Nghiên cứu sinh học, sinh thái và nhân giống rong bắp sú (kappaphycus striatus) (f schmitz) doty ex p c silva, 1996

Nhân giống in vitro rong biển Có nhiều phương pháp nhân giống in vitro rong biển bao gồm: Tái sinh chồi trực tiếp, tế bào đơn, phương pháp phát sinh phôi vô tính trực tiếp và phát sinh

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

VŨ THỊ MƠ

NGHIÊN CỨU SINH HỌC, SINH THÁI

VÀ NHÂN GIỐNG RONG BẮP SÚ – Kappaphycus striatus

(F Schmitz) Doty ex P.C Silva, 1996

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1 GS.TS DƯƠNG TẤN NHỰT

2 GS.TS NGUYỄN NGỌC LÂM

KHÁNH HÒA, 2022

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và thực hiện luận án tiến sĩ, tôi đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ rất tận tình từ quý thầy cô, các anh chị, đồng nghiệp, bạn bè và gia đình

Đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất đến GS.TS Dương Tấn Nhựt (Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên) Thầy đã truyền cho tôi nhiệt huyết, lòng say mê khoa học, phương pháp làm việc khoa học, hiệu quả và hướng nghiên cứu mới Thầy tận tình hướng dẫn, cung cấp tài liệu, sách vở quý giá, hết lòng sửa chữa những sai sót trong bài báo và các chuyên đề cũng như luận án Thầy không chỉ tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất để tôi có thể hoàn thành tốt luận án nghiên cứu của mình

mà còn tích lũy cho tôi vốn kiến thức và vốn sống mà không ở đâu có được Tôi xin gửi lời cảm ơn đến GS.TS Nguyễn Ngọc Lâm (Viện Hải dương học) đã hỗ trợ hết mình giúp tôi hoàn thành các môn học và đã định hướng, dìu dắt cũng như giúp đỡ tôi hoàn thành luận án này

Lòng biết ơn sâu sắc kính gửi tới GS.TS Reddy (Trung tâm muối và Viện Nghiên cứu Hóa học Biển, Bhavnagar, Ấn Độ) người đã trao cho tôi cơ hội để được tiếp cận một lĩnh vực nghiên cứu mới về nuôi cấy mô rong biển Tôi không thể quên

sự giúp đỡ của TS Lê Kim Cương và TS Hoàng Thanh Tùng (Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên), TS Huỳnh Hoàng Như Khánh và ThS Trần Mai Đức (Viện Nghiên cứu & Ứng dụng công nghệ Nha Trang) đã có những hỗ trợ trong suốt quá trình thực hiện luận án

Lời cám ơn chân thành cũng được gửi đến Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên, Viện Hải dương học và Viện Nghiên cứu & Ứng dụng công nghệ Nha Trang đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi thực hiện luận án Kính gởi lòng biết ơn chân thành đến quý thầy cô trong khoa Khoa học và Công nghệ biển, Học Viện Khoa học và Công Nghệ, VAST đã giúp đỡ tôi hoàn thành các môn học cũng như trang bị cho tôi những kiến thức cơ bản về lĩnh vực thủy sinh vật học

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các cán bộ phòng Sinh học phân tử và chọn tạo giống cây trồng, Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên, đặc biệt TS Vũ Thị Hiền,

CN Hoàng Đắc Khải, TS Nguyễn Thị Phương Mai cùng các nghiên cứu sinh NCS

Lê Thị Diễm, NCS Trương Hoài Phong, NCS Hà Thị Mỹ Ngân và các em sinh viên như em Mai, em Nguyệt… đã hết lòng giúp đỡ động viên tôi hoàn thành luận án

Chân thành cảm ơn quý đồng nghiệp trong Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang, đặc biệt là tập thể phòng Vật liệu Hữu cơ từ Tài nguyên biển, suốt thời gian qua đã giúp đỡ, động viên tinh thần cho tôi hoàn thành luận án

Nhân dịp này, cho phép tôi được gửi lời cảm ơn đến thầy cô đã dành thời gian quý báu để đọc, tham gia hội đồng các cấp với những góp ý cụ thể, gợi ý bổ ích, giúp tôi hoàn thiện tốt hơn các nội dung nghiên cứu của luận án

Cuối cùng, công trình luận án này sẽ không được hoàn thành nếu không có sự cảm thông và chia sẻ của gia đình, người thân và bạn bè đã luôn sát cánh động viên

và chăm sóc gia đình trong thời gian tôi vắng nhà theo đuổi con đường khoa học

Khánh Hòa, tháng 01 năm 2022

Tác giả luận án

Vũ Thị Mơ

MỤC LỤC

Trang

LỜI CAM ĐOAN i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC BẢNG viii

DANH MỤC HÌNH x

DANH MỤC BIỂU ĐỒ xii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu về rong Bắp sú 4

1.1.1 Hệ thống phân loại 4

1.1.2 Một số đặc điểm sinh học và sinh thái 5

1.1.2.1 Đặc điểm hình thái 5

1.1.2.2 Đặc điểm sinh trưởng và phát triển 5

1.1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của rong 6

1.1.2.4 Đặc điểm phân bố tự nhiên 8

1.1.2.5 Chu trình sinh trưởng và phát triển 8

1.1.3 Giá trị của rong Bắp sú 9

1.2 Nhân giống in vitro rong biển 11

1.2.1 Các giai đoạn nhân giống in vitro 11

1.2.1.1 Tạo nguồn vật liệu ban đầu 11

1.2.1.2 Cảm ứng mô sẹo 12

1.2.1.3 Tái sinh phôi vô tính 13

1.2.1.4 Tái sinh cây con 13

1.2.1.5 Giai đoạn thích nghi 14

1.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến nhân giống in vitro rong biển 14

1.2.2.1 Nguồn mẫu cấy 14

1.2.2.2 Chất khử trùng 14

1.2.2.3 Môi trường dinh dưỡng 16

1.2.2.4 Nhiệt độ 17

1.2.2.5 Ánh sáng 17

1.2.2.6 Chất tạo đông 18

1.2.2.7 Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật 18

1.3 Tình hình nghiên cứu đặc điểm sinh học, sinh thái và nhân giống rong biển

trên thế giới 20

1.3.1 Tình hình nghiên cứu đặc điểm sinh học và sinh thái 20

1.3.2 Tình hình nghiên cứu nhân giống rong biển 23

1.4 Tình hình nghiên cứu đặc điểm sinh học, sinh thái và nhân giống rong biển

tại Việt Nam 26

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu 30

2.1.1 Vật liệu 30

2.1.2 Địa điểm 30

2.1.3 Thời gian 31

2.2 Nội dung nghiên cứu 31

2.2.1 Đặc điểm sinh học và sinh thái các dòng rong Bắp sú 31

2.2.2 Nhân giống rong Bắp sú bằng phương pháp nuôi cấy in vitro 32

2.3 Phương pháp nghiên cứu 32

2.3.1 Điều kiện nuôi cấy/trồng 32

2.3.1.1 Điều kiện in vitro 32

2.3.1.2 Điều kiện ex vitro 32

2.3.2 Nuôi trồng và chăm sóc rong Bắp sú ngoài tự nhiên 33

2.3.3 Phương pháp bố trí thí nghiệm 34

2.3.3.1 Hiện trạng các dòng rong Bắp sú đang được nuôi trồng ở vịnh Vân Phong và vịnh Cam Ranh 34

2.3.3.2 Đánh giá sinh trưởng, hàm lượng và chất lượng carrageenan của các dòng rong thuộc loài rong Bắp sú thu thập được ở vịnh Vân Phong và vịnh Cam Ranh 34

2.3.3.3 Tạo nguồn vật liệu 35

2.3.3.4 Cảm ứng mô sẹo và nhân nhanh mô sẹo 36

2.3.3.5 Sự phát sinh phôi vô tính từ mô sẹo 38

2.3.3.6 Khả năng tái sinh cây con và thích nghi điều kiện sống tự

nhiên 38

2.3.4 Phương pháp quan sát giải phẫu hình thái thực vật 41

2.3.5 Phương pháp ghi nhận số liệu 42

2.3.5.1 Các yếu môi trường 42

2.3.5.2 Xác định khối lượng tươi và khô 42

2.3.5.3 Tốc độ tăng trưởng 42

2.3.5.4 Xác định chiều dài cây con và số nhánh/cây 43

2.3.5.5 Xác định hàm lượng và chất lượng carrageenan 43

2.3.5.6 Các chỉ tiêu theo dõi 43

2.3.5.7 Một số công thức tính sau khi thu nhận số liệu 44

2.3.6 Xử lý số liệu 45

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Đặc điểm sinh học và sinh thái rong Bắp sú 46

3.1.1 Hiện trạng các dòng rong Bắp sú ở vịnh Vân Phong và vịnh Cam Ranh 46

3.1.2 Sinh trưởng, hàm lượng và chất lượng carrageenan dòng rong nâu Sacol và nâu Payaka nuôi trồng ở vịnh Vân Phong và vịnh Cam Ranh 47

3.1.2.1 Các yếu tố môi trường tại khu vực nuôi trồng 47

3.1.2.2 Sinh trưởng, hàm lượng và chất lượng carrageenan của 2 dòng rong nuôi trồng 47

3.2 Nhân giống dòng rong nâu Sacol thuộc loài rong Bắp sú 56

3.2.1 Tạo nguồn vật liệu 56

3.2.1.1 Thử nghiệm các loại môi trường dinh dưỡng đối với sự sinh trưởng của rong giống trong điều kiện in vitro giai đoạn thuần hóa 56

3.2.1.2 Khử trùng mẫu in vitro 58

3.2.2 Cảm ứng và nhân nhanh mô sẹo 62

3.2.2.1 Ảnh hưởng của một số yếu tố đối với sự cảm ứng mô sẹo 62

3.2.2.2 Ảnh hưởng của các loại môi trường dinh dưỡng và NAA, BAP đối với khả năng nhân nhanh mô sẹo 75

3.2.3 Sự phát sinh phôi vô tính từ mô sẹo 80

3.2.3.1 Ảnh hưởng của độ rắn môi trường nuôi cấy đối với khả

năng phát sinh phôi vô tính 80 3.2.3.2 Ảnh hưởng của NAA và BAP đối với khả năng phát sinh

phôi vô tính 82 3.2.4 Khả năng tái sinh cây con và thích nghi điều kiện sống tự nhiên 88

3.2.4.1 Ảnh hưởng của một số yếu tố đối với khả năng tái sinh cây

con hoàn chỉnh từ phôi vô tính 88 3.2.4.2 Giai đoạn thích nghi ngoài tự nhiên của cây con có nguồn

gốc in vitro 102

3.2.4.3 Đánh giá hàm lượng và chất lượng carrageenan của dòng

rong nâu Sacol có nguồn gốc in vitro 113

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1 Kết luận 117 4.2 Kiến nghị 117

DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu về rong Bắp sú

1.1.1 Hệ thống phân loại

Trước đây, loài rong Bắp sú (Kappaphycus striatus) được định danh là

Eucheuma striatum Schmitz và xếp vào chi Eucheuma thuộc họ Solieriaceae, bộ

Gigartinales, lớp Eucheumatoideae, ngành Rhodophyta Đến năm 1989, dựa vào thành phần hóa học có chứa chủ yếu là Kappa-carrageenan của một số loài trong chi

Eucheuma, Doty đã tách ra một chi mới, đặt tên là Kappaphycus và xếp loài rong Bắp

sú vào chi này mang tên K striatum [1] Năm 1996, Liao đã hiệu chỉnh thành

Chi : Kappaphycus, Doty

Loài : K striatus (F Schmitz, 1895) Doty ex P.C Silva, 1996

Tên tiếng việt: Rong Bắp sú [2]

Rong Bắp sú có nhiều dòng khác nhau, trong đó có 6 dòng đang được nuôi

trồng phổ biến trên thế giới đó là:

Kab Kab sitangkai, Tawi – Tawi: Dòng rong Kab Kab

Red Payaka Hingutanan Is., Bohol: Dòng rong đỏ Payaka

Green Sacol Green Is., Roxas, Palawan: Dòng rong xanh Sacol

Brown Sacol Tuluk sangay, zamboanga City: Dòng rong nâu Sacol

Brown Payaka Hingutanan Is., Bohol: Dòng rong nâu Payaka

Green Sacol Tando, Guimaras: Dòng rong xanh Sacol

Trong số những dòng rong trên, ba dòng rong (nâu Sacol, xanh Sacol và nâu

Payaka) có những đặc tính sinh học vượt trội và được trồng phổ biến ở đảo Coco,

Philippines Vì vậy, năm 2005, ba dòng này đã được di trồng vào vùng biển các tỉnh miền Trung, Việt Nam (Hình 1.1) [3]

Hình 1.1 Hình thái của một số dòng thuộc loài rong Bắp sú được di trồng vào Việt Nam

A: Dòng rong nâu Sacol

B: Dòng rong nâu Payaka

C: Dòng rong xanh Sacol

1.1.2 Một số đặc điểm sinh học và sinh thái

1.1.2.1 Đặc điểm hình thái

Tản rong Bắp sú có cấu tạo thân hình trụ đặc, thường tròn hay hơi dẹp và nhiều nhánh Thân dạng bò hoặc thẳng, cao khoảng 20 – 25 cm, đường kính thân chính và nhánh 1 – 2 cm Phân nhánh dày 3 – 4 lần, theo kiểu đối nhau, mọc vòng, chạc hai không đều Nhánh chót ngắn, đỉnh nhánh chia chạc hai có đầu vuốt nhọn hoặc tù Khi

sờ vào rong Bắp sú ta thấy các nhánh rong hơi dẻo và mềm [4]

Dòng rong nâu Sacol (Hình 1.1 A) có màu xanh nâu đến nâu, màu nâu của dòng

này thay đổi nhẹ liên quan đến cường độ ánh sáng (CĐAS) Các nhánh rong trơn bóng,

khoảng cách giữa hai nhánh 1 – 4 cm, đỉnh nhánh chia chạc hai với đầu nhọn [4]

Dòng rong nâu Payaka (Hình 1.1 B) có màu từ nâu nhạt đến nâu đậm hoặc

nâu đỏ, màu nâu thay đổi đậm hay nhạt liên quan đến CĐAS vào các mùa khác nhau trong một năm Rong thô và sần sùi, bề mặt nhánh có nhiều u lồi, khoảng cách giữa hai nhánh 1 – 3 cm Đỉnh nhánh cùn hoặc tròn [4]

Dòng rong xanh Sacol (Hình 1.1 C) có đặc điểm phân nhánh tương tự dòng rong nâu Sacol nhưng có màu xanh lá cây hay xanh ngọc, màu xanh của dòng này

thay đổi nhẹ liên quan đến CĐAS [4]

1.1.2.2 Đặc điểm sinh trưởng và phát triển

27‰ đến 33‰ Ở độ mặn dưới 20‰ kéo dài nhiều ngày, rong ngừng phát triển và chết sau một tuần; độ mặn cao 35 – 40‰ thì rong bị ức chế sinh trưởng [5] Nhiệt độ nước thích hợp nhất cho rong Bắp sú sinh trưởng và phát triển là từ 25°C đến 30°C; khi nhiệt độ nước cao hơn 31°C thì rong tăng trưởng chậm còn ở nhiệt độ thấp hơn 15°C rong bị chết [6] Nhu cầu muối khoáng (chủ yếu là muối nitơ và photpho) đối với rong Bắp sú cao trong điều kiện nhiệt độ cao và ánh sáng mạnh Trong điều kiện nước biển tự nhiên và trao đổi thường xuyên, hàm lượng khoáng đã đủ cho rong sinh trưởng và phát triển [5] Trong điều kiện tự nhiên, CĐAS thích hợp nhất là 585 – 975 μmol photons.m-2.s-1, CĐAS quá cao hay quá thấp đều ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của rong [7] Rong phát triển tốt ở vùng nước thường xuyên trao đổi nước

1.1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của rong

Có nhiều yếu tố sinh thái ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của rong như: Nhiệt độ, ánh sáng, độ mặn, hàm lượng khoáng và dòng chảy…[8, 9]

Độ mặn ảnh hưởng đối với sinh trưởng và phát triển của rong Độ mặn ảnh

hưởng đến TĐTT của rong Kappaphycus Rong Sụn (K alvarezzi) phát triển thuận

lợi ở độ mặn 25 – 35‰ [10] và có TĐTT cao nhất ở độ mặn dao động từ 33,8‰ đến 34,8‰ [11, 12] Độ mặn thấp hơn 26‰ thì rong Sụn bị căng thẳng và dễ bị bệnh

trắng nhũn thân [13] Rong Sụn được thu thập vào những tháng có nhiệt độ nước cao

có khả năng chịu đựng sự thay đổi độ mặn (25 – 35‰) cao hơn những mẫu rong được thu thập trong những tháng có nhiệt độ nước thấp Rong Bắp sú là loài hẹp muối, chỉ sinh trưởng và phát triển tốt ở độ mặn từ 27 – 33‰ Độ mặn dưới 20‰ kéo dài nhiều ngày, rong ngừng phát triển và chết sau một tuần Độ mặn cao 35 – 40‰ thì rong bị

ức chế sinh trưởng [14]

Bên cạnh độ mặn thì nhiệt độ cũng ảnh hưởng tới sinh trưởng của rong Trong phạm vi nhiệt độ thích hợp, khi nhiệt độ tăng thì quá trình sinh trưởng của rong tăng

và ngược lại, yêu cầu nhiệt độ thích hợp cho quá trình sinh trưởng của rong khác nhau

ở từng loài Mặt khác, nhiệt độ ảnh hưởng tới quá trình sinh lý của rong Quá trình quang hợp và hô hấp của rong tối ưu trong phạm vi nhiệt độ thích hợp TĐTT trung bình của rong cũng thay đổi theo mùa TĐTT của rong Sụn vào những tháng có nhiệt

độ nước thấp cao hơn những tháng có nhiệt độ nước cao [15] Rong Sụn sinh trưởng

và phát triển tốt ở nhiệt độ 20 – 30°C [10, 11] Khi nuôi ngoài biển, nhiệt độ nước

biển cao làm giảm TĐTT [16–18] Nhiệt độ nước tăng cao (35,7 ± 2,4°C) làm cho rong chết hàng loạt [19] Nhiệt độ nước thích hợp nhất cho rong Bắp sú sinh trưởng

và phát triển là từ 25 – 30°C; khi nhiệt độ nước cao hơn 31oC rong tăng trưởng chậm,

ở nhiệt độ thấp hơn 15°C rong bị chết [20] Rong Bắp sú có TĐTT cao nhất trong khoảng nhiệt độ 21 – 31°C được nuôi ngoài tự nhiên và 24 – 31°C trong phòng thí nghiệm và sống được ở nhiệt độ 18°C trong khoảng thời gian 10 ngày [21] Vì vậy, nên trồng rong tập trung vào mùa có nhiệt độ nước thấp để rong sinh trưởng và phát triển tốt [8]

Hơn nữa, hàm lượng khoáng có vai trò quan trọng trong quá trình sinh trưởng, phát triển của rong Nhu cầu muối khoáng (chủ yếu là muối nitơ và photpho) đối với rong Bắp sú cao trong điều kiện nhiệt độ cao và ánh sáng mạnh Trong điều kiện nước biển tự nhiên và trao đổi thường xuyên, hàm lượng khoáng đã đủ cho rong sinh trưởng

và phát triển [5] Tuy nhiên, năng suất của rong bị suy giảm sau 2 – 3 năm nuôi trồng

Do đó, việc cung cấp khoáng dạng nitơ đã được thực hiện trong nuôi trồng bằng cách

hồ phân trong chậu trước khi thả giống để đạt được tốc độ tăng trưởng (TĐTT) cao nhất [22]

Nguồn ánh sáng cũng là một trong những yếu tố quan trọng của rong do liên quan đến cường độ quang hợp Cường độ và bước sóng ánh sáng đều ảnh hưởng đến năng suất quang hợp của rong Các dòng rong khác nhau thể hiện phạm vi sinh trưởng tối ưu khác nhau và khả năng chịu được các nguồn ánh sáng khác nhau CĐAS tác động đến hoạt động của tế bào trong hoạt động trao đổi chất và tăng trưởng Cường

độ quang hợp khác nhau đối với các loại mô khác nhau ở rong Bắp sú, những mô ở gần đỉnh nhánh có cường độ quang hợp cao hơn Trong điều kiện tự nhiên, CĐAS thích hợp nhất là 585 – 975 μmol photons.m-2.s-1, CĐAS quá cao hay quá thấp đều ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của rong [7]

Ngoài các yếu tố trên, trao đổi nước cũng ảnh hưởng đến sự phát triển của rong Rong phát triển tốt ở vùng nước thường xuyên trao đổi nước, đây là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến TĐTT, phát triển cũng như chất lượng của rong Nước tù hay

sự lưu thông kém sẽ làm cho tốc độ phát triển của rong chậm lại Đặc biệt, nếu kết hợp với nhiệt độ của nước cao, các chất lơ lửng trong nước lớn, hàm lượng khoáng trong nước thấp sẽ dẫn đến sự tàn lụi của rong Ngược lại, nguồn nước có sự trao đổi

và dòng chảy tốt giúp vận chuyển dinh dưỡng và loại bỏ tảo tạp bám trên rong Rong

Bắp sú có tỉ lệ mất nước thấp và tỉ lệ bù nước cao hơn so với rong Sụn [23] TĐTT của rong Bắp sú diễn ra cao nhất trong mùa gió mạnh và làm nước chuyển động

mạnh [24]

Trong những năm gần đây, ảnh hưởng của biến đổi khí hậu làm rong biển rất

dễ bùng phát dịch bệnh dẫn đến năng suất và chất lượng rong cũng giảm một cách đáng kể Do đó, việc lựa chọn vùng trồng và mùa vụ trồng rất quan trọng trong nuôi trồng rong Bắp sú

1.1.2.4 Đặc điểm phân bố tự nhiên

Rong Bắp sú có nguồn gốc từ vùng biển nhiệt đới như: Khu vực Đông Nam Á gồm: Philippines, Singapore, Indonesia, Malaysia, Papua New Guine; khu vực Ấn

Độ – Thái Bình Dương gồm: Kenya, Tanzania, Madascar, Ấn Độ; khu vực biển Ấn

Độ Dương gồm: Đài Loan, quần đảo Ryukyu và liên bang Micronesia [5] Rong Bắp

sú phát triển ở khu vực có sự trao đổi nước trung bình, nơi có chất đáy cát – san hô, nằm ở vùng trung triều đến dưới triều, rong thường bám vào các vật bám cứng hoặc nằm trong hốc đá khi không bám được [1, 6]

Hiện nay, có khoảng 30 nước trên thế giới trồng rong Kappaphycus Ngoài ra,

rong này còn được di trồng ở nhiều quốc gia và khu vực như: Khu vực Đông Bắc Á gồm Nhật Bản, Trung Quốc; khu vực Đông Nam Á gồm Philippines, Singapore, Việt Nam…; khu vực Tây đại Tây Dương và khu vực Tây Nam Á như Ấn Độ…[22]

1.1.2.5 Chu trình sinh trưởng và phát triển

Vòng đời của rong Kappaphycus có ba pha phát triển là: Cây đơn tính (n)

(gametophyte), cây bào tử (2n) (carsporophyte) và cây tứ bào tử (2n) (tetrasporophyte) xuất hiện luân phiên Cây giao tử đực (male plant) thành thục hình thành túi tinh tử, cây giao tử cái (female plant) thành thục hình thành túi noãn Các giao tử thụ tinh trong túi bào tử của cây cái để tạo thành túi bào tử lưỡng bội, sau đó tạo ra các bào tử lưỡng bội (2n), giao tử được phóng thích ra ngoài môi trường, bám vào nền đáy, phát triển thành cây lưỡng bội Sự phân chia nguyên phân lặp đi lặp lại trong túi bào tử dẫn đến sự hình thành của tứ bào tử và sự phân chia giảm phân tiếp

theo trong tứ bào tử tạo ra tứ bào tử đơn bội Các tứ bào tử được giải phóng phát triển thành các cây giao tử tương ứng để hoàn thành vòng đời [25]

Hình 1.2 Vòng đời của rong Kappaphycus [25]

Trong tự nhiên, rong Bắp sú sinh sản theo hình thức sinh sản sinh dưỡng từ các đoạn thân và nhánh, sinh sản đơn tính bằng bào tử và sinh sản hữu tính bằng sự kết hợp giữa tinh tử của cây giao tử đực với noãn của cây giao tử cái Các hình thức sinh sản này luân phiên xảy ra trong tự nhiên, các dạng cây này đồng thời tồn tại và phát triển

1.1.3 Giá trị của rong Bắp sú

Rong Bắp sú có chứa hàm lượng chất khoáng cao và 18 loại axit amin gồm: Axit aspartic, axit glutamic, asparagine, serine, glultamine, glycine, threonine, arginine, alanine, cysteine, tyrosine, histidine, valine, methionine, iso-leucine, phenyl alanine, lysine và tryptophan [26] Bên cạnh đó, rong còn chứa hàm lượng axit béo cao nên phù hợp với chế độ dinh dưỡng của con người [26, 27], đặc biệt là tỉ lệ Na/K rất tốt cho người bệnh trong điều trị chứng cao huyết áp [26] Rong Bắp sú không chỉ giàu chất xơ thô, sắt và axit béo omega-3 [28], chất chống oxy hóa [29] mà còn chứa

Cây giao tử

(Gametophyte) 2N Cây bào tử

(Carsporophyte) Túi bào tử

các hợp chất sinh học phục vụ cho ngành dược phẩm và sinh hóa như lectin [30, 31] hay K-carrageenan oligosaccharite là chất có hoạt tính chống ung thư và điều hòa miễn dịch [32] Bên cạnh giá trị dinh dưỡng, rong Bắp sú được sử dụng làm nguyên liệu để chiết xuất K-carrageenan, làm phân bón nông nghiệp [33–36] và ethanol sinh học [37–39]

Một trong những ứng dụng điển hình của rong Bắp sú là chiết xuất carrageenan Carrageenan là một loại colloid nhóm phycocolloid được chiết xuất từ

rong biển thuộc ngành rong đỏ như chi Kappaphycus Carrageenan có cấu trúc là một

polysaccharite, có đặc tính liên kết rất tốt với các phân tử protein của động và thực vật [40] Vì vậy, carrageenan được ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực sau:

Trong lĩnh vực thực phẩm: Carrageenan đóng vai trò là chất phụ gia trong thực

phẩm để tạo đông tụ, tạo tính mềm dẻo đồng nhất cho sản phẩm và do điểm nóng chảy thấp nên carrageenan được dùng để làm các món ăn như: Các món thạch, hạnh nhân và nước uống Carrageenan được bổ sung vào bia rượu và dấm làm tăng độ trong suốt Trong sản xuất bánh mì, bánh quy và bánh bông lan… carrageenan có tác dụng tạo cho sản phẩm có cấu trúc mềm xốp [41]

Trong y học và dược phẩm: Carrageenan là chất nhũ hoá trong ngành dược

phẩm Carrageenan được sử dụng để sản xuất các loại sản phẩm như các loại thuốc nhờn, nhũ tương để thoa lên các vết thương mau lành và làm màng bao cho thuốc Cũng dựa vào tính chất mang điện tích âm nên carrageenan được ứng dụng trong việc điều chế thuốc loét dạ dày và đường ruột Khi thành dạ dày bị men pepsin tấn công protein tại chỗ loét làm cho độ axit tăng lên nhưng khi có mặt của carrageenan thì nó tương tác với pepsin và làm ức chế tác dụng của pepsin [41]

Trong công nghiệp: Hỗn hợp I-carrageenan, K-carrageenan và các chất tạo nhũ

tương được đưa vào dung dịch sơn nước để tạo độ đồng nhất nhũ hóa cho sơn Bổ sung carrageenan vào kem đánh răng để chống lại sự tách lỏng và sự bào mòn trạng thái tạo các đặc tính tốt cho sản phẩm Carrageenan được ứng dụng trong công nghiệp sợi nhân tạo, phim ảnh và sản xuất giấy Ngoài ra, carrageenan là môi trường cố định enzyme, chất xúc tác trong công nghiệp tổng hợp và chuyển hoá các chất khác [41]

Hiện nay, việc sử dụng rong biển thô và những sản phẩm từ rong ngày càng tăng trong khi sản lượng rong Bắp sú đã không đáp ứng đủ nhu cầu tiêu thụ trên thế

giới [42] Vì vậy, nghiên cứu để tăng sản lượng rong biển để cung cấp cho nhu cầu tiêu thụ trên thế giới là việc làm quan trọng

1.2 Nhân giống in vitro rong biển

Có nhiều phương pháp nhân giống in vitro rong biển bao gồm: Tái sinh chồi

trực tiếp, tế bào đơn, phương pháp phát sinh phôi vô tính trực tiếp và phát sinh phôi

vô tính gián tiếp thông qua mô sẹo… Trong đó, phương pháp phát sinh phôi vô tính gián tiếp thông qua mô sẹo trải qua các giai đoạn và các yếu tố ảnh hưởng như sau:

1.2.1 Các giai đoạn nhân giống in vitro

Nhân giống in vitro rong biển trải qua các giai đoạn sau: Tạo nguồn vật liệu ban

đầu, cảm ứng mô sẹo, tái sinh phôi vô tính, tái sinh cây con và thích nghi ngoài tự nhiên

1.2.1.1 Tạo nguồn vật liệu ban đầu

Trong giai đoạn tạo nguồn vật liệu ban đầu thì đầu tiên rong cần được thuần

hóa trong điều kiện in vitro Rong ngoài tự nhiên đã quen với việc phát triển trong điều kiện có nhiệt độ và CĐAS cao so với điều kiện nuôi cấy in vitro Do vậy, trước khi đưa vào môi trường in vitro cần có bước đệm giúp rong giống làm quen với điều

kiện bên trong phòng thí nghiệm bằng cách nuôi trong các bể kính với nhiệt độ và

CĐAS giảm dần đến khi đạt được điều kiện in vitro Rong ngoài tự nhiên bị bám

nhiều rong tảo và vi sinh vật (VSV) phụ sinh, trong khi đó, mẫu đưa vào nhân giống phải đảm bảo sạch bệnh và không có phụ sinh cũng như VSV bám Vì thế, môi trường dinh dưỡng thuần hóa rong vừa phải đảm bảo cho rong sinh trưởng tốt và vừa hạn

chế sự phát triển của VSV có hại trong điều kiện in vitro Vì vậy, Ge2O thường được

sử dụng để hạn chế phụ sinh và VSV phát triển Tuy nhiên, đây là hóa chất đắt tiền

và có hại cho rong giống [43] Vì thế, việc tìm ra loại môi trường phù hợp với giai đoạn thuần hóa rong làm nguyên liệu nhân giống là rất cần thiết

Sau khi rong thích nghi với điều kiện in vitro thì bước tiếp theo là khử trùng

mẫu cấy Khử trùng mẫu cấy sau giai đoạn thuần hóa rong là bước quan trọng quyết

định cả quá trình nhân giống Hiệu quả của nhân giống in vitro phụ thuộc vào giai

đoạn khử trùng mẫu cấy Khử trùng mẫu cấy ở rong biển gặp khó khăn hơn so với thực vật bậc cao [44] và tỉ lệ mẫu vô trùng đạt được thấp [45] Do cấu trúc tản rong

biển có lớp biểu bì bên ngoài mỏng [46] và chỉ được bảo vệ bởi một lớp tế bào Khi rong được khử trùng, lớp này bị mất đi, các nguyên tố kim loại dễ dàng xâm nhập và những tác nhân vật lí khác làm hư hại mô rong Do đó, mô rong trở nên nhạy cảm sau khi khử trùng Vì vậy, phương pháp khử trùng phải vừa có thể loại bỏ các tác nhân như: Vi khuẩn, nấm và các VSV khác mà vẫn bảo vệ được các tế bào của mô cấy Khả năng tiêu diệt nấm, khuẩn và VSV khác của các chất khử trùng phụ thuộc vào nồng độ, thời gian xử lý và mức độ xâm nhập của chúng vào các ngõ ngách trên bề mặt của mô cấy Vì vậy, tùy thuộc vào loài rong mà lựa chọn chất khử trùng cũng như nồng độ sử dụng phù hợp

1.2.1.2 Cảm ứng mô sẹo

Khái niệm mô sẹo: Mô sẹo là một khối tế bào không có tổ chức và hình dạng

nhất định Mô sẹo là kết quả của sự xáo trộn trong quá trình tạo cơ quan Mô sẹo được hình thành từ lớp cắt của các phần non của cơ thể thực vật (mô phân sinh ngọn, thân hay rễ…), bao gồm các tế bào nhu mô và thành phần tế bào cây Mô sẹo phát triển không theo quy luật nhưng có khả năng biệt hóa thành rễ, chồi hoặc phôi Từ đó, mô sẹo có thể tái sinh thành cây hoàn chỉnh Mô sẹo là nguyên liệu ban đầu cho các nghiên cứu quan trọng khác như: Phân hóa mô và tế bào, nuôi cấy tế bào đơn, nuôi cấy phôi vô tính và sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học…[47]

Đặc điểm của mô sẹo: Mô sẹo thường có màu vàng trắng, xanh hay màu của

sắc tố anthocyanin Có hai loại tế bào mô sẹo là tế bào mô sẹo xốp (có đặc điểm như không bào to, nhân nhỏ, tế bào chất loãng) và tế bào mô sẹo cứng (có không bào nhỏ, nhân to và tế bào chất đậm đặc) Sau khi mô sẹo hình thành, mô sẹo được cấy chuyển sang môi trường mới Mô sẹo được tách với kích thước vừa phải để tế bào phát triển mạnh nhất, thường cụm mô sẹo có trọng lượng 20 – 100 mg, thời gian giữa hai lần cấy chuyển là 20 – 30 ngày phụ thuộc vào từng loại mô sẹo [47] Mô sẹo cứng có khả năng tái sinh chồi sớm nhất Nguyên nhân có thể do các tế bào mô sẹo sẽ mất đi khả năng sinh ra một số chất thiết yếu cho sự tái sinh của nó khi số lần cấy chuyển tăng lên [47]

Cũng giống như mô sẹo của thực vật bậc cao, mô sẹo rong biển có nhiều loại khác nhau như: Mô sẹo dạng sợi, mô sẹo xốp, mô sẹo đặc… và màu sắc biến thiên từ trắng đến nâu và hơi xanh [48, 49] Mô sẹo có dạng đặc “compact” ở đầu mô cấy khi đầu mô cấy tiếp xúc với môi trường thạch [50] Mô sẹo được cảm ứng từ nhiều bộ

phận khác nhau như phần vỏ, phần ruột của nhánh rong Sụn [48, 50–52] và rong Sụn

gai (Euchema denticulatum) [53] Thời gian cảm ứng mô sẹo từ 4 ngày đến 15 ngày

[48, 50] hoặc lâu hơn 29 – 35 ngày [54] Mô sẹo rong Sụn có dạng sợi gồm nhiều tế bào xếp lại tạo thành chuỗi, có hình thuôn dài (10 – 15 µm x 25 – 200 µm); mô sẹo chứa không bào và chất lục lạp [48] Tỉ lệ cảm ứng mô sẹo phụ thuộc vào loài, điều kiện nuôi cấy như nhiệt độ và vị trí mẫu mô [55–57]

1.2.1.3 Tái sinh phôi vô tính

Phôi vô tính hay còn gọi là phôi soma có chứa tế bào phát sinh cơ quan tương

tự như phôi hữu tính Các mô và tế bào sinh dưỡng tạo ra phôi vô tính thông qua quá trình tạo mô sẹo trung gian [58] Trong quá trình phát sinh phôi vô tính, tế bào soma đóng vai trò sinh phôi như hợp tử và sự phát triển của phôi cũng trải qua các giai đoạn như trong quá trình sinh phôi hợp tử Để tạo thành phôi vô tính, các tế bào thực vật

đã biệt hóa cần phản biệt hóa (trừ các tế bào mô phân sinh) tạo thành tế bào gốc, phát triển thông qua giai đoạn phôi đặc trưng để tạo ra tất cả các loại tế bào của cây mới

Do đó, các tế bào tiền thân của một phôi vô tính là một tế bào gốc có tính toàn năng Các đặc điểm chính để phân biệt một phôi vô tính với một chồi bất định là khi giải phẫu hình thái cho thấy phôi có cấu tạo rời rạc, độc lập không có liên kết mạch với các mô của mô mẹ [59, 60] Phôi vô tính có hình dạng tương tự như phôi hữu tính,

có cấu trúc lưỡng cực và có đầy đủ các bộ phận của một phôi

Tế bào có khả năng phát sinh phôi là những tế bào nhỏ, nhân nằm ở vị trí trung tâm được bao bọc bởi khối tế bào chất dày và những không bào nhỏ Về cơ bản chúng rất giống các tế bào mô phân sinh hay hợp tử Các tế bào có khả năng phát sinh phôi gặp điều kiện như nội bào và ngoại bào cho phép biểu hiện quá trình phát sinh phôi thì sẽ phát sinh phôi, xảy ra sau hoặc đồng thời với quá trình phân bào Quá trình phân bào tiếp theo cùng với quá trình phân cực tế bào dẫn đến sự phát sinh phôi [58] Các nhân tố ảnh hưởng đến cảm ứng phát sinh phôi vô tính rất phong phú, nhưng chủ yếu là CĐHSTTV ngoại sinh và các nhân tố gây căng thẳng khác

1.2.1.4 Tái sinh cây con

Thời gian tái sinh chồi (nảy mầm) phụ thuộc vào loài rong và điều kiện nuôi Chỉ có những phôi đã trưởng thành với hình thái bình thường có tích lũy đủ vật chất

dự trữ và vượt qua giai đoạn làm khô thì phát triển thành cây hoàn chỉnh được Giai đoạn nảy mầm thường không có có sự hiện diện của CĐHSTTV ngoại sinh Tuy nhiên, có vài trường hợp cần auxin và cytokinin để thúc đẩy sự nảy mầm

Tỉ lệ nảy mầm của phôi vô tính, thời gian hình thành nhánh chính và TĐTT phụ thuộc vào loài rong Mô sẹo rong Sụn phát sinh phôi và tái sinh cây con đạt kích thước 2 –

3 mm sau 98 – 177 ngày [54] Rong có thể tái sinh cây mới trong môi trường lỏng có

bổ sung Kinetin (Kin) và α-Naphthaleneacetic axit (NAA) [61]

1.2.1.5 Giai đoạn thích nghi

Cây con có nguồn gốc in vitro đã quen với việc phát triển trong điều kiện vô

trùng, nhiệt độ và CĐAS thấp Do vậy khi chuyển ra bên ngoài môi trường khắc nghiệt, cần có bước đệm giúp cây con làm quen với điều kiện bên ngoài bằng cách nuôi trong các bể kính với nhiệt độ và CĐAS tăng dần đến khi đạt được điều kiện tự nhiên

1.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến nhân giống in vitro rong biển

1.2.2.1 Nguồn mẫu cấy

Mẫu cấy đóng vai trò quan trọng đến hiệu quả của nhân giống in vitro Nguồn

mẫu được chọn phải khỏe, không bị bệnh như bệnh trắng nhũn thân và bệnh do phụ sinh gây ra Chọn những đầu nhánh non [62], phần nhánh [48] hoặc có thể cả tản rong [49] Tuổi mẫu cấy, vị trí mẫu cấy khác nhau cho cảm ứng mô sẹo khác nhau Mẫu cấy cần có kích thước từ 0,5 cm đến 2 cm [48, 63]

1.2.2.2 Chất khử trùng

Khử trùng mẫu thường trải qua hai bước Đầu tiên cần loại bỏ tảo và VSV bám trên bề mặt bằng cách rửa với nước biển đã khử trùng với bàn chải mềm, lược mỏng hoặc dao cạo [64] Sau đó, mẫu được khử trùng với chất khử trùng chính như cồn, Ca(OCl)2, NaOCl, H2O2, Betadine hoặc kháng sinh

Kháng sinh sử dụng trong khử trùng mẫu cấy là hỗn hợp nhiều kháng sinh có khả năng tiêu diệt được nhiều chủng vi khuẩn, nấm kí sinh sâu bên trong thân rong, loại và nồng độ kháng sinh lần đầu tiên được báo cáo bởi Saga và cộng sự [65], Bradley và cộng sự [66] Thời gian khử trùng và nồng độ các chất khử trùng cũng khác nhau phụ thuộc vào nguồn gốc của mẫu [48, 63, 67] Nhiều nghiên cứu đã tiến

hành và chỉ ra rằng khi sử dụng hỗn hợp kháng sinh như: Antimycotic, penicillin G, streptomycin sulfate, amphotericin B, kanamycin, neomycin (sulphate) và nystatin

cho kết quả khử trùng tốt trên rong Sụn [48, 52, 63] Tuy nhiên, thời gian khử trùng

dài từ 2 ngày đến 7 ngày, thậm chí 2 tuần Khi đạt được mẫu vô trùng thì những mẫu này sẽ được chuyển sang môi trường mới để cảm ứng mô sẹo [48, 52, 65, 68] Mặc

dù kháng sinh được sử dụng rộng rãi trong nhân giống in vitro rong biển cho hiệu quả

sạch VSV cao nhưng có thể gây ra hiện tượng kháng kháng sinh ở thực vật, đồng thời thời gian khử trùng kéo dài Các chất khử trùng khác có thời gian khử trùng ngắn, nhưng đều là chất độc hại đối với cơ thể con người Sử dụng kháng sinh trong môi trường nuôi cấy có thể ảnh hưởng tới người thí nghiệm và môi trường Dư lượng kháng sinh trong rong có thể ảnh hưởng đến sức khỏe của con người

Ngoài kháng sinh, một số chất khử trùng khác cũng được sử dụng cho hiệu quả tốt trên đối tượng rong biển như: Nước Javel 0,05%, chất tẩy rửa Triton X-100 hữu cơ (Sigma) 2% trong 5 giây [52], 3 mg.L-1 Iodine và 15% ethanol trong thời gian

30 phút [63] Có thể sử dụng các chất khử trùng này độc lập hoặc sử dụng sau khi xử

lí với kháng sinh [52]

Những năm gần đây, việc sử dụng Nano bạc để làm chất khử trùng cũng được các tác giả quan tâm Nano bạc là chất kháng khuẩn tốt, tiêu diệt các loài vi khuẩn, vi rút và bào tử nấm nhưng không độc hại đối với cơ thể con người Nano bạc có thể thẩm thấu nhanh vào sâu bên trong nhánh rong cùng cơ chế diệt khuẩn của nó là phá hủy chức năng hô hấp của tế bào VSV, phá hủy chức năng của thành tế bào hay liên kết với DNA và ức chế khả năng sao chép của VSV [69]; với kích thước siêu nhỏ của các hạt nano giúp chúng tăng khả năng tiếp xúc bề mặt, dễ dàng xâm nhập và tác động sâu bên trong tế bào [70, 71] và có khả năng tiêu diệt những VSV kí sinh sâu bên trong thân rong hiệu quả Vì vậy, nano bạc được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như y học, mỹ phẩm và dược phẩm… Trong nuôi cấy mô, Nano bạc cũng được nhiều tác giả sử dụng để khử trùng mẫu trên đối tượng thực vật bậc cao Trong

đó, đi đầu là nhóm nghiên cứu của Dương Tấn Nhựt và cộng sự đã thành công trong việc sử dụng nano bạc làm tác nhân khử trùng mẫu cấy cây African violet [72], cây Chanh dây [73], cây Salem [74] và cây sâm Ngọc Linh [75]… Thêm vào đó, nano bạc không chỉ có tính kháng khuẩn tốt mà còn là chất khử trùng an toàn cho sức khỏe

con người Nano bạc không gây độc hại đối với tế bào của động vật máu nóng Bởi

vì màng tế bào của chúng được bảo vệ bởi một lớp lipoprotein kép nhiều liên kết đôi nên các ion được giải phóng ra từ các hạt nano bạc dễ dàng bị vô hiệu hóa [76] Vì vậy, nghiên cứu sử dụng nano bạc như là một chất khử trùng thay thế các chất khử trùng truyền thống khác là hướng nghiên cứu mới

1.2.2.3 Môi trường dinh dưỡng

Môi trường dinh dưỡng trong nuôi cấy in vitro rong biển phải cung cấp đầy đủ

các ion khoáng cần thiết, nguồn chất hữu cơ bổ sung như axit amin và vitamin, nguồn carbon cố định và một số thành phần khác cho sự sống Hiện nay, có rất nhiều môi trường được sử dụng như: Môi trường làm giàu nước biển Provasoli (PES) [77], môi trường Suto (MPI) [78], môi trường Murashige và Skoog (MS) [79], môi trường ASP 12-NTA tổng hợp (ASP12-NTA) [80], môi trường làm giàu nước biển Erdshcribers (ESS/2) [54] và môi trường 50% dung dịch Von Stosch (VS 50) [52] Trong đó, môi trường PES được đánh giá là phù hợp với nhiều loài rong đặc biệt là rong

Kappaphycus [48, 63]

Môi trường dinh dưỡng ảnh hưởng đến thời gian cảm ứng mô sẹo Đối với rong Sụn, mô sẹo cảm ứng sau 4 ngày đến 14 ngày nuôi cấy trên môi trường PES [48, 81], 14 –15 ngày ở môi trường 50% dung dịch Guillard và Ryther (F/2 50) [49, 50],

28 ngày ở môi trường Conwy (CW) [49, 81] và 29 – 35 ngày ở môi trường ESS/2 +

E3 Bên cạnh đó, môi trường dinh dưỡng cũng ảnh hưởng đối với tỉ lệ cảm ứng mô sẹo Mẫu rong Sụn nuôi ở môi trường PES có tỉ lệ cảm ứng mô sẹo là 80 – 100% [48], tỉ lệ này là 90% ở môi trường F/2 50 [50] Môi trường VS 50, F/2 50 và ASP 12

có tỉ lệ cảm ứng mô sẹo rong Sụn 40 – 100% [50] Việc bổ sung đường carbon như glycerol, manose, glucose và galactose cũng nâng cao sự phát triển của mô sẹo [82] Tuy nhiên, glycerol kìm hãm sự phát sinh chồi trực tiếp ở rong Sụn [50]

Môi trường bổ sung dịch chiết rong nâu Ascophyllum (AMPEP) kích thích sự

nảy chồi trực tiếp [83] Rong Sụn có tỉ lệ phát sinh chồi trực tiếp (98 – 100%) sau 9 – 15 ngày nuôi cấy và sau 45 ngày nuôi cấy nhánh rong đạt kích thước (6,4 – 7,0 mm) [84] Do đó, việc tìm ra môi trường dinh dưỡng phù hợp cho từng giai đoạn phát triển

của từng loài rong rất quan trọng trong quy trình nhân giống in vitro

1.2.2.4 Nhiệt độ

Nhiệt độ trong phòng nuôi cấy in vitro thường được điều chỉnh ổn định từ

22°C đến 25°C Tuy nhiên, tùy từng loại nuôi cấy, đối tượng và giai đoạn nuôi khác nhau mà có sự điều chỉnh nhiệt độ phù hợp Nhiệt độ thích hợp cảm ứng mô sẹo rong Sụn là 23 – 25°C [52, 54] Ở giai đoạn tái sinh cây con từ phôi thì nhu cầu nhiệt độ thấp hơn là 20°C Giai đoạn nuôi cây con cần nhiệt độ 25°C [54]

1.2.2.5 Ánh sáng

Ánh sáng bao gồm cường độ và chu kỳ chiếu sáng, là một nhân tố quan trọng

trong quang hợp và ảnh hưởng đến khả năng nuôi cấy in vitro thực vật nói chung

và rong biển nói riêng Ảnh hưởng của ánh sáng liên quan đến loài; có loài chịu ánh

sáng cao, trung bình và thấp Trong nuôi cấy in vitro, nhu cầu về CĐAS thấp hơn

so với rong ngoài tự nhiên nhưng thời gian chiếu sáng và CĐAS… rất quan trọng trong sự điều hòa quang phát sinh hình thái của mẫu mô nuôi cấy Nhu cầu về CĐCS

và chu kì chiếu sáng tùy thuộc vào từng giai đoạn Rong Sụn cảm ứng mô sẹo tốt nhất ở CĐAS 5 µmol photons.m-2.s-1 với chu kì chiếu sáng 12 giờ/ngày [48]; 10 –

15 µmol photons.m-2.s-1 với chu kì chiếu sáng 13 giờ/ngày [54] và 40 ± 10 µmol photons.m-2.s-1 [52] Khi CĐAS cao thì mô cấy bị mất màu và hoại tử, mẫu có cảm ứng mô sẹo nhưng phát triển chậm hoặc bị mất màu thậm chí bị hoại tử [48]

Phôi vô tính có thể được tạo ra trong những điều kiện sáng và tối khác nhau

Có những loài có nhu cầu CĐAS cao nhưng cũng có những loài sự hình thành phôi xảy ra trong điều kiện tối hoàn toàn Ví dụ như, sự phát sinh phôi vô tính ở cây Vân sam Na uy chỉ có thể thực hiện được trong điều kiện tối hoàn toàn nếu có sự hiện diện của ammonium trong môi trường và việc loại bỏ ammonium ra khỏi môi trường là hoàn toàn cần thiết trước khi việc phát sinh phôi được tiến hành ngoài sáng [47] Ánh sáng đỏ thúc đẩy phát sinh phôi trên cây Chà là trong khi ánh sáng xanh thì làm giảm khả năng đó Trong quá trình phát sinh phôi vô tính ở cây Cà rốt thì ánh sáng đỏ, ánh sáng xanh lục hoặc tối đều có hiệu quả tương tự như nhau, còn ánh sáng xanh hoặc ánh sáng trắng lại ức chế hiệu quả phát sinh phôi [47] Rong Sụn phát sinh phôi ở

5 µmol photons.m-2.s-1 với chu kỳ chiếu sáng 12 giờ/ngày [52, 54] Ở giai đoạn tái sinh cây con từ phôi, nhu cầu CĐAS có sự thay đổi 10 – 15 µmol photons.m-2.s-1, chu

chu kì chiếu sáng 16 giờ/ngày [54]

1.2.2.6 Chất tạo đông

Trong nuôi cấy in vitro, agar thường được sử dụng như là chất làm đông môi

trường để tránh hiện tượng mô chìm trong môi trường hoặc bị chết vì thiếu oxy nếu môi trường lỏng và tĩnh Đây là một loại polysaccharide tách chiết từ rong biển Hàm lượng agar cũng ảnh hưởng đối với sự phát sinh hình thái mô cấy Mô sẹo cảm ứng ở 5 – 8 g.L-1 agar trên đối tượng rong Sụn [49, 50, 52] Tuy nhiên, ở một báo cáo khác lại cho rằng agar ở hàm lượng 15 g.L-1 agar thích hợp cho rong Sụn cảm ứng mô sẹo, hàm lượng quá cao hoặc quá thấp kích thích tạo chồi [48]

Khả năng phát sinh phôi vô tính cũng ảnh hưởng bởi trạng thái vật lí của môi

trường nuôi cấy [85] Trong nuôi cấy in vitro, sự nảy mầm của phôi vô tính thường diễn

ra trên môi trường được làm đông bằng agar hoặc trên môi trường lỏng có các giá thể nâng đỡ như cầu giấy lọc Mô sẹo của rong Sụn có thể hình thành phôi vô tính ở môi trường PES từ lỏng đến rắn (bổ sung 10 g.L-1 agar) [48, 86] Tuy nhiên, thông thường phôi vô tính hình thành ở môi trường bán lỏng Sau đó phôi này được chuyển sang môi trường PES lỏng để tái sinh cây con [48] Ngoài ra, ở hàm lượng agar cao thường kích thích mô sẹo phát triển thành dạng búp [87] Do đó, việc nghiên cứu hàm lượng agar thích hợp với từng giai đoạn phát sinh hình thái đối với rong Bắp sú là việc cần thiết

1.2.2.7 Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật

Các CĐHSTTV đóng vai trò quan trọng trong việc kiểm soát sự sinh trưởng, biệt hóa, phát triển của thực vật nói chung và rong biển nói riêng Mức độ kiểm soát phụ thuộc vào loài, từng giai đoạn ở mỗi nồng độ và loại CĐHSTTV khác nhau CĐHSTTV như auxin và cytokinin ảnh hưởng đối với quá trình cảm ứng mô sẹo và biệt hóa phôi

Auxin có hai nhóm gồm auxin nội sinh (Indolebutyric axit (IBA), Indoleacetic axit (IAA)) được tổng hợp từ mô non đang phân chia nhanh và auxin nhân tạo (NAA, 2,4-D…) Auxin kích thích rất mạnh sự phân chia tế bào thượng tầng Ở mức độ tế bào, auxin kích thích sự trương giãn tế bào, đặc biệt theo chiều ngang làm tế bào lớn lên, kích thích sự tổng hợp các cấu tử cấu trúc lên thành tế bào như các chất cenlulose và pectin… Auxin có vai trò kích thích cảm ứng và tăng trưởng của mô sẹo Tuy nhiên, vai trò của auxin lên quá trình cảm ứng mô sẹo và biệt hóa

3-phôi tùy thuộc vào sự kết hợp giữa các chất và nồng độ Kết hợp NAA với amino-purine (BAP)hoặc IAA được cho là không ảnh hưởng đối với quá trình cảm ứng mô sẹo rong Sụn [48, 49, 88] Mặt khác, khi kết hợp đúng loại và đúng nồng độ của hai nhóm CĐHSTTV như NAA + Di-methyl-allyl-amino purine (2iP), NAA+ BAP và PAA + 2iP làm tăng kích thước của mô sẹo [51] Sử dụng NAA và BA đơn

Benzyl-lẻ hoặc kết hợp với nồng độ 0,1 – 1,0 mg.L-1 không kích thích cảm ứng mô sẹo nhưng kích thích biệt hóa phôi vô tính [48] Vai trò của auxin đối với quá trình phát sinh phôi tùy thuộc vào sự kết hợp giữa các chất và nồng độ [56] Sự phát triển của phôi

vô tính cây Cà rốt trong nuôi cấy trải qua một quá trình gồm hai giai đoạn, mỗi giai đoạn cần có môi trường riêng Các mô sẹo được nuôi cấy khởi đầu và nhân sinh khối trên môi trường giàu auxin và thường được sử dụng 2,4-D ở phạm vi nồng độ 0,5 – 1 mg.L-1 Trên môi trường này, sự phân hoá mô sẹo xảy ra tại các nhóm tế bào phân sinh được gọi là “các cụm phát triển phôi” (EC) Khi cấy chuyền sang môi trường tăng sinh, các EC tiếp tục lớn dần mà không tạo các phôi trưởng thành Nếu các EC được chuyển sang môi trường có nồng độ auxin rất thấp (0,01 – 0,1 mg.L-1) hoặc không có auxin, chúng sẽ phát triển thành phôi trưởng thành Sự có mặt của auxin trong môi trường tăng sinh là cần thiết cho mẫu có thể phát triển thành phôi khi chuyển sang môi trường phù hợp Các môi trường tăng sinh có thể coi là môi trường cảm ứng đối với hình thành phôi vô tính Những mẫu duy trì liên tục trong môi trường không có auxin sẽ không hình thành phôi [89] Sử dụng NAA đơn hoặc kết hợp với BAP ở nồng độ 0,1 – 1,0 mg.L-1 kích thích biệt hóa phôi vô tính rong Sụn [48]

Tương tự auxin, cytokinin cũng gồm cytokinin nội sinh (Zeatin,2-iP (IPA)…)

và cytokinin nhân tạo (BAP, Kin, Thidiazuron (TDZ)…) Cytokinin nội sinh được tổng hợp từ rễ và phôi đang tăng trưởng Cytokinin có vai trò kích thích sự phân chia

tế bào Cytokinin ảnh hưởng rõ rệt đối với sự hình thành và phân hóa cơ quan thực vật như sự phân hóa chồi, phân chia và phát sinh hình thái tế bào Cytokinin kích thích sự tăng trưởng tế bào trong điều kiện có auxin Khi kết hợp PAA và Zeatin ở nồng độ 1 mg.L-1 là đủ cho sự phát triển mô sẹo rong Sụn gai [53] Khi sử dụng 1 mg.L-1 Kin, 1 mg.L-1 NAA và 0,018 mg.L-1 spermine mô sẹo hình thành sau 30 ngày nuôi cấy Kết hợp 1 mg.L-1 BA với 2,5 mg.L-1 IAA kích thích tạo cụm mô sẹo dạng sợi

ở rong Sụn [49] Tỉ lệ cảm ứng mô sẹo ở rong Sụn được nuôi ở môi trường có bổ sung

tỉ lệ CĐHSTTV là 5 mg.L-1 IAA kết hợp với 1 mg.L-1 BAP [63], 2,5 mg.L-1 BAP kết hợp với 1 mg.L-1 IAA [91] hay IAA và Kin đơn lẻ kích thích phát sinh chồi chính trực tiếp [92]

Ngoài ra, các cytokinin cũng được dùng cho cảm ứng phát sinh hình thái ở các loài thực vật hai lá mầm Loại cytokinin được sử dụng nhiều trong môi trường nuôi cấy là BAP, nhưng các cytokinin khác như Kin, zeatin và TDZ cũng cho kết quả tốt tuỳ thuộc vào loài thực vật Trong nuôi cấy phôi, nồng độ của các CĐHSTTV là rất quan trọng đối với phản ứng sinh trưởng tối ưu của mẫu cấy Khi nồng độ quá thấp sẽ không kích thích sinh trưởng, ngược lại nồng độ quá cao có thể gây độc cho mẫu… Các môi trường tăng sinh chứa BAP có thể thúc đẩy sự phân bào nhưng kìm hãm khả năng phát sinh phôi trong trường hợp ở cây Cà rốt Điều này có lẽ do những kích thích tăng sinh khối chọn lọc ở những thành phần của tế bào không phát sinh phôi Tuy nhiên hiệu quả tích cực của cytokinin đối với sự hình thành phôi đã được xác nhận trong nuôi cấy nhiều loài thực vật Zeatin có tác dụng kích thích tốt nhất đối với

sự hình thành phôi khi được đưa vào môi trường phôi hoá đã chứa mẫu nuôi cấy được

3 – 4 ngày tuổi [93] Nhìn chung, vai trò của cytokinin trong phát sinh phôi vô tính

là khác nhau giữa các loài thực vật phụ thuộc vào kiểu gene, điều kiện môi trường và thời điểm chúng được sử dụng Đối với rong Sụn khi bổ sung BA đơn hoặc kết hợp với NAA ở nồng độ 0,1 – 1,0 mg.L-1 kích thích phát sinh phôi vô tính [48] Từ những vấn đề nêu trên, có thể thấy, CĐHSTTV rất đa dạng và nồng độ sử dụng cũng rất khác nhau Vì vậy, cần phải nghiên cứu để tìm ra loại và nồng độ thích hợp ứng với mỗi giai đoạn phát triển hình thái của mẫu cấy

1.3 Tình hình nghiên cứu đặc điểm sinh học, sinh thái và nhân giống rong biển trên thế giới

1.3.1 Tình hình nghiên cứu đặc điểm sinh học và sinh thái

Trên thế giới, có rất nhiều nghiên cứu về đặc điểm sinh học và sinh thái của những loài rong có chứa carrageenan Tuy nhiên, hầu hết các tác giả tập trung nghiên cứu về rong Sụn, chỉ một số ít công trình nghiên cứu về loài rong Bắp sú Nội dung các nghiên cứu tập trung giải quyết vấn đề ảnh hưởng của môi trường như: Nhiệt độ, ánh sáng và phương pháp trồng đối với TĐTT và hàm lượng carrageenan (Bảng 1.1)

Bảng 1.1 Các nghiên cứu về đặc điểm sinh học và sinh thái các loài rong chứa carrageenan

tham khảo

1 E

denticulatum

Điều kiện phòng thí nghiệm

25oC, 145 μmol photons.m-2.s-1 TĐTT: 2,21 – 2,76%/ngày [94]

Điều kiện ngoài tự nhiên

350 μmol photons.m-2.s-1, bệnh trắng nhũn thân và bệnh do phụ sinh gây ra TĐTT: 4 – 9,5%/ngày [95]

25 – 32°C, 30 – 32‰, hàm lượng nitrat 0,0136 – 0,838 mg.L-1, photphat 0,0085 – 0,0099 mg.L-1, bệnh do phụ sinh, địch hại là cá

TĐTT: 1,67 – 3,32%/ngày [96] Phương pháp nuôi trồng bằng lồng lưới nổi TĐTT: 2,68 – 3,32%/ngày [97, 98]

2 E spinosum

Điều kiện ngoài tự nhiên

Khối lượng giống ban đầu 50 g/bụi TĐTT: 4,14%/ngày [99] Ảnh hưởng của chất đáy: Đáy đá, đáy cát Rong phát triển tốt nhất ở nơi có chất

đáy là đá [100]

3 K alvarezii

Điều kiện ngoài tự nhiên

Bệnh do phụ sinh gây ra TĐTT: 1,1%/ngày [95, 101] Phương pháp trồng bằng lồng lưới nổi, độ sâu 0,5 m,

mật độ 8,4 – 12 cây/m2, sâu 44 – 59 ngày nuôi, 33 – 35‰, 800 – 1000 μmol photons.m-2.s-1, 26 – 28°C

TĐTT: 3,5 – 7,2 % /ngày [19, 102–

104] Phương pháp trồng bằng túi lưới 26,51 ± 1,72°C,

34,23 ± 1,79‰, 17,46 ± 8,77 μM.L-1 nitrat và 1,32 ±  0,78 μM.L-1 photphat

TĐTT: 4,4 – 7,8%/ngày [9]

Thử nghiệm nuôi trồng rong bằng bè nổi

Sinh khối tăng gấp 8 lần sau 45 ngày nuôi

TĐTT: 3,69 – 3,76%/ngày

[105, 106]

Hồ phân với dịch chiết xuất thương mại rong nâu

Ascophyllum nodosum (AMPEP), độ sâu 50 – 100 cm

TĐTT: 3,1 – 5,6%/ngày Hàm lượng carrageenan: 33,3 – 44,65%

30,54 – 33,59‰, 29,67 – 32,18°C, 102,33 – 146, 15 μmol photons.m-2.s-1 TĐTT: 2,25 – 2,81%/ngày [113]

Điều kiện ngoài tự nhiên

29 – 36‰ và 28,5 – 32,5°C TĐTT: 3,5%/ngày [55]

500 g/m2 dây trồng, độ sâu 50 cm sau 30 ngày nuôi trồng

TĐTT: 4,5%/ngày Hàm lượng carrageenan: 45% [114]

28 – 33‰, 26 – 28°C, 0,05 – 0,07 mg.L-1 nitrat, 0,04 – 0,08 mg.L-1 photphat TĐTT: 5,5%/ngày [24]

Hồ phân với dịch chiết xuất thương mại rong nâu

Ascophyllum nodosum (AMPEP) [115]

Hồ phân 0 – 9 g.L-1 (NH4)2HPO4

Hàm lượng carrageenan giảm so với đối chứng [116]

Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng của rong như các yếu tố sinh thái (nhiệt

độ, ánh sáng và độ mặn…) Bên cạnh đó, nguồn gốc giống cũng ảnh hưởng đến TĐTT và

chất lượng của rong [117] Khả năng sinh trưởng và phát triển của rong Kappaphycus có nguồn gốc in vitro tốt hơn so với cây rong ngoài tự nhiên được nhân giống bằng phương pháp sinh sản sinh dưỡng truyền thống [112] Cây giống rong Sụn có nguồn gốc in vitro

có TĐTT 4,6%/ngày – 7,2%/ngày [18, 53, 111] cao hơn so với giống có nguồn gốc tự nhiên (3,5%/ngày) [18] Ở một nghiên cứu khác cũng ghi nhận TĐTT của rong Sụn có

nguồn gốc in vitro cao gấp 1,5 – 1,8 lần so với giống rong lấy ngoài tự nhiên [48]

Ngoài ra, bệnh trên rong Kappaphycus cũng làm giảm TĐTT dẫn đến sinh

khối của rong bị giảm thậm chí chết hoàn toàn, trong đó có hai bệnh phổ biến là bệnh trắng nhũn thân và bệnh do phụ sinh gây ra Bệnh trắng nhũn thân (bệnh ice-ice) là

một bệnh phổ biến ở rong Kappaphycus nói chung và rong Bắp sú nói riêng, chủ yếu

gây thiệt hại về sản lượng cũng như chất lượng rong ở nhiều mức độ khác nhau Ngoài bệnh trắng nhũn thân, bệnh do phụ sinh gây ra cũng làm giảm năng suất và chất lượng

rong Bệnh do phụ sinh được định nghĩa là những thực vật bám như: Neosiphonia sp [110], Ulva fasciata, Enteromorpha intestinalis… [105, 118], hay ấu trùng của động

vật hai mảnh vỏ và cua [105] Những sinh vật này gây cản trở sự quang hợp và trao đổi chất của rong, dẫn đến TĐTT giảm Cách khắc phục bệnh này đòi hỏi nông dân phải loại bỏ phụ sinh 2 – 3 lần mỗi tuần, trong đó đòi hỏi lao động có chuyên môn [119] Nhiễm bệnh do phụ sinh và bệnh trắng nhũn thân được coi là mối đe dọa nghề

nuôi trồng rong Kappaphycus toàn cầu [119, 120] Đây là lí do chính làm suy giảm

sản lượng rong nuôi trồng [121] Bệnh do phụ sinh gây ra xuất hiện ở một số khu vực nuôi thường gây ra hậu quả nặng nề như xóa sổ hoàn toàn một số vùng nuôi [122]

Vì thế, điều quan trọng là phát triển các dòng mới chịu nhiệt và có khả năng kháng

mầm bệnh Nuôi cấy in vitro được cho là phương pháp tạo ra những thế hệ cây con

có khả năng sinh trưởng tốt khi tiếp xúc với tác nhân gây bệnh trắng nhũn thân và giống rong có khả năng chịu được nhiệt độ cao [123]

1.3.2 Tình hình nghiên cứu nhân giống rong biển

Hầu hết các nghiên cứu nuôi cấy in vitro rong biển trên thế giới tập trung vào

những loài có giá trị kinh tế, đặc biệt là ngành rong đỏ, trong đó có các loài chủ yếu

thuộc chi Kappaphycus như: Rong Sụn, rong Bắp sú và Euchema sp

Bảng 1.2 Một số nghiên cứu về nhân giống in vitro các loài rong chứa carrageenan

Loài Nguồn mẫu Giai đoạn Môi trường CĐAS

(μmol photons.m -2 s -1 )

Nhiệt độ (°C)

Nguồn tham khảo

K alvarezii

Nhánh

Tái sinh trực tiếp và cảm ứng mô sẹo ESS (đặc) 20 – 160 18 – 26 [51] Cảm ứng mô sẹo ESS + CW (đặc) 25 – 50 23 – 25 [124]

VS 50 40 ± 10 25 ± 1 [52]

Mô sẹo Phôi vô tính và tái sinh cây con PES (lỏng) 5 – 70 22 (± 1) [20]

Tản

Tế bào trần và nảy mầm F/2 và F/4 (lỏng) 20 – 160 20 – 30 [125] Cảm ứng mô sẹo và tái sinh cây con PES (đặc) 94 22 – 25 [49]

PES (đặc và lỏng) 25 25 [86] Tái sinh chồi trực tiếp PES (lỏng) 100 (± 10) 25 (± 1) [91, 111]

VS 50 (lỏng) 15 – 50 25 (± 1) [126] Cây con Thích nghi ngoài tự nhiên AMPEP 25 [127]

Mảnh mô

Cảm ứng mô sẹo và tái sinh

PES (đặc và lỏng) 5 – 90 26 (± 1) [90] ESS/2 (đặc và

lỏng) 10 – 15 23 – 25 [54]

VS 50 (đặc) 40 (± 10) 23 (± 2) [50]

Tế bào trần và nảy mầm PES (lỏng) 94 – 120 15 – 40 [62]

F/2 60 24 ± 1 [128] Tái sinh chồi trực tiếp

AMPEP + K+ 27,2 – 33,8 [129, 130]

AN, môi trường Grund, Ni tơ thương mại,

80 25 [131]

AMPEP [84] Nảy mầm ESS/2 (lỏng) 5 – 45 23 [132]

E denticulatum Mảnh mô Cảm ứng mô sẹo và tái sinh ESS/2 (lỏng) 5 – 80 25 [53]

K striatus

Bào tử Bào tử MGM (lỏng) 50 25 [134] Mảnh mô Nảy mầm ESS/2 (lỏng) 10 – 45 20 – 25 [7]

Tái sinh chồi trực tiếp AMPEP + K+ 27,2 – 33,8 [130]

Phương pháp nhân giống như phát sinh chồi trực tiếp, tái sinh cây con thông qua phát sinh phôi từ mô sẹo, sinh sản bằng bào tử và nuôi cấy tế bào trần đã được

thực hiện trên nhiều đối tượng rong Kappaphycus Phương pháp nhân giống bằng bào

tử làm tăng sự biến đổi di truyền và rất quan trọng đối với đa dạng sinh học Tuy nhiên,

nhân giống cây con Kappaphycus bằng bào tử mất nhiều thời gian vì thời kỳ cây con

kéo dài và vẫn đang ở giai đoạn đầu sự phát triển công nghệ Mặt khác, ở cá thể trưởng thành, cả hai cây bào tử và cây tứ bào tử hiếm khi được tìm thấy trong tự nhiên; khác

với chi Gracilaria, cây bào tử có thể tìm thấy quanh năm [134] Phương pháp phát

sinh chồi trực tiếp không thông qua phôi bản chất là sinh sản sinh dưỡng, sau vài thế

hệ rong bị thoái hóa và giảm sức sống Nhân giống bằng phương pháp phát sinh phôi thông qua phát sinh mô sẹo đã được thực hiện trên rong Sụn cho kết quả khả quan với

tỉ lệ cảm ứng mô sẹo cao và hệ số nhân nhanh lớn Trên đối tượng rong Bắp sú gần đây đã có nghiên cứu nhân giống bằng phương pháp tái sinh chồi trực tiếp [130] Tuy nhiên, đến nay vẫn chưa có bất kì nghiên cứu nào được thực hiện trên loài này bằng phương pháp nuôi cấy mô sẹo Vì vậy, nghiên cứu nhân giống rong Bắp sú bằng kĩ

thuật in vitro thông qua tái sinh phôi vô tính từ mô sẹo là hướng đi mới đầy tiềm năng

1.4 Tình hình nghiên cứu đặc điểm sinh học, sinh thái và nhân giống rong biển tại Việt Nam

Năm 1993, Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang đã di nhập

rong Kappaphyus về trồng và nhân rộng ra khắp các tỉnh miền Trung và Nam Bộ

Đến nay, cũng có một số nghiên cứu về đặc điểm sinh học và sinh thái Các kết quả nghiên cứu về đặc tính sinh học và trồng thử nghiệm rong Sụn vào các thủy vực ven biển phía Nam cho thấy điều kiện tự nhiên vùng biển phía Nam hoàn toàn phù hợp cho rong Sụn sinh trưởng và phát triển (TĐTT đạt 2 – 3%/ngày trong mùa khô và 6 – 8%/ngày trong mùa mưa, tương đương với các chỉ tiêu tăng trọng của rong Sụn trồng ở Philippines, Indonesia ) Các kết quả phân tích sinh hóa cho thấy chất lượng nguyên liệu rong Sụn, rong Sụn gai và rong Bắp sú (hàm lượng K-carrageenan đạt bình quân từ 24 – 29% trọng lượng rong khô, sức đông của K-carrageenan đạt tiêu chuẩn của thế giới (dung dịch 1,5% trong nước, đo ở nhiệt độ 20°C) đạt từ 600 – 1200 g.cm-2) [14, 135]

Nghiên cứu trong phòng thí nghiệm về hàm lượng NH4+/NH3, NO2- và NO

3-cho thấy rong Sụn có thể thích nghi với môi trường ưu dưỡng và hấp thu các chất này

để phục vụ cho quá trình sinh trưởng [135] Khi nghiên cứu ba dòng rong Sụn đỏ, nâu và xanh, kết quả cho thấy dòng rong nâu thuộc rong Sụn có TĐTT 3,5 – 4,6%/ngày vào mùa mưa (tháng 9 năm trước đến tháng 2 năm sau) và 1,6 – 2,8%/ngày vào mùa khô (từ tháng 3 đến tháng 8) Hàm lượng carrageenan dao động từ 18,8 – 26,4% TĐTT của dòng màu đỏ (3,6 – 4,4%/ngày) và dòng màu xanh (3,7 – 4,2%/ngày) vào mùa mưa (từ tháng 9 năm trước đến tháng 2 năm sau) [136] Rong Bắp sú nuôi ở vịnh Cam Ranh có TĐTT là 4,1 – 5,8%/ngày vào mùa mưa (tháng 9 đến tháng 4) và 2,5 – 3,1%/ngày vào mùa khô (tháng 5 – 8) với hàm lượng carrageenan 25,1 – 28,7% [30]

Năm 2005, Việt Nam đã di trồng rong Bắp sú có nguồn gốc từ Phillipines Từ khi di trồng thành công loài rong Bắp sú đến nay, sinh sản sinh dưỡng là phương pháp duy nhất được sử dụng trong nuôi trồng Những năm đầu mới di nhập, rong có TĐTT cao và có thể trồng quanh năm ở những vực nước có độ mặn ổn định Tuy nhiên, sau gần hai mươi năm nuôi trồng ở Việt Nam, việc sản xuất giống bằng phương pháp sinh sản sinh dưỡng, không có chọn lọc và dưới tác động của điều kiện sinh thái, đã biến đổi về đặc điểm sinh học như TĐTT và hàm lượng cũng như chất lượng K-carrageenan bị suy giảm Đặc biệt, trong những năm gần đây, ảnh hưởng của biến đổi khí hậu làm rong biển rất dễ bị các dịch bệnh bùng phát, dẫn tới năng suất và chất lượng rong cũng giảm một cách đáng kể [120] Hiện nay, chưa có nghiên cứu nào chứng minh sự thoái hóa giống của các dòng rong của loài rong Bắp sú tại Việt Nam

Vì vậy, nghiên cứu này với mục đích đánh giá lại ảnh hưởng của các yếu tố môi trường sinh thái đối với đặc điểm sinh học các dòng thuộc loài rong Bắp sú trong điều kiện sinh thái hiện nay

Bên cạnh đó, nhân giống rong biển ở Việt Nam chủ yếu được thực hiện bằng

phương pháp sinh sản sinh dưỡng và bào tử [137] Một số nghiên cứu giống in vitro

rong Sụn đã được thực hiện Kết quả là những nhánh rong Sụn dài 3 – 5 cm sau khi khử trùng sống và phát triển tốt trong môi trường ESS và PES có bổ sung vitamin hoặc NAA kết hợp với Kin [138–140] Gần đây, viện Nghiên cứu Hải sản đã nghiên

cứu nhân giống thành công rong Sụn bằng phương pháp nuôi cấy in vitro [141–143]

Nguyễn Thị Duyệt và cộng sự [143] cho rằng tác nhân gây nhiễm chủ yếu trong nuôi

cấy in vitro rong Sụn là vi khuẩn Flavobacterium sp., nấm Monilinia sp và rong phụ sinh Polysiphonia Sử dụng Betadin (2 phút) sau đó khử trùng mẫu bằng nước Javen

0,25% trong 5 giây, kết quả chỉ 20,83% mẫu sạch và 41,67% mẫu còn sống sau 40 ngày nuôi cấy [143] Cùng sử dụng chất khử trùng là nước Javen 0,25% trong 5 giây trên đối tượng rong Sụn, nhưng nhóm tác giả Phạm Thị Mát và cộng sự [141] lại có kết quả khử trùng cao đạt 86,67% mẫu sạch, tỉ lệ mẫu sống đạt 100% và tỉ lệ cảm ứng

mô sẹo đạt 96,67% [141] Mẫu rong Sụn cảm ứng mô sẹo với tỉ lệ là 100% ở môi trường PES chứa 15 g.L-1 agar bổ sung 1 mg.L-1 BA được đặt dưới CĐAS 5 μmol

photons.m-2.s-1 Khối mô sẹo được cấy chuyển sang môi trường PES có bổ sung 1 mg.L-1 BAP kết hợp 2,5 mg.L-1 IAA và 8 g.L-1 agar để làm đông môi trường đã cảm ứng phôi vô tính sau 24 – 35 ngày nuôi cấy Những phôi vô tính được chuyển sang môi trường PES lỏng có chứa 1 mg.L-1 BA và 2,5 mg.L-1 IAA, môi trường được lắc liên tục bằng máy lắc trong 10 – 15 ngày thì tạo ra các phôi trưởng thành dày đặc [141] Nhóm tác giả đã tái sinh thành công cây con từ vi mầm trong môi trường PES lỏng và môi trường có bổ sung 1 mg.L-1 phân vô cơ NH4Cl-KH2PO4 hàng ngày

Tóm lại, các phương pháp nuôi cấy in vitro như tái sinh chồi trực tiếp, tái sinh

cây con thông qua mô sẹo, tái sinh cây con bằng tế bào trần hoặc sinh sản bằng bào

tử đều được thử nghiệm và cho kết quả khả quan Tuy nhiên, cho đến nay, nuôi mô rong Sụn từ mô sẹo hoặc tái sinh chồi trực tiếp được thực hiện nhiều hơn và cho kết quả ổn định hơn, với hiệu quả tạo mô sẹo có thể lên tới 100% ở nhiều hình thức phối hợp môi trường nuôi và CĐHSTTV Theo quá trình khảo sát thực nghiệm, hiện nay

ở Việt Nam rong Kappaphycus chỉ sản xuất theo phương pháp truyền thống, giống

được giữ vài tháng sau đó được sử dụng cho mùa vụ tiếp theo, sau 2 – 3 tháng trồng thương phẩm đã có thể thu thoạch, do đó ngoài tự nhiên chưa ghi nhận được trường

hợp nào có bào tử Vì vậy, việc nghiên cứu nhân giống bằng bào tử rong Kappaphycus

tại Việt Nam sẽ gặp khó khăn do không có nguồn vật liệu ban đầu Phương pháp nhân giống tái sinh cây con từ phôi vô tính thông qua mô sẹo có đầy đủ những ưu điểm

của nuôi cấy in vitro, mặt khác nguồn vật liệu dùng để tái sinh dễ dàng thu được ngoài

tự nhiên Ở Việt Nam, đã có nhiều tác giả nghiên cứu về nhân giống vô tính, tuy nhiên kết quả còn hạn chế, chưa đưa ra được quy trình nhân giống, đến thời điểm hiện tại vẫn chưa được ứng dụng vào trong sản xuất thực tiễn Hiện nay, giống rong biển chủ yếu được sản xuất bằng phương pháp sinh sản sinh dưỡng Theo phương pháp này,

chỉ có những nhánh rong có sức sinh trưởng tốt được lựa chọn để nhân giống và đây

là nguyên nhân chính dẫn đến suy giảm nguồn gen, kém sức sống kéo theo sự suy

giảm về năng suất rong thu hoạch Nuôi cấy in vitro rong biển là phương pháp khá

đơn giản nhưng hiệu quả trong việc lưu giữ những nguồn gen quí phục vụ cho việc sản xuất đại trà theo phương pháp truyền thống Quá trình phục hồi và nhân nhanh thành rong non có tác dụng “trẻ hóa” nguồn giống, tăng cường khả năng chống chịu với môi trường Bên cạnh đó, việc kết hợp với các kỹ thuật di truyền như chuyển gen,

lai tạo tế bào trong nuôi cấy in vitro rong biển càng làm tăng nhanh chất lượng rong

giống theo ý muốn Vì vậy, nghiên cứu đặc điểm sinh học và sinh thái rong Bắp sú

để đánh giá so sánh sự phát triển của các dòng rong, từ đó chọn ra dòng có đặc tính

tốt nhất để nhân giống bằng kĩ thuật nuôi cấy in vitro là việc làm cần thiết Kết quả

tạo ra được thế hệ cây con có đặc tính tốt, có khả năng chịu được nhiệt độ cao, kháng bệnh, từ đó nâng cao năng suất nuôi trồng cũng như chất lượng rong

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu

2.1.1 Vật liệu

Những bụi rong 2 – 4 tuần tuổi của dòng rong nâu Payaka và dòng rong nâu

Sacol thuộc loài rong Bắp sú có khối lượng khoảng 400 g, kích thước khoảng 30 –

40 cm, cây khỏe, không bị bệnh, màu nâu nhạt, không trầy xước được thu thập tại

Sũng Ké, vịnh Vân Phong và Mỹ Ca, vịnh Cam Ranh, tỉnh Khánh Hòa

2.1.2 Địa điểm

Các thí nghiệm trong nuôi cấy in vitro được thực hiện tại phòng Vật liệu Hữu

cơ từ Tài nguyên biển, Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang, số 02 Hùng Vương, Nha Trang, Khánh Hòa và phòng Sinh học phân tử và Chọn tạo giống cây trồng, Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên, số 116 Xô Viết Nghệ Tĩnh, Đà Lạt, Lâm Đồng

Quan sát, giải phẫu hình thái mô sẹo và sự phát triển của phôi vô tính được thực hiện tại phòng Sinh vật phù du, Viện Hải dương học, số 02 Cầu Đá, Nha Trang, Khánh Hòa

Thí nghiệm đánh giá sinh trưởng, hàm lượng và chất lượng carrageenan của các dòng rong thuộc loài rong Bắp sú thu thập được ở vịnh Vân Phong và vịnh Cam Ranh được thực hiện tại Vịnh Vân Phong và vịnh Cam Ranh, Khánh Hòa (Hình 2.1) Đây là những địa điểm nuôi trồng rong Bắp sú chính trên địa bàn tỉnh, có quy mô và sản lượng lớn

Thí nghiệm nuôi thích nghi ngoài tự nhiên được thực hiện tại vịnh Vân Phong, Khánh Hòa (Hình 2.1 A)

Vịnh Vân Phong có vị trí địa lí 109°10’– 109°26’ Đông và 120°29’– 120°48’ Bắc, độ sâu gần bờ trung bình từ 1 m đến 7 m Tổng diện tích mặt nước vùng vịnh khoảng 80.000 ha Khu vực này có địa hình phong phú, đặc biệt là hệ thống đảo, bán đảo, vịnh sâu và kín gió Nền đáy là các rạn san hô chết và sỏi lớn

Vịnh Cam Ranh có tọa độ 11°54'4" Bắc 109°9'54" Đông, nền đáy cát sỏi, không có rạn san hô như ở Vân Phong

Hình 2.1 Vị trí bố trí thí nghiệm ở vịnh Vân Phong (A) và vịnh Cam Ranh (B)

2.1.3 Thời gian

Thời gian thực hiện luận án: 11/2016 – 11/2020

Thí nghiệm đánh giá sinh trưởng, hàm lượng và chất lượng carrageenan của các dòng rong thuộc loài rong Bắp sú thu thập được ở vịnh Vân Phong và vịnh Cam Ranh được thực hiện từ tháng 01 đến tháng 04 năm 2017

Các thí nghiệm trong nuôi cấy in vitro được thực hiện từ tháng 4 năm 2017

đến tháng 6 năm 2019

Các thí nghiệm nuôi bán thích nghi được thực hiện từ tháng 7 năm 2019 đến tháng 12 năm 2019

Giai đoạn thích nghi ngoài tự nhiên dòng rong nâu Sacol có nguồn gốc in vitro

được thực hiện từ tháng 10 năm 2019 đến tháng 03 năm 2020

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Đặc điểm sinh học và sinh thái các dòng rong Bắp sú

Hiện trạng các dòng thuộc loài rong Bắp sú đang được nuôi trồng ở vịnh Vân Phong và vịnh Cam Ranh

Đánh giá sinh trưởng, hàm lượng và chất lượng carrageenan của dòng rong nâu

Sacol và nâu Payaka thuộc loài rong Bắp sú ở vịnh Vân Phong và vịnh Cam Ranh

2.2.2 Nhân giống rong Bắp sú bằng phương pháp nuôi cấy in vitro

Tạo nguồn vật liệu

Cảm ứng và nhân nhanh mô sẹo

Sự phát sinh phôi vô tính từ mô sẹo

Khả năng tái sinh cây con và thích nghi điều kiện sống tự nhiên

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Điều kiện nuôi cấy/trồng

2.3.1.1 Điều kiện in vitro

Điều kiện phòng nuôi cấy in vitro của phòng Vật liệu Hữu cơ từ Tài nguyên

biển (Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang); phòng Sinh học phân tử

và Chọn tạo giống cây trồng (Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên): Sử dụng máy điều hòa nhiệt độ để làm mát nhiệt độ trong phòng là 24 ± 2oC, độ ẩm 55 – 60%, thời gian chiếu sáng 12 giờ/ngày với CĐAS 5 – 55 µmol photons.m-2.s-1 dưới ánh sáng trắng đèn huỳnh quang

Các thí nghiệm khử trùng mẫu, cảm ứng mô sẹo được nuôi dưới CĐAS 5 µmol photons.m-2.s-1 (trừ thí nghiệm khảo sát CĐAS)

Các thí nghiệm nhân nhanh mô sẹo và sự phát sinh phôi vô tính được nuôi dưới CĐAS 35 µmol photons.m-2.s-1

Các thí nghiệm tái sinh cây con từ phôi vô tính được nuôi dưới CĐAS 55 µmol photons.m-2.s-1 (trừ thí nghiệm khảo sát CĐAS)

2.3.1.2 Điều kiện ex vitro

Điều kiện bán tự nhiên (phòng thí nghiệm Vật liệu Hữu cơ từ Tài nguyên biển, Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang): Sử dụng máy điều nhiệt để đạt được nhiệt độ trong bể kính là 27 ± 2oC, che bóng râm bằng tôn trong và lưới xanh đen để giảm một nửa CĐAS tự nhiên

Điều kiện tự nhiên (vịnh Vân Phong và vịnh Cam Ranh, tỉnh Khánh Hòa)

Trong thời gian nuôi trồng thích nghi rong có nguồn gốc in vitro ở vịnh Vân Phong,

các yếu tố môi trường như sau: Nhiệt độ (26 – 28oC), pH (8,04 – 8,2) và CĐAS (257 – 525 µmol photons.m-2.s-1)

2.3.2 Nuôi trồng và chăm sóc rong Bắp sú ngoài tự nhiên

Kỹ thuật nuôi trồng và chăm sóc rong Bắp sú ngoài tự nhiên bao gồm các bước chính như sau:

Chọn vùng trồng: Trong kỹ thuật trồng Kappaphycus, việc lựa chọn vùng trồng

có ý nghĩa rất quan trọng trong việc quyết định đến năng suất, chi phí sản xuất, tính

ổn định và hiệu quả kinh tế Rong Bắp sú có thể trồng ở các loại thủy vực khác nhau ven biển ở độ sâu từ 0,5 m đến 10 m Tùy thuộc vào điều kiện tự nhiên nơi trồng mà đưa ra các phương pháp trồng cho thích hợp Rong được nuôi trồng bằng hình thức giàn phao nổi (vịnh Vân Phong) và phương pháp giàn căng cố định (vịnh Cam Ranh)

Chuẩn bị giống: Chọn cây rong khỏe mạnh, không quá già, có màu sắc tươi sáng, không bị đứt gãy hay có dấu hiệu bị thương tổn bề mặt thân rong, có rất nhiều nhánh nhỏ và đỉnh nhánh còn nguyên

Kĩ thuật làm giàn: Đối với phương pháp giàn phao nổi, giàn phao được giữ bằng cách buộc dây chính vào rạn san hô chết hoặc đá lớn dưới đáy Bằng hình thức này, người trồng rong phải tốn thêm chi phí thuê lao động lặn chuyên nghiệp cho việc tạo giàn trồng Đối với phương pháp giàn căng cố định, giàn phao được cố định bằng cách sử dụng cọc cây xung quanh Do địa hình nền đáy cát sỏi có lẫn ít bùn nên không thể cố định giàn căng bằng neo hay bao cát do chi phí cho neo quá lớn Sử dụng lưới rào chắn xung quanh để tránh các loài cá vào ăn rong, gây ảnh hưởng lớn đến sự phát triển bình thường của rong và năng suất trồng

Kĩ thuật chăm sóc: Thường xuyên theo dõi sự phát triển của rong 2 – 3 ngày/lần Người chăm sóc phải gỡ bỏ rong tạp, các loài động vật có vỏ (hàu, ốc), bọt biển hoặc bất kỳ vật liệu trôi dạt mắc kẹt vào rong và giàn rong Rong được vệ sinh thường xuyên để loại bỏ các chất lơ lửng bám vào Bên cạnh đó, những cây rong yếu (bị bệnh trắng nhũn thân, bệnh do phụ sinh) cũng được loại bỏ và thay thế bằng bụi rong khác Công việc chăm sóc này đòi hỏi tính cẩn thận và chuyên cần tránh làm rong bị gãy hay dập thân, gây ảnh hưởng đến sự phát triển bình thường của rong Khi

rong sinh trưởng làm tăng trọng lượng cho giàn trồng, giàn nuôi rong được bổ sung thêm phao gắn vào các góc và dây để đề phòng chìm quá sâu trong nước Cuối cùng, thường xuyên kiểm tra, sửa chữa neo và dây trong khu vực thí nghiệm

ở các giàn trồng rong Bắp sú khác trong khu vực Khảo sát lúc người dân tiến hành nhân giống và thu hoạch rong Bắp sú

Các dòng rong Bắp sú đã thu thập được ở vịnh Vân Phong và vịnh Cam Ranh được phân loại theo phương pháp của Doty [1] thông qua sự khác nhau về các đặc trưng hình thái bên ngoài của rong như: Màu sắc, kích thước của thân rong, nhánh rong, đỉnh nhánh và đặc điểm phân nhánh của cây rong

2.3.3.2 Đánh giá sinh trưởng, hàm lượng và chất lượng carrageenan của các dòng rong

thuộc loài rong Bắp sú thu thập được ở vịnh Vân Phong và vịnh Cam Ranh

Thí nghiệm này được tiến hành nhằm nghiên cứu đặc điểm sinh trưởng, hàm

lượng và chất lượng carrageenan của các dòng rong thuộc loài rong Bắp sú thu thập

được ở vịnh Vân Phong và vịnh Cam Ranh sau gần hai mươi năm di trồng

Những bụi rong khỏe, không trầy xước, màu sắc tươi sáng của hai dòng rong

nâu Sacol và nâu Payaka thuộc loài rong Bắp sú đang được nuôi trồng ở vịnh Vân

Phong và vịnh Cam Ranh được chọn lọc và rửa tại hiện trường nhiều lần Rong được giữ ẩm bằng vải ướt trong thùng xốp và vận chuyển bằng ô tô về phòng thí nghiệm Vật liệu Hữu cơ từ Tài nguyên biển Sau đó, rong được giữ dưới điều kiện bán tự nhiên trong bể kính có thể tích 100 L chứa 80 L nước biển có sục khí, thay nước và rửa rong hàng ngày trong thời gian 2 – 3 ngày Những ngày tiếp theo giãn dần khoảng cách thay nước và lưu giữ 2 tuần trước khi bố trí nghí nghiệm

Sau 2 tuần lưu giữ trong điều kiện bán tự nhiên, rong được đặt vào thùng xốp