NGUYỄN THỊ CHÍ HIẾU VAI TRÒ CỦA ADENYLYL CYCLASE HÒA TAN TRONG SẢN XUẤT cAMP DƯỚI TÁC ĐỘNG KÍCH THÍCH CỦA eCG TRONG TẾ BÀO LEYDIG mLTC-1 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THỰC NGHIỆM Bình Định
Tính cấp thiết của đề tài và lý do chọn đề tài
Adenylate cyclase (EC 4.6.1.1) hay còn gọi là adenylyl cyclase (hoặc adenyl cyclase, AC) là enzyme đóng vai trò quan trọng trong chuỗi truyền tín hiệu từ bên ngoài tế bào vào trong tế bào chất Khi nhận được tín hiệu truyền từ protein G (protein G nhận tín hiệu từ thụ thể), adenylyl cyclase sẽ thực hiện chức năng xúc tác quá trình chuyển hóa adenosine triphosphate (ATP) thành adenosine monophosphate mạch vòng (AMP vòng, cAMP) và pyrophosphate (PPi) Sản phẩm của adenylyl cyclase, AMP vòng, là một mắt xích quan trọng trong quá trình truyền tín hiệu nội bào, được xem như là chất truyền tín hiệu thứ hai trong tế bào Ở động vật, hoạt động AC liên quan đến màng và được mã hóa bởi một họ adenylyl cyclase xuyên màng (AC xuyên màng), làm trung gian cho các phản ứng của tế bào với các kích thích ngoại bào Ở động vật có vú, chín gen
AC xuyên màng riêng biệt khác nhau về kiểu biểu hiện và đặc tính điều hòa của chúng cho đến nay đã được xác định Các AC xuyên màng này được nghiên cứu rộng rãi trong nhiều phòng thí nghiệm Một dạng AC thứ hai ở động vật có vú được mô tả vào năm 1975 và được dự đoán là khác biệt về mặt phân tử với AC xuyên màng, đó là adenylyl cyclase hòa tan (AC hòa tan) Hoạt động của AC hòa tan được cho là phụ thuộc vào mangan và không nhạy với G-protein và forskolin Hoạt động AC hòa tan liên kết với màng bị kích thích bởi bicarbonat Tuy nhiên, bản chất phân tử, quy định sinh hóa và chức năng sinh lý của AC hòa tan vẫn còn không rõ ràng cho đến khi protein AC hòa tan được tinh chế và nhân bản vào năm 1999 Các lĩnh vực xúc tác của
AC hòa tan có liên quan đến AC cảm nhận bicarbonat từ vi khuẩn lam cho thấy sự bảo tồn chức năng của các cyclase này như cảm biến bicarbonat trong suốt quá trình tiến hóa [1-2]
Chín AC xuyên màng và một AC hòa tan được biểu hiện theo tỷ lệ khác nhau trong tế bào động vật có vú, và nhiều tế bào biểu hiện cả hai loại AC Do đó, để hiểu đầy đủ về quy định của các con đường tín hiệu cAMP, điều cần thiết là phải phân biệt những đóng góp tương đối của AC hòa tan và AC xuyên màng
Sử dụng phương pháp di truyền, vai trò sinh lý của AC hòa tan đã được xác định thông qua hai dòng chuột loại trực tiếp gen AC hòa tan (ký hiệu là chuột KO) [3-5] và loại bỏ AC hòa tan - siRNA đặc hiệu [6] Nó cũng có thể được phân biệt bằng cách sử dụng các chất ức chế AC hòa tan dược lý như các dẫn xuất catechol của estrogen (CE) và KH7 CE ức chế AC hòa tan bằng cách liên kết với một khe hở kỵ nước và bề mặt kim loại chelat hóa đồng CE đã được sử dụng để hiểu vai trò của AC hòa tan trong các quá trình phụ thuộc cAMP, nhưng chúng không hữu ích để làm như vậy vì chúng cũng có thể ức chế ACs xuyên màng KH7 đã được xác định trong màn hình phân tử chống lại protein AC hòa tan tinh khiết Đặc hiệu hơn cho AC hòa tan so với AC xuyên màng, nó là thuốc thử thường được sử dụng nhất để xác định các chức năng báo hiệu cAMP do AC hòa tan làm trung gian Cơ chế hoạt động của KH7 vẫn chưa được biết, nhưng người ta đã xác định được rằng nó sở hữu các tác động tế bào không đặc hiệu (ngoài mục tiêu) LRE1 là chất ức chế AC hòa tan cụ thể nhất, hoạt động bằng cách chiếm vị trí liên kết của chất hoạt hóa sinh lý HCO3
− mà không có độc tính [7]
Tế bào mLTC-1 (tế bào khối u Leydig của chuột-1) có nguồn gốc từ khối u tế bào Leydig tự phát và được chọn lọc vào năm 1982 với mục đích thu được mô hình tế bào Leydig với phản ứng nội tiết tố được duy trì Tế bào
Leydig trong tinh hoàn là nguồn chính của testosterone ở các loài động vật có vú Sự tổng hợp bài tiết của steroid này chủ yếu được kiểm soát bởi các hormone điều hòa tuyến sinh dục được tiết ra từ thùy trước tuyến yên Chúng ta biết rằng tế bào tinh hoàn Leydig có một lượng thụ thể khá thấp, và một con số cao hơn nhiều chắc chắn sẽ ảnh hưởng đến phương thức kích hoạt con đường cAMP bởi các hormone có hoạt động LH khác nhau và phương thức có thể được điều khiển bởi các con đường khác Do đó, trong nghiên cứu này, chúng tôi đặc biệt quan tâm đến tác dụng của một số chất ức chế AC hòa tan và AC xuyên màng để có thêm thông tin chính xác về vai trò của AC hòa tan trong phản ứng của tế bào Leydig mLTC-1 với eCG.
Mục tiêu nghiên cứu của đề tài
Mục tiêu của đề tài là đánh giá vai trò của adenylyl cyclase hòa tan trong sản xuất cAMP dưới tác động kích thích của eCG trong tế bào Leydig mLTC-
Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
Kết quả nghiên cứu sẽ đóng góp bằng chứng về vai trò của AC hòa tan trong phản ứng tổng hợp cAMP nội bào và sản xuất progesterone trong tế bào Leydig
Những kết quả này cũng sẽ cung cấp những hiểu biết sâu sắc hơn về cơ chế hoạt động của enzyme adenylyl cyclase trong chuỗi truyền tín hiệu từ bên ngoài tế bào vào trong tế bào chất.
Cấu trúc luận văn
- Chương 1 Tổng quan tài liệu
- Chương 2 Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu
- Chương 3 Kết quả nghiên cứu và thảo luận
- Kết luận và kiến nghị
Những đóng góp mới của đề tài
Kết hợp với nghiên cứu trước đây về vai trò của AC hòa tan trên những dòng tế bào testis và trong tinh trùng, đề tài đã cung cấp những kết quả nghiên cứu đầu tiên về vai trò của AC hòa tan trên dòng tế bào Leydig, đề tài đã cho thấy vai trò của AC hòa tan trong phản ứng tổng hợp cAMP nội bào và progesterone dưới tác động kích thích của eCG Điều này cho thấy AC hòa tan cũng tham gia trực tiếp vào hoạt động truyền tín hiệu của tế bào có liên quan đến chất truyền tin thứ hai là cAMP và nội tiết tố trong cơ thể.
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Adenylyl cyclase
Adenylyl cyclases (AC) là enzyme duy nhất tham gia tổng hợp AMP vòng (cAMP), một chất truyền tin thứ hai quan trọng điều chỉnh các phản ứng sinh lý đa dạng trong tế bào bao gồm chuyển hóa đường và lipid, tăng trưởng và biệt hóa tế bào Adenylyl cyclases rất quan trọng ở cả sinh vật nhân chuẩn và sinh vật nhân sơ, nơi chúng tạo ra cAMP cần thiết cho nhiều chức năng của tế bào Là enzyme quan trọng trong con đường cAMP được bảo tồn tiến hóa cao, AC kiểm soát sinh lý của tế bào, mô, cơ quan và sinh vật về sức khỏe và bệnh tật [8] Cơ chế điều hòa chức năng tế bào của AC thông qua protein
G và calmodulin đã được nghiên cứu rất nhiều trong những năm qua, tuy nhiên các phương pháp mới để nghiên cứu sâu hơn về hoạt động và vai trò của AC vẫn đang được tìm kiếm Gần đây, các dẫn xuất của forskolin, nucleoside và chất ức chế vị trí P đã được phát triển cho thấy tính đặc hiệu đồng dạng đầy hứa hẹn và cho thấy tiềm năng điều trị mạnh mẽ Thật vậy, vẫn còn nhiều điều cần tìm hiểu về hoạt động của AC khi các cơ quan điều tiết và vai trò sinh lý mới xuất hiện, và tiềm năng nhắm mục tiêu các đồng dạng AC cụ thể về mặt trị liệu sẽ định hướng cho các nghiên cứu trong tương lai Sự hiểu biết toàn diện về vai trò cụ thể của AC trong quá trình sống đòi hỏi sự hiểu biết sâu sắc về cấu trúc và cơ chế hoạt động của các enzyme này
1.1.1 Cấu trúc của Adenylate cyclase
Các AC tồn tại trong cơ thể sống hiện nay bao gồm sáu lớp riêng biệt (lớp I – VI) Sáu lớp có mặt ở cả sinh vật nhân sơ và sinh vật nhân chuẩn, nhưng bộ gen của động vật có vú chỉ mã hóa AC lớp III Mặc dù có sự khác biệt sâu sắc về cấu trúc và tổ chức miền, sáu lớp AC này đều có chức năng rất giống nhau, xúc tác chuyển đổi ATP thành cAMP [9] Ở động vật có vú, AC được mã hóa chủ yếu là AC lớp III, với chín đồng dạng tích hợp màng tham gia vào con đường tín hiệu qua trung gian GPCR và protein G (AC1-9), và một AC hòa tan (AC10 hoặc AC hòa tan) không liên kết trực tiếp với tín hiệu GPCR Vùng được bảo tồn nhiều nhất của các enzyme này là vùng xúc tác loại III Cấu trúc domain của AC1 – AC9 tương đối giống nhau Hai domain lớn nằm trong bào tương là C1 và C2 có chứa vùng xúc tác, tạo thành cấu trúc dị thể dimer và đồng tác dụng với nhau để chuyển ATP thành cAMP [10] AC hòa tan không nhạy cảm với protein G và không bị kích thích bởi forskolin như AC xuyên màng, thay vào đó AC hòa tan được kích thích trực tiếp bởi bicarbonate [10] a) Cấu trúc Adenylate cyclase xuyên màng
Các AC xuyên màng có sự giống nhau về cấu trúc (Hình 1.1): 12 miền xuyên màng (TM), và 2 miền xoắn liên kết TM6 và TM12 với miền xúc tác 1 và 2 (tương ứng là C1a và C2a) Các miền C1b và C2b ít được bảo tồn hơn và được dự đoán là sẽ đóng một vai trò đặc hiệu đồng dạng trong việc điều hòa hoạt động hoặc tập hợp các AC và các phức hợp của chúng Một phần (C1) nằm giữa hai 2 vùng kị nước và phần còn lại (C2) nằm ở đầu tận cùng carboxyl của chuỗi protein Vai trò của vùng TM trong AC màng, ngoài việc neo và vận chuyển màng hoặc sự oligome hóa của các enzyme này, hiện vẫn chưa rõ ràng [9]
Hình 1.1 Cấu trúc adenylate cyclase màng b) Cấu trúc Adenylate cyclase hòa tan
Adenylyl cyclase hòa tan và Adenylyl cyclase màng là các protein đơn phân và xúc tác sản xuất cAMP thông qua quá trình đồng phân hóa hai miền xúc tác của chúng Chúng có chung tính chất tương đồng của hai miền xúc tác, nhưng AC hòa tan thiếu hai miền kỵ nước, mỗi miền đại diện cho 6 vòng xoắn trải dài qua màng định vị AC xuyên màng trên màng tế bào [11] (Hình 1.2)
Hình 1.2 Cấu trúc domain của adenylate cyclase
Gần đây, cấu trúc tinh thể của các miền xúc tác của AC hòa tan đã được nghiên cứu nhiều hơn Các đơn vị xúc tác trên ACs ở người tiết lộ cấu trúc thứ cấp tương tự như cấu trúc của vi khuẩn lam nhưng có sự khác biệt ở một số vòng bên ngoài AC hòa tan của vi khuẩn lam có hai vị trí liên kết nucleotide hoàn toàn giống nhau nhưng chỉ một trong những vị trí này có thể tiếp cận được ATP như dạng ở người Điều thú vị là có một chuỗi 3 gốc proline liên tiếp giữa C1 và C2 (220 - 222) cục bộ liên quan đến một miếng dán kỵ nước [12] Các cấu trúc này đã được mô tả là các vị trí liên kết protein tiềm năng Chúng cung cấp khả năng về một vùng tương tác cho các protein hoặc các vùng AC hòa tan khác, có thể cho phép đồng phân hóa các dạng nối
AC hòa tan chỉ chứa một đơn vị xúc tác [12] Trái ngược với các loài động vật có vú khác như chó, ở người có một gen AC hòa tan duy nhất Bằng cách nối thay thế, một số đồng dạng AC hòa tan được tạo ra và một vị trí bắt đầu thay thế bổ sung gần đây đã được mô tả, cho thấy sự đa dạng về đồng dạng đáng kể AC hòa tan có chiều dài đầy đủ (AC hòa tan fl) bao gồm đầu tận cùng N với hai miền xúc tác (∼1.100 axit amin kéo dài 33 exon) Loại bỏ exon 12 tạo ra một dạng đồng phân cắt ngắn, AC hòa tan t (axit amin 1– 490), chỉ chứa hai vùng xúc tác AC hòa tan (Hình 1.3) [12]
Hình 1.3 Cấu trúc tinh thể của enzyme Adenylate cyclase hòa tan ở người
1.1.2 Hoạt động của Adenylate cyclase
Sự tác động của nhiều hormone và chất dẫn truyền xung thần kinh lên các tế bào đích bằng cách liên kết các thụ thể với protein G, kích thích sự hoạt động của adenylyl cylclase (AC), lúc này AC sẽ thực hiện chức năng chuyển hóa tổng hợp cyclic adenosine monophosphate (AMP vòng, cAMP) và pyrophosphate (PPi) từ adenosine triphosphate (ATP) Sản phẩm của AC, cAMP, là một mắt xích quan trọng trong quá trình truyền tín hiệu nội bào, được xem như là chất truyền tín hiệu thứ hai trong tế bào [8], [13]
Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến sự hoạt động của AC, trong đó chủ yếu là các protein G, Forskolin và ion Ca 2+ Có hai nhóm protein G chính tác động lên AC: protein G kích thích (stimulatory G protein – Gαs) có chức năng hoạt hóa AC và protein G ức chế (inhibitory G protein – Gαi) có chức năng bất hoạt enzyme này [13]
Hình 1.4 Phản ứng chuyển đổi ATP thành cAMP
Adenylyl cyclases màng có thể được điều tiết bởi các loại protein và ion khác nhau Về mặt cổ điển, adenylyl cyclases đã được bao gồm trong bối cảnh của tín hiệu thụ thể kết hợp với protein G (GPCR) Khi kích hoạt GPCR, sự trao đổi guanosine diphosphate (GDP) bởi guanosine triphosphate (GTP) trong tiểu đơn vị Gα cùng với thụ thể được cảm ứng Sự trao đổi này dẫn đến việc kích hoạt bộ ba protein G bao gồm các tiểu đơn vị α, β và γ Các GPCR kết hợp với các protein Gαs kích thích sẽ kích hoạt các adenylyl cyclases và các GPCR kết hợp với các protein Gα i ức chế sẽ ức chế các adenylyl cyclases
[13] Mặc dù đúng một phần nhưng cách biểu diễn cổ điển này của adenylyl cyclase không nhận ra các thuộc tính điều chỉnh duy nhất của các đồng dạng adenylyl cyclase riêng lẻ
Trong khi tất cả các đồng dạng adenylyl cyclase của màng đều được kích hoạt bởi Gα, chỉ AC1, AC5, AC6 và AC9 được báo cáo là bị ức chế bởi
Gαi, mặc dù sự ức chế AC9 dường như là gián tiếp [14] Hơn nữa, các tiểu đơn vị Gβ γ cũng có thể điều chỉnh hoạt động của adenylyl cyclase, kích thích AC2, AC4, AC5, AC6, AC7 và ức chế AC1, AC3, AC8 Một yếu tố khác được xem xét là tính đa dạng cao của protein G, ví dụ, có 4 họ chính của đơn vị protein Gα với nhiều đồng dạng trong mỗi họ, dẫn đến tổng cộng 16 đồng dạng Gα khác nhau, ngoài ra còn có 5 đồng dạng Gβ khác nhau và 13 đồng dạng Gγ khác nhau [15] Tính đa dạng này tạo cơ hội cho việc điều tiết chọn lọc các tác nhân tác động xuôi dòng riêng lẻ, bao gồm các đồng dạng adenylyl cyclase Hơn nữa, khía cạnh thời gian cũng được xem xét để điều tiết protein
G của adenylyl cyclase, đặc biệt là đối với protein Gαi Các thụ thể kết hợp với Gαi thường ức chế hoạt động của adenylyl cyclase một cách sâu sắc, sự hoạt hóa của các thụ thể này gây ức chế việc sản xuất cAMP Sự ức chế việc sản xuất cAMP đã được chứng minh đối với các đồng dạng khác nhau của
AC như AC1, AC3, AC5, AC6, AC8 và AC9 khi thụ thể kết hợp Gα i Cơ chế này có liên quan đến một số tác dụng phụ của thuốc do điều trị một số bệnh mãn tính, chẳng hạn như việc sử dụng thuốc giảm đau thuộc nhóm opioid, là nhóm các chất tự nhiên và tổng hợp, có các tính chất như morphine Sự điều tiết mạnh mẽ của adenylyl cyclases bởi GPCRs cũng cho thấy tầm quan trọng lớn đối với cAMP trong sinh lý học GPCR có vai trò về cơ bản trong tất cả các quá trình sinh lý của con người và được nhắm mục tiêu trực tiếp bởi hơn một phần ba tất cả các loại thuốc được Cơ quan Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm (FDA) phê duyệt Mặc dù không phải tất cả các con đường xuôi dòng của GPCR đều ảnh hưởng đến hoạt động của adenylyl cyclase, việc điều chế sản xuất cAMP có tầm quan trọng lớn đối với nhiều chức năng của GPCR
Cyclic adenosine monophosphat (cAMP) và cơ chế hình thành
1.2.1 cAMP - chất truyền tin thứ hai trong tế bào
Cyclic adenosine monophosphate (cAMP, AMP vòng hoặc 3'-5'-cyclic adenosine monophosphate) (Hình 1.6) là một nucleotide hoạt động như một chất truyền tin quan trọng thứ hai trong nhiều con đường dẫn truyền tín hiệu cAMP điều chỉnh các chức năng khác nhau của tế bào, bao gồm tăng trưởng và biệt hóa tế bào, phiên mã gen và biểu hiện protein [17] Vào những năm
1950, Earl W Sutherland cùng với cộng sự đã phát hiện ra rằng epinephrine đã kích hoạt sự tổng hợp cAMP
Hình 1.6 Mô hình cấu trúc phân tử của cAMP
Thụ thể liên kết với protein G (GPCRs)
GPCRs là một họ protein lớn bao hàm những thụ thể xuyên màng cảm nhận các phân tử bên ngoài tế bào và kích hoạt các con đường dẫn truyền tín hiệu bên trong và cuối cùng là các phản ứng của tế bào Các thụ thể kết hợp với G-protein chỉ được tìm thấy ở các sinh vật nhân chuẩn, bao gồm cả nấm men, thực vật, trùng roi dạng phễu và động vật Các thụ thể kết hợp với protein G
(GPCRs) có liên quan tới nhiều bệnh tật và cũng là mục tiêu của một nửa số thuốc dược phẩm hiện nay [13]
Sự hình thành cAMP cAMP có thể được tạo thành từ sự kích thích của rất nhiều tác chất khác nhau, mà thông thường là neurotransmitter và hormones Tất cả các chất kích thích đều tác động thông qua hệ thống GPCRs, có vai trò hoạt hóa hay ức chế enzyme adenylyl cyclase (AC) Trong trường hợp hoạt hóa AC, guanine nucleotide exchange factor (GEF) sẽ thay thế GDP bằng GTP tại tiểu đơn vị α, rồi phân ly tiểu đơn vị này khỏi phức hợp βγ, và tiểu đơn vị Gα s GTP sẽ hoạt hóa AC (ngược lại, Gαi.GTP sẽ ức chế AC) Sau đó, GTPase trên tiểu đơn vị α sẽ thủy phân GTP thành GDP, protein được tái cấu trúc và quá trình hoạt hóa AC kết thúc (Hình 1.7) [13]
Hình 1.7 Sơ đồ minh họa quá trình hình thành cAMP
Có 2 cách ngắt phản ứng của cAMP, cụ thể:
- Sự thủy phân cAMP thành AMP dưới tác dụng của enzyme phosphodiesterase (PDE)
- cAMP được đưa ra khỏi tế bào bằng ABC C4, một loại ATP – binding cassette (ABC)
1.2.4 Con đường truyền tín hiệu cAMP
Lộ trình tín hiệu cAMP cAMP là một chất truyền tin thứ hai hiện diện ở tất cả các cơ quan trong cơ thể và tham gia vào vô số các quá trình điều hòa của tế bào Sự hình thành cAMP thường phụ thuộc vào sự hoạt hóa protein G (G-protein coupled receptors – GPCRs)
Protein G là một dị trimer hóa protein, bao gồm một họ protein được phân loại dựa vào cách nó liên kết với màng tế bào và cơ chế hoạt hóa nó Họ protein này giúp hoạt hóa enzyme adenylyl cyclase (AC) Có một vài chất tác hiệu tín hiệu cAMP (cAMP signalling effectors) như protein kinase A (PKA), exchange proteins activated by cyclic AMP (EPACs) có khả năng hoạt hóa GTP-binding protein Rap1 và cyclic nucleotide gated channels (CNGCs) Các chất tác hiệu này sau đó biến thông tin chức năng của cAMP thành các đáp ứng, như sự chuyển hóa năng lượng, sự phiên mã gene và hoạt động của các kênh ion Trong nhiều trường hợp, những chức năng này được điều biến (modulation), cAMP sẽ hoạt động như một chất thiết lập hoạt động của các lộ trình tín hiệu khác và do vậy nó đóng vai trò trung tâm trong sự chồng lấp (cross-talk) giữa các lộ trình tín hiệu với nhau Chức năng điều biến này cũng thể hiện rõ ở các chuỗi tín hiệu của Ca 2+ trong cả tế bào thần kinh và tế bào cơ Nhiều hoạt động của cAMP phụ thuộc vào vị trí chính xác của PKA, liên quan tới cả các chất tác hiệu ngược dòng (upstream) và xuôi dòng (downstream) Một họ A-kinase-anchoring protein (AKAPs) quyết định sự định cư trong tế bào của PKA cũng như là số lượng thành phần của lộ trình tín hiệu Các phản ứng OFF – ngắt tín hiệu có vai trò giảm cAMP thông qua quá trình thủy phân cAMP hoặc đưa cAMP ra ngoài tế bào [13] cAMP được hình thành từ hệ thống AC xuyên màng và AC hòa tan nhạy cảm bicarbonate Sự hình thành được điều hòa cả bởi các agonists hoạt hóa hoạt động thông qua tiểu đơn vị αs và cả agonist bất hoạt αi hay tiểu đơn vị βγ Nồng độ cAMP gia tăng nhanh chóng và thực hiện chức năng thông qua ba hệ thống tác hiệu khác nhau Trong đó, chức năng chính của cAMP là hoạt hóa PKA để phosphoryl hóa một lượng lớn các yếu tố trung gian thuận chiều Một vài quá trình dẫn đến sự phiên mã gene thông qua hoạt động của cAMP respone element-binding protein (CREB) và hoạt hóa các kênh ion (như thụ thể AMPA và CFTR) Các yếu tố trung gian thuận chiều khác cũng có thể là cGMP phosphodiesterase (cGMP PDE), phospholamban (PLN) điều khiển sarco/endo-plasmic reticulum Ca 2+ -ATPase (SERCA), thụ thể ryanodine (RYR) và kênh Ca 2+ Ca V 1.1 and Ca V 1.2 [13]
Hình 1.8 Lộ trình tín hiệu cAMP
Quá trình tín hiệu cAMP điều khiển một lượng lớn các quá trình nội bào như [9], [13]:
cAMP có hoạt tính kháng viêm mạnh bởi sự ức chế hoạt động của macrophages và dưỡng bào (mast cell)
Thụ thể melanocortin 4 (MC4Rs) trên neuron thứ hai (second-order) sử dụng lộ trình tín hiệu cAMP để tổng hợp lên các yếu tố phiên mã hạ đồi (hypothylamic transcription factor) single-minded 1 (Sim1) làm giảm lượng thức ăn đưa vào cơ thể và gây giảm cân
cAMP có vai trò trung gian đối với các hormone ưa lipid trong tế bào mỡ vàng bằng cách hoạt hóa lipase nhạy cảm hormone (hormone-sensitive lipase)
Sự sinh nhiệt của tế bào mỡ nâu được điều hòa bởi hoạt động của noradrenaline qua hoạt động của cAMP
Sự hoạt hóa của DARPP-32 cùng phối hợp với hoạt động của lộ trình tín hiệu của dopamine và glutamate trong neuron tủy trung gian (medium spiny neurons)
Sự phân hủy glycogen cảm ứng adrenaline (adrenaline-induced glycogenolysis) trong tế bào cơ bám xương phụ thuộc vào sự phosphoryl hóa phụ thuộc cAMP của phosphorylase kinase
Sự hoạt hóa của các yếu tố phiên mã phụ thuộc AMP (CREB) góp phần điều hòa sự tổng hợp glucagon trong tế bào α tụy.
Tế bào Leydig mLTC-1
Dòng tế bào Leydig mLTC-1 từ chuột đã được thiết lập từ nhiều năm trước từ mô khối u Leydig có kí hiệu là M548OP thuộc Viện Nghiên cứu Ung thư Papanicolaou của Mỹ [18] Sau nhiều lần cấy ghép liên tiếp ở chuột đực có kí hiệu là C57B1/6J, mô khối u sẽ được tách ra khỏi cơ thể chuột và được đông lạnh trong môi trường 199 (Gibco) chứa 20% huyết thanh và 10% glycerol và được bảo quản trong nitơ lỏng Đây là dòng tế bào đã được rất nhiều nhà nghiên cứu quan tâm nghiên cứu về sự liên kết giữa hCG với các thụ thể LHR và sự sản sinh steroid hormone dưới sự kiểm soát của những hormone điều hòa tuyến sinh dục do thùy trước tuyến yên tiết ra Chúng ta biết rằng tế bào tinh hoàn Leydig có một lượng thụ thể khá thấp, và một con số cao hơn nhiều chắc chắn sẽ ảnh hưởng đến phương thức kích hoạt con đường cAMP bởi các hormone có hoạt động LH khác nhau và phương thức có thể được điều khiển bởi các con đường khác [18]
Sự hiểu biết hiện tại về chức năng của tế bào Leydig và sự điều hòa của nó đã được thực hiện nhờ sự phát triển của các phương pháp thực nghiệm mà qua đó, tế bào Leydig có thể được kiểm tra cả in vivo và in vitro, cũng như thông qua việc sử dụng các dòng tế bào Hormone tạo hoàng thể (LH) do tuyến yên tiết ra để đáp ứng với hormone giải phóng gonadotropin (GnRH) từ vùng dưới đồi, bắt đầu hình thành steroid bằng cách liên kết với thụ thể LH của tế bào Leydig (LHR), thông qua kết hợp với protein G, kích thích tế bào Leydig hoạt động theo chu kỳ sản xuất adenosine 3', 5'-monophosphate (cAMP) Đến lượt mình, AMP vòng (cAMP) kích thích sự chuyển vị cholesterol từ các nguồn nội bào vào ty thể, bước quyết định tốc độ hình thành steroid Tiếp theo là sự hình thành pregnenolone từ cholesterol trong ty thể, và sau đó chuyển hóa thành testosterone nhờ các enzyme của lưới nội chất trơn Suy giảm sản xuất testosterone xảy ra khi lão hóa và các tình trạng khác, dẫn đến giảm nồng độ testosterone trong huyết thanh (thiểu năng sinh dục) và kèm theo những thay đổi về trao đổi chất và chất lượng cuộc sống Liệu pháp thay thế testosterone (TRT) có sẵn và được sử dụng rộng rãi để nâng cao nồng độ testosterone trong huyết thanh ở nam giới suy giảm chức năng sinh dục Kiến thức về các cơ chế liên quan đến sự hình thành testosterone cũng giúp chúng ta có thể hình dung được việc sử dụng các phương tiện dược lý để tăng testosterone trong huyết thanh (và trong tế bào) bằng cách kích thích chính các tế bào Leydig [19]
Hình 1.9 Tế bào Leydig mLTC-1
Hiện nay, có rất nhiều nghiên cứu khám phá về các hormone và enzyme liên quan đến quá trình sinh tổng hợp testosterone trong các tế bào Leydig Testosterone của tinh hoàn được sản xuất ở vùng dưới đồi của tuyến yên GnRH liên kết với các thụ thể màng trên tế bào sinh dục và kích thích sinh tổng hợp và bài tiết LH LH gắn LHR trên bề mặt của tế bào Leydig và kích thích các dòng tín hiệu nội bào Dufau và Catt đã chứng minh rằng phản ứng của thụ thể màng Leydig với LH sẽ kích thích hoạt động của adenylyl cyclase tạo ra cAMP và kích hoạt protein kinase PKA Con đường cAMP, thông qua protein kinase A (PKA), có tầm quan trọng thiết yếu trong việc hình thành steroid nhờ kích thích của nó đối với sự chuyển vị của cholesterol đến màng ngoài ti thể Cholesterol có thể được tổng hợp từ axetat và được lưu trữ trong các giọt lipid, hoặc nó có thể đến từ màng tế bào Leydig bao gồm cả màng sinh chất Cơ chế điều hòa của quá trình sinh steroid là do LH (hoặc gonadotropin màng đệm ở người, hCG), liên kết với thụ thể liên kết với protein G và kích hoạt adenylate cyclase, dẫn đến sản xuất cAMP và sau đó kích hoạt protein kinase phụ thuộc cAMP Điều này dẫn đến việc bắt đầu giải phóng cholesterol từ các giọt lipid hoặc từ màng sinh chất Sau đó, cholesterol được chuyển từ bên ngoài vào bên trong màng ti thể, nơi nó được chuyển thành pregnenolone bởi enzyme CYP11A Ngoài ra, sự kích thích của tế bào Leydig bởi LH và cAMP là điều cần thiết để điều chỉnh mức độ biểu hiện của các protein và enzyme liên quan đến sự hình thành steroid, và do đó đối với sự điều hòa dinh dưỡng của sự hình thành steroid, chịu trách nhiệm sản xuất bền vững steroid trong một thời gian dài
Năm 1975, Cooke và cộng sự chỉ ra rằng sự ức chế tổng hợp protein ảnh hưởng đến quá trình sản xuất steroid do LH của tế bào Leydig Bốn năm sau, phòng thí nghiệm Cooke đề xuất rằng LH ảnh hưởng đến sự ổn định của một protein điều hòa liên quan đến sự hình thành steroid, việc xác định nó vẫn chưa được biết đến Cuối cùng, vào năm 1991, Orme-Johnson và các đồng nghiệp đã mô tả một phosphoprotein 30kDa do LH gây ra trong các tế bào sinh steroid, bao gồm cả tế bào Leydig của chuột, mức độ này tăng lên song song với việc sản xuất steroid Protein được tìm thấy là khu trú trong ti thể và sau đó được chứng minh là kết quả của sự phân cắt của một protein tiền thân 37kDa Protein đã được nhân bản và được đặt tên là protein điều hòa cấp tính steroidogenic (StAR) Các nghiên cứu chi tiết đã chứng minh rằng StAR hoạt động tại ti thể để kích hoạt sự di chuyển của cholesterol qua màng Quá trình phosphoryl hóa StAR phụ thuộc PKA được chứng minh là rất quan trọng đối với chức năng của nó Sự cảm ứng nhanh chóng của sự hình thành StAR bởi
LH và quá trình xử lý và mục tiêu của nó ở màng ngoài ty thể làm tăng sự hình thành testosterone
Tầm quan trọng của StAR được thể hiện rõ ràng khi quan sát thấy các đột biến của gen StAR dẫn đến sự thiếu hụt nghiêm trọng mineralocorticoid và, nhất quán với điều này, có những khiếm khuyết nghiêm trọng trong steroid tuyến thượng thận được thấy ở chuột loại bỏ gen StAR Chuyển gen
StAR được tìm thấy để khôi phục chức năng sinh steroid cho chuột Hormone gonadotropin ở chuột loại trực tiếp không khác biệt đáng kể so với nồng độ có ở những con giống hoang dã Điều này cho thấy rằng mặc dù việc sản xuất steroid tuyến thượng thận bị giảm đáng kể ở chuột loại bỏ gen StAR, những con chuột này vẫn giữ được khả năng sinh tổng hợp androgen của chúng Tuy nhiên, những con chuột bị thiếu StAR được báo cáo có biểu hiện cơ quan sinh dục ngoài giống con cái, cho thấy tác động có thể có của StAR đối với việc sản xuất androgen của tinh hoàn thai nhi [19].
ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên vật liệu, thiết bị hóa chất và đối tượng nghiên cứu
Vai trò của adenylyl cyclase hòa tan trong sản xuất cAMP dưới tác động kích thích của eCG trong tế bào Leydig mLTC-1
2.1.2 Vật liệu sử dụng trong nghiên cứu
Dòng tế bào Leydig chuột có ký hiệu là mLTC-1 (mouse Leydig tumor cells) được cung cấp từ nhóm nghiên cứu “Gonadotropines” của Giáo sư Yves Combarnous thuộc Viện nghiên cứu nông nghiệp quốc gia Pháp và đang được lưu trữ tại Viện Hệ Gen Người thuộc Viện Hàn Lâm Khoa Học Việt Nam
Hormone eCG chuỗi đơn tái tổ hợp được sản xuất từ dòng tế bào HEK 293 tại Học viện quân y Hà Nội
Tất cả các hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu này được mua từ Sigma Aldrich (Trung Quốc) trừ khi có ghi chú khác, pGlosentorTM-22F plasmid và CellTiter-Blue Cell (G8080) từ Promega (Pháp), X- tremeGENETM-HP-DNA đến từ Roche (Pháp)
Cân phân tích (Mettler Toledo), máy nanodrop (Thermo scientific), máy nghiền đồng thể (Ati instruments), máy lắc (IKA), máy ly tâm (Biofuge Fresco Heraeus), cassette 18 x 24, tủ lạnh 4°C (Toshiba), tủ lạnh -80°C (Sanyo), tủ pha hóa chất, micropipet, máy hút hóa chất lỏng, máy đo huỳnh quang, máy đo quang phổ Spectra Gemini, máy đọc ELISA, kính hiển vi huỳnh quang, tủ ấm, tủ nuôi cấy tế bào
2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu
- Địa điểm: Tại phòng thí nghiệm Học viện Quân y, Hà Nội
Nội dung nghiên cứu
2.3.1 Xác định vị trí của AC hòa tan trong tế bào mLTC-1
2.3.2 Đánh giá nồng độ cAMP nội bào dưới kích thích của eCG trong tế bào mLTC-1 khi ức chế hoạt động của AC hòa tan
2.3.3 Đánh giá ảnh hưởng của KH7, 2-CE và 4-CE đến khả năng sống của mLTC-1 và nồng độ ATP trong tế bào
2.3.4 Xác định sự liên kết giữa AC xuyên màng và AC hòa tan trong phản ứng tổng hợp cAMP dưới kích thích của eCG
2.3.5 Đánh giá sự hình thành steroid do eCG trong tế bào mLTC-1 và tế bào Leydig tinh hoàn khi ức chế hoạt động của AC hòa tan.
Phương pháp nghiên cứu
2.4.1 Phương pháp nuôi cấy tế bào mLTC-1
Tế bào mLTC-1 nuôi cấy sau khi được rã đông từ nitơ lỏng (-196°C) sẽ được nuôi cấy trong hộp nhựa 25cm 2 trong môi trường RPMI 1640 có bổ sung huyết thanh bò 1 tuần trước khi cấy truyền vào các giếng trên một đĩa nuôi cấy 96 lỗ, sau đó mang ủ ở 37°C với 5% CO 2 trong vòng 48 tiếng Trong quá trình nuôi cấy lần một trong hộp nhựa, chúng ta cần thay môi trường sau
3 ngày và trong lần cấy truyền lần hai trong đĩa 96 lỗ thì thay môi trường sau
2.4.2 Đánh giá khả năng sống của tế bào
Các tế bào mLTC-1 được tra vào đĩa nuôi cấy gồm 96 giếng với số lượng khoảng 100.000 tế bào/giếng Sau 48 giờ nuôi cấy ở nhiệt độ 37°C, môi trường được thay thế bằng môi trường không có huyết thanh và có bổ sung KH7, 2-CE, 4-CE (0 – 100μM) Đĩa tế bào được ủ thêm 1 giờ ở nhiệt độ 37°C trước khi thêm 20μl CellTiter-Blue Reagent vào mỗi giếng Sau đó ủ thêm 2 giờ ở 37°C để chất huỳnh quang thấm vào tế bào, những thay đổi trong huỳnh quang sau đó sẽ được ghi lại bằng máy đo quang phổ Spectra Gemini (Thiết bị phân tử, Sunnyvale, CA) ở bước sóng kích thích 560nm và bước sóng phát xạ là 640nm Tín hiệu huỳnh quang từ thuốc thử CellTiter-Blue tỷ lệ thuận với số lượng tế bào sống sót
2.4.3 Phương pháp xác định nồng độ cAMP
Tế bào mLTC-1 được transfected với Glosensor-TM-22F cyclic AMP plasmid, sử dụng chất vận chuyển X-treme GENETM-HP-DNA Plasmid này bao gồm trình tự gen mã hóa luciferase của đom đóm dung hợp với vùng liên kết cAMP của gen mã hóa protein kinase A cho phép kiểm soát hoạt động enzyme bằng cAMP Các đĩa sau đó được ủ qua đêm ở 37°C dưới 5%
CO 2 trước khi sử dụng các tế bào trong các xét nghiệm
Sau đó dịch môi trường transfection được loại bỏ và thay thế bằng môi trường RPMI 1640 không có huyết thanh và chứa cơ chất của luciferase là luciferin có bổ sung IBMX (3-isobutyl-1-methylxanthine) Tế bào sau đó được ủ ở 28°C 1 giờ trước khi bổ sung các chất KH7, 2-CE, 4-CE, ở các nồng độ khác nhau (0 – 100μM), khi bổ sung KH7, 2-CE, 4-CE thì phải ủ thêm 1 giờ Cuối cựng, kớch thớch bằng eCG (10àl/giếng tương đương với nồng độ 0,7nM) trước khi quan sát nồng độ cAMP bằng máy đo quang phổ huỳnh quang
Hình 2.1 Cơ chế hoạt động của Glosensor và Luciferin trong phản ứng tạo cAMP
2.4.4 Phương pháp xác định nồng độ Progesterone
Nồng độ progesterone được đo ở phần nổi trên bề mặt của tế bào mLTC-
1 ủ cùng với eCG trong môi trường nuôi cấy RPMI 1640 Các tế bào mLTC-1 được nuôi cấy vào các đĩa gồm 96 giếng (100.000 tế bào/giếng) trong ba ngày và sau đó được thay môi trường bằng môi trường RPMI 1640 không có huyết thanh và được ủ khi có hoặc không có KH7, 2-CE, 4-CE (0 - 100μM) trong 2 giờ Sau đú, đĩa tế bào sẽ được bổ sung eCG (10àl/giếng tương đương với nồng độ 0,7nM) và ủ thêm 3 giờ Những môi trường nổi trên bề mặt sau đó sẽ được thu thập và lưu trữ ở -20 0 C cho đến khi phân tích
Nồng độ progesterone sản xuất ra trong tế bào được đo bằng xét nghiệm ELISA Một đĩa 96 giếng được ủ qua đêm ở 4 0 C với kháng thể IgG (10ng/giếng) Sau ba lần rửa với PBS 1X chứa 0,1% Tween 20, các vị trí không đặc hiệu sẽ được bão hòa 1 giờ với 200μl/giếng PBS-Tween 20 bổ sung 0,2% BSA Rã đông tự nhiên môi trường thu được đã bảo quản ở -20 0 C và tra vào các giếng để tiến hành đo nồng độ progesterone Progesterone-11-
Hemisuccine-HRP đã được thêm vào cùng với kháng thể kháng P4 (36ng/giếng) Đĩa tế bào sau đó được ủ trong 4 giờ ở nhiệt độ phòng, được rửa lại 3 lần với dung dịch PBS 1X chứa 0,1% Tween 20 trước khi tra TMB vào đĩa với 100μl/giếng Đĩa tế bào tiếp tục được ủ thêm 20 phút ở nhiệt độ phòng trong bóng tối Phản ứng được dừng lại khi bổ sung H 2 SO 4 2N và nồng độ progesterone được đo ở bước sóng 450nm
Nồng độ protein của tế bào mLTC-1 trong mỗi phần nổi trên mặt được xác định bằng một xét nghiệm so màu (Bio-Rad DC Protein Assay; Bio-Rad,
Hercules, CA) Các protein được điện di bằng gel SDS-PAGE 10% (Polyacrylamide Gel Electrophoresis) và sau đó được chuyển vào màng nitrocellulose (Whatman Protran, Dassel, Germany) Màng được chặn bằng đệm chặn và được ủ với kháng thể đặc hiệu ADCY10 (48kDa), được pha loãng trong BSA 5% trong TBS-Tween 0,1% (độ pha loãng cuối cùng 1:
1000) qua đêm ở 4 0 C Cuối cùng, các màng này được ủ tiếp trong 1 giờ trong IgG kháng thể thỏ (H + L) (CF770 Conjugate) (độ pha loãng cuối cùng 1:
2000) Các màng sau đó được quét trên hệ thống hình ảnh LI-COR Bioscience Odyssey CLx (Lincoln, Hoa Kỳ)
2.4.6 Phương pháp miễn dịch huỳnh quang
Các tế bào mLTC-1 được rửa với dung dịch muối đệm PBS, cố định trên lame kính bằng paraformaldehyde (4%) trong 4 phút Sau đó, các tế bào được rửa trong PBS (3 lần x 3 phút) và sau đó ủ 10 phút với 0,5% Triton X-
100 trong PBS Các liên kết không đặc hiệu đã bị chặn với PBS bổ sung 10% huyết thanh lừa (Eurobio, Courtaboeuf, Pháp) trong 30 phút ở nhiệt độ phòng Các mẫu sau đó được ủ qua đêm ở 4 0 C với kháng thể đặc hiệu ADCY10 Sau
3 lần rửa với PBS, các tế bào được ủ với các kháng thể thứ cấp IgG thỏ kèm
FluoProbes 448 trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng trong bóng tối, rửa lại (3 lần x 3 phút) với PBS và ủ với 4', 6'-diamidino-2-phenylindole (DAPI) trong 10 phút
Sự có mặt của ADCY10 trong tế bào đã được kiểm tra bằng kính hiển vi confocal Zeiss LSM 700 Đối chứng được thực hiện bằng cách bỏ các kháng thể chính Phân tích hình ảnh được thực hiện bằng phần mềm IMAGEJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/)
2.4.7 Xác định mức năng lượng ATP trong tế bào
Các tế bào mLTC-1 được tra vào đĩa nuôi cấy gồm 96 giếng với số lượng khoảng 100.000 tế bào/giếng Sau 48 giờ nuôi cấy ở nhiệt độ 37°C, môi trường được thay thế bằng môi trường không có huyết thanh và có bổ sung KH7, 2-CE, 4-CE (0 – 100μM) Đĩa tế bào được ủ thêm 1 giờ ở nhiệt độ 37°C trước khi thêm 50μl Cell-Titer-Glo 2.0 Assay Promega vào mỗi giếng Sau đó đĩa tế bào được lắc đều với vận tốc nhẹ trong 10 phút trong tối và ủ thêm 2 phút ở nhiệt độ phòng trước khi ghi lại sự phát quang của thuốc thử Cell-Titer-Glo 2.0 Giá trị cường độ phát quang thu được tương đương với giá trị nồng độ ATP trong tế bào sống ATP standard được pha trong dung môi Cell-Titer-Glo 2.0 Assay Promega với các nồng độ quy định là 10 -10 , 10 -11 , 10 -12 Chú ý trước khi tiến hành thí nghiệm, bộ kit thuốc thử Cell-Titer-Glo 2.0 Assay Promega cần được rã đông chậm tại nhiệt độ phòng tối đa 4 tiếng, không lắc mạnh thuốc thử, không được rã đông bằng nước nóng
Hình 2.2 Cơ chế phản ứng phát quang của Luciferin trong Cell-
Titer-Glo 2.0 dưới xúc tác của enzyme luciferase và ion Mg 2+
2.4.8 Phương pháp xử lý các số liệu
Kết quả được biểu diễn dưới dạng TB ± SE (TB: giá trị trung bình của từng lô, SE: sai số chuẩn) Xử lý số liệu bằng phần mềm GRAPHPAD PRISM (test thống kê Anova) để so sánh sự khác biệt giữa các thí nghiệm Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê khi p