Nhiều bài thuốc dân gian đã được sử dụng để điều trị các bệnh về gan mật tại Việt Nam. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đánh giá tác dụng bảo vệ gan, lợi mật và độc tính cấp của cao chiết nước của bài thuốc dân gian vùng Tây Bắc gồm ba thành phần là: Bàn tay ma (Heliciopsis terminalis Kurz.), Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum Thunb.) và Cà gai leo (Solanum procumbens Lour.).
Trang 1Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 Kỷ yếu khoa học
NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG BẢO VỆ GAN, LỢI MẬT VÀ ĐỘC TÍNH CẤP CỦA BÀI THUỐC DÂN GIAN “BÀN TAY MA” VÙNG TÂY BẮC Bùi Thanh Tùng 1 *, Dương Thị Duyên 1 , Hoàng Thị Thúy 1 ,
Hồ Thị Hằng 1 , Đồng Thị Nhâm 1 , Phạm Thanh Hải 1 , Phạm Hùng Việt 2
1 Khoa Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội
2 Trường Đại học Khoa học tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội
*Tác giả liên lạc: tungasia82@gmail.com
TÓM TẮT
Nhiều bài thuốc dân gian đã được sử dụng để điều trị các bệnh về gan mật tại Việt Nam Trong nghiên cứu này, chúng tôi đánh giá tác dụng bảo vệ gan, lợi mật
và độc tính cấp của cao chiết nước của bài thuốc dân gian vùng Tây Bắc gồm ba thành phần là: Bàn tay ma (Heliciopsis terminalis Kurz.), Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum Thunb.) và Cà gai leo (Solanum procumbens Lour.) Kết quả nghiên cứu cho thấy cao chiết nước của bài thuốc dân gian với liều 648 mg/kg và 1296 mg/kg đều có tác dụng bảo vệ gan trên mô hình chuột bị tổn thương gan do paracetamol liều 400 mg/kg thể trọng qua việc vừa làm giảm hoạt
độ enzym AST và ALT, giảm các chỉ số viêm malonyl dialdehyde (MDA), TNF-α
và IFN-γ, vừa làm giảm các tổn thương đại phẫu và vi phẫu trên gan so với nhóm chứng bệnh Bài thuốc còn cho thấy tác dụng lợi mật do khi uống cao thuốc lượng mật tiết ra tăng
Từ khóa: Bảo vệ gan, lợi mật, độc tính cấp, Bàn tay ma, Giảo cổ lam, Cà gai leo
HEPATOPROTECTIVE, CHOLERETIC EFFECTS AND ACUTE TOXICITY OF THE HERBAL FORMULATION “GHOST HAND” (“BAN TAY MA”) COLLECTED IN THE NORTHWEST REGION Bui Thanh Tung 1 *, Duong Thi Duyen 1 , Hoang Thi Thuy 1 ,
Ho Thi Hang 1 , Dong Thi Nham 1 , Pham Thanh Hai 1 *, Pham Hung Viet 2
1
School of Medicine and Pharmacy – VNU Ha Noi 2
University of Science – VNU Ha Noi
*Corresponding Author: tungasia82@gmail.com
ABSTRACT
In traditional medicine, many medicinal remedies have been used been used for treatment of liver disease In this study, we investigated the hepatoprotective, choleretic effect and the acute toxicity of aqueous extract of the herbal formulation containing Heliciopsis terminalis Kurz., Gynostemma pentaphyllum Thunb and Solanum procumbens Lour Our results showed that the herbal formulation at dose of 648 mg/kg and 1296 mg/kg has strong hepatoprotective in mice model injured by paracetamol 400mg/kg bw by decreasing enzymes Alanin Amino Transferase (ALT) and Aspartate Amino Transferase (AST), malonyl dialdehyde (MDA), TNF-α và IFN-γ; significantly reducing macroscopic and microscopic lesions in liver compared with the control group The study also demonstrated that the herbal formulation had choleretic effect by increasing bile secretion and did not show the acute toxicity
Keywords: Hepatoprotective, choleretic effect, acute toxicity, Heliciopsis
terminalis Kurz., Gynostemma pentaphyllum Thunb, Solanum procumbens Lour
Trang 2Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 Kỷ yếu khoa học
ĐẶT VẤN ĐỀ
Gan là một trong những cơ quan lớn
nhất và đảm nhận những chức năng vô
cùng quan trọng đối với cơ thể như:
chuyển hóa thức ăn thành những chất
cần thiết cho sự sống; sản xuất nhiều
chất quan trọng cần cho các hoạt động
sống; giải độc và bài tiết các chất độc
trong cơ thể Bên cạnh đó, gan cũng tạo
ra mật, một chất dịch cần thiết cho sự
tiêu hóa Hiện nay tỷ lệ người mắc các
bệnh về gan mật ngày càng gia tăng và
mức độ nghiêm trọng của bệnh cũng
tăng lên đáng kể Y học cổ truyền từ
lâu đã sử dụng các loại thảo dược với
mục đích: kích thích tiêu hóa thông qua
tác dụng tăng hoạt tính của men tụy
như Bạch truật, Phục linh, Trần bì…
bảo vệ tế bào gan: Sài hồ, Đương quy,
Đại táo, Glycyrrhizine của Cam thảo;
điều hòa chức năng miễn dịch: Sài hồ,
Đảng sâm, Bạch truật, Bạch thược
Trong chương trình nghiên cứu các bài
thuốc dân gian có tác dụng điều trị
bệnh gan mật, chúng tôi đã sàng lọc
được hơn 150 bài thuốc dân gian ở
vùng Tây Bắc có tác dụng bảo vệ gan
và lợi mật Trong các thuốc đã sàng
lọc, có bài thuốc dân gian gồm 3 thành
phần là: Bàn tay ma (Heliciopsis
terminalis Kurz.), Giảo cổ lam
(Gynostemma pentaphyllum Thunb.)
và Cà gai leo (Solanum procumbens
Lour.) (nguồn: ông lang Nguyễn Quyết
Thắng - Hội YHCT Bắc Kạn) cho kết
quả khả quan về nguồn dược liệu dễ
kiếm và theo thống kê đã chữa bệnh
cho số lượng lớn bệnh nhân Tuy
nhiên, các bằng chứng khoa học chứng
minh tác dụng của bài thuốc này hiện
chưa được tiến hành Do đó, trong
nghiên cứu này, chúng tôi đánh giá tác
dụng bảo vệ gan và lợi mật của một bài
thuốc dân gian này
NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên liệu
Các mẫu cây nghiên cứu gồm bàn tay
ma, giảo cổ lam, cà gai leo được thu hái
từ huyện Bạch Thông, tỉnh Bắc Kạn, được định danh bởi PGS.TS Trần Văn
Ơn, Đại học Dược Hà Nội Cao đặc chiết nước của bài thuốc được điều chế như sau: Gộp dịch 3 lần chiết nước của dược liệu khô với tỷ lệ (30 g lá bàn tay
ma, 5 g lá giảo cổ lam, 10g thân cà gai leo), lọc và lấy phần dịch lọc Cô quay chân không để loại nước đến khi khối lượng rắn không đổi thu được cao chiết nước với hiệu suất khoảng 6%
Đối tượng nghiên cứu
Chuột nhắt trắng chủng swiss, cả 2 giống, khoẻ mạnh, trọng lượng 25.0 ± 2.0 gam để nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan do Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương cung cấp Động vật được nuôi thích nghi trong điều kiện đầy đủ thức
ăn và nước uống tại phòng thí nghiệm
từ 3 - 5 ngày trước khi nghiên cứu và trong suốt thời gian nghiên cứu tại Khoa Y Dược, ĐHQG Hà Nội Hóa chất: Paracetamol (A7085 – Sigma Aldrich) dạng bột tinh khiết; Silymarin; Formol; Kít định lượng ALT, AST của hãng Human (Đức) Dụng cụ nghiên cứu: Máy định lượng sinh hóa bán tự động HumaLyzer 2000 (Đức), các dụng cụ thí nghiệm thông thường của Khoa Y Dược, ĐHQG Hà Nội
Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp thử tác dụng bảo vệ gan của bài thuốc: Chuột nhắt trắng chủng swiss được chia ngẫu nhiên thành 5 lô, mỗi lô 10 con Chuột được uống nước/thuốc liên tục trong 8 ngày Ngày thứ 8, sau uống thuốc 1 giờ, chuột nhịn đói từ 16-18h, gây tổn thương gan từ lô 2-5 bằng paracetamol (PAR) liều 400mg/kg với thể tích uống là 0,2 ml/10g Sau khi gây độc 48 giờ, chuột được lấy máu động mạch cảnh để định lượng AST, ALT và quan sát mô bệnh
Trang 3Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 Kỷ yếu khoa học học (đại thể và vi thể) Gan chuột thí
nghiệm sau khi mổ được cố định bằng
formol 10%, xử lí và nhuộm
Hematoxylin-Eosin và được thực hiện
tại bộ môn Y Dược học cơ sở, Khoa Y
Dược, ĐHQG HN
Lô 1 (chứng sinh học, C(-)): Chuột
được cho uống nước cất
Lô 2 (chứng bệnh, mô hình viêm gan,
C(+)): Chuột uống PAR mà không có điều trị
Lô 3 (Silymarin): Chuột được cho uống silymarin 70mg/kg + PAR
Lô 4 (BT-L1): Chuột được cho uống cao chiết bài thuốc - liều 1 + PAR
Lô 5 (BT-L2): Chuột được cho uống cao chiết bài thuốc - liều 2 + PAR Các liều được tính như sau:
Bảng 1 Liều bài thuốc trong nghiên cứu dựa trên quy đổi từ liều dùng trên
người
Dược liệu khô
(mg/ngày/người)
Liều trên người (mg/kg/ngày)
Liều quy đổi trên chuột (mg/kg/ngày)
Liều 1 trên chuột nhắt 25g (mg), tương đương với liều
sử dụng trên người
Liều 2 trên chuột nhắt 25g (mg) (gấp đôi liều 1)
270 (tương ứng 16,2mg cao chiết)
540 (tương ứng 32,4mg cao chiết) Phương pháp nghiên cứu các chỉ số
marker sinh học phân tử liên quan đến
quá trình viêm của bài thuốc: Chuột
được chia ngẫu nhiên thành 4 lô, mỗi
lô 10 con:
Lô 1 (chứng sinh học, C(-)): chuột
được cho uống nước cất
Lô 2 (chứng bệnh, mô hình viêm gan,
C(+)): Chuột được cho uống PAR mà
không có điều trị
Lô 3 (Silymarin): Chuột được cho
uống silymarin 70mg/kg + PAR
Lô 4 (BT-L2): Chuột được cho uống
cao chiết bài thuốc - liều 2 + PAR
Chuột được uống nước/thuốc thử liên
tục trong 8 ngày Ngày thứ 8, sau uống
thuốc 1 giờ, chuột được nhịn đói 16 -
18 giờ trước đó, gây tổn thương gan
chuột ở các lô từ lô 2 đến lô 5 bằng
uống PAR liều 400mg/kg với thể tích
0.2ml/10g 48 giờ sau gây độc bằng
paracetamol, giết chuột, lấy gan, bỏ
vào nitrogen lỏng và bảo quản ở -80oC
Mô gan được cân và đồng nhất trong
hệ đệm lạnh Nonidet-P40 (NP40) gồm
(150 mM sodium chloride, 1.0% Triton X-100, 50 mM Tris, pH = 8.0) Sau đó, ly tâm ở điều kiện (12000g,
4oC) trong 15 phút rồi thu lấy phần dịch nổi phía trên và bảo quản ở nhiệt
độ -80oC đến khi phân tích
Xác định hàm lượng MDA
Khả năng ức chế quá trình peroxy hóa lipid của các chất được đánh giá thông qua việc xác định hàm lượng malonyl dialdehyde (MDA) - sản phẩm của quá trình oxy hóa lipid màng tế bào
Định lượng nồng độ TNF-alpha, INF-gamma bằng phương pháp ELISA
Phương pháp này dựa trên nguyên tắc
là kháng nguyên đã hòa tan trong dung dịch đệm thích hợp có thể phủ lên bề mặt plastic (như polystyrene)
Nghiên cứu tác dụng lợi mật của bài thuốc trên mô hình in vivo:
Tiến hành: Dùng 30 chuột nhắt trắng chia ngẫu nhiên thành 3 lô, mỗi lô 10 con Theo phương pháp của Rudi + Lô thử 1: chuột uống cao nước liều thứ 1
Trang 4Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 Kỷ yếu khoa học + Lô thử 2: chuột uống cao nước liều
2
+ Lô 3 (đối chứng sinh lý): chuột uống
NaCl 0,9%
Chuột ở 3 lô được uống mẫu thử theo
liều qui định trong 3 ngày liên tục,
ngày thứ 4 sau khi uống thuốc 30 phút
tiến hành gây mê bằng ether ethylic và
mổ bụng để thắt ống dẫn mật rồi khâu
thành bụng lại, sau 30 phút bóc tách túi
mật, thấm qua giấy lọc, cân ngay được
m1 (mg)
Rạch túi mật cho mật chảy ra hết rồi
thấm dịch mật còn lại vào giấy lọc và
cân lại khối lượng túi mật được m2
(mg)
Khối lượng mật mỗi con là m = m1-
m2 (mg)
Lượng sinh mật ở lô thử tăng hơn so
với lô chứng tính theo công thức:
𝐿% =𝑚𝑡− 𝑚𝑐
𝑚𝑐 × 100 Phương pháp đánh giá độc tính cấp:
Trước khi tiến hành thí nghiệm, cho
chuột nhịn ăn qua đêm Chuột được
chia thành các lô khác nhau (mỗi lô 10
con) Cho chuột uống cao chiết liều
duy nhất với liều tăng dần đến khoảng
80000 mg cao/kg (gấp 62 lần liều 2)
(liều cao nhất được thiết kế bằng cách
thêm dần nước vào cao đặc đến khi thể
chất cao có dạng lỏng để có thể cho
chuột uống, cho chuột uống 1,2 ml
dịch đặc) trong cùng một thể tích để
xác định liều thấp nhất gây chết 100% chuột và liều cao nhất không gây chết chuột (gây chết 0% chuột) Lô thử uống thuốc với các mức liều tăng dần đến khoảng 80000 mg cao/kg với cùng thể tích uống 1,2 ml Nước cất và thuốc thử được đưa thẳng vào dạ dày chuột bằng kim cong đầu tù Theo dõi tình trạng chung của chuột, quá trình diễn biến bắt đầu có dấu hiệu nhiễm độc (như co giật, kích động, run rẩy, lờ đờ,…) và số lượng chuột chết trong vòng 72 giờ sau khi uống thuốc
Xử lý số liệu
Số liệu nghiên cứu được xử lý thống kê theo phương pháp t-test và test “trước-sau” Số liệu được biểu diễn dưới dạng
X ± SD Sự khác biệt có ý nghĩa khi p<0.05
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Tác dụng bảo vệ gan
Kết quả định lượng men gan
AST và ALT là các enzym transaminase tìm thấy nhiều ở tế bào gan Khi gan bị tổn thương, các enzym này được giải phóng vào trong máu làm cho hàm lượng của chúng trong máu tăng lên Đây là hai enzym chính dùng để đánh giá các tổn thương gan Kết quả tác dụng lên các enzyme gan của các nhóm nghiên cứu được trình bày trong Bảng 2
Bảng 2 Ảnh hưởng của cao thuốc lên hoạt độ AST và ALT trong huyết thanh
chuột bị gây độc bằng paracetamol
C (-) C (+) Silymarin BT-L1 BT-L2
AST
(UI/L)
60.16 ±
14.43
176.96 ± 32.13
105.68 ± 7.58*
148.38 ± 13.42
124.4 ± 7.33
*
ALT
(UI/L) 97.33 ± 4.02
156.89 ± 12.42
102.54 ± 7.48*
133.81 ± 12.35
111.99 ± 6.9*
* : Khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nhóm chứng bệnh C (+)
Lượng enzym gan của lô C (+) cao hơn
hẳn so với lô C (-), điều này cho thấy
paracetamol đã làm tăng đáng kể
enzym gan so với nhóm chứng đối
chứng sinh lý Thêm nữa là kết quả định lượng enzyme gan của lô Silymarin cho thấy silymarin đã làm giảm enzym gan đáng kể (p < 0,05)
Trang 5Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 Kỷ yếu khoa học Như vậy mô hình nghiên cứu là phù
hợp để đánh giá tác dụng của bài thuốc
nghiên cứu trong bảo vệ gan
Kết quả giải phẫu bệnh
Tác dụng bảo vệ gan của bài thuốc còn
được đánh giá thông qua kết quả giải
phẫu bệnh đại thể và vi thể của chuột
được gây độc bằng paracetamol
Tác dụng lợi mật
Tác dụng lợi mật được đánh giá thông
qua lượng mật tiết ra sau quá trình cho
chuột uống thuốc Lượng mật tiết ra
nhiều hơn thông thường chứng tỏ
thuốc có tác dụng lợi mật
Độc tính cấp
Sau khi cho uống, tất cả chuột giảm
hoạt động, đi lại chậm chạp (sau 15
phút), chuột nằm cụm lại (sau 30 phút),
chuột ít ăn uống, có vẻ mệt (sau 45
phút), sau 60 phút một nửa số chuột bắt
đầu ăn uống khá hơn và linh hoạt trở
lại, sau 90 phút chuột hoạt động và ăn
uống bình thường, khảo sát đến 72 giờ không có chuột chết
KẾT LUẬN
Cao chiết nước của bài thuốc nghiên cứu với liều 648 mg/kg và 1296 mg/kg đều có tác dụng bảo vệ gan trên mô hình gây tổn thương gan bằng paracetamol liều 400 mg/kg ở chuột nhắt trắng Tác dụng ấy thể hiện thông qua sự giảm hoạt độ enzym AST và ALT, giảm các chỉ số viêm TNF-α, IFN-γ, MDA, cùng với đó là sự giảm tổn thương gan trên kết quả giải phẫu bệnh đại thể và vi thể Bài thuốc cũng cho thấy tác dụng lợi mật rõ rệt khi làm tăng lượng mật tiết ra so với nhóm đối chứng sinh lý Trong điều kiện cho phép về liều phù hợp có thể cho chuột uống, cao thuốc không thể hiện độc tính cấp
TÀI LIỆU THAM KHẢO
ĐỖ TRUNG ĐÀM Phương pháp xác định độc tính cấp của thuốc NXB Y học
– Hà Nội, 1996
HÀ VÂN OANH AND ĐIỀN VŨ VĂN Nghiên cứu độc tính cấp và tác dụng lợi mật của bài thuốc BG Tạp chí Dược học, 2017 57(7): p 57-59 SCOTT LUPER A review of plants used in the treatment of liver disease: part 1 Alternative medicine review A journal of clinical therapeutic, 1998 3(6):
p 410-421
TUNG BUI THANH, ET AL, Protective effect of Tetracera scandens L leaf extract against CCl4-induced acute liver injury in rats Asian Pacific
Journal of Tropical Biomedicine, 2015 5(3): p 221-227