Nghiên cứu hoạt tính sinh học định hướng phân lập hợp chất tinh khiết từ cây nhân trần tía và ứng dụng

Mục đích của nghiên cứu là đánh giá hoạt tính chống oxy hóa in vitro, in vivo và chống tăng đường huyết của nhân trần tía. Ba loại cao chiết chloroform, cao chiết ethanol và cao chiết nước của cây được đánh giá trên các mô hình chống oxy hóa FRAP (ferric reducing/antioxidant power), quét gốc tự do DPPH (1,1- diphenyl-2-picryl-hydrazyl) và ức chế enzyme xanthin oxidase.

Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 Kỷ yếu khoa học

NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH SINH HỌC ĐỊNH HƯỚNG PHÂN LẬP HỢP CHẤT TINH KHIẾT TỪ CÂY NHÂN TRẦN TÍA VÀ ỨNG DỤNG

Nguyễn Ngọc Hồng*, Lương Thị Ngọc Hân, Phạm Tiến Đạt, Trương Hồng Nhung

Trường Đại học Công nghệ TP Hồ Chí Minh

*Tác giả liên lạc: nnhong@hutech.edu.vn

TÓM TẮT

Cây nhân trần tía Adenosma bracteosum Bonati được dùng trong y học cổ truyền

để trị bệnh gan mật nhưng ít có những nghiên cứu về các hoạt tính sinh học khác Mục đích của nghiên cứu là đánh giá hoạt tính chống oxy hóa in vitro, in vivo và chống tăng đường huyết của nhân trần tía Ba loại cao chiết chloroform, cao chiết ethanol và cao chiết nước của cây được đánh giá trên các mô hình chống oxy hóa FRAP (ferric reducing/antioxidant power), quét gốc tự do DPPH (1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl) và ức chế enzyme xanthin oxidase Kết quả phân tích cho thấy cao cồn và cao nước đều có hoạt tính chống oxy hóa mạnh Kết quả định lượng phenol tổng cho kết quả cao chiết cồn có hàm lượng cao nhất Các liều thử khác nhau của các cao chiết cồn và nước trên chuột bị tăng đường huyết bằng đường uống cho kết quả ở liều dùng thấp của cao cồn (40 mg/kg) và của cao nước (50 mg/kg) tương đương với nhóm đối chứng dùng thuốc glibenclamide Hoạt tính chống tăng đường huyết của cao chiết cồn trên chuột bị gây độc bởi streptozotocin là tương đương với nhóm chứng thuốc Từ đó phân lập hợp được hợp chất tự nhiên 5,7-Dihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)-4-oxo-4H-chromen-8-yl hexopyranoside từ cao chiết cồn được thu nhận bằng phương pháp sắc ký cột, cấu trúc hợp chất được xác định bằng phổ NMR và phổ MS Hợp chất này cũng

có khả năng làm giảm lượng đường trong máu trên chuột tăng đường huyết bằng đường uống Những kết quả thu được trong nghiên cứu chứng minh cây nhân trần tía là nguồn của chất chống oxy hóa tự nhiên, ngăn ngừa bệnh gout và chống tăng đường huyết nên có thể hỗ trợ trong điều trị bệnh tiểu đường Ngoài ra nhóm tác giả đã bước đầu xây dựng qui trình sản xuất sản phẩm trà túi lọc từ Nhân trần tía

Từ khóa: A.bracteosum, cao chiết, streptozotocin, chống tăng đường huyết, hoạt

tính chống oxy hóa

RESEARCH ON BIOLOGIC ACTIVITY AND NATURAL COMPOUND ISOLATION FROM ADENOSMA BRACTEOSUM BONATI

AND APPLICATION Nguyen Ngoc Hong*, Luong Thi Ngoc Han, Pham Tien Đat, Truong Hong Nhung

Ho Chi Minh City University of Technology

*Corresponding Author: nnhong@hutech.edu.vn

ABSTRACT

Adenosma bracteosum Bonati has been used in traditional and folk medicine in Vietnam as a treatment for liver disease but there are little reports about its biological activities The aim of the present study was to evaluate antioxidant and anti-hyperglycemic activities of extracts from A bracteosum The chloroform,

Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 Kỷ yếu khoa học

ethanolic and aqueous extracts of A bracteosum were tested for their antioxidant activity by using ferric reducing/antioxidant power assay (FRAP) and 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl (DPPH) free radical scavenging assays, and the xanthine oxidase inhibitory activity of these extracts also were carried out The results showed that ethanolic and aqueous extracts possessed strong in vitro antioxidant capacity This study was also found that ethanolic extract had stronger than total phenolic content that of their chloroform and aqueous ones Different doses of ethanolic extract and aqueous extract were treated by oral tolerance to mice body before oral glucose tolerance The results indicated that inhibition percentage of ethanolic (at the dose of 40 mg/kg) and aqueous (at the dose of 50 mg/kg) extracts of A bracteosum in glucose-induced hyperglycemic mice were effectively similar to standard drug Glibenclamide The antihyperglycemic activity of ethanolic extract in streptozotocin-induced diabetic mice were effectively similar to standard drug Glibenclamide (p> 0.05) From ethanolic extract, we have isolated a flavonoid which was identified as 5,7-Dihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)-4-oxo-4H-chromen-8-yl hexopyranoside by using Nuclear magnetic resonance (1H-NMR, 13C-NMR, 2D-NMR) and Mass spectrometry Isolated compound also exhibited significant antihyperglycemic activity in glucose-induced hyperglycemia mice The results obtained indicate that A bracteosum is a potential antioxidant, anti-gout and anti-hyperglycemic agent The Authors have initially designed a production process of tea bag from

A bracteosum Bonati

Keywords: A bracteosum, streptozocin, antioxidant activity, anti-hyperglycemic

activity

TỒNG QUAN

Bệnh tiểu đường được xem là một

trong những bệnh mãn tính phổ biến

nhất trên toàn thế giới Trong quá trình

tăng đường huyết của cơ thể sản sinh

ra nhiều gốc tự do làm suy yếu hệ

thống phòng thủ chống oxy hóa nội

sinh (Maritim A.C et al., 2003) Các

loài thực vật chứa một nguồn chất

chống oxy hóa tự nhiên trong việc duy

trì sức khỏe và bảo vệ cơ thể khỏi nhiều

loại bệnh trong đó có bệnh tiểu đường

Cây nhân trần tía Adenosma

bracteosum Bonati thuộc họ

Scrophulariaceae là loại cây thân thảo,

có mùi thơm được trồng và mọc hoang

tại Campuchia, Lào và miền Nam Việt

Nam Cây nhân trần tía được sử dụng

trong dân gian như là một vị thuốc với

tác dụng hỗ trợ tiêu hóa, lợi mật, tiêu

độc, lợi tiểu, chữa cảm cúm, táo bón,

bệnh vàng da, (Đỗ Tất Lợi, 2004)

Ngoài ra, trong cây có chứa tinh dầu với thành phần chính là thymol cùng với sự hiện diện của carvacrol nên có khả năng kiểm sóa t và phòng chống các bệnh về nhiễm khuẩn, ho, hen suyễn (Tsankova et al., 1994, Can Baser K.H, 2008) Tuy nhiên, cho đến nay vẫn chưa có nhiều công trình nghiên cứu về cây nhân trần tía Mục đích của nghiên cứu này là nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa in vitro, in vivo và tác dụng chống tăng đường

huyết của cây nhân trần tía

NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Nguyên liệu

Cây tươi (phần trên mặt đất) được thu hái vào tháng 11 tại tỉnh Tây Ninh Nguyên liệu được rửa sạch, đem phơi ráo rồi sấy khô ở nhiệt độ 55-600C Nguyên liệu sau khi đã khô đạt độ ẩm

Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 Kỷ yếu khoa học yêu cầu, được đem đi xay nhỏ cỡ 1×1

mm làm nguyên liệu cho quá trình

chiết thu cao

Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp định tính thành phần hóa

thực vật của mẫu: Được thực hiện theo

quy trình mô tả bởi Ciulei và có một số

thay đổi bởi Đại học Y dược TP.HCM

(Trần Hùng, 2004)

Phương pháp chống oxy hóa in vitro

FRAP: Tiềm năng chống oxy hóa của

các cao chiết được xác định bằng khả

năng khử Fe3+ qua phương pháp FRAP

(Ferric reducing antioxidant power

assay) theo quy trình được mô tả bởi

Benzie và Strain (1996)

Phương pháp quét gốc tự do in vitro

DPPH: Được xác định qua việc sử

dụng mô hình được đề nghị bởi Von

Gadow et al (1997)

Phương pháp ức chế enzym xanthin

oxidase: Được xác định qua việc sử

dụng mô hình được đề nghị bởi

Umamaheswari et al (2007)

Allopurinol được dùng làm chất chuẩn

Phương pháp đánh giá khả năng chống

tăng đường huyết: Nghiên cứu này

được thực hiện như mô tả trước đây bởi

Rahman et al (2011) Những con

chuột bạch đực được chia làm 9 nhóm

(6 con mỗi nhóm) Nhóm 1 (nhóm

chứng trắng) chuột bình thường Nhóm

2 (chuột tăng đường huyết) chuột được

uống đường với 2g glucose/kg Nhóm

3 (nhóm chứng thuốc) chuột được

uống thuốc với thành phần

glibenclamide (10 mg/kg ) và đường

với 2g glucose/kg Nhóm 4 đến nhóm

9 (nhóm 4, 5 và 6 dùng Et; nhóm 7, 8

và 9 dùng cao chiết AQ): chuột được

cho uống cao chiết Et và AQ ở liều

tương ứng là 30, 40 và 50 mg/kg và

đường với 2g glucose/kg Các mẫu

máu được thu nhận hai giờ sau khi

uống glucose và lượng đường trong

máu được đo ngay lập tức bằng

phương pháp glucose oxidase

Phương pháp khảo sát trên mô hình in vivo chuột bị gây tiểu đường bởi streptozocin: Tạo mô hình chuột tiểu đường type 1 bằng phương pháp được

mô tả của Kenneth et al (2008) và tham khảo mô hình của Nguyễn Trung Quân (2009) có thay đổi về liều thử: chuột được gây bệnh tiểu đường bằng cách tiêm phúc mạc bụng chuột liều duy nhất 150 mg.kg-1 streptozocin (STZ), được hòa tan trong đệm citrate 0,1M lạnh, pH 4,5; sau khi tiêm, nước cho chuột uống được thay thế bằng dung dịch glucose 5% Nhóm đối chứng chuột chỉ được tiêm đệm citrate Sau 3 ngày tiêm STZ, chuột có nồng

độ glucose máu lúc đói trên 14 mmol/L được coi là tiểu đường và đưa vào nghiên cứu

Sau khi tạo mô hình chuột tiểu đường type 1 thành công, tiến hành với số lượng lớn để thử nghiệm hoạt tính chống tăng đường huyết của các mẫu cao chiết trên chuột đã gây tiểu đường được chọn, thực hiện như mô tả bởi Rucha et al (2010) Các con chuột được phân thành 5 nhóm, 6 con mỗi nhóm Nhóm 1 là chuột bình thường uống DMSO 1% và nước cất Nhóm 2

là chuột bệnh tiểu đường uống DMSO 1% và nước cất Nhóm 3 là chuột bị bệnh tiểu đường uống thuốc đặc trị glibenclamide (10 mg.kg-1) Nhóm 4, nhóm 5 là nhóm thử chuột bệnh tiểu đường lần lượt cho uống cao Et và cao

AQ nhân trần với liều 40 mg.kg-1 đối với cao Et và liều 50 mg.kg-1 đối với cao AQ Mỗi nhóm được cho cho uống như mô tả đều đặn mỗi ngày trong 21 ngày, đo lượng đường trong máu, đều đặn mỗi tuần 1 lần, chuột được cho nhịn ăn cả đêm trước khi đo

Phương pháp phân lập chất từ cao

Et bằng sắc ký cột cổ điển

Pha tĩnh: Silica gel loại dùng cho sắc

ký cột của Merck, cỡ hạt 0.040 – 0,063

mm

Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 Kỷ yếu khoa học Pha động: Hệ dung môi được thăm dò

bằng sắc ký lớp mỏng, chọn hệ dung

môi thích hợp sao cho vết cần tách có

Rf trong khoảng 0,25 - 0,35

Nhồi cột và ổn định cột: Chất hấp phụ

được nhồi vào cột bằng phương pháp

bột ướt Ổn định cột bằng dòng dung

môi đi qua cột Thể tích dung môi dùng

cho ổn định cột gấp 2 - 3 lần thể tích

chất hấp phụ

Nạp mẫu và triển khai cột: Mẫu được

nạp vào cột ở dạng bột khô khi lớp

dung môi ổn định vừa rút khỏi mặt chất

hấp phụ

Kiểm tra phân đoạn: Các phân đoạn

được sắc ký lớp mỏng, phát hiện bằng

thuốc thử VS Gộp các phân đoạn có

thành phần giống nhau, cô dưới áp suất

để thu được dịch đậm đặc

Các chất được phân lập từ các phân

đoạn của cao Et được kết tinh lại trong

dung môi thích hợp, lọc qua phễu thủy tinh xốp, rửa bằng dung môi lạnh để thu được chất tinh khiết và được làm khô trong tủ sấy chân không

Phương pháp xác định độ tinh khiết và định danh: Xác định độ tinh khiết bằng sắc ký lớp mỏng dùng bản mỏng tráng sẵn Silica gel F254 của Merck Chất sau khi được phân lập được mang đi định danh bằng phương pháp phổ khối và cộng hưởng từ hạt nhân

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hóa học thực vật của nguyên liệu

Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hóa học thực vật của nhân trần tía cho thấy nguyên liệu này có các nhóm hoạt chất polyphenol, flavonoid, triterpenoid, steroid, saponin và nhiều tinh dầu (bảng 1)

Bảng 1 Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hóa học của nhân trần tía

Liebermann-Burchard

+

Ghi chú: (-): Không có, (±): Nghi ngờ, (+): Có

Hoạt tính chống oxy hóa in vitro của các mẫu theo mô hình FRAP

Bảng 2 Hoạt tính chống oxy hóa theo mô hình FRAP, DPPH và ức chế enzyme

XO của các mẫu

Mẫu FRAP(μmol

Fe 2+ /L)

FRAP (μmolFe2+/g nguyên liệu

khô)

IC 50 của

DPPH (g/ml) IC

50 của

XO (g/ml) Cao C 907±18 28,47±0,56 > 25 > 100

Cao Et 4033±80 383,19±7,58 6,61±0,17 67,65±0,38 Cao AQ 3253±46 504,86±7,10 10,12±0,13 79,84±0,22

Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 Kỷ yếu khoa học Phương pháp FRAP được sử dụng để

phân tích các chất chống oxy hóa Kết

quả hoạt tính chống oxy hóa của các

mẫu được trình bày trong bảng 2 Giá trị

chống oxy hóa của các mẫu

(μmolFe2+/g nguyên liệu khô) được

xếp theo thứ tự tăng dần là cao C < cao

Et < cao AQ Cao chiết thô Et có hoạt

tính chống oxy hóa tiềm năng với hoạt

tính chống oxy hóa kém 2,79 lần so với

acid ascorbic tinh khiết ở cùng nồng độ

mẫu ban đầu là 1 mg/ml

Hoạt tính quét gốc tự do DPPH

Phương pháp DPPH là một phương pháp

thường được sử dụng để đo hoạt tính các

chất chống oxy hóa vì đơn giản, nhanh

chóng và ổn định Kết quả trình bày ở bảng

2 cho thấy mẫu cao Et có hoạt tính quét gốc

tự do DPPH cao nhất so với hai cao chiết

còn lại Hoạt tính quét gốc tự do của cao Et

với giá trị IC50 = 6,61 g/ml kém 2,28 lần so

với acid ascorbic tinh khiết

Hoạt tính ức chế enzyme xanthin

oxidase

Xanthin oxidase là một loại enzym xúc tác

cho phản ứng oxy hóa hypoxanthine thành

xanthine và sau đó tiếp tục xúc tác cho phản

ứng oxy hóa xanthine thành acid uric Khi

acid uric trong cơ thể người bị tích tụ nhiều

sẽ dẫn đến bệnh gút Allopurinol là một loại

thuốc đặc trị gút có tác dụng ức chế enzyme

xanthin oxidase nhưng có tác dụng phụ nên

việc tìm kiếm, thay thế bằng những loại

thuốc có nguồn gốc từ thực vật an toàn là điều cần thiết Kết quả, ở nồng độ 100

g/ml, cao C, Et và AQ có hoạt tính ức chế xanthin oxidase lần lượt là 10,72%, 77,87%

và 60,86% Giá trị IC50 của các cao chiết trong phương pháp này cũng được trình bày trong bảng 2 Như vậy Cao Et có tiềm năng chống oxy hóa, ức chế enzyme xanthin oxidase

Hoạt tính chống tăng đường huyết của nhân trần tía

Hình 1 cho thấy sự thay đổi trong nồng

độ đường huyết ở nhóm chứng trắng (nhóm 1) ở mức ổn định và nhóm tăng đường huyết (nhóm 2) nằm ở mức cao Kết quả cho thấy các nhóm động vật được cho uống cao chiết Et và AQ từ nhân trần tía đều có khả năng giảm nồng độ glucose đáng kể ở liều 40 mg/kg đối với cao

Et và ở liều 50 mg/kg đối với cao AQ và tương đương với nhóm chứng trắng cũng như nhóm thuốc glibenclamide ở liều 10 mg/kg (p>0,05) Điều này chứng tỏ cao chiết từ nhân trần tía rất có tiềm năng trong việc phòng ngừa và hỗ trợ điều trị bệnh tiểu đường cho con người vì ở liều dùng thấp đã thể hiện hoạt tính giúp ổn định đường huyết Đây là những báo cáo đầu tiên về hoạt tính chống tăng đường huyết từ nhân trần tía được báo cáo Cao chiết từ nhân trần tía đang được nghiên cứu tiếp tục trên mô hình động vật bị đái tháo đường type 1

và type 2

Hình 1 Hiệu quả chống tăng đường huyết của cao Et và AQ

Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 Kỷ yếu khoa học

Hoạt tính chống tăng đường huyết

trên mô hình in vivo chuột bị gây

tiểu đường bởi streptozocin

Streptozotocin là dẫn xuất n-nitroso

của glucosamine Streptozocin được

coi là tác nhân phá hủy các tế bào beta

ở tuyến tụy trong nghiên cứu đái tháo

đường, STZ làm cản trở quá trinh oxy

hóa chuyển hóa tế bào, gây độc cho tế

bào beta Chức năng của tế bào beta

của đảo tụy bị suy giảm, gây giảm

lượng insulin bài tiết vào máu, và dẫn

tới lượng đường huyết cao trong máu

Phân lập hợp chất tự nhiên

Cao chiết cồn sau khi cho chạy qua

nhiều sắc ký cột khác nhau và chạy trên

sắc ký lớp mỏng thu được tinh thể

AB3

Sau khi được định danh bằng phương

pháp phổ khối và cộng hưởng từ hạt

nhân xác định là isoscuerllarein

8-O-β-D-glucopyranoside một hợp chất tự

nhiên có trong Nhân trần tía mà chưa

có tài liệu nào công bố

Ứng dụng

Đã đề xuất quy trình sản xuất trà túi lọc chưa có trên thị trường và đã đánh giá hoạt tính của dịch chiết trà trên mô hình động vật tăng đường huyết cấp tính là khá tốt

KẾT LUẬN

Những kết quả thu được trong nghiên cứu chứng minh cao ethanol và cao nước của cây Nhân trần tía là nguồn của chất chống oxy hóa tự nhiên nên có khả năng phòng ngừa, ngăn chặn nhiều loại bệnh liên quan đến stress oxy hóa, đồng thời

là tác nhân ngăn ngừa bệnh gút và bảo

vệ gan

Đồng thời cũng phân lập được hợp chất

tự nhiên tinh khiết từ cao chiết cồn của cây Nhân trần tía và sản xuất ra sản phẩm trà có khả năng làm giảm đường huyết

TÀI LIỆU THAM KHẢO

BENZIE I F., STRAIN J J (1996) The ferric reducing ability of plasma (FRAP)

as a measure of “antioxidant power”: the FRAP assay Analytical

Biochemistry 239(1): 70-76

CAN BASER K.H (2008) Biological and pharmacological activities of

carvacrol and carvacrol bearing essential oils Current pharmaceutical

design, 14(29): 3106-3119

ĐỖ TẤT LỢI (2004) Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam Nhà xuất bản Y

học, Hà Nội, 625-629

GONZALEZ-BURGOS E., GOMEZ-SERRANILLOS, M P (2012) Terpenoid

compounds in nature: A review of their potential antioxidant activity Current medicinal chemistry, 19: 5319-5341

HOSTETTMANN K (1991) Methods in plant biochemistry assay for bioactivity,

Academic Press Harcourd Brace Jovanovic Pud.6: tr.142-147