Đánh giá định lượng thiếu enzyme glucose 6 phosphate dehydrogenase (G6PD) trên hồng cầu bằng bộ cảm biến carestar G6PD ở cộng đồng dân sống tại vùng sốt rét lưu hành huyện kroong năng, đắk lắk

Do vậy, phát triển thuốc thay thế PQ dùng ngắn ngày và an toàn là rất quan trọng và tafenoquine là một thuốc ứng viên đang được nghiên cứu đánh giá cả hiệu lực và tính an toàn, nhất là

ĐẶNG THỊ HỒNG XUÂN THỦY

ĐÁNH GIÁ ĐỊNH LƯỢNG THIẾU ENZYME GLUCOSE-6- PHOSPHATE DEHYDROGENASE (G6PD) TRÊN HỒNG CẦU BẰNG BỘ CẢM BIẾN CARESTARTTM G6PD Ở CỘNG ĐỒNG

DÂN SỐNG TẠI VÙNG SỐT RÉT LƯU HÀNH

HUYỆN KRÔNG NĂNG, ĐĂK LĂK

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 8420114

Người hướng dẫn : TS HUỲNH HỒNG QUANG

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi cùng với các nghiên cứu viên đồng thực hiện tại thực địa huyện Krông Năng, tỉnh Đăk Lăk và

La bô của Khoa Nghiên cứu và Điều trị, Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Quy Nhơn Các số liệu về kết quả nêu trong luận văn là hoàn toàn trung thực và chƣa từng đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tác giả luận văn

Đặng Thị Hồng Xuân Thủy

Luận văn hoàn thành nếu không có sự giúp đỡ của Quý thầy cô, các bạn đồng nghiệp và gia đình Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin trân trọng cảm ơn:

TS.BS Huỳnh Hồng Quang là Thầy giáo đã dành nhiều thời gian, tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức, giúp đỡ, chỉnh sửa toàn bộ đề cương và luận văn, cũng như động viên tôi trong quá trình học tập và làm luận văn

Trân trọng cảm ơn đến Trường Đại học Quy Nhơn, Ban Giám hiệu Nhà trường, Phòng Đào tạo sau đại học giúp cho hoàn thiện hồ ớ dự tuyển chương trình cao học, đồng thời đã dành mọi điều kiện cho tôi học tập và nghiên cứu

Xin trân trọng cảm ơn đến Quý thầy cô, đồng nghiệp đang công tác tại Khoa Sinh - Kỹ thuật Nông nghiệp, Đại học Quy Nhơn, Khoa Nghiên cứu Điều trị, Khoa Xét nghiệm - Sinh học phân tử, Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Quy Nhơn đã luôn tạo điều kiện thực hành tốt nhất, đóng góp ý kiến sâu sắc để luận văn hoàn chỉnh

Chân thành cảm ơn đến Quý cán bộ y tế từ TTYT huyện đến các Trạm y tế xã,

y tế thôn buôn đã giúp đỡ tôi trong suốt thời gian tham gia thực hiện đề tài tại thực địa

Kính trân trọng cảm ơn cha mẹ hai bên và chồng - những người luôn mong muốn các con mình tiến bộ, là động lực mạnh mẽ, thay gánh vác việc gia đình cho tôi yên tâm học tập, nghiên cứu khoa học

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn đến tất cả người dân đã chia sẻ thông tin và mẫu bệnh phẩm để số liệu xét nghiệm nghiên cứu một cách đầy đủ nhất

Tác giả luận văn

Đặng Thị Hồng Xuân Thủy

CDC Centers for Disease Control and Prevention

G6PD Glucose-6- Phosphate Dehydrogenase

P falciparum Plasmodium falciparum

P vivax Plasmodium vivax

LỜI CAM ĐOAN

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CÁC TỪ VIÊT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài luận văn 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Những đóng góp của đề tài luận văn 2

4 Bố cục của luận văn 3

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Giới thiệu vai trò enzyme glucose 6 phosphat dehydrogenase 4

1.1.1 Cấu trúc và cơ chế hoạt động của enzyme G6PD 5

1.1.2 Đặc điểm di truyền, cấu trúc và đột biến trên G6PD 6

1.2 Phát hiện, chẩn đoán và điều trị thiếu hụt enzyme G6PD 10

1.2.1 Phát hiện, chẩn đoán 10

1.2.2 Điều trị 12

1.3 Các phương pháp phát hiện thiếu hụt enzyme G6PD 13

1.4 Bệnh sốt rét và các khía cạnh liên quan enzyme G6PD 16

1.4.1 Giới thiệu các loài ký sinh trùng sốt rét Plasmodium spp 16

1.4.2 Chu kỳ sinh học của ký sinh trùng sốt rét 16

1.4.3 Điều trị sốt rét 17

1.5 Nghiên cứu về biến thể thiếu hoạt độ enzyme G6PD và bệnh sốt rét 18

1.5.1 Tại Việt Nam 18

1.5.2 Trên thế giới 21

1.6 Thiếu enzyme G6PD và sử dụng thuốc primaquine phosphate 23

1.7 Các biến thể thiếu enzyme G6PD và mức độ nghiêm trọng 25

Chương 2 ĐỔI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29

2.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 29

2.2.2 Tiêu chuẩn loại trừ 30

2.3 Phương pháp nghiên cứu 31

2.3.1 Thiết kế nghiên cứu 31

2.3.2 Cỡ mẫu 31

2.3.3 Phương pháp chọn mẫu 31

2.4 Kỹ thuật nghiên cứu 31

2.5 Các biến số và chỉ số trong nghiên cứu 37

2.6 Nội dung nghiên cứu 37

2.7 Phân tích và xử lý số liệu 38

2.8 Bảo quản và lưu trữ dữ liệu 39

2.9 Đảm bảo chất lượng nghiên cứu 39

2.7 Khía cạnh đạo đức trong nghiên cứu 40

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 41

3.1 Đặc điểm chung của quần thể tại các xã nghiên cứu, huyện Krông Năng 41

3.2 Trị số trung vị của hoạt độ enzyme G6PD theo giới tính nam hiệu chỉnh 42

3.3 Tỷ lệ thiếu hoạt độ enzyme G6PD theo giới tính, nhóm dân tộc 44

3.3.1 Tỷ lệ thiếu hoạt độ enzyme G6PD theo giới tính 44

3.3.2 Tỷ lệ thiếu hoạt độ enzyme G6PD theo từng nhóm dân tộc 49

3.4 Phân tích các biến thể di truyền thiếu hoạt độ enzyme G6PD 57

KẾT LUẬN 70

1 Giá trị bình thường hoạt độ enzyme glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD) trong quần thể nghiên cứu 70

2 Tình trạng thiếu hoạt độ enzyme G6PD bằng bộ cảm biến định lượng CareStartTM tại điểm nghiên cứu 70

KIẾN NGHỊ 71

TÍNH KHOA HỌC, TÍNH MỚI VÀ KHẢ THI CỦA ĐỀ TÀI 72

Tính khoa học 72

Tính mới 72

Tính khả thi 72

PHỤ LỤC

QUYẾT ĐỊNH GIAO TÊN ĐỀ TÀI LUẬN VĂN THẠC SĨ (BẢN SAO)

Bảng 1.1 Các lớp thiếu enzyme G6PD và biểu hiện bệnh trên lâm sàng 9

Bảng 1.2 Phân loại các đột biến thiếu G6PD theo Tổ chức Y tế thế giới 11

Bảng 1.3 Phân nhóm các biến thể thiếu enzyme G6PD 18

Bảng 2.1 Biến thể và các enzyme phân cắt giới hạn áp dụng phân tích 36

Bảng 2.2 Biến số, chỉ số, định nghĩa biến số và cách thu thập biến số 37

Bảng 2.3 Tiêu chuẩn phân loại hoạt độ enzyme G6PD (WHO, 2018) 38

Bảng 3.1 Đặc điểm chung về quần thể nghiên cứu 41

Bảng 3.2 Giá trị chung hemoglobin và hoạt độ enzyme G6PD quần thể 42

Bảng 3.3 Đặc điểm hoạt độ enzyme G6PD của quần thể nghiên cứu 42

Bảng 3.4 Tỷ lệ thiếu, bán thiếu và bình thường của hoạt độ enzyme G6PD phân tích theo giới tính 44

Bảng 3.5 Tỷ lệ thiếu hoạt độ enzyme G6PD theo từng dân tộc 49

Bảng 3.7 Các biến thể enzyme G6PD trên tất cả nhóm dân tộc thiếu G6PD 57

Bảng 3.8 Các biến thể enzyme G6PD phân theo nhóm dân tộc tại các vùng 64

Hình 1.1 Sơ đồ quá trình tổng hợp glutathione có sự tham gia enzyme G6PD 5

Hình 1.2 Sơ đồ di truyền về khiếm khuyết thiếu enzyme G6PD 6

Hình 1.3 Sơ đồ di truyền nhiễm sắc thể liên quan đến thiếu enzyme G6PD 8

Hình 1.4 Bản đồ phân bố và tần suất các alen G6PD liên quan đến thiếu enzyme G6PD | Nguồn: WHO, 2017 10

Hình 1.5 Cơ chế thiếu enzyme G6PD dẫn đến hồng cầu dễ vỡ và tan máu cấp 12

Hình 1.6 Cấu trúc enzyme G6PD không đột biến (2BHL và 2BH9) 15

Hình 1.7 Tần suất thiếu enzyme G6PD và biến thể đa hình thiếu enzyme G6PD 22

Hình 1.8 Vùng q28 trên nhiễm sắc thể X phân tích biến thể enzyme G6PD 23

Hình 2.1 Địa điểm nghiên cứu 3 xã thuộc huyện Krông Năng, tỉnh Đăk Lăk 29

Hình 2.2a Máy đo hoạt độ enzyme G6PD 32

Hình 2.2b Máy đo nồng độ Hb 32

Hình 2.3 Phân loại thiếu hoạt độ enzyme G6PD theo các mốc 30% và 80% so với giá trị bình thường sau khi tính giá trị trung vị 39

Hình 3.1 Phân loại hoạt độ G6PD theo các mức 30% và 80% so với bình thường 43 Hình 3.2 Tỷ lệ thiếu, bán thiếu hoạt độ enzyme G6PD theo giới 44

Hình 3.3 Phân bố tỷ lệ thiếu hoạt độ enzyme G6PD trên từng nhóm dân tộc 50

Hình 3.4 Phân bố tỷ lệ thiếu hoạt độ enzyme G6PD trên từng nhóm dân tộc Kinh, dân tộc di cư từ các tỉnh phía Bắc vào và dân tộc bản địa hoặc

phía Nam 56

Hình 3.5 Tỷ lệ các biến thể thiếu enzyme G6PD trên tổng số 120 mẫu 58

Hình 3.6 Tỷ lệ từng loại biến thể thiêu enzyme G6PD trên từng nhóm dân tộc 58

Hình 3.7 Phân tích các biến thể theo các nhóm dân tộc bản địa và nhóm dân tộc di cư từ các tỉnh miền Bắc hoặc di cư từ Nam vào 65

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài luận văn

Sốt rét là một trong những căn bệnh truyền nhiễm nguy hiểm và là vấn đề

y tế công cộng tại các nước châu Phi, Nam Mỹ và khu vực châu Á-Thái Bình Dương Trong cơ cấu 5 loài ký sinh trùng sốt rét (KSTSR) gây bệnh ở người,

Plasmodium falciparum và Plasmodium vivax thường chiếm tỷ lệ cao Trong

khi loài P falciparum chưa thể loại trừ thì P vivax đã tăng lên tại một vùng lưu

hành như thế là một gánh nặng và thách thức trong điều trị tiệt căn vì điểm đặc

biệt trong chu kỳ sinh học của P vivax có thể ngủ trong tế bào gan, tồn tại và có

thể tái hoạt động sau vài tuần đến vài tháng, thậm chí vài năm, tùy thuộc vào từng chủng Việc điều trị thể ngủ hiện này chỉ có một loại thuốc duy nhất thuộc nhóm 8-aminoquinolein là primaquin phosphate (PQ) liệu trình kéo dài 14 ngày liên tục nên có khả năng gây tan máu cấp trên một số bệnh nhân thiếu enzyme glucose-6-phosphate-dehydrogenase (G6PD)

G6PD là một enzyme oxy hóa khử, nằm ở trên bề mặt hồng cầu Các đột biến trên gen mã hóa G6PD tạo nên các kiểu hình G6PD khác nhau tương ứng với mức độ thiếu và bán thiếu enzyme G6PD Bệnh nhân thiếu G6PD thường ít biểu hiện lâm sàng, nên họ không biết mình mắc bệnh, trừ khi “phơi nhiễm” tác nhân oxy hóa cao như nhiễm trùng, thực phẩm, thuốc và hóa chất có tính oxy hóa cao gây tan máu Trong số các thuốc gây tan máu đó, PQ dùng liệu trình dài

ngày để điều trị sốt rét P vivax là loại được quan tâm nhất Do vậy, phát triển

thuốc thay thế PQ dùng ngắn ngày và an toàn là rất quan trọng và tafenoquine là một thuốc ứng viên đang được nghiên cứu đánh giá cả hiệu lực và tính an toàn, nhất là trên bệnh nhân khiếm khuyết enzyme G6PD trên hồng cầu, nên điều tra

tình trạng thiếu G6PD tại các vùng sốt rét lưu hành P vivax rất cần thiết

Để đánh giá tỷ lệ thiếu enzyme G6PD trên cộng đồng tại vùng sốt rét lưu hành để khi dùng thuốc PQ hay thử nghiệm thuốc mới tafenoquin an toàn, đề tài

“Đánh giá định lượng thiếu enzyme Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase (G6PD) trên hồng cầu bằng bộ cảm biến CareStartTM G6PD ở cộng đồng dân sống tại vùng sốt rét lưu hành huyện Krông Năng, Đăk Lăk" được tiến hành

2 Mục tiêu nghiên cứu

2.1 Xác định giá trị bình thường của hoạt độ enzyme glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD) trong quần thể nghiên cứu;

2.2 Đánh giá tình trạng thiếu hoạt độ enzyme G6PD bằng bộ cảm biến định lượng CareStartTM

tại vùng sốt rét lưu hành huyện Krông Năng, tỉnh Đăk Lăk

3 Những đóng góp của đề tài luận văn

3.1 Đóng góp về mặt khoa học

- Nghiên cứu điều tra về tình trạng hoạt độ enzyme G6PD theo phương pháp định lượng sẽ đóng góp dữ liệu về tỷ lệ người có hoạt độ enzyme bình thường, thiếu hoặc bán thiếu trên từng giới tính và nhóm dân tộc, cũng như yếu tố liên quan trên cộng đồng dân được điều tra ở điểm nghiên cứu;

- Khắc phục về một số nhược điểm của phương pháp định tính hoặc bán định lượng, phương pháp định lượng sẽ đánh giá chính xác ngưỡng mức độ thiếu

để khi sử dụng thuốc sẽ an toàn, hiệu quả, tránh các hậu quả nghiêm trọng;

- Định lượng sẽ cung cấp thông tin hoạt độ G6PD trên hồng cầu của đối tượng nghiên cứu để khi dùng các thuốc có tính oxy hóa nói chung và thuốc sốt rét primaquine nói riêng an toàn, giúp bệnh nhân dùng thuốc đủ liệu trình, loại trừ thể ngủ trong tế bào gan, tránh tái phát xa trong tương lai;

4 Bố cục của luận văn

Đặt vấn đề từ trang 1 đến trang 3;

Chương 1 Tổng quan tài liệu từ trang 4 đến 28;

Chương 2 Đối tượng và Phương pháp nghiên cứu, từ trang 29 đến 40; Chương 3 Kết quả nghiên cứu và Bàn luận, từ trang 41 đến 71;

Kết luận và Kiến nghị, từ trang 72 đến 73

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu vai trò enzyme glucose 6 phosphat dehydrogenase

Gen mã mã hóa cho enzyme glucose 6 phosphat dehydrogenase (G6PD) nằm trên cánh dài đầu mút của nhiễm sắc thể giới tính X, ở vị trí P28, nên gen G6PD là một gen di truyền liên kết giới tính Gen mã hóa G6PD bao gồm 13

exon xen kẽ là các intron có chiều dài khoảng 16Kb, trong đó exon-1 không mã

hóa G6PD được hai tác giả Otto Warburg và Christan phát hiện lần đầu tiên vào năm 1930 ở trên hồng cầu ngựa, hồng cầu của một số động vật, vi sinh vật, men bia và hồng cầu người Khi đó, những nghiên cứu về G6PD thường là những điều tra cơ bản về các thể loại, chủ yếu là dựa vào hoạt độ xúc tác, độ di chuyển điện di và một số đặc tính của enzym [33]

Quá trình tinh khiết G6PD bắt đầu từ năm 1936, sau đó nó mới được phân lập và tinh khiết từ dịch đồng thể của men bia Năm 1966, tác giả Yoshida lần đầu tiên tách chiết được G6PD từ hồng cầu người Từ những thông tin về cấu trúc ban đầu, khối lượng phân tử và các thông số động học của G6PD mới dần được thu thập G6PD thuộc loại enzym oxy hóa khử, với ký hiệu quốc tế là 1.1.1.49, nằm trong hệ thống oxy hóa, nó xúc tác phản ứng oxy hóa G6P Enzyme G6PD là một enzym quan trọng, xúc tác phản ứng đầu tiên của chu trình pentose phosphate - con đường oxy hóa trực tiếp ở hồng cầu [1],[2] Về mặt năng lượng con đường này cung cấp không đáng kể vì chỉ có 10% glucose được thoái hóa ở đây, nhưng về mặt sinh lý nó lại tạo ra NADPH, một chất khử mạnh liên quan mật thiết với các quá trình chuyển hóa và sự toàn vẹn của hồng cầu

Quá trình tách chiết enzyme ra khỏi hồng cầu cũng ngày càng đạt được

độ tinh sạch cao hơn Cùng với sự phát triển của chuyên ngành sinh học phân tử, các dạng đột biến gen của G6PD càng được phát hiện nhiều

1.1.1 Cấu trúc và cơ chế hoạt động của enzyme G6PD

1.1.1.1 Cấu trúc của enzyme

G6PD là một enzyme polymer được tạo thành từ nhiều monomer Một monomer G6PD bao gồm 515 amino acid với khối lượng phân tử khoảng 59.256 dalton Enzyme hoạt động tồn tại dưới dạng chính là dimer (chuỗi kép) và chứa cầu nối NADP [34] Sự biến đổi từ các monomer không hoạt động sang dạng hoạt động dimer, tetramer đòi hỏi phải có sự hiện diện của NADP Cấu trúc bậc

2 của enzyme G6PD có dạng xoắn α G6PD có thể tồn tại dưới nhiều dạng như monomer, dimer, trimer, tetramer và hexamer, nghĩa là có các olygomer bao gồm 1,2,3,4 hoặc 6 chuỗi polypeptide [6] Như vậy trong enzyme hoạt động, NADP vừa là phần cấu trúc nối hai monomer vừa là chất tham gia phản ứng Vị trí kết nối coenzym này chưa được xác định song kiểm tra các đột biến đã chỉ ra

đó là điểm amino acide 386 và 387, tương ứng với lysine và arginine

1.1.1.2 Cơ chế hoạt động của G6PD

G6PD xúc tác phản ứng thứ nhất của con đường hexose monophosphate (HMP), nó oxy hoá G6P thành 6 phospho gluconolactone và chuyển NADP thành NADPH HMP là đường duy nhất tạo NADPH trong HC, NADPH là một coenzym quan trọng giúp bảo vệ HC chống lại chất oxy hoá Glutathion peroxidase (GSHPX) là một phức hợp gồm 3 enzyme G6PD, GR glutathion reductase (GR) và glutathion oxidase(GPx) GSHPx loại bỏ các chất oxy hoá ra khỏi HC theo chu trình:

Hình 1.1 Sơ đồ quá trình tổng hợp glutathione có sự tham gia enzyme G6PD

Ba enzyme trên hoạt động theo chu trình: Tiêu hủy ROOH nhằm tránh gốc tự do, giảm G6PD sẽ làm giảm yếu tố bảo vệ HC Đặc biệt, HC giàu catalase mà catalase là một enzyme oxy hóa phản ứng: Km của G6PD dành cho NADP là rất thấp (khoảng 2-4 mcmol/L và enzyme này bị ức chế bởi NADPH Tỷ số NADPH/NADP+ kiểm soát phản ứng theo nguyên tắc

tự động Ở dạng không hoạt động tỷ số NADPH/NADP+

rất cao và G6PD gần như bị ức chế hoàn toàn Khi NADPH bị oxy hoá, lúc đó oxidic glutathion bị giảm xuống trong phản ứng làm giảm glutathion NADPH sẽ chuyển thành NADP+ và G6PD trở nên xúc tác phản ứng chuyển NADP+ thành NADPH làm chất gây ra oxy hoá bị đào thải Trường hợp giảm G6PD cơ thể sẽ mất khả năng đáp ứng với các tác nhân oxy hoá

1.1.2 Đặc điểm di truyền, cấu trúc và đột biến trên G6PD

1.1.2.1 Đặc điểm di truyền

Thiếu hụt G6PD là một bệnh di truyền liên kết nhiễm sắc thể (NST) X không có alen tương ứng trên Y Trước khi những nghiên cứu cơ bản về di truyền của G6PD được biết, bằng xét nghiệm thử độ ổn định của glutathion

Hình 1.2 Sơ đồ di truyền về khiếm khuyết thiếu enzyme G6PD

Nghiên cứu phả hệ của Afro- về các gia đình người Mỹ cho thấy sự bất thường glutathion là di truyền từ mẹ sang con trai dù ở những trường hợp đó những biến đổi của glutathion không được phát hiện ở mẹ Bằng những kỹ thuật phù hợp người ta đã xác định được nguyên nhân của bất thường di truyền đó là

ở những bà mẹ có đột biến trên gen mã hoá G6PD dạng dị hợp tử [40] Sau này với nhiều phát hiện cơ bản về G6PD, thiếu G6PD có di truyền liên kết với NST

X đã được khẳng định bằng cách đánh giá hoạt độ enzym, nghiên cứu về sự di chuyển điện di, nghiên cứu di truyền của bệnh mù màu Cho đến nay có nhiều gia đình mà sự bất thường trong di truyền liên kết NST X vẫn được thu thập và ghi nhận Những bất thường này đưa đến kết luận là 1 trong 2 quy định cấu trúc G6PD nằm trên NST X có thể đã bị đột biến ở mẹ

Gần đây, người ta đã phát hiện ra trên gen mã hóa cho G6PD là một trong những gen nằm trên cánh dài NST X (q28) Đó là tập hợp những gen fragile X, Hemophilia A, đen quy định màu sắc khi nhìn mà khi đột biến gây bệnh mù màu [44] Như vậy, tình trạng thiếu G6PD là bệnh di truyền liên kết NST X do mẹ truyền cho con trai

1.1.2.2 Đặc điếm về gen liên quan G6PD

Locus liên quan đến quy định cấu trúc G6PD nằm trên nhánh dài vùng 2 băng 8 của NST X (X.q28) Gen được tách và giải trình tự bởi Persico [44] Gen

có 13 exon, dài 20kb, exon đầu tiên không được mã hoá và intron giữa exon 2

và 3 dài hơn mức bình thường, khoảng 9.857 bit Trình tự của gen G6PD đã được biết toàn bộ Vị trí 5' của gen là một vùng giàu 2 nucleotide: Cytidine và Guanidine (CpG) Vùng CpG này được bảo tồn giữa người và chuột Một số ARNm đã được phát hiện nhưng chức năng của nó chưa hiểu hết ARNm chứa

138 nucleotide nằm trên intron 7 của đầu 3' Trên thử nghiệm in vitro người ta

đã tạo ra được G6PD từ loại vi khuẩn E coli

1.1.2.3 Đột biến trên G6PD và biểu hiện bệnh thiếu G6PD

Khi gen cấu trúc bị đột biến sẽ gây nên thiếu G6PD về mặt chất lượng

Còn khi gen điều hoà hoặc gen khởi động bị đột biến sẽ gây ra thiếu G6PD về số lượng Sự biến đổi về mặt số lượng và chất lượng của phân tử enzym đều dẫn đến thay đổi hoạt độ của enzym Trong nữ giới, mỗi tế bào đều có hai gen mã hóa cho G6PD (một gen nhận từ bố, một gen nhận từ mẹ) Những người nữ dị hợp tử vì mang gen đột biến là lặn nên có thể có kiểu hình bình thường, tuy nhiên có thể có các biểu hiện bệnh lý ở mức độ nhẹ hoặc vừa, một số lại biểu hiện rất nặng Nguyên nhân là do một trong hai nhiễm sắc thể trong tế bào nữ đã

bị bất hoạt từ giai đoạn sớm của thời kỳ phôi thai, sau đó theo sự phân bào nó được nhân lên tạo thành cơ thể ở dạng khảm giữa tế bào có nhiễm sắc thể lành

và mang đến bệnh với các tỷ lệ khác nhau Vì vậy, những người này có hai quần thể hồng cầu:

Hình 1.3 Sơ đồ di truyền nhiễm sắc thể liên quan đến thiếu enzyme G6PD

Một nhóm hồng cầu bình thường và một thiếu hụt G6PD Tỷ lệ của chúng thay đổi trong phạm vi rộng 50:50 ở một số ít trường hợp các hồng cầu bất thường chỉ chiếm 1%, nhưng cũng có khi lên đến 99% Nam giới chỉ có một NST X di truyền từ mẹ nên nếu thừa hưởng đến bị đột biến họ sẽ có kiểu trên bán hợp tử và biểu hiện sự thiếu hụt G6PD [33],[34]

Năm 1993, Beutler tìm thấy 58 dạng đột biến tương ứng 97 biến thể Năm

2002, người ta đã tìm ra được hơn 140 đột biến hay phức hợp đột biến tương ứng trên 442 biến thể của G6PD, 299 biến thể trong đó được phân loại bởi Tổ chức Y tế thế giới (TCYTTG) Họ mô tả một biến thể mới phải hoàn toàn khác với những biến thể đã từng được biết và công bố dựa trên chỉ số như hoạt độ enzyme, di chuyển điện di, hằng số cho G6PD và NADP [12] Vì hầu hết đột biến về G6PD đều có bất thường về điện di, động học hoặc cả hai nên người ta cho rằng đột biến tác động đến enzyme phải được tìm thấy trên vùng mã hoá

Ngày nay, nhờ kỹ thuật sinh học phân tử, đặc biệt phân tích chuỗi trùng hợp (PCR) mà sự xác định ra đột biến trở nên chính xác và có thể phát hiện nhiều đột biến trên một cá thể Trong điều kiện sống bình thường, sự thiếu hụt G6PD ít có biểu hiện lâm sàng vì quá trình khử được bảo đảm nhờ hệ thống enzym phụ thuộc NAD+, do vậy hàm lượng glutathion dạng khử chỉ giảm nhẹ,

tỷ lệ methaemoglobin (MetHb) thấp Ở những người thiếu hụt G6PD sự già hóa theo tuổi thọ của hồng cầu thường sớm hơn bình thường [17], đời sống của HC giảm 20% do có hiện tượng tan máu nhẹ ngay cả khi không dùng một thuốc nào

Bù lại cơ thể tăng cường sản xuất HC non trong tuỷ xương

Dưới tác dụng của thuốc hoặc chất oxy hoá dẫn đến hệ thống enzyme khử phụ thuộc NAD+ không còn đáp ứng đủ nhu cầu quá trình khử, lúc này enzyme thuộc NADP trở nên quan trọng Hai hệ thống này tăng cường hoạt động để bảo

vệ HC Những người thiếu G6PD cơ chế bảo vệ HC chống lại tác nhân oxy hoá

bị giảm nên hay xảy ra tan huyết HC già thường bị huỷ nhiều với biểu hiện tán huyết, HC non ít bị vỡ hơn vì nó giàu enzyme, ít nhạy cảm với chất oxy hoá

Bảng 1.1 Các lớp thiếu enzyme G6PD và biểu hiện bệnh trên lâm sàng

I Thiếu G6PD nặng, biểu hiện thiếu máu tan máu hình cầu mạn tính

I Thiếu G6PD nặng (hoạt độ enzyme < 10% so với bình thường)

III Thiếu G6PD từ mức độ vừa đến nhẹ (hoạt độ enzyme từ 10-60% so với bình thường)

IV Thiếu G6PD rất nhẹ hoặc không thiếu (hoạt độ enzyme từ 60- 150% so với bình

thường)

V Tăng hoạt độ (hoạt độ > 150%)

Với những trường hợp thiếu G6PD mức độ nhẹ thì việc huy động HC non

là một giải pháp nhằm tự hạn chế cơn tan máu Sự tăng tạm thời về hoạt tính xúc tác G6PD dẫn đến việc ổn định hàm lượng glutathion dạng khử (GSH) dù chất oxy hoá vẫn tiếp tục được dùng Bình thường GSH được phục hồi khoảng 90% trong vòng 1 giờ [17] Nếu GSH phục hồi thấp hơn 30% thì các ca tan máu trở nên nguy kịch Thời gian bán huỷ của HC bình thường là 60 ngày và tuổi thọ khoảng 120 ngày, nhưng thời gian bán huỷ của HC thiếu hụt G6PD là 48 ngày

Dựa vào hoạt độ G6PD trong HC và biểu hiện lâm sàng khi thiếu enzyme, chia biến thể thiếu hụt G6PD ra thành lớp Song, sự phân biệt giữa các lớp này không phải luôn rõ ràng Chẳng hạn, G6PD Med được chia vào lớp II, nhưng đã được mô tả là thiếu máu tan máu bẩm sinh HC không tròn

Hình 1.4 Bản đồ phân bố và tần suất các alen G6PD liên quan đến thiếu enzyme

- Thuốc: Người thiếu G6PD dễ bị tán huyết khi dùng các thuốc có tính oxy

hóa cao như primaquine (PQ) Thuốc PQ là một trong những thuốc làm giảm tuổi thọ HC ở người thiếu G6PD Sau khi cho bệnh nhân dùng thuốc 1-2 ngày hàm lượng hemoglobin (Hb) đã giảm xuống Những ca tan máu nặng, nước tiểu trở nên đen thẩm, hoặc triệu chứng lâm sàng nặng như sốt cao, vàng da Với những ca thiếu G6PD mức độ vừa như lớp 3 thì tan máu cũng chỉ ở mức độ vừa phải vì chỉ có những HC già bị phá hủy còn những HC non

có hoạt tính enzyme bình thường thì không Ngoài ra, vài thuốc khi dùng cho bệnh nhân phải thận trọng như acetaminophen, ascorbic acid;

- Thức ăn: Một số người khi ăn đậu Hà Lan có thể xuất hiện tình trạng tan

máu, đôi khi nghiêm trọng Đa số ca như thế là những người thiếu G6PD Đậu fava chứa divicine có thể oxy hoá mạnh [31], khi vào cơ thể thì hai chất này gây giảm glutathion khử nhanh, nên ca thiếu hụt G6PD type Địa Trung Hải khi ăn đậu này sẽ xảy ra cơn tan máu cấp;

- Vàng da kéo dài ở trẻ sơ sinh: Vàng da nhẹ là một hiện tượng hay gặp ở

trẻ sơ sinh do vỡ HC trong những ngày đầu Những ca vàng da kéo dài có thể

do nhiều nguyên nhân và một trong số đó là do thiếu G6PD, có thể ảnh hưởng đến tính mạng và sức khỏe của trẻ

Bảng 1.2 Phân loại các đột biến thiếu G6PD theo Tổ chức Y tế thế giới Phân loại

theo

TCYTTG

G6PD Địa Trung Hải (G6PD B)

G6PD Asahi (G6PD A-) G6PD-Canton

(G6PD A)

Loại đột biến

CT ở vị trí 563 trên exon 6 làm acid amin ở vị trí 188 là serin  phenylalanin

AG ± GA ở vị trí

376 (AG) hoặc 202 (GA) trên exon 5, làm thay đổi Sparagine  Aspartic acid ở vị trí acid amin 126/valine 

methionine vị trí 88

GT ở vị trí

1376 làm acid amin ở vị trí 459

là arginin  leucine

Quần thể bị

ảnh hưởng

Ý, Hy Lạp, Tây Ban Nha, Ả Rập, Do Thái Châu Phi Đông Nam Á

Phân loại

theo

TCYTTG

G6PD Địa Trung Hải (G6PD B)

G6PD Asahi (G6PD A-) G6PD-Canton

Hình 1.5 Cơ chế thiếu enzyme G6PD dẫn đến hồng cầu dễ vỡ và tan máu cấp

Nguồn: Malariasite, 2018

Một số thuốc có thể gây tán huyết trên bệnh nhân thiếu enzyme G6PD như aspirin, dapsone, nitrofurantoin, chloramphenicol, quinolone, vitamin K, quinidin, dimercaprol, phenylhydrazine, primaquine, chloroquin, quinine

1.2.2 Điều trị

Trong những trường hợp tan máu do dùng thuốc bệnh nhân phải ngay lập tức ngưng dùng thuốc Nếu tan máu nặng cần phải truyền máu

Với những bệnh nhân thiếu G6PD đã biết trước, cần chủ động phòng tránh những thức ăn và các thuốc có tính chất oxy hoá (có danh sách các thuốc) Những bệnh nhân chỉ định các thuốc oxy hoá nên xét nghiệm G6PD trước khi dùng Có nhiều nghiên cứu cho rằng thiếu hụt G6PD hay gặp ở những vùng sốt rét lưu hành (SRLH) nặng, một số nghiên cứu khác lại thấy có những vùng SRLH nặng lại có tỷ lệ thiếu G6PD thấp Do đó, chúng ta phải tìm hiểu mối liên quan giữa thiếu G6PD trong những vùng SRLH

1.3 Các phương pháp phát hiện thiếu hụt enzyme G6PD

Vì những người thiếu G6PD ít có biểu hiện lâm sàng nên để chẩn đoán bệnh nhân có thiếu G6PD hay không cần có các phương pháp xác định [28] Hiện nay một số phương pháp đã và đang được áp dụng trên toàn cầu và dần dần từng bước chuẩn hóa quy trình [49] theo tiêu chí của Tổ chức Y tế thế giới:

- Phương pháp huỳnh quang của Ernest Beutler: Phương pháp này được

giới thiệu vào năm 1966, định tính dựa trên nguyên lý chuyển hóa phosphate không phát quang khi có mặt của G6PD và NADP, chuyển thành

glucose-5-6 phospho glucononolacton là một chất phát quang, nên có thể nhận biết dưới ánh sáng đèn cực tím [20] Phương pháp này hiện nay được sản xuất thành kit lưu hành trên thị trường;

- Phương pháp tạo vòng formazan: Phương pháp do tác giả Fujii H giới thiệu

năm 1984 định tính, dựa trên nguyên lý chuyển màu của MTT từ một chất có màu vàng nhạt sang màu xanh sẫm với sự có mặt của NADPH, mà NADPH được tạo thành với sự có mặt của G6PD, có ưu điểm là có thể tiến hành trên các mẫu máu khô trên giấy thấm, sau đó các mảnh giấy thấm chứa máu được đặt đen thạch chứa hóa chất [32] Các ca thiếu G6PD không có vòng màu xanh sẫm được tạo thành Đường kính của vòng màu xanh nói lên hoạt độ G6PD có trong mẫu máu Tuy nhiên, phương pháp cho kết quả sau 8 giờ và phụ thuộc vào điều kiện và thời gian bảo quản mẫu máu

- Phương pháp định lượng theo quang khối phổ: Đo hoạt độ G6PD bằng hệ

thống quang phổ kế thông qua bước đo lường sự hình thành NADPH dựa trên sự khác biệt hấp phụ của mẫu ở bước sóng 340nm qua thời gian và các test như thế thường làm ở bệnh viện và cơ sở nghiên cứu (Pfeffer DA và cs., 2020) Xét nghiệm này cũng phân biệt được quần thể HC có G6PD bình thường/thiếu Lưu ý rằng các kết quả bị ảnh hưởng bởi nồng độ Hb trên mẫu máu, nhất là thiếu máu thiếu sắt có thể dẫn đến enzyme G6PD cao giả [39]

- Phương pháp Akira Hirono: Phương pháp được giới thiệu vào năm 1998,

định tính dựa trên nguyên lý tạo vòng formazan, có ưu điểm là trả lời kết quả nhanh chỉ sau 30 phút và không cần các thiết bị đắt tiền, nhưng khó phân biệt dạng thiếu và bán thiếu [18],[19]

- Phương pháp phân tích di truyền và đáp ứng miễn dịch theo kit Roche:

Phương pháp này tiến hành qua lấy máu, phân tích theo kỹ thuật ELISA phát hiện và định lượng protein và kháng nguyên từ các mẫu khác nhau Các protein mã hóa bởi G6PD ước đoán có độ dài amino acid là 515 và trọng lượng 59.3 kDa và hiện đã phát hiện 3 đồng phân dạng (isoform)

Các mối liên quan về bệnh học trên những người thiếu máu, tán huyết hồng cầu không phải hình cầu do thiếu G6PD Một số ortholog (một trong hai hoặc nhiều trình tự gen tương đồng được tìm thấy trong HC các loài khác nhau, có liên quan bởi dòng dõi tuyến tính trong khi tương đồng, hợp chất hóa học hoặc nhiễm sắc thể) của gen liên quan G6PD bao gồm người, chuột,

bò, gà, linh trưởng, heo và động vật có vú khác

- Phương pháp phân tích di truyền dựa vào sinh học phân tử: Phương pháp

này được dùng để xác định các đột biến và biến thể thiếu enzyme G6PD trên hồng cầu người tại các vùng địa lý khác nhau, đặc biệt cho nghiên cứu nhiều hơn là thực hành lâm sàng [44],[48]

Hình 1.6 Cấu trúc enzyme G6PD không đột biến (2BHL và 2BH9) chỉ ra vị trí các

đột biến lớp I-IV (biến thể đột biến sai nghĩa) trong dimer (mũi tên đậm) Các đột biến lớp I, II, III và IV lần lượt là các hình cầu màu đỏ, tím, vàng và nâu Các đột biến lớp chưa có tên là hình cầu màu đen Dù các đột biến nằm ở vị trí tương đương trên G6PD dimer, đột biến Zacatecas, Palermo, Bahia, Vietnam 1 và Vietnam 2, Sierra Leone, San Luis Potosí là chỉ có một trong số monomer Đột biến Taif là mất đoạn (mũi tên dạng chấm) và đột biến Vietnam 1 được trình bày bởi sự tồn lưu Val27

|Nguồn: Hugo Serrano-Posada, 2018

- Phương pháp xác định thiếu enzyme G6PD bằng test nhanh: Đánh giá

được thiếu G6PD có độ nhạy, độ đặc hiệu, độ chính xác cao được một số quốc gia và cơ sở điều trị áp dụng trong phát hiện chẩn đoán rất phổ biến, song không đánh giá mức độ thiếu Phương pháp định tính phù hợp cho quản

lý ca bệnh và nguồn lực sẵn về nhân viên y tế địa phương Loại test nhanh dễ

sử dụng và đọc kết quả trong 15 phút, bảo quản test trong điều kiện mát 32°C, các test này đáng tin cậy về giá trị trên các mẫu thiếu G6PD với hoạt

18-độ enzyme <30% so với giá trị bình thường [45] Hạn chế của test là không

có vạch chứng và giá trị khó kiểm soát khi điều kiện nhiệt độ cao hơn 32°C

- Phương pháp định lượng thiếu enzyme G6PD bằng bộ cảm biến: Sự ra đời

các bộ cảm biến đánh giá định lượng thiếu enzyme G6PD không những mang lại hiệu quả cho sàng lọc tình trạng G6PD trên các trẻ sơ sinh vàng da và dân cư trong vùng sốt rét lưu hành, giúp cho xử lý và ngăn ngừa các hậu quả có thể tiên đoán được, các công cụ định lượng như thế có thể áp dụng ngay tại chỗ, thao tác đơn giản, thời gian cho kết quả nhanh (5 phút), không cần bảo quản mẫu trong môi trường đông, lạnh, đặc biệt có thể thực hiện ngay điều kiện thực địa [54]

1.4 Bệnh sốt rét và các khía cạnh liên quan enzyme G6PD

1.4.1 Giới thiệu các loài ký sinh trùng sốt rét Plasmodium spp

Sốt rét là một bệnh truyền nhiễm do KSTSR truyền từ người bệnh sang

người lành thông qua muỗi Anopheles spp., bệnh lưu hành ở địa phương, có thể

phát thành dịch Từ năm 1881 đến nay, các nhà khoa học đã phát hiện ít nhất 5

loài KSTSR gây bệnh trên người, gồm Plasmodium malariae (Laveran, 1881),

P vivax (Grassi và Feletti, 1890), P falciparum (Welch, l897), P ovale

(Stephens, 1922) và P knowlesi (Sinton và Mulligan, 1933)

1.4.2 Chu kỳ sinh học của ký sinh trùng sốt rét

Chu kỳ sinh học và phát triển bao gồm 2 giai đoạn: Giai đoạn sinh sản hữu tính trên muỗi và giai đoạn sinh sản vô tính trên người Giai đoạn phát triển trong cơ thể người biểu hiện:

+ Giai đoạn mô: Thoa trùng trong hạch nước bọt của muỗi Anophen truyền bệnh Khi muỗi đốt, thoa trùng sẽ đi ngay vào trong máu, lưu hành ở đó trong vòng 30 phút Một số lớn thoa trùng bị thực bào, còn lại một số vào các tế bào nhu mô gan một cách trực tiếp Trong tế bào gan, thoa trùng cuộn tròn lại, nguyên sinh chất lớn dần lên, phân chia thành nhiều mảnh, mỗi mảnh bọc một ít nguyên sinh chất Như vậy KSTSR đã sinh sản vô tính thành nhiều ký sinh trùng

khác Với P vivax và P ovale thì KSTSR không phóng thích hết vào trong máu,

mà vẫn còn một lượng KST tồn tại ở trong gan được gọi là thể ngủ (hypnozoite form hay dormant form), do vậy hay gây cơn sốt rét tái phát sau vài tuần hoặc vài năm kể từ lần nhiễm đầu tiên

+ Giai đoạn hồng cầu: Mezoroit được phóng thích khỏi tế bào gan vỡ bắt đầu xâm nhập vào bên trong hồng cầu Thể KSTSR trẻ nhất rất nhỏ gọi là thể nhẫn, sau đó lớn dần lên, gọi là thể tư dưỡng Thể tư dưỡng trưởng thành tiếp tục quá trình phân chia vô tính HC Nhân KSTSR phân chia thành nhiều nhân con, tiếp theo là sự phân chia bào tương tạo thành thể phân liệt Các thể phân liệt già trưởng thành chứa các KSTSR đã được phát triển hoàn toàn, lúc

đó HC bị vỡ ra các mezoroit xâm nhập tiếp tục vào hồng cầu mới để một chu trình mới lại bắt đầu Những thể hoa thị phân chia bắt nguồn ngay từ giai đoạn phân chia vô tính tiền HC cũng đã có những thể bị biệt hoá hữu tính thành giao bào Sau khi xâm nhập HC mới chúng phát triển nhưng không phân chia và tạo thành giao bào trưởng thành có hình thể khác nhau tuỳ loài KSTSR

Giai đoạn phát triển trong cơ thể muỗi: Giao bào đực và giao bào cái được muỗi hút vào dạ dày sẽ trưởng thành và thay đổi Trong giao bào đực phân nhân, nguyên sinh chất kéo dài thành 4-8 roi, môi roi có cấu trúc hình sợi dài 20-

25 µm, những thể roi này tách hẳn khỏi tế bào gốc và hoạt động tự do

Giao bào cái trải qua quá trình trưởng thành và chuyển dạng thành giao

tử cái Trong dạ dày muỗi giao tử đực kết hợp với giao tử cái tạo thành hợp tử Hợp tử này chuyển dạng kéo dài ra tạo thành thể noãn và di động tới thành

dạ dày muỗi chui qua đó ra ngoài và định cư ở đấy để phát triển Noãn bào lớn dần song song với sự phân chia liên tiếp của nhân và bào tương Nhân phân chia của phôi bào tử tạo thành những thoa trùng hình thoi có chiều dài 10-15µm Thoa trùng di động và phá vỡ màng noãn bào, thâm nhập vào các xoang cơ thể muỗi Sau đó, thoa trùng được giải phóng khỏi xoang để di chuyển đến tuyến nước bọt của muỗi cái Thời điểm này nếu muỗi đốt người thoa trùng sẽ tiếp tục chu kỳ mới trên cơ thể người

1.4.3 Điều trị sốt rét

Nhằm mục đích điều trị khỏi cho bệnh nhân, giảm nguồn bệnh trong cộng

đồng và hạn chế lan truyền bệnh Hiện nay, ở Việt Nam phổ biến là 2 loài P

falciparum và P vivax, còn tỷ lệ P malarie và P ovale rất thấp (< 1%)

- Điều trị cắt cơn và tiệt căn:

+ Với P vivax dùng các thuốc diệt thể vô tính trong HC chỉ có tác

dụng điều trị cắt cơn và hiện nay chloroquin vẫn là thuốc còn nhạy với

P vivax Để diệt thể ngủ trong gan, chống tái phát xa cho đến nay trên thế giới

cũng chỉ có duy nhất primaquin phosphate (PQ) với liệu trình dài 2 viên/ngày trong 14 ngày liên tiếp theo liều khuyến cáo của TCYTTG (WHO, 2015) và Hướng dẫn Chẩn đoán và Điều trị của Bộ Y tế Việt Nam (Bộ Y tế, 2020) Trong khi đó PQ là thuốc duy nhất trong các thuốc thuộc nhóm 8-aminoquinolein, chống chỉ định với trẻ em dưới 6 tháng tuổi, phụ nữ có thai và thiếu enzyme G6PD

Với P falciparum, chỉ cần dùng thuốc diệt thể vô tính trong HC là đủ để

cắt cơn và tiệt căn theo phác đồ thuốc phối hợp có artemisinin (ACTs) với primaquin liều duy nhất đang dùng theo khuyến cáo

1.5 Nghiên cứu về biến thể thiếu hoạt độ enzyme G6PD và bệnh sốt rét

Primaquin phosphate (PQ) là thuốc sốt rét được dùng để tiêu diệt thể ẩn và

giao bào của P vivax giai đoạn trong tế bào gan, ngừa tái phát và thể giao bào chống lây lan trong cộng đồng của P falciparum ở bệnh nhân Điều này sẽ nguy cơ cho bệnh nhân P vivax bị thiếu hụt enzym G6PD khi dùng PQ dài ngày

Bảng 1.3 Phân nhóm các biến thể thiếu enzyme G6PD

1.5.1 Tại Việt Nam

Chiến lược Phòng chống và Loại trừ sốt rét (PCSR và LTSR) ở Việt Nam

đã đạt được nhiều thành tựu quan trọng trong việc giảm gánh nặng bệnh tật và

tử vong rõ rệt, không còn dịch sốt rét xảy ra trên phạm vi toàn quốc trong vài

năm gần đây Tuy nhiên, cơ cấu KSTSR đã thay đổi, với số ca P vivax đang gia

tăng, có nhiều vùng chiếm tới 50% Việt Nam đang triển khai Chiến lược PCSR

và LTSR, trong khi có sự chuyển dịch cơ cấu như thế sẽ khó khăn về kỹ thuật

Do đó, điều trị các ca sốt rét P vivax có thiếu hụt G6PD sẽ đặt ra một thách thức

rất lớn Trong khi kỹ thuật để phát hiện thiếu hụt G6PD chưa được áp dụng trong tất cả các cơ sở y tế, một điều tra để xác định tỷ lệ thiếu hụt G6PD ở các nhóm dân tộc sống trong vùng SRLH là rất cần thiết, để góp phần vào sự định hướng của chính sách sử dụng PQ một cách an toàn và hiệu quả

Trước đây, trong nước một số nghiên cứu về thiếu enzyme G6PD liên quan đến bệnh sốt rét tại Việt Nam như Hoàng Văn Sơn, Đoàn Hạnh Nhân, Tạ Thị Tĩnh,

Lê Thị Việt Nga, Huỳnh Hồng Quang trên một vài nhóm dân tộc nhưng chưa tìm được mối liên quan nào giữa sốt rét và thiếu hụt G6PD Đồng thời, việc xác định các biến thể liên quan G6PD tại Việt Nam [8],[10],[12],[14] vẫn còn hạn hữu với

cỡ mẫu nhỏ Y văn trong và ngoài nước trước đây cho thấy tỷ lệ thiếu G6PD thay đổi khác nhau ở nhiều vùng địa lý và trên nhiều nhóm dân tộc

Tại Việt Nam, các nhà khoa học đã nghiên cứu về enzyme G6PD từ năm

1969, Đặng Hanh Phức dùng thử nghiệm sàng lọc đơn giản của Brewer cho kết quả tỷ lệ thiếu hụt enzyme G6PD Ở Hà Nội là 5,3%, ở Hải Phòng 7,5% Năm

1978, Hoàng Văn Sơn tại Viện Nhi Trung ương có một nghiên cứu cho biết tỷ lệ thiếu enzyme G6PD 2-6% ở những vùng không có sốt rét, một số vùng SRLH nặng tỷ lệ thiếu hụt lên tới 20-24% [12],[14]

Một nghiên cứu của Đoàn Hạnh Nhân, Tạ Thị Tĩnh tiến hành theo phương pháp chọn mẫu ngẫu nhiên trên 1.676 nam học sinh phổ thông cơ sở tuổi từ 6-15 tại 8 huyện thuộc 4 tỉnh (Hoà Bình, Hà Giang, Sơn La, Thanh Hoá)

từ 1996-1997 [14] Kết quả cho thấy, thiếu G6PD trên HC có tỷ lệ cao tại một số vùng SRLH nhẹ như Kim Bôi (34,1%), Mai Châu (20,4%), Như Xuân (19,7%),

Mường La (17,8%) và thấp tại một số vùng sốt rét không lưu hành như Mèo Vạc (0,3%) và Nga Sơn (0,5%) Tỷ lệ thiếu enzym ở các dân tộc khác nhau cho kết quả khác nhau, cao nhất là nhóm dân tộc Mường (31%), Thổ (22,6%) và Thái (19,3%); rất thấp ở nhóm dân tộc Kinh (0,5%) và dân tộc Mông (0,3%)

Một nghiên cứu khác của Đoàn Hạnh Nhân và Tạ Thị Tĩnh cùng cộng sự năm 1999, tiến hành tại Gia lai, Bình Phước nơi SRLH nặng cho biết tỷ lệ thiếu G6PD của dân tộc Gia rai, Ba na, X’ Tiêng tương ứng là 2,3%; 1,7% và 3,4%, đồng thời không có mối liên quan giữa thiếu G6PD với bệnh sốt rét

Theo tác giả Hoàng Hạnh Phúc khi điều tra tỷ lệ thiếu enzyme G6PD trong phổ thông cơ sở cho thấy tỷ lệ thiếu enzym G6PD trong dân tộc Kinh tại Hà Nội là 0,86%, Hoà Bình là 4,53%, học sinh dân tộc Mường tại Hoà Bình là 11 36%

Theo Nguyễn Thọ Viễn [16] khi nghiên cứu bệnh nhân có KSTSR thấy tỷ

lệ thiếu G6PD tới 60,71%, thiếu hoàn toàn tới 25%, trong lúc người không

có KSTSR thiếu enzyme G6PD là 37,04% và hoàn toàn là 6,79%, qua đó tác giả

đã nhận định hiện tượng thiếu enzyme G6PD có liên quan đến sốt rét

Theo nghiên cứu của Trần Thị Chính và cộng sự [7] nghiên cứu trên người Kinh tại Hà Nội và khu vực quanh Hà Nội tỷ lệ thiếu G6PD là 1,75% Thiếu hụt enzyme G6PD là một nguyên nhân gây thiếu máu tan máu di truyền Thông thường trên lâm sàng hay gặp thiếu máu do tan máu mạn tính Những trường hợp tan máu cấp tính hay xảy ra khi có tác động của một số tác nhân gây oxy hoá, đặc biệt là thuốc sốt rét (primaquin, quinin)

Đến nay, Nhiều nước trong khu vực Tây Thái Bình Dương có các dạng đột biến biến thể enzyme G6PD được phát hiện như biến thể Viangchan, Canton, Kaiping, Union, Mahidol Theo Tsiu A Sane khi điều trị cho 15 bệnh nhân thiếu enzyme G6PD bằng PQ liều 13,2mg x 1,5 viên/ngày tại Bệnh viện E thì có hai người bị tan huyết mạnh phải dừng thuốc và xử trí cấp cứu [13] Điều này cho thấy việc xác định tỷ lệ thiếu G6PD ở một số nhóm dân tộc và những cá thể thiếu enzyme G6PD hiện đang sống trong vùng SRLH là vô cùng cần thiết

từ đó có những biện pháp phòng tránh tai biến trong điều trị

1.5.2 Trên thế giới

Trên thế giới, điều tra dịch tễ học cho thấy tần suất thiếu enzyme cao nhất

ở các nhóm dân tộc sống trong vùng SRLH Theo Enest Beutler và cộng sự, trên thế giới có khoảng 400 triệu người thiếu G6PD, bệnh gặp ở tất cả các nhóm dân tộc, chủng tộc khác nhau Tần suất thiếu hụt G6PD khác nhau tùy thuộc vào dân tộc và vùng địa lý, nhưng cao nhất là các khu vực Địa Trung Hải, châu Phi và Nam Á, ít gặp hơn ở khu vực Bắc Âu Theo Matsuoka H và Khui Iwai, tỷ lệ thiếu G6PD ở Lào là 7,2%, Thái Lan 11,5%, ở Indonesia 3,7%, Myanmar 5,4%

Theo điều tra của Bouma tại Pakistan năm 1995, tỷ lệ thiếu enzym cũng rất khác nhau ở các dân tộc khác nhau, tỷ lệ thiếu enzym ở nhóm dân tộc Pathan

là 15,8 %, Uzbak là 9,1%, Tajik 2,9% và Tukoman là 2,1% Các nghiên cứu dịch tễ học thấy tần suất thiếu enzyme G6PD cao nhất gặp ở nhóm dân tộc sống trong vùng SRLH Điều tra của Ganczakowski-M, tỷ lệ thiếu G6PD chung ở

Vanuatu là 6,8%, mức độ khác nhau ở các điểm điều tra, dao động từ 0-39%, có

sự tương quan thuận giữa thiếu enzyme G6PD với mức độ sốt rét tại đây Một nghiên cứu của Devi ST điều tra tại Ấn Độ cũng cho thấy vùng SRLH nặng có

tỷ lệ thiếu G6PD là 14,13%, trong khi đó tại vùng SRLH nhẹ, tỷ lệ thiếu enzym chỉ chiếm 5,5%

Theo Laundry, khi nghiên cứu trên trẻ em ở Gabon, châu Phi thì chỉ có những bệnh nhân nữ thiếu hụt G6PD dạng dị hợp tử mới có khả năng bảo vệ đối

với sốt rét và chỉ với trường hợp nhiễm P falciparum mà thôi Một số tác giả

khác lại cho rằng tất cả dù đang hợp tử, dị hợp tử hay bệnh nhân nam bán hợp tử đều có khả năng bảo vệ đối với Theo Beutler, tiến hành nghiên cứu những ca thiếu hụt G6PD dạng dị hợp tử ở hai quần thể HC thì HC bình thường có nhiều KSTSR hơn HC bị thiếu G6PD Tương tự, Luzatto thấy nhiều KSTSR trong HC bình thường hơn HC thiếu enzyme G6PD

Hình 1.7 Tần suất thiếu enzyme G6PD và biến thể đa hình thiếu enzyme G6PD

Trong nghiên cứu in vitro người ta nhận ra là KSTSR sốt rét ít phát triển

ở những hồng cầu thiếu G6PD Cơ chế của hiện tượng này có nhiều giả thuyết,

có giả thuyết cho là KSTSR cần NADPH cho sự xâm nhập và tồn tại nên ở bệnh nhân thiếu hụt G6PD, lượng NADPH tại HC thấp không thích hợp cho sự phát

triển của nó Nghiên cứu in vitro thấy HC thiếu hụt G6PD nhiễm P falciparum

bị thực bào mạnh hơn gấp 2-3 lần so với HC bình thường cũng nhiễm P

falciparum Có sự tăng nồng độ của immunoglobuline và bổ thể C3 ở ca thiếu

hụt G6PD làm thuận lợi hơn cho quá trình thực bào các HC nhiễm P falciparum

vì thế ức chế phát triển của KSTSR này

Ở khu vực châu Á, người ta đã tìm thấy các loại đột biến như Gaoche và Chinese-4 ở Trung Quốc, Ube và Konan ở Nhật Bản, Chinese-3 ở Philipines [29], Mahidol ở Đông Nam Á, Trung Quốc và Đài Loan, G6PD Union, một đột biến lớp 2, đầu tiên được mô tả ở người Philipines trên đảo Hawai (Mỹ), sau đó lại tìm thấy ở cực rất xa của địa cầu, quần đảo Vanuatu thuộc Tây Nam Thái Bình Dương Tiếp đó được tìm thấy ở Lào, Trung Quốc, Nhật Bản

Hình 1.8 Vùng q28 trên nhiễm sắc thể X phân tích biến thể enzyme G6PD

Đến nay, các nhà khoa học đã xác định có ít nhất 400 biến thể G6PD và

130 đột biến điểm khác nhau Mỗi loại biến thể có đặc điểm về tính gắn kết khác nhau, tỉnh ốn định của enzyme trên màng hồng cầu và khả năng thay đổi hoạt tính protease dẫn đến ổn định hay bất ổn định màng hồng cầu

1.6 Thiếu enzyme G6PD và sử dụng thuốc primaquine phosphate

Thuốc primaquine (PQ) đã được sử dụng liên tục kể từ năm 1952 để ngăn

ngừa tái phát xa sốt rét do P vivax và P ovale Thuốc PQ có độc tính gây tán

huyết trên những cá nhân thiếu enzyme G6PD và ở những nơi mà bệnh nhân sốt rét đang sống thì khâu thực hành không được kiểm tra G6PD xem có thiếu hay không và giám sát liệu trình dùng thuốc trong 1-2 tuần Tuy nhiên, không có liệu

pháp thuốc nào khác thay thế để ngăn chặn sự tái phát của sốt rét P vivax và P

ovale Liều dùng hàng ngày 0,25 hay 0,5 mg/kg trong 14 ngày gây ra thiếu máu

tan máu cấp trên ca bệnh thiếu enzyme G6PD [21] Tình trạng di truyền gen lặn liên kết giới tính X dị hợp tử đã ảnh hưởng đến 400 triệu người trên toàn cầu

Theo ước tính toàn cầu, các quốc gia lưu hành sốt rét, tần suất alen trung bình của thiếu enzyme G6PD ước tính là 8% (7,4-8,8%) Vì bản đồ gen G6PD với nhiễm sắc thể X, tần suất nam thiếu enzyme G6PD trên giới nam giống nhau Tần suất nữ thiếu enzyme G6PD ước tính là tổng các thể đồng hợp tử ở nữ cộng với một phần nhỏ thể dị hợp tử khoảng chừng 30% hoặc ít hơn so với hoạt tính G6PD thông thường Về tổng thể thì con số này chiếm khoảng 350 triệu người thiếu enzyme G6PD

Kể từ năm 1956, thiếu enzyme G6PD đã được nhận ra như một nguyên nhân nhạy cảm với PQ Bất cứ khi nào không thể kiểm tra thiếu enzyme G6PD trước khi cho thuốc PQ, khi đó đưa ra quyết định cần chân nhắc đến lợi ích và

nguy cơ tiềm tàng dựa vào uống thuốc PQ trên các bệnh nhân thiếu enzyme

G6PD với nguy cơ tái phát nhiều cơn trên lâm sàng do sốt rét P vivax khi dùng

PQ [30] Ngoài ra, sự góp phần các cơn tái phát lặp đi lặp lại của P vivax vào tỷ

lệ mắc bệnh và tử vong cũng như lan truyền bệnh cũng nên xem xét Về mặt thực hành, nên có công cụ chẩn đoán tại chỗ về tình trạng thiếu enzyme G6PD

khi gặp ca nhiễm P vivax và hiện nay Chương trình Sốt rét toàn cầu của Tổ

chức Y tế thế giới đang đánh giá vai trò các công cụ chẩn đoán thiếu enzyme G6PD tại chỗ về hiệu quả và chi phí

Một số vấn đề đặt ra của TCYTTG hiện nay là ứng dụng các bằng chứng sẵn có để trả lời các câu hỏi sau: (i) Mức độ thấp nhất nào của tỷ lệ thiếu enzyme G6PD mà không cần phải xét nghiệm kiểm tra enzyme G6PD khi dùng thuốc

điều trị tiệt căn sốt rét P vivax? (ii) Loại xét nghiệm nào nên dùng để phân loại

nam giới có thiếu hay bình thường enzyme G6PD? (iii) Loại xét nghiệm nào có thể dùng để xác định nữ dị hợp tử như một nguy cơ lâm sàng tan huyết khi dùng

PQ Điều này đỏi hỏi có kiến thức về mức độ thiếu enzyme G6PD (tỷ lệ thiếu G6PD trên hồng cầu, điều này có thể khác nhau trên các nữ dị hợp tử giữa 0% và 100% vì ở ngưỡng đó thuốc PQ sẽ gây các cơn tán huyết trên lâm sàng khi dùng

liều chuẩn khuyến cáo để điều trị tiệt căn sốt rét do P vivax Khi một nam giới

được phân loại thiếu enzyme G6PD hoặc khi một nữ phân loại như một thể dị hợp có tỷ lệ biểu hiện lâm sàng thiếu enzyme G6PD trên hồng cầu, hay khi thể

dị hợp G6PD không thể xem là an toàn thì khi đó quản lý ca bệnh P vivax như

mà P vivax lưu hành

Hiện tại chính sách quốc gia sử dụng thuốc PQ chống tái phát và kiểm tra

thiếu enzyme G6PD là hầu hết các quốc gia có lưu hành P vivax có khuyến cáo

dùng PQ chống tái phát theo khuyến cáo của TCYTTG, ngoại trừ 4 nước Algeria, Campuchia, Ethiopia và Somalia không khuyến cáo dùng, các nước còn lại đều dùng liều chuẩn 0,25 mg/kg mỗi ngày trong 14 ngày, hay một số khác dùng liều 0,5 mg/kg mỗi ngày trong 7 hoặc 14 ngày Một phân tích tổng hợp gần

đây cho biết hiệu lực liều 0,25 mg/kg hàng ngày (14 ngày) đối với các chủng P

vivax ôn đới và liều 0,5 mg/kg hàng ngày (14 ngày) đới với các chủng nhiệt đới

để ngăn chặn tái phát do P vivax Tuy nhiên, các chương trình của các quốc gia

có P vivax lưu hành đều đang dùng liều thấp (0,25 mg/kg/ngày trong 14 ngày)

trên nền tảng nguy cơ cao ở tổng liều hiệu lực cao Chỉ có Iran dùng liều PQ một lần một tuần 0,75 mg/kg trong 8 tuần mà không thử G6pD thường quy Việc ứng dụng liều này trên bệnh nhân mà chúng ta không biết tình trạng thiếu enzyme G6PD sẽ thay đổi ở từng quốc gia và ngay cả trong một nước thì tỷ lệ thiếu này cũng đã khác nhau tùy vùng và dân tộc

Ngoài ra, các dữ liệu về thuốc sốt rét PQ cũng được ghi nhận ở các quốc gia có khuyến cáo dùng PQ nhưng không thử enzyme G6PD, tỷ lệ kê đơn thấp

khoảng 10% trên số ca nhiễm P vivax Lý do không kê đơn PQ trong điều trị P

vivax thì rất nhiều và phức tạp, nhưng nguy cơ độc tính trên hồng cầu ở người

thiếu enzyme G6PD có thể là yếu tố chính Việc thiếu các test dùng tại thực địa

dễ dàng và phù hợp, thì việc dùng PQ sẽ khó khăn khi dùng liệu trình 14 ngày

1.7 Các biến thể thiếu enzyme G6PD và mức độ nghiêm trọng

Trên các ca có G6PD bình thường, thuốc PQ là rất an toàn, dung nạp tốt

với hiệu lực cao trong việc ngăn tái phát P vivax Thử nghiệm liều PQ 0,5

mg/kg hàng ngày trong 14 ngày chỉ định theo sau

dihydroartemisinin-piperaquine để điều trị sốt rét P vivax cấp cũng cho thấy an toàn, dung nạp tốt,

với hiệu lực chữa khỏi 98% về chặn tái phát Thuốc PQ sinh ra tán huyết trên

các bệnh nhân thiếu enzyme G6PD khi so sánh thời gian bán hủy của enzyme với mức độ tồn lưu hoạt độ enzyme G6PD có liên quan đến các biến thể di truyền G6PD Về cơ bản, độ nặng của thiếu enzyme G6PD được phân loại nhẹ hay trầm trọng, phần lớn lệ thuộc vào sự giảm hoạt tính của enzyme G6PD liên quan đến mỗi biến thể

Vào những năm 1980, TCYTTG đã đưa ra một phân loại mà trong đó xác định các biến thể thiếu G6PD hay gặp hoặc là lớp II (hoạt độ <10% so với bình thường) hay lớp III (hoạt độ >10% so với bình thường) Loại prototype của lớp

II là G6PD Mediterranean và prototype của lớp III là G6PD A- (biến thể châu Phi phổ biến) Phân loại các biến thể khác như lớp II hay lớp III thường dựa trên một vài mẫu thử tại các la bô khác nhau Liên quan giữa hoạt độ enzyme và tính nhạy cảm với tán huyết cấp là dựa trên một số lượng nghiên cứu tương đối nhỏ trên các người lớn trưởng thành khỏe mạnh dùng với PQ

Một số nghiên cứu lâm sàng chỉ ra thuốc PQ trên các cá nhân có biến thể A- hay Mediterranean rằng loại biến thể A- bị tan huyết khoảng 30% trên hồng cầu trong một tuần dùng thuốc PQ liều 0,5 mg/kg hàng ngày, nhưng sau đó bình phục trở về lượng haematocrite ban đầu và duy trì mức này dù vẫn đang dùng liều đó trong nhiều tuần nữa Sự bù trừ này được giải thích do ngẫu nhiên mà ở

đó các hồng cầu già nhất bị phá hủy và rồi được thay thế bởi các quần thể hồng cầu dung nạp tốt với thuốc PQ, điều này biểu hiện dung nạp ngay cả khi dùng liều cao PQ liên tục (30 mg mỗi ngày) Trong khi đó, người có biến thể Mediterranean không biểu hiện dung nạp vì nhiều hồng cầu non hơn có hoạt độ enzyme G6PD tồn lưu không đủ chống lại với các sang chấn oxy hóa của PQ, kết quả là thiếu máu tan máu xảy ra nghiêm trọng hơn và không thể tự giới hạn được Do đó, dù có đa dạng về mức độ thiếu enzyme G6PD, nguy cơ tán huyết

do dùng PQ cũng nên cân nhắc và để ý đến tất cả các biến thể G6PD

Liều dùng PQ hàng ngày như hiện nay được coi là tương đối an toàn trên các bệnh nhân biến thể African A- là hoàn toàn không đúng, vì diện rộng đặc

tính của các biến thể A- thường xem là nhẹ và tự giới hạn có thể khác nhau từ một số nghiên cứu cỡ mẫu nhỏ, hơn nữa trên các cá nhân là nam giới tình nguyện khỏe mạnh Có 3 type G6PD A- ở châu Phi và người ta không biết kiểu gen nào trên các cá nhân là khó cho việc dùng PQ qua các nghiên cứu tiến hành những năm 1950 và 1960 (dù kiểu gen phổ biến nhất thường là có sự thay thế nucleotide G202A) Ngoài ra, có hai ca tử vong ở Brazil bị quy kết tan máu là do dùng PQ, cả hai đều được giải phẩu tử thi và có biến thể A- Do đó, phân loại các biến thể thiếu G6PD như nhẹ và nghiêm trọng nhằm đưa ra quyết định trên lâm sàng và các nhà khoa học cho rằng liều hàng ngày PQ 0,5 mg/kg trong 14 ngày có thể tiềm năng gây tán huyết cấp trên các bệnh nhân có biến thể G6PD là A- Ngoài ra, trong việc giám sát dược cảnh giác vẫn còn giới hạn ở các quốc gia

có bệnh lưu hành, một số lượng tương đối nhỏ ấn bản về tác hại nghiêm trọng khi kê đơn PQ mà không có test G6PD vì không thấy các nguy cơ tiềm tàng này

Một số định nghĩa sau đây được đưa ra sau khi cân nhắc kỹ của nhóm chuyên gia về thiếu enzyme G6PD của Tổ chức Y tế thế giới (WHO, 2016):

- Trên nam giới: Bất cứ người nam nào có hoạt độ G6PD trên HC < 30% so với trị số trung bình bình thường được coi là thiếu G6PD Người ta ước tính đối tượng này bán dị hợp đối với một alen thiếu G6PD Bất cứ người nam nào có hoạt độ enzyme G6PD từ 30% trở lên so với mức trung bình được coi là G6PD bình thường và người ta coi đó là bán dị hợp alen G6PD bình thường;

- Trên nữ giới: Bất cứ người nữ nào có hoạt độ G6PD hồng cầu dưới 30% mức trung bình bình thường được coi là thiếu enzyme G6PD Khi đó, người ta đoán chừng hoặc là người đó có đồng hợp tử alen thiếu G6PD, hoặc có đột biến hai alen (chẳng hạn alen Viangchan và một alen Mahidol), hoặc người đó có dị hợp

tử alen thiếu G6PD, trong đó quần thể hồng cầu thiếu G6PD nổi trội hơn Bất cứ người nữ nào có hoạt độ G6PD trên hồng cầu từ 80% trở lên so với mức trung bình hay trung vị bình thường được coi là mức G6PD bình thường Người ta ước tính rằng người đó hoặc là đồng hợp tử đối với alen G6PD bình thường hoặc là

dị hợp tử của một alen thiếu G6PD và một alen G6PD bình thường, trong đó quần thể hồng cầu có mức G6PD bình thường nổi trội hơn Bất cứ phụ nữ nào có mức hoạt độ enzyme G6PD từ 30-80% so với mức G6PD bình thường thì coi như là loại bán thiếu enzyme G6PD; ước tính người đó có dị hợp tử với alen thiếu G6PD và một alen G6PD bình thường

Hơn 10 năm qua, xét nghiệm phát hiện phát quang (fluorescent spot FST) đã được coi là test định tính sàng lọc thiếu enzyme G6PD TCYTTG chấp nhận một loại test định tính G6PD mới ít nhất là tương đương kết quả với FST trong thực hành, vì đây là một test thương mại đã được dùng rộng rãi tại các la bô lâm sàng, ngân hàng máu và các bệnh về máu như an toàn truyền máu Tuy nhiên, quy trình rất phức tạp và đòi hỏi kỹ năng la bô và trang thiết bị cùng với dây chuyền lạnh cho các thuốc thử, đồng thời các test định tính sẽ không phù hợp để phát hiện các thể dị hợp thiếu enzyme G6PD ở nữ, nên sẽ có nguy cơ tan máu cấp khi dùng

test-PQ dài ngày, đồng thời test định tính sẽ không phát hiện mức độ thiếu và bán thiếu Điều đó sẽ không khả thi để sử dụng thường quy tại các vùng nhiệt đới, đặc biệt là các cơ sở y tế xa xôi mà ở đó bệnh nhân sốt rét đang có mặt và cần chẩn đoán, nên nhu cầu cần có công cụ định lượng tốt hơn và dễ sử dụng và không cần thiết bị phức tạp và phiên giải kết quả nhanh là rất thiết thực

Trong trường hợp tình trạng thiếu enzyme G6PD không được biết và test không có sẵn thì quyết định kê đơn PQ hàng ngày để ngăn ngừa tái phát xa phải dựa trên đánh giá sau: (i) Dữ liệu về tỷ lệ thiếu enzyme G6PD trên quần thể tại chỗ, (ii) Khả năng xác định và giám sát an toàn và quản lý sự tán huyết do dùng

PQ điều trị, (iii) Lợi điểm của việc điều trị để giảm số tái phát Bệnh nhân mắc

sốt rét cấp do P vivax hay P ovale mà tình trạng enzyme G6PD không biết như

thế nào thì có thể dùng liều hàng tuần 0,75 mg/kg/tuần trong 8 tuần dưới sự giám sát chặt chẽ về các triệu chứng thiếu máu tan máu cấp trong 3 tuần đầu dùng thuốc

Chương 2 ĐỔI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

- Địa điểm:

Nghiên cứu sẽ được tiến hành tại địa bàn ba xã có sốt rét lưu hành phức tạp

và thường xuyên biến động, gồm xã Ea Dăh, Đliê Ya, Ea Puk, thuộc huyện Krông Năng, tỉnh Đắk Lắk Đây là huyện có số bệnh nhân sốt rét cao nhất tỉnh Đăk Lăk năm 2019-2020 Tỉnh Đăk Lăk nằm ở Tây Nguyên Việt Nam với tổng dân số 1.872.228 người trong năm 2019 Tỉnh này nằm ở phía tây và cuối dãy Trường Sơn, là một cao nguyên rộng lớn, địa hình khá bằng phẳng, dốc thoải, có hướng thấp dần từ đông nam sang tây bắc và xen kẽ với các đồng bằng thấp ven theo các sông chính

Hình 2.1 Địa điểm nghiên cứu 3 xã thuộc huyện Krông Năng, tỉnh Đăk Lăk

Huyện Krông Năng bao phủ diện tích 615 km² với tổng dân số khoảng 127.000 người Huyện này tiếp giáp huyện Krông Pa, tỉnh Gia Lai ở phía bắc, huyện Ninh Hòa, tỉnh Khánh Hòa, và huyện Sông Hinh, Phú Yên ở phía đông

Hai huyện này có năm nhóm dân tộc thiểu số H’Mông, Ê Đê, Tày, Thái

Nguồn thu nhập chính của những người dân sống trong huyện này từ nông nghiệp bao gồm trồng lúa gần nhà hoặc ở trong rừng và sản xuất đồ nội thất trang trí và nghệ thuật Huyện có 11 trạm y tế thuộc TTYT huyện Trong năm

2020, dân số xã Ea Dah, Dliê Ya và Ea Puk lần lượt là 8.274; 16.207 và 4.935 người

Mỗi năm có hai mùa khác nhau rõ rệt trong huyện Krông Năng: mùa mưa kéo dài từ tháng 7 đến cuối tháng 12; mùa khô bắt đầu từ tháng 1 đến cuối tháng

6 Việc triển khai điều tra trong 6 tháng đầu tiên năm 2021 tại 3 xã, song song đó phân tích các mẫu thiếu enzyme G6PD về biến thể của G6PD

- Thời gian

Từ tháng 01 đến tháng 9 năm 2021

2.2 Đối tượng nghiên cứu

Quần thể dân cư đang sinh sống và làm việc tại địa bàn các xã Ea Dăh, Đ’Liê Ya, Ea Puk, người tham gia nghiên cứu với độ tuổi từ 5 tuổi trở lên, không phân biệt giới tính và dân tộc

Tiêu chuẩn lựa chọn và tiêu chuẩn loại trừ phù hợp chọn mẫu:

2.2.1 Tiêu chuẩn lựa chọn

- Trẻ em từ 5 tuổi trở lên và người lớn, không phân biệt giới tính, dân tộc;

- Bệnh nhân đồng ý tham gia nghiên cứu hoặc có sự đồng ý của cha mẹ, người thân hoặc người giám hộ trong trường hợp là trẻ em;

- Các đối tượng này đang sống, học tập, làm việc có địa chỉ tại các xã chọn;

- Đồng ý và ký giấy chấp thuận tham gia nghiên cứu

2.2.2 Tiêu chuẩn loại trừ

- Trẻ em dưới 5 tuổi (chọn để khả thi trong việc dễ lấy mẫu máu đầu ngón tay

và gót chân của trẻ em để xét nghiệm hoạt độ enzyme G6PD);

- Đang mắc bệnh cấp tính, sốt cao, thiếu máu, phụ nữ đang mang thai;

- Đối tượng không đồng ý tham gia vào nghiên cứu

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu cắt ngang mô tả;

Phân tích định lượng hoạt độ enzyme G6PD bằng công cụ cảm biến

CareStart™ G6PD biosensor (AccessBio, Mỹ)

2.3.2 Cỡ mẫu

Với tỷ lệ thiếu hoạt độ enzyme G6PD là 8,6% qua nghiên cứu trước đó tại huyện Tuy Đức, tỉnh Đăk Nông, độ nhạy kỳ vọng (ES: Expected Sensitivity) là 0,95; khoảng tin cậy 0,95% (CI95%), độ chính xác d = 0,1 và số trường hợp bị thiếu enzyme ước tính là 94 Cỡ mẫu cần thu thập tại mỗi xã tính theo công thức:

Khi đó cỡ mẫu cần điều tra tại mỗi xã là n1 = n2 = n3 = 1.094 người

Vậy tổng số 3 xã thì cần số mẫu khoảng 1.094 x 3 = 3.282 người

2.4 Kỹ thuật nghiên cứu

Phỏng vấn điều tra thông tin

- Điều tra phỏng vấn cá nhân: Tất cả đối tượng từ ≥ 15 tuổi tại điểm nghiên

cứu, các trường hợp ≥ 5 - < 15 tuổi thì phỏng vấn bố, mẹ hoặc người giám hộ;

- Thu thập các thông tin về dân số học và thông tin liên quan đến nghiên cứu về oạt độ enzyme G6PD của quần thể