-141, mà gene đích hoạt động như một gene gây ung thư hoặc một gene ức chế khối u, kết hợp với miR-141, sẽ phát triển một dấu
Trang 3Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 Kỷ yếu khoa học chứng sinh học tiềm năng cho chẩn đóa
n và điều trị nhắm đích Trong các
nghiên cứu trước đây, các gene đích
của miR-141 đã được xác định, bao
gồm: BRD3, PTEN và UBAP1; tham
gia vào một mạng lưới gene-miR-141
để đóng góp cho sự tiến triển của
UTVH13 Một nghiên cứu khác chỉ ra
rằng biểu hiện của miR-141 tăng đáng
kể trong các mô UTVH và tham gia
vào sự phát triển của tế bào và sự hình
thành khối u qua trung gian BRD7
thông qua sự ức chế đường truyền tín
hiệu PTEN/AKT15 Do đó, miR-141 và
các gene đích đã trở thành một phân tử
sinh học tiềm năng cho nghiên cứu một
dấu chứng sinh học cho tiên lượng,
chẩn đóa n và liệu pháp điều trị cho
UTVH Trong nghiên cứu này, chúng
tôi đã sử dụng nhiều phần mềm tin sinh
học để xác định các gene đích của
miR-141, sau đó, miR-141 và gene đích
được xác định bằng thực nghiệm trên
các mẫu mô sinh thiết UTVH
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Thu nhận mẫu và vấn đề y đức
Bộ mẫu sử dụng trong nghiên cứu bao gồm: 20 mẫu mô sinh thiết UTVH và
20 mẫu dịch phết lành tính Bộ mẫu được thu nhận từ bệnh nhân UTVH và các tình nguyện viên khỏe mạnh tại Bệnh viện Chợ Rẫy Tất cả những mẫu
đã được gửi đến Khoa Mô Bệnh Học, sau đó, đã được chứng minh mô học
Immunohistochemistry (IHC) xác nhận là UTVH Các mẫu sinh thiết UTVH kiểm tra dương tính với UTVH bằng hematoxylin và eosin (Hình 1) Tất cả các mẫu sử dụng trong nghiên cứu đã được kiểm tra mô học và được
sự chấp thuận từ Hội đồng Y Đức Bệnh Viện Chợ Rẫy, quyết định số: 516/BVCR-HDDD
Hình 1 Kiểm tra mô học của ung thư vòm họng chưa biệt hóa
Phân tích Tin-sinh học
Phần mềm miRBase database
(http://www.mirbase.org/) được sử
dụng để thu nhận thông tin cơ bản của
miR-141 Các gene đích tiềm năng và
đường truyền tín hiệu của chúng được
xác định bằng cách sử dụng các phần
mềm Pictar Cùng với đó, vị trí gắn của
miRNA trên gene đích được xác định
bằng phần mềm TargetScan 7.2
DAVID 2008 Functional Annotation
Bioinformatics Microarray Analysis
Tools (http://niaid.abcc.ncifcrf gov/)
được sử dụng để phân loại chức năng các gene đích được dự đóa n từ các phần mềm trực tuyến Pictar, TargetScan 7.2 và miRDB Sử dụng phần mềm Cancer Gene Census (https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic/)
và Tumor suppressor database (https://bioinfo.uth.edu/ TSGene/) để nhận diện các gene đích là “oncogene” hoặc “tumor suppressor gene”
Tách chiết RNA tổng, Reverse transcriptase PCR và phát hiện sự biểu hiện của miR-141
Trang 4miRNA được tách chiết từ mẫu mô
sinh thiết UTVH và mẫu dịch phết lành
tính bằng bộ kit mirVanaTMmiRNA
Isolation Kit (Ambion, Life
Technology), cDNA được phiên mã
ngược từ khoảng 5 ng RNA tổng bằng
bộ kit TaqMan® Advanced miRNA
cDNA Synthesis Kit Phát hiện
miR-141 được thực hiện bằng phương pháp
Real-time PCR (qRT PCR), sử dụng
bộ kit TaqmanTM Advanced miRNA
assays kit (ThermoFisher Scientific)
The UniSp6 rRNA được sử dụng làm
chứng nội cho phản ứng phát hiện
miR-141
Đánh giá sự biểu hiện của mRNA-PTEN
Để đánh giá sự biểu hiện của PTEN, việc phát hiện cDNA mục tiêu được thực hiện bằng phương pháp Reverse-Transcriptase PCR RNA tổng được chuyển thành cDNA bằng việc sử dụng
bộ kit SensiFASTTM cDNA Synthesis Phản ứng tổng hợp cDNA bao gồm các bước sau: 25oC trong 10 phút, 42oC trong 15 phút, 85oC trong 5 phút và giữ
ở 4oC, cDNA được bảo quản ở -20oC
GAPDH được sử dụng làm chứng nội
trong nghiên cứu này Trình tự các cặp mồi được sử dụng trong nghiên cứu được trình bày ở Bảng 1
Bảng 1 Trình tự các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu
PTEN
18 Mồi
GAPDH
19 Mồi
Phân tích thống kê
Kết quả thực nghiệm được phân tích
bằng phần mềm Medcalc® Version
12.7.0.0 Tất cả các giá trị p là two-side
và nhỏ hơn 0,05 được xem là có sự
khác biệt Tất cả các giá trị được báo
cáo là Mean ± SD Sự biểu hiện của
miR-141 được phân tích qua trị số 2
-ΔΔCt Giá trị 2-ΔΔCt lớn hơn và nhỏ hơn 1
nhằm xác định sự tăng hoặc giảm biểu
hiện Phương pháp Chi-test được sử
dụng để xác định mối liên hệ giữa sự
biểu hiện của miR-141 và UTVH Hơn
nữa, mối tương quan giữa biểu hiện
của miR-141 và nguy cơ mắc UTVH
được ước tính bằng cách tính tóa n các
giá trị OR, RR và khoảng tin cậy 95%
(CI)
KẾT QUẢ
Phân tích Tin-sinh học của miR-141
và dự đóa n gene đích
miR-141 thuộc họ phân tử miR-200c, bao gồm 5 thành viên: 200b, 200c, 429, 141 và miR-200a Họ phân tử này được chia thành
2 phân họ dựa trên sự tương đồng trình
tự trên vùng “seed region” MiR-141
có tính bảo tồn cao trên nhiều loài khác nhau17, bao gồm: Pan troglodytes, Homo sapiens, Mus musculus, Rattus norvegicus, Macaca mulatta, Gorilla gorilla, Pongo pygmaeus, Pan paniscus, Monodelphis domestica Gene đích của miR-141 được dự đóa n
từ 3 phần mềm khác nhau, bao gồm: Pictar, TargetScan 7.2, miRDB TargetScan dự đóa n được 896 gene, Pictar dự đóa n 422 gene và miRDB dự đóa n 759 gene là gene đích của
miR-141 Chức năng gene được dự đóa n từ
3 phần mềm trên, được phân tích bằng phần mềm DAVID 2008 Functional Annotation Bioinformatics Microarray
Trang 5Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 Kỷ yếu khoa học Analysis Tools Kết quả cho thấy rằng,
hầu hết các gene đích của miR-141
tham gia vào nhiều đường truyền tín
hiệu khác nhau, có vai trò quan trọng
trong quá trình sinh ung thư, bao gồm:
cell cyle, p53 signaling pathway, tight
junction, Wnt signaling pathway,
MAPK signaling pathway, Jak-STAT
signaling pathway
THẢO LUẬN
UTVH là căn bệnh phổ biến, xuất phát
từ lớp biểu mô vòm mũi họng với sự
xuất hiện cao ở miền Nam Trung Quốc
và Nam Á Theo số liệu toàn cầu về tỷ
lệ mắc và tỷ lệ tử vong do ung thư,
UTVH xếp thứ 5 trong số tất cả các
bệnh ung thư ác tính ở Việt Nam Cho
đến nay, nhiều bằng chứng cho thấy sự
rối loạn chức năng của miRNA có vai
trò quan trọng trong sự tiến triển của
loại ung thư khác nhau Biểu hiện bất
thường của miR-141, nằm trên nhiễm
sắc thể 12p13.31, đã được ghi nhận
trong nhiều loại ung thư, bao gồm: ung
thư vòm họng, ung thư biểu mô tế bào
gan, ung thư đại tràng, ung thư tuyến
tiền liệt, ung thư bàng quang, ung thư
buồng trứng, ung thư vú miR-141 có
vai trò kép trong ung thư, là
“oncogene” hoặc “tumor suppressor”
thông qua một số cơ chế phân tử
Trong nghiên cứu này, chúng tôi khẳng
định rằng miR-141 biểu hiện cao trong
các mẫu sinh thiết UTVH so với các
mẫu dịch phết lành tính bằng phương
pháp qRT-PCR Tần số biểu hiện
miR-141 trong mẫu bệnh là 40,0%, so với
10,0% mẫu lành Giá trị 2-ΔΔCt (2-ΔΔCt =
9,38) xác định sự biểu hiện của
miR-141 cao hơn 9,38 lần trong các mẫu
bệnh so với mẫu lành Sự tăng biểu
hiện miR-141 tương quan chặt chẽ với nguy cơ mắc UTVH thông qua các giá
trị RR và OR (p < 0,05)
Trường hợp biểu hiện dương tính với miR-141 có khả năng mắc UTVH cao gấp 6 lần so với trường hợp không có biểu hiện của miR-141 (OR = 6,00; 95% CI = 1,08 - 33,28)
KẾT LUẬN
Bằng các công cụ tin sinh học, bao gồm: Pictar, TargetScan, miRDB, DAVID 2008… và các cơ sở dữ liệu trực tuyến về dữ liệu gene ức chế khối
u, dữ liệu gene liên quan đến ung thư, chúng tôi khẳng định rằng: miR-141 tham gia điều hòa một loạt các con đường tín hiệu liên quan đến sự tăng sinh, biệt hóa tế bào; Sự bất thường biểu hiện miR-141 liên quan đến con đường hình thành khối u vòm họng Gene đích được chọn làm mục tiêu
nghiên cứu trong đề tài này là PTEN (phosphatase and tensin homolog
gene) Tiến hành thực nghiệm trên mẫu sinh phẩm người Việt Nam, chúng tôi khẳng định miR-141 tăng biểu hiện gấp 9,38 lần ở mẫu UTVH so với mẫu
lành và PTEN giảm biểu hiện ở mẫu
UTVH so với mẫu lành Vì vậy,
miR-141 và PTEN là các phân tử sinh học
tiềm năng hướng tới sử dụng làm dấu chứng sinh học cho việc chẩn đóa n, tiên lượng UTVH trên cộng đồng người Việt Nam Trong nghiên cứu tiếp theo, nhóm nghiên cứu sẽ mở rộng
số lượng mẫu, cũng như nghiên cứu trên các giai đoạn khác nhau của bệnh ung thư, từ đó, sẽ áp dụng các đặc tính
miR-141 và PTEN trong chẩn đóa n và
tiên lượng cũng như liệu pháp điều trị trong UTVH
Trang 6TÀI LIỆU THAM KHẢO
BARTEL DP MicroRNAs: Target recognition and regulatory functions Cell
2009; 136(2):215-33
CROCE CM, CALIN GA miRNAs, cancer, and stem cell division Cell 2005;
15;122(1):6-7
HE L, HANNON GJ MicroRNAs: Small RNAs with a big role in gene regulation
Nat Rev Genet 2004; 5(7):522-31
MAHDAVIFAR N, GHONCHEH M, MOHAMMADIAN-HAFSHEJANI A,
KHOSRAVI B, SALEHINIYA H Epidemiology and Inequality in the
Incidence and Mortality of Nasopharynx Cancer in Asia Osong Public
Health and Research Perspectives 2016;7(6):360-372