Nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích chất ma túy tổng hợp (ma, mdma) bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ và ứng dụng

Một số hạn chế trong công tác xét nghiệm các chất ma túy tổng hợp hiện nay ở Việt Nam là thiết bị phân tích sử dụng chồng chéo, chưa chuyên dụng, độ nhạy chưa cao, kỹ thuật xử lý mẫu chư

ĐẶNG ĐỨC KHANH

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH CHẤT MA TÚY TỔNG HỢP (MA, MDMA) BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ KHỐI PHỔ VÀ ỨNG DỤNG

Hà Nội, 2012

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan luận văn này “Nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích

chất ma túy tổng hợp (MA, MDMA) bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ và ứng dụng” là công trình nghiên cứu của bản thân Tất cả những thông tin tham khảo dùng trong luận văn lấy từ các công trình nghiên cứu có liên quan đều được nêu rõ nguồn gốc trong danh mục tài liệu tham khảo Các kết quả nghiên cứu đưa ra trong luận văn là hoàn toàn trung thực và chưa được công bố trong bất kỳ công trình khoa học nào khác

Ngày 30 tháng 10 năm 2012

Tác giả

Đặng Đức Khanh

LỜI CẢM ƠN

Luận văn này được thực hiện tại Phòng thí nghiệm, Khoa Hóa pháp, Viện Pháp y Quân đội và Bộ môn Hóa Phân tích, Viện Kỹ thuật Hóa học, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn TS Trần Thị Thúy và TS Trần Việt Hùng đã tin tưởng, giao đề tài, tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện bản luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn Lãnh đạo chỉ huy Viện Pháp y Quân đội, cán bộ khoa Hóa pháp đã tạo điều kiện cho tôi đi học và nhiệt tình giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô bộ môn Hóa Phân tích, Viện Kỹ thuật Hóa học, ĐHBKHN đã tạo điều kiện cho tôi hoàn thành bản luận văn này

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã động viên và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn này

Hà Nội, ngày 26 tháng 10 năm 2012

Học viên

Đặng Đức Khanh

MỤC LỤC

trang DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

1.1.2.1 Công thức cấu tạo và tính chất hóa lý của MA 4 1.1.2.2 Công thức cấu tạo và tính chất hóa lý của MDMA 5 1.1.3 Tác dụng dược lý và dược động học của MA, MDMA 6

1.2.4 Kỹ thuật dẫn xuất hóa bằng tác nhân acyl 14

1.3.1 Cấu tạo của hệ thống sắc ký khí khối phổ 16 1.3.2 Kỹ thuật phân tích và ưu nhược điểm của sắc ký khí khối phổ 18 1.4 Các phương pháp phân tích ma túy tổng hợp trong mẫu dịch sinh

học

19

2.2 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị nghiên cứu 21

2.3.1 Lấy mẫu và bảo quản mẫu 23

2.3.6 Áp dụng quy trình phân tích mẫu thực tế 30

3.1 Kết quả khảo sát điều kiện phân tích GC/MS, phản ứng tạo dẫn

3.1.1 Kết quả khảo sát điều kiện phân tích GC/MS 32 3.1.2 Kết quả khảo sát độ ổn định của thiết bị phân tích GC/MS 38 3.1.3 Kết quả so sánh độ nhạy của GC/MS đối với mẫu có dẫn xuất và

3.1.4 Kết quả khảo sát độ lặp lại của phản ứng tạo dẫn xuất 41 3.1.5 Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính và LOD, LOQ 43 3.1.6 Kết quả khảo sát độ đặc hiệu của phương pháp 48 3.1.7 Kết quả khảo sát độ chính xác của quy trình phân tích 49 3.1.8 Kết quả khảo sát độ thu hồi của quy trình phân tích 52 3.2 Kết quả phân tích mẫu thực tế giám định 53

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

AM : Amphetamin

EI : Electric ionization - Ion hóa điện tử

FID Flame ionization detector – Detector ion hóa ngọn lửa

GC : Gas chromatography - Sắc ký khí

GC/MS : Gas chromatography/ mass spectrometry - Sắc ký khí khối

phổ HFBA : Heptafluorobutyric anhydride

IS : Internal standard - Chuẩn nội

LC/MS : Liquid chromatography/ mass spectrometry - Sắc ký lỏng

khối phổ LOD : Limit of detection - Giới hạn phát hiện

LOQ : Limit of quantification - Giới hạn định lượng

MA : Methamphetamin

MA-TFA : Dẫn xuất Trifluoro acetyl của MA

MDA : 3,4- methylenedioxyamphetamin

MDMA : 3,4- methylenedioxymethamphetamin

MDMA-TFA : Dẫn xuất Trifluoro acetyl của MDMA

MS Mass spectrometry – khối phổ

MSD : Mass spectrometry detector - Detector khối phổ

NPD Nitor phospho detector – Detector NPD

RSD Relative standard Deviation – Độ lệch chuẩn tương đối

SPE : Solid phase extraction - Chiết pha rắn

TCD Thermal conductivity detector – detector dẫn nhiệt

TFAA : Trifluoroacetic anhydride

tR Retention time - Thời gian lưu

DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 : Chuẩn bị mẫu hỗn hợp chất chuẩn trong mẫu máu và nước

tiểu

24

Bảng 3.1 : Mảnh phổ m/z của MA, MDA-d5, MDMA sau dẫn xuất

TFA dùng để định tính, định lượng MA, MDMA

38

Bảng 3.2 : Bảng 3.2.Kết quả khảo sát độ ổn định thiết bị thông qua thời

gian lưu

39

Bảng 3.3 : Kết quả khảo sát độ ổn định thiết bị thông qua diện tích píc 40

Bảng 3.4 : Kết quả so sánh độ nhạy của GC/MS trên mẫu có và không

dẫn xuất TFAA

41

Bảng 3.5 : Kết quả khảo sát độ lặp lại của kỹ thuật tạo dẫn xuất 42

Bảng 3.6 : Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của MA trong mẫu máu 43

Bảng 3.7 : Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của MDMA trong mẫu

Bảng 3.11 : Kết quả khảo sát độ chính xác của quy trình phân tích trên

mẫu nước tiểu

51

Bảng 3.12 : Kết quả khảo sát độ đúng của quy trình phân tích MA,

MDMA trong mẫu máu và nước tiểu

52

Bảng 3.13 : Kết quả phân tích MA, MDMA trong mẫu má và nước tiểu

giám định

53

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 : Các dạng khác nhau của ma túy tổng hợp 4

Hình 1.2 : Sơ đồ chuyển hóa của Methamphetamin 8

Hình 1.3 : Sơ đồ chuyển hóa của MDMA 10

Hình 1.5 : Sơ đồ cấu tạo và hình ảnh thiết bị vi chiết pha rắn 13

Hình 1.6 : Sơ đồ cấu tạo của thiết bị sắc ký khí khối phổ 16

Hình 1.7 : Hình ảnh cột mao quản, cấu tạo cắt ngang của cột mao quản 17

Hình 3.1 : Đồ thị chương trình nhiệt độ cột tách sắc ký 32

Hình 3.2 : (A) Sắc ký đồ của MA; (B) Phổ khối scan của MA; (C) Sắc

ký đồ của MA-TFA; (D) Phổ khối scan của MA-TFA; (E) Sắc ký đồ của m/z 154, 110, 118

34

Hình 3.3 : (A) Sắc ký đồ của MDMA; (B) Phổ khối scan của MDMA;

(C) Sắc ký đồ của MDMA-TFA; (D) Phổ khối scan của MDMA-TFA; (E) Sắc ký đồ của m/z 154, 162, 135

35

Hình 3.4 : (A) Sắc ký đồ của d5; (B) Phổ khối scan của

MDA-d5; (C) Sắc ký đồ của MDA-d5-TFA; (D) Phổ khối scan của MDA-d5-TFA; (E) Sắc ký đồ của m/z 136, 166, 167

36

Hình 3.5 : (A) Sắc ký đồ của HFB; (B) Phổ khối scan của

MA-HFB; (C) Sắc ký đồ của MDMA-MA-HFB; (D) Phổ khối scan của MDMA-HFB

37

Hình 3.6 : Đồ thị tương quan tuyến tính giữa tỷ lệ diện tích pic và tỷ lệ

lượng chất của MA/MDA-d5 trong mẫu máu

44

Hình 3.7 : Đồ thị tương quan tuyến tính giữa tỷ lệ diện tích pic và tỷ lệ 45

lượng chất của MDMA/MDA-d5 trong mẫu máu

Hình 3.8 : Đồ thị tương quan tuyến tính giữa tỷ lệ diện tích pic và tỷ lệ

lượng chất của MA/MDA-d5 trong mẫu nước tiểu

46

Hình 3.9 : Đồ thị tương quan tuyến tính giữa tỷ lệ diện tích pic và tỷ lệ

lượng chất của MDMA/MDA-d5 trong mẫu nước tiểu

47

Hình 3.10 : Sắc ký đồ phân tích mẫu mẫu máu không có chất ma túy 48

Hình 3.11 : Sắc ký đồ phân tích mẫu máu có thêm chuẩn MA, MDMA,

Phụ lục 1 : Sơ đồ phân mảnh của MA-TFA

Phụ lục 2 : Sơ đồ phân mảnh của MDMA-TFA

Phụ lục 3 : Thiết bị GC 6890N/ MS 59731 của Agilent tại Viện Pháp y Quân đội Phụ lục 4 : Phụ lục 4: Sắc ký đồ phân tích mẫu nước tiểu Blank

Phụ lục 5 : Phụ lục 5: Sắc ký đồ phân tích mẫu nước tiểu thêm chuẩn MA,

MDMA, MDA-d5 Phụ lục 6 : Phụ lục 6: Sắc ký đồ phân tích mẫu máu Vũ Thị H có MDMA

Phụ lục 7 : Kết quả xét nghiệm mẫu máu và nước tiểu đối chứng bằng LC/MS

MỞ ĐẦU

Hàng năm, các chất ma túy tổng hợp được vận chuyển trái phép vào Việt Nam với số lượng rất lớn, các chất này được sử dụng nhiều trong các vũ trường, quán bar… Các chất ma túy tổng hợp này phổ biến phải được kể đến như amphetamin (AM), methamphetamin (MA), 3,4-methylenedioxyamphetamine (MDA), 3,4- methylenedioxymethamphetamine (MDMA) Những loại ma túy này vẫn lưu thông trên thị trường một cách bất hợp pháp dưới dạng viên, bột tinh thể với các tên gọi Yinyang, Adam, Eva, Love, VW, Ice, Mọi da đỏ, Mè đen, Tên lửa, Thiên thần, viên lắc, thuốc lắc, viên chúa, viên hoàng hậu, ecstasy, mecsydes, đá …

Đối tượng sử dụng các chất ma tuý tổng hợp hiện nay tập trung chủ yếu là tầng lớp thanh niên, trung niên sống ở Thành phố, thị xã Số người sử dụng ma tuý tăng cao có ảnh hưởng xấu tới trật tự an ninh xã hội Sử dụng ma túy tổng hợp thường tụ tập theo nhóm đông người ở các vũ trường, quán bar hay nhà nghỉ, nhà riêng

Có rất nhiều các kỹ thuật xử lý mẫu và phương pháp để định tính, định lượng các chất ma túy tổng hợp Hiện nay ở Việt Nam xét nghiệm ma túy thường sử dụng các phương pháp như sắc ký lỏng, sắc ký khí khối phổ, kỹ thuật xử lý mẫu như chiết lỏng lỏng, chiết pha rắn, vi chiết pha rắn Một số hạn chế trong công tác xét nghiệm các chất ma túy tổng hợp hiện nay ở Việt Nam là thiết bị phân tích sử dụng chồng chéo, chưa chuyên dụng, độ nhạy chưa cao, kỹ thuật xử lý mẫu chưa được nghiên cứu đầy đủ và toàn diện, hệ thống chất chuẩn và nội chuẩn chưa đáp ứng được yêu cầu Từ những lý do trên dẫn đến chất lượng kết quả xét nghiệm các chất ma túy chưa cao

Các chất ma túy trong mẫu dịch sinh học thường có nồng độ thấp, lượng mẫu lấy phân tích thường xuyên không nhiều Do đó cần có sự kết hợp tốt giữa kỹ thuật xử lý mẫu và phương pháp phân tích Sự kết hợp chặt chẽ giữa kỹ thuật xử lý

mẫu và phương pháp phân tích sẽ cho phép phát hiện được các chất ma túy tổng hợp có nồng độ thấp

Xuất phát từ những lý do trên tôi tiến hành đề tài “ Nghiên cứu xây dựng

quy trình phân tích chất ma túy tổng hợp (MA, MDMA) bằng phương pháp sắc

ký khí khối phổ và ứng dụng ”

Nội dung nghiên cứu chính của đề tài: :

Nghiên cứu ứng dụng phương pháp GC/MS để phân tích các chất ma túy tổng hợp MA, MDMA cho kết quả chính xác nhờ vào việc so sánh cả thời gian lưu

và phổ khối của chất phân tích với chất chuẩn.[8, 14]

Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật SPE sử dụng chất hấp phụ C8 dùng để chiết,

và làm sạch MA, MDMA từ mẫu máu và nước tiểu

Tạo dẫn xuất TFA vào nhóm amin của chất MA, MDMA làm tăng khả năng bay hơi của chất phân tích, giúp phù hợp hơn trong quá trình phân tích sắc ký, tăng

độ nhạy cho thiết bị phân tích sắc ký [1]

Quy trình sử dụng chất nội chuẩn đánh dấu d5 (MDA-d5) cho vào mẫu máu và nước tiểu ngay từ đầu trước khi tiến hành các bước xử lý mẫu sẽ giúp loại ảnh hưởng sai số trong các thao tác phân tích, tăng độ chính xác của kết quả đo

3,4-methylenedioxyamphetamin-Ứng dụng quy trình đã xây dựng và khảo sát tiến hành phân tích mẫu thực tế giám định ma túy tổng hợp tại Viện Pháp y Quân đội

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về ma túy

1.1.1 Định nghĩa và phân loại [6,9]

*Định nghĩa:

Các chất ma túy là các chất có nguồn gốc tự nhiên hay tổng hợp, khi xâm nhập vào cơ thể sẽ làm thay đổi trạng thái ý thức, trí tuệ Nếu dùng lặp lại nhiều lần

sẽ làm cho người dùng lệ thuộc vào nó, gây nguy hại cho cá nhân và cho cộng đồng

*Phân loại các chất ma túy:

Các chất ma túy có thể phân loại theo những cách sau đây:

-Phân loại theo nguồn gốc -Phân loại theo tác dụng dược lý -Phân loại theo cấu trúc hóa học -Phân loại theo cách thức sử dụng Tuy nhiên hiện nay trên thế giới, cách phân loại ma túy theo nguồn gốc và tác dụng dược lý là phổ biến

*Phân loại dựa theo nguồn gốc

Các chất ma túy được phân loại theo nguồn gốc gồm có 3 nhóm chính:

Nguồn gốc tự nhiên: gồm các chất ma túy được chiết xuất từ nguyên liệu có

nguồn gốc tự nhiên, như canabinols trong cây cần sa, morphin trong cây thuốc phiện, …

Nguồn gốc bán tổng hợp: là các chất ma túy có nguồn gốc tự nhiên được

tổng hợp thêm 1 hoặc vài nhóm chức như heroin được tổng hợp từ morphin

Nguồn gốc tổng hợp: Gồm các chất ma túy có nguồn gốc tổng hợp như

amphetamin (AM), methylamphetamin (MA), MDA, MDMA, diazepam, …

Các chất ma túy có nguồn gốc tổng hợp được phân loại theo dược lý gồm các nhóm chất khác nhau như: Nhóm kích thích thần kinh trung ương như AM, MA, MDA, MDMA, …, nhóm gây trầm cảm như diazepam, dẫn xuất phenothiazin, …

1.1.2 Tổng quan về MA, MDMA

1.1.2.1 Công thức cấu tạo và tính chất hóa lý của MA [1,2,25]

Methamphetamin (MA) là chất ma túy tổng hợp được sử dụng một cách rộng rãi hiện nay do tác dụng mạnh lên hệ thần kinh trung ương đồng thời MA rất dễ dàng tổng hợp MA có rất nhiều dạng trên thị trường tự do, ngoài ở dạng viên có chứa nhiều tạp chất với đủ màu sắc, ký hiệu khác nhau thì MA còn có mặt trên thị trường dưới dạng tinh thể có độ tinh khiết cao, dạng này thường được “dân bay” gọi

là “đá”

Hình 1.1 Các dạng khác nhau của ma túy tổng hợp

Công thức cấu tạo, tính chất vật lý và hóa học của MA

- Tên hóa học theo (IUPAC) lµ (S)-N-Methyl-1-phenyl-propan-2-amin

- Công thức phân tử:C10H15N

- Công thức cấu tạo của MA:

*Tính chất vật lý

- Khối lượng phân tử: 149,23 g/mol

- Tính chất: Chất lỏng không màu, trong, ít tan trong nước, tan trong ethanol,

cloroform và ethylacetate…

- Dạng muối HCl, sunfat là bột kết tinh màu trắng, hoặc tinh thể không màu

tan tốt trong nước

*Tính chất hóa học

MA là chất hữu cơ có nhóm chức amin bậc 2, tồn tại ở cả hai dạng là base và

muối của các acid khác nhau như HCl, H2SO4,…

MA có nhóm chức amin bậc 2 nên dễ dàng tham gia phản ứng acyl hóa với 1

anhydride acid để tạo amide, phản ứng thực hiện trong điều kiện bình thường mà

không cần xúc tác, xảy ra nhanh

1.1.2.2 Công thức cấu tạo và tính chất hóa lý của MDMA [2,25]

MDMA là một loại ma túy tổng hợp có khả năng gây ảo giác mạnh, khi sử

dụng ở liều cao dễ gây ra chứng hoang tưởng, loạn thần, trí nhớ giảm sút,… Trên

thị trường tự do hiện nay xuất hiện chủ yếu MDMA dưới dạng viên có hàm lượng

khác nhau, với đủ màu sắc và ký hiệu riêng, ít thấy ở dạng tinh thể tinh khiết

*Công thức cấu tạo, tính chất vật lý và hóa học của MDMA

- Tên hoá học theo (IUPAC) là

(RS)-1-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-N-methylpropan-2-amine

- Công thức phân tử:C11H15NO2

- Công thức cấu tạo của MDMA

*Tính chất vật lý

- Khối lượng phân tử : 193,25g/mol

- UVmax (ethanol): 286nm

- Nhiệt độ nóng chảy:

+ 147 - 148ºC (tinh thể HCl từ isopropanol/ n-hexan)

+ 152 - 153°C (tinh thể HCl từ isopropanol/ ether)

- Chất lỏng không màu, trong, ít tan trong nước, tan trong ethanol, cloroform

và ethylacetate…

- Dạng muối HCl, sunfat là bột kết tinh màu trắng, hoặc tinh thể không màu tan tốt trong nước

*Tính chất hóa học: tương tự như MA

1.1.3 Tác dụng dược lý và dược động học của MA, MDMA [1,2,10,11]

1.1.3.1 Tác dụng dược lý

MA và MDMA có tác dụng nhanh làm kích thích thần kinh trung ương, thời gian tác dụng khoảng 4 đến 8 giờ Khả năng tác dụng tăng lên khi dùng kết hợp với một số nhóm thuốc khác như caffein, cocain, nhóm opiates, … Tuy nhiên MDMA gây ra tác dụng mạnh hơn MA nhiều lần

Các tác dụng của MA và MDMA sau khi vào cơ thể khoảng 15 phút tùy vào cách thức, thường gặp là tinh thần sảng khoái, tỉnh táo, phấn chấn tinh thần, nhanh nhẹn, tăng tính năng động, tăng vận động, giảm mệt mỏi, dịu đau Vì cảm giác đó nên người đã sử dụng có xu hướng thèm muốn tiếp tục sử dụng hết lần này đến lần khác dẫn đến nghiện Khi vào cơ thể MA, MDMA làm gia tăng giải phóng hoặc ức chế tái hấp thu serotonin (5-HT), dopamin (DA) và norepinephrin (NE) trước synap bằng cách gắn vào các Receptor 5-HT2A trên màng tế bào do đó ngăn chặn việc hấp thu, vận chuyển 5-HT, DA, NE vào các bọng lưu trữ Chính sự cạn kiệt chất dẫn truyền serotonin khiến các tế bào thần kinh bị chết Việc sử dụng chúng thường

xuyên trong thời gian ngắn cũng sẽ huỷ hoại các tế bào sản xuất dopamin (chất kiểm soát nhận thức và tình cảm) trong não

Tác dụng không mong muốn:

*Trên thần kinh: rối loạn ý thức nhẹ, rối loạn nhận thức màu sắc và âm thanh,

mất điều hòa thân nhiệt, mất ngủ, ảo giác

*Trên tim mạch: Huyết áp tâm thu tăng 40mm Hg, nhịp tim tăng 30 lần/phút,

gây hiện tương co mạch làm tăng huyết áp

*Các triệu chứng khác: buồn nôn, nôn, tiểu nhiều, rung giật nhãn cầu, tình

trạng thiếu oxy tạm thời

Quá liều: các triệu chứng khi quá liều MDMA bao gồm: rối loạn hành vi, rối loạn thân nhiệt, tiêu cơ vân, đông mạch, mất chức năng thận cấp tính, xuất huyết não,hoại tử gan, thậm chí tử vong

1.1.3.2 Dược động học

*Dược động học của MA

Hấp thu và phân bố: MA dễ dàng hấp thu qua đường uống và phân bố nhanh

vào máu Đào thải chủ yếu qua đường nước tiểu và phụ thuộc vào pH của nước tiểu Đào thải nhiều hơn khi nước tiểu axit và giảm khi nước tiểu kiềm Thời gian bán thải của methamphetamin là 10 giờ

Chuyển hóa: Khi uống MA, trong 24 giờ đầu nó được đào thải qua nước tiểu

43% ở dạng không biến đổi, 15% ở dạng 4-hydroxy- methamphetamin, 5% ở dạng amphetamin và một số chất chuyển hoá khác cũng được tìm thấy dưới dạng biến đổi hoặc kết hợp

Hình 1.2 Sơ đồ chuyển hoá của methamphetamin

*Dược động học của MDMA

Hấp thu và phân bố: MDMA dễ dàng hấp thu qua đường uống Với liều 75,

125mg trên người khỏe mạnh thì Cmax lần lượt là 130,6, 236,4 ng/mL và đạt Cmaxtrong huyết tương sau 1,8 và 2,4h Nồng độ khá thấp do đó thuốc dễ đi vào các mô

và liên kết với các thành phần trong mô

CH2C

CH 3

H NH 2

OH H

OH

HYDROXYNOREPHEDRINE

C N C H H

Chuyển hóa: MDMA được chuyển hóa ở gan theo 2 con đường chính:

+ Khử methyl ở vị trí O bởi enzym methyl hóa catechol-O-methyl transferase và hoặc liên hợp với glucuronat/ sulfat Quá trình này bị ức chế bởi isoenzym CYP2D6 Chuyển hóa chậm có thể làm tăng độc tính của MDMA

+ Đề alkyl hóa ở vị trí N, khử amin và oxi hóa tạo thành các dẫn xuất của acid benzoic liên hợp với glycin

Một số sản phẩm chuyển hóa của MDMA vẫn còn hoạt tính, đặc biệt là các chất chuyển hóa lần đầu (ví dụ MDA) do đó thời gian tác dụng dài hơn thời gian tác dụng của chính MDMA Sản phẩm chuyển hóa của MDMA là HHMA, HMMA, MDA, 4-hydroxy-3-methoxy2methamphetamin trong đó chủ yếu là 4-hydroxy-3-methoxymethamphetamin có thể được tìm thấy cả trong máu và nươc tiểu

Thải trừ: thuốc thải trừ chậm Với liều 75, 125mg thời gian bán thải t1/2 lần lượt là 7,7 và 8,6h Sau 3t1/2 (khoảng 25h) thì 95% thuốc mới được thải trừ ra khỏi

cơ thế Điều này giải thích tác dụng phụ của thuốc vẫn còn sau 1 ngày sử dụng thuốc

Hình 1.3 Sơ đồ chuyển hóa của MDMA

1.2 Tổng quan về các kỹ thuật xử lý mẫu thường dùng trong phân tích ma túy

Trước khi phân tích các chất ma túy tổng hợp trong mẫu máu và nước tiểu bằng sắc ký khí khối phổ thường phải sử dụng các kỹ thuật chiết mẫu, làm sạch và dẫn xuất hóa Mục đích của chiết và làm sạch là tách chất ma túy ra khỏi mẫu dịch sinh học, loại một số tạp chất trong mẫu dịch sinh học có ảnh hưởng đến quá trình phân tích, kỹ thuật dẫn xuất hóa mẫu làm tăng độ nhạy của phép phân tích, phù hợp hơn với điều kiện phân tích sắc ký Một số các kỹ thuật sử dụng là chiết lỏng lỏng, chiết pha rắn, vi chiết pha rắn, dẫn xuất nhóm amine bằng tác nhân acyl hóa

1.2.1 Kỹ thuật chiết lỏng lỏng [22,24]

Chiết lỏng - lỏng là kỹ thuật đã được sử dụng từ rất lâu trong phòng thí nghiệm Là kỹ thuật được dùng rất phổ biến để chuyển chất phân tích hòa tan trong một dung môi hoặc mẫu dạng lỏng sang 1 dung môi thứ hai không hòa tan trong dung môi thứ nhất Các dung môi thường sử dụng để chiết các chất ma túy tổng hợp

là ethylacetat, chloroform, diclomethan, aceton…hoặc có thể kết hợp dung môi theo

tỷ lệ thích hợp làm tăng hiệu suất chiết Dịch chiết sau đó được tinh khiết hoá bằng các chất hấp phụ làm sạch khác nhau như silicagel, florisil, nhôm oxit, C18…., tuỳ từng đối tượng mẫu mà chọn các chất hấp phụ khác nhau Phương pháp này đơn giản nhưng tốn dung môi, thời gian phân tích và có ảnh hưởng nguy hại đến con người do sử dụng các dung môi chiết

1.2.2 Kỹ thuật chiết pha rắn [20,21,22]

Chiết pha rắn (SPE) là kỹ thuật xử lý mẫu dựa trên nguyên tắc của sắc ký lỏng nhằm loại các chất ảnh hưởng của nền hoặc làm giàu các chất cần phân tích trước khi tiến hành phân tích

Kỹ thuật này dùng để chiết trực tiếp mẫu lỏng hoặc làm sạch chất phân tích

đã được chiết bằng dung môi theo kỹ thuật khác Kỹ thuật SPE dùng để làm giàu mẫu Thông thường nồng độ chất phân tích trong mẫu quá thấp không phù hợp cho việc phân tích GC do đó cần phải sử dụng kỹ thuật SPE để làm giàu chất phân tích đến mức nào đó đủ để phát hiện cũng như loại bỏ tạp chất không quan tâm ra khỏi chất phân tích

Kỹ thuật chiết pha rắn có sự thay đổi lớn trong một số những năm gần đây như các loại chất hấp phụ dùng cho mẫu sinh học tăng lên rất nhiều, có khả năng

tự động hóa Một số nhà sản xuất đã đưa ra thiết bị có khả năng tự động hóa trong quá trình chuẩn bị mẫu dịch sinh học

* Cơ chế chiết: Tương tự sắc ký lỏng gồm pha thuận, pha đảo và trao đổi ion Pha

tĩnh thường dùng là silicagel, Florisil®, oxit nhôm, C8, C18, …

* Áp dụng: Sử dụng SPE để chiết, làm sạch và làm giàu chất phân tích hiện rất

phổ biến, SPE được sử dụng để chiết và làm sạch hóa chất bảo vệ thực vật, các chất ma túy, các loại thuốc … từ các mẫu nước tiểu, máu, dược liêu…

Để làm sạch mẫu bằng SPE thường qua 4 bước

Bước 1- Điều kiện hoạt hóa cột (luyện cột): Luyện cột chiết pha rắn nhằm hoạt hóa

cột chuẩn bị nhận mẫu

Bước 2- Chuyển mẫu vào cột chiết: Chuyển mẫu chiết lên cột, sau đó sử dụng áp

suất giảm hoặc để mẫu tự chảy với tốc độ khoảng 1-3 ml/phút tùy thể tích cột

Bước 3- Loại tạp chất: Sử dụng dung môi hoặc hỗn hợp dung môi thích hợp để rửa

giải tạp chất bẩn ra trước,

Bước 4- Rửa giải hợp chất cần phân tích: Sử dụng lượng nhỏ dung môi hữu cơ mà

nó chỉ rửa giải hay chiết các hợp chất quan tâm và để lại tạp chất không loại được trong quá trình rửa

Kỹ thuật chiết pha rắn có những ưu điểm sau:

-Chất phân tích được thu hồi cao và nhiễm bẩn ít

-Lượng dung môi dùng ít, do đó tiết kiệm kinh phí và ít ảnh hưởng đến người làm -Thời gian xử lý mẫu nhanh, có thể làm nhiều mẫu cùng lúc

Hoạt hoá Nạp mẫu Loại tạp chất Rửa giải

Hình 1.4: Các bước tiến hành SPE

-Dễ tự động hóa quá trình phân tích

-Tính chọn lọc tốt

1.2.3 Kỹ thuật vi chiết pha rắn [8,18]

Kỹ thuật vi chiết pha rắn (SPME) dựa trên cơ chế hấp phụ của chất phân tích

từ pha nước hoặc pha khí lên sợi pha tĩnh được phủ hay tẩm chất hấp phụ nh polydimethylsiloxan …

Vi chiết pha rắn là kỹ thuật chiết mới phát triển, trong đó, những chất phân tích được hấp phụ trực tiếp từ mẫu trên đầu sợi silica được phủ pha tĩnh thích hợp Quá trình hấp phụ trên sợi xảy ra trong nền mẫu hoặc trong khoảng không gian hơi trên mẫu Việc chiết dựa trên sự phân tách chất phân tích giữa pha tĩnh và nền mẫu Chất phân tích được hấp phụ trên sợi cho đến khi đạt tới cân bằng Sợi sau đó được đưa vào trong buồng tiêm mẫu của máy sắc ký khí (GC), tại đó, nó được đun nóng

và những chất phân tích được giải hấp bằng nhiệt

Trong vài năm gần đây, có nhiều nghiên cứu ứng dụng SPME, và kỹ thuật này ngày càng được sử dụng nhiều Ban đầu SPME chỉ được thực hiện với những mẫu nước Gần đây, SPME thể hiện khả năng ứng dụng cao khi phân tích những mẫu sinh học như nước tiểu

1.2.4 Kỹ thuật dẫn xuất hóa bằng tác nhân acyl [8,21,22]

Các chất hữu cơ muốn phân tích được bằng phương pháp sắc ký khí thì mẫu phải chuyển thành dạng hơi ở điều kiện nhiệt độ làm việc của thiết bị Tuy nhiên một số nhóm chất thường khó thực hiện được do khả năng bay hơi kém như axits amin, axit béo, … Do đó, để phân tích được các hợp chất này bằng phương pháp sắc ký khí thì chúng phải được chuyển hóa để tạo dẫn xuất dễ bay hơi hơn Ví dụ amine chuyển hóa tạo thành amide, axit chuyển hóa tạo thành ester, … Ngoài việc làm tăng khả năng bay hơi của chất phân tích thì phương pháp dẫn xuất hóa còn cho phép chuyển hóa những nhóm phân cực thành những nhóm ít phân cực hơn để hạn chế khả năng hấp phụ trong quá trình sắc ký

Ngoài việc làm tăng khả năng bay hơi của mẫu thì kỹ thuật dẫn xuất hoá thường áp dụng cho việc phân tích các chất có nồng độ thấp, tăng độ phát hiện các chất trong mẫu dịch sinh học có tạp chất lớn Sau khi tạo dẫn xuất thì khả năng thích ứng với thiết bị sắc ký, detector là tốt hơn, tạo nên các pic cân đối hơn

Mục tiêu của dẫn xuất hoá:

- Tạo các hợp chất mới phù hợp hơn cho phân tích (tăng khả năng bay hơi, bền nhiệt …)

- Làm tăng hiệu quả sắc ký (Thay đổi thời gian lưu, giảm hoặc loại bỏ doãng pic, tăng độ phân giải và hệ số đối xứng )

- Tăng khả năng phát hiện Dẫn xuất hoá bằng tác nhân Acyl

Phản ứng acyl hoá xảy ra khi nhóm chức alcol (OH), thiol (SH), amine (NH) phản ứng với 1 acid anhydride, phản ứng này tạo este, thioeste, amit tương ứng và phụ thuộc vào tác nhân dẫn xuất hoá là axit hoặc amidazole Phản ứng xảy ra gần như hoàn toàn mà không cần xúc tác Phản ứng này làm tăng độ nhạy của detector khối phổ, cộng kết điện tử

Phương trình phản ứng minh hoạ:

R1NH2 + (R2CO)2O = R1NHOCR2 + R2COOH

Tác nhân dẫn xuất hoá phải được loại bỏ khỏi mẫu bằng cách làm bay hơi dưới dòng khí nitơ trước khi bơm vào hệ thống GC Sau khi làm bay hơi hết tác nhân dẫn xuất hoá, tiến hành hoà tan chất lại bằng dung môi thích hợp như ethyl acetate

Các tác nhân dẫn xuất hiện nay thường sử dụng để tạo dẫn xuất với nhóm amin của ma túy tổng hợp là TFAA, HFBA, …

1.3 Tổng quan về sắc ký khí khối phổ [8,14,17,19]

Phương pháp phân tích sắc ký khí detector khối phổ là một phương pháp phân tích hóa lý được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành khoa học hiện nay như y dược học, hóa học, hình sự, môi trường, Đây là phương pháp phân tích hiện đại,

có độ chính xác cao thường được dùng để khẳng định các kết quả cuối cùng của phép phân tích lượng vết

Thiết bị phân tích sắc ký khí khối phổ gồm có thiết bị sắc ký khí kết nối với detector khối phổ Mẫu sau khi được tách trên cột phân tích của thiết bị sắc ký khí

sẽ được detector khối phổ (MSD) nhận biết và cho ra kết quả dưới dạng sắc ký đồ

và phổ khối Kết quả nhận biết của detector khối phổ có ưu điểm hơn các detector khác là ngoài việc cho thông tin về thời gian lưu, diện tích píc của chất thì còn cho thông tin về phổ khối lượng của chất, từ đó sẽ giúp cho định tính các chất chính xác hơn hay so sánh với thư viện phổ để phát hiện ra các chất cần thiết khác

Như vậy đề tài sử dụng phương pháp sắc ký khí khối phổ sẽ giúp cho việc định tính, định lượng các chất ma túy tổng hợp một cách chính xác dựa vào kỹ thuật phân tích lựa chọn các mảnh phổ khối của từng chất (SIM), mảnh phổ lựa chọn để phân tích phải có tính chất đặc trưng và là mảnh có tín hiệu cao nhất Kỹ thuật phân tích Scan của khối phổ cho phép thu nhận toàn bộ các mảnh phổ khổi của chất phân tích thể hiện trên từng píc, dựa vào thư viện phổ sẽ cho chúng ta biết được píc đó là chất gì, như vậy kỹ thuật scan sẽ cho phép phát hiện một số chất chuyển hóa trong các giai đoạn khác nhau sau khi sử dụng ma túy tổng hợp

1.3.1 Cấu tạo của hệ thống sắc ký khí khối phổ

Cấu tạo của thiết bị sắc ký khí (GC) khối phổ (MS) gồm có các bộ phận như sau:

1: Nguồn khí mang

2: Bơm chân không

3: Buồng bơm mẫu

4: Lò điều nhiệt

5: Cột tách sắc ký

6: Detector MS

7: Thiết bị thu nhận và xử lý tín hiệu

Hình 1.6 Sơ đồ cấu tạo của thiết bị sắc ký khí khối phổ

Nguồn khí mang: Thiết bị sắc ký khí kết nối detector khối phổ chỉ sử dụng

khí trơ là heli hoặc hydro Các khí này có độ tinh khiết cao (99,999%), nguồn khí phải có van điều chỉnh áp suất và phải được nối với các hệ thống lọc khí trước khi vào thiết bị sắc ký Với khí hydro hiện nay thường có máy sinh khí, còn khí heli vẫn được nạp trong chai Nguồn khí mang này dùng để tách các cấu tử trong cột sắc ký

và tốc độ dòng khí được điều khiển bằng điện

Bơm chân không: Có nhiệm vụ tạo môi trường chân không trong buồng ion

hóa mẫu đạt khoảng 10-5 torr trong MSD Thiết bị sắc ký trước đây sử dụng 2 bơm gồm sơ cấp và thứ cấp do đó thời gian đạt được áp suất làm việc mất dài hơn 2 giờ Hiện nay các nhà sản xuất sử dụng bơm turbo do đó thời gian đạt được áp suất làm việc nhanh hơn rất nhiều

Cột sắc ký khí: Là bộ phận rất quan trọng của thiết bị sắc ký, được thể hiện

thông qua khả năng lưu giữ và tách các chất trong mẫu phân tích Cột phân tích hay được ví như là trái tim của hệ thống sắc ký khí Có hai loại cột phổ biến là cột nhồi

và cột mao quản Cột nhồi thường có kích thước đường kính lớn hơn nhưng độ dài lại ngắn hơn cột mao quản, do đó khả năng tách chất cũng như hiệu quả phân tích của cột nhồi thấp hơn cột mao quản rất nhiều Do vậy, ngày nay phần lớn các cột

GC được sử dụng là cột mao quản

Các thông số quan trọng của cột phân tích mao quản gồm có: thành phần và

độ dày pha tĩnh, đường kính trong của cột, chiều dài cột Tùy theo tính chất của các chất phân tích mà sẽ lựa chọn cột sao cho phù hợp Cột phân tích có độ phân cực cao như HP-inowax, DB-wax, … thường là các loại cột chứa pha tĩnh là polyethylene glycol, hoặc có thêm các thành phần khác như nitroterephthalic… Các loại cột có độ phân cực thấp như HP-1, HP5, …thường là chứa pha tĩnh dimethylpolysiloxane hoặc có thêm các thành phần là phenyl, …

Lò điều nhiệt: Là bộ phân gia nhiệt cho cột tách sắc ký giúp cho các cấu tử

tách ra trong cột sắc ký, quá trình tách sắc ký ngoài việc dựa vào yếu tố là dòng khí mang, bản chất pha tĩnh còn dựa vào tốc độ gia nhiệt của lò Lò điều nhiệt được điều khiển bằng nút trực tiếp hoặc phần mềm trên máy tính, bên trong lò điều nhiệt còn có sensor nhiệt

Detector khối phổ (MSD): Hoạt động của detector khối phổ dựa trên nguyên

tắc bẻ gẫy phân tử chất phân tích thành các mảnh ion có tỷ số m/z xác định và đặc trưng cho chất phân tích Có hai loại kỹ thuật ion hóa mẫu là ion hóa điện tử (EI) và ion hóa hóa học Kỹ thuật EI được sử dụng phổ biến, đơn giản hiện nay

Khi mẫu ở dạng khí đi vào vùng ion hóa, tại đây mẫu tương tác với chùm electron có nguồn năng lượng cao cỡ 70 eV để tạo ra các electron thứ cấp mang điện tích dương và một số phân mảnh nhỏ hơn của phân tử Sau quá trình ion hóa, các ion sẽ được thu nhận bởi một lăng kính mang điện dẫn vào trong bộ phân tích khối Các ion khác nhau sẽ được phân tách do sự khác nhau về tỷ số khối lượng hạt trên điện tích (m/z) Sau khi các ion tạo thành đã được tách, detector (thường là bộ nhân điện tử loại dynod liên tục), được sử dụng để "đếm" các ion, hình thành nên phổ khối Ion từ bộ phân tích khối va chạm vào bề mặt bán dẫn của detector giải phóng các điện tử, cứ như thế sẽ nhân lên thành dòng thác điện tử, dẫn tới hệ số khuếch đại có thể tới 1 triệu lần

1.3.2 Kỹ thuật phân tích và ưu nhược điểm của sắc ký khí khối phổ

Có hai chế độ trong phân tích GC/MS là quét toàn bộ các ion như SCAN hoặc chỉ lựa chọn một số ion giàu hay đặc trưng để quét (SIM) Chế độ SCAN thường dùng để định tính các chất chưa biết nhờ việc so sánh với thư viện phổ hoặc chất chuẩn hoặc dùng để xác định thời gian lưu của chất Hiện tại, các thiết bị GC/MS sử dụng máy tính có thể cập nhật trong thư viện phổ trên 350.000 chất Do mất một khoảng thời gian nhất định để quét toàn bộ các ion, độ nhạy trong chế độ SCAN thường thấp hơn chế độ SIM Ở chế độ SIM, chỉ vài ion xác định được lựa chọn để quét, tốc độ thu thập số liệu sẽ nhanh hơn, tương ứng với khoảng thời gian

của một píc sắc ký (1 giây), như vậy kết quả định lượng sẽ tốt hơn và độ nhạy được cải thiện nhiều

Ứng dụng: GC/MS thường được sử dụng để phân tích các chất hữu cơ có khả năng

bay hơi ở nhiệt độ dưới 350oC, có khối lượng phân tử nhỏ hơn 600 đvC

Ưu điểm: Kết hợp ưu điểm của cả GC và MS, tính năng phân tích nhanh và độ

phân giải cao của sắc ký khí được bảo toàn MS cung cấp độ nhạy cả phân tích định tính và định lượng ở mức ppb đến ppt Dữ liệu phân tích được lưu dữ đầy đủ ở dạng phổ khố

Nhược điểm: GC/MS là thiết bị phân tích đắt, vận hành phức tạp hơn sắc ký khí

thông thường

1.4 Các phương pháp phân tích ma túy tổng hợp trong mẫu dịch sinh học

*Phương pháp kiểm tra nhanh (test nhanh)

Phương pháp test nhanh thường dùng để sàng lọc trước khi phân tích, kết quả test nhanh thường cho kết quả không chính xác do có sự phản ứng chéo của một số nhóm chất, kết quả không chỉ ra chính xác là chất gì và hàm lượng là bao nhiêu Do

đó, nếu kết quả test nhanh mà dương tính phải được phân tích lại bằng phương pháp khác có độ tin cậy cao hơn như GC/MS hoặc LC/MS

*Phương pháp sắc ký lớp mỏng

Giới hạn phát hiện cao do đó cần lượng mẫu phân tích lớn, mẫu có nồng độ các chất phân tích cao, phương pháp này rất khó cho chúng ta biết được chính xác là chất gì, độ chính xác thấp khi dùng để định lượng Do phát hiện chất bằng thuốc thử hiện mầu nên dễ phản ứng chéo giữa các chất có cùng nhóm chức

*Phương pháp sắc ký lỏng và sắc ký lỏng khối phổ

Phương pháp sắc ký lỏng hay được sử dụng để phân tích các chất ma túy, tuy nhiên chúng ít được sử dụng hơn do một số nhược điểm như khả năng tách của cột kém, không tách được nhiều chất một mẫu, pha động phức tạp và đắt tiền Detector

MS trong sắc ký lỏng có độ chính xác cao, khi phân tích bằng LC/MS sẽ cho kết

quả chính xác, tuy nhiên do một số nhược điểm của LC và detector MS là vận hành khó, độ ổn định không cao, chi phí vaanh hành đắt nên kỹ thuật này cũng ít được sử dụng

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là 2 chất ma túy tổng hợp MA, MDMA

Mẫu máu và mẫu nước tiểu không có ma túy, mẫu máu và mẫu nước tiểu có cho thêm chất chuẩn ma túy

Mẫu máu và nước tiểu gửi xét nghiệm ma túy tại Viện Pháp y Quân đội

2.2 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị nghiên cứu

2.2.1 Hóa chất, chất chuẩn

Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu là tính khiết dùng cho phân tích sắc

ký của hãng Merck, … gồm: aceton, diclometan, hexan, ethanol, methanol, isopropanol, amoniac, HCl, acetic acid, KH2PO4, K2HPO4, NaOH, ethylacetate, TFAA, HFBA, khí nitơ, heli 99,999%, cột SPE C8 loại 100mg của Alltech, nước cất loại ion, …

- Dung dịch đơn chất (MA, MDMA) nồng độ 10µg/ml methanol: Lấy 2,5ml dung dịch chuẩn nồng độ 100 µg/ml cho vào bình định mức 25ml, định mức đến vạch bằng methanol

- Dung dịch đơn chất (MA, MDMA) nồng độ 5µg/ml methanol: Lấy 1,00 ml dung dịch chuẩn nồng độ 100µg/ml cho vào bình định mức 20ml, định mức đến vạch bằng methanol

- Dung dịch đơn chất (MA, MDMA) nồng độ 1µg/ml methanol: Lấy 2,5ml dung dịch chuẩn nồng độ 10µg/ml cho vào bình định mức 25ml, định mức đến vạch bằng methanol

- MDA-d5 nồng độ 2µg/ml methanol: Lấy 1,00ml dung dịch chuẩn nồng độ

100 µg/ml cho vào bình định mức 50ml, định mức đến vạch bằng methanol

- 0,1M Acetic acid: Lấy 2,86ml acid acetic vào trong bình định mức 500ml

có sẵn khoảng 300ml nước cất loại ion, định mức đến vạch bằng nước cất loại ion

- 0,1M đệm phosphate pH 6: Hoà tan 1,7g Na2HPO4 và 12,14g NaH2PO4 trong bình định mức 1000ml Chỉnh pH ở mức 6 ± 0,5 bằng dung dịch 0,1M NaH2PO4 nếu pH thấp, hoặc Na2HPO4 nếu pH cao

2.2.2 Dụng cụ và thiết bị

Dụng cụ nghiên cứu gồm có bình định mức, ống đong các loại, micropipet, ống nghiệm 10ml, vial 2ml, kim bơm mẫu và các dụng cụ cần thiết khác

Bộ chiết pha rắn 10 vị trí của Agilent

Máy gia nhiệt có độ chính xác ± 0,5oC

Bộ làm khô mẫu bằng khí nitơ

Máy ly tâm Rotina 380, tốc độ max 14000rpm

Cân phân tích Satorius độ chính xác 10 - 4g

Thiết bị phân tích sắc ký khí 6890N và detector khối phổ 5973i của hãng Agilent

Cột mao quản DB-5, dài 60m, đường kính 0,25mm, độ dày lớp film 1,0µm (pha tĩnh tẩm 5% Phenyl Methyl Siloxane)

2.3 Phương pháp nghiên cứu

- Nghiên cứu tổng quan tài liệu

- Phương pháp thống kê xử lý số liệu bằng phần mềm Exel, Chemstation

- Phương pháp sắc ký khí khối phổ

2.3.1 Lấy mẫu và bảo quản

Lấy mẫu phải đảm bảo đúng các yêu cầu như đựng trong ống nghiệm sạch, máu phải được chống đông, mẫu phải điền đầy đủ thông tin như tên, tuổi, giới tính, thời gian lấy và mã số nếu có

Mẫu máu, nước tiểu không có chứa ma túy tổng hợp được lấy của cán bộ nhân viên khoa Hóa pháp – Viện Pháp y Quân đội

Mẫu máu và nước tiểu thực tế gửi giám định ma túy nhận từ các cơ quan trưng cầu như Bệnh viện Việt Đức, Bệnh viện Hòe Nhai, Trung tâm Pháp y Vĩnh Phúc, Hải Phòng, Lạng Sơn

Mẫu máu, nước tiểu và mẫu chất chuẩn được bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt

độ 0 – 4oC

2.3.2 Chuẩn bị mẫu nghiên cứu

*Chuẩn bị mẫu chuẩn hỗn hợp có các hàm lượng khác nhau:

- Mẫu có hàm lượng MA, MDMA tương ứng là 2000ng, MDA-d5 là 200ng: Lấy 400µl dung dich chuẩn MA, MDMA có nồng độ 5µg/ml và lấy 100µl dung dịch nội chuẩn MDA-d5 có nồng độ 2µg/ml vào vial 2ml

- Mẫu có hàm lượng MA, MDMA tương ứng là 1000ng, MDA-d5 là 200ng: Lấy 200µl dung dich chuẩn MA, MDMA có nồng độ 5µg/ml và lấy 100µl dung dịch nội chuẩn MDA-d5 có nồng độ 2µg/ml vào vial 2ml

- Mẫu có hàm lượng MA, MDMA tương ứng là 250ng, MDA-d5 là 200ng: Lấy 50µl dung dich chuẩn MA, MDMA có nồng độ 5µg/ml và lấy 100µl dung dịch nội chuẩn MDA-d5 có nồng độ 2µg/ml vào vial 2ml

- Mẫu có hàm lượng MA, MDMA tương ứng là 100ng, MDA-d5 là 200ng: Lấy 100µl dung dich chuẩn MA, MDMA có nồng độ 1µg/ml và lấy 100µl dung dịch nội chuẩn MDA-d5 có nồng độ 2µg/ml vào vial 2ml

- Mẫu có hàm lượng MA, MDMA tương ứng là 50ng, MDA-d5 là 200ng:

Lấy 50µl dung dich chuẩn MA, MDMA có nồng độ 1µg/ml và lấy 100µl dung dịch nội chuẩn MDA-d5 có nồng độ 2µg/ml vào vial 2ml

- Mẫu có hàm lượng MA, MDMA tương ứng là 25ng, MDA-d5 là 200ng: Lấy 25µl dung dich chuẩn MA, MDMA có nồng độ 1µg/ml và lấy 100µl dung dịch nội chuẩn MDA-d5 có nồng độ 2µg/ml vào vial 2ml

*Chuẩn bị mẫu máu và mẫu nước tiểu thêm chuẩn

Mẫu máu và mẫu nước tiểu có chứa chất chuẩn MA, MDMA, IS được dùng

để khảo sát khoảng tuyến tính, khảo sát độ chính xác (độ lặp lại) của quy trình, khảo sát độ đúng (độ thu hồi) của quy trình Thứ tự chuẩn bị mẫu được tiến hành là thêm mẫu chuẩn vào ống nghiệm thể tích 50ml, làm bay hơi dung môi, sau cuối cùng là thêm mẫu máu hoặc nước tiểu Cách chuẩn bị mẫu máu hoặc nước tiểu thêm chuẩn được tiến hành theo bảng 2.1

Bảng 2.1 Chuẩn bị mẫu hỗn hợp chất chuẩn trong mẫu máu và nước tiểu

2.3.3 Quy trình xử lý mẫu

Xử lý mẫu là công việc quan trọng và cần thiết trước khi phân tích các chất

ma túy tổng hợp MA, MDMA trong mẫu máu và nước tiểu bằng phương pháp

GC/MS Ở giai đoạn xử lý mẫu gồm có những bước như chuẩn bị mẫu, hoạt hóa cột

chiết pha rắn, loại tạp chất, rửa giải thu lấy chất phân tích và dẫn xuất hóa Sau đây

là sơ đồ mô tả các bước xử lý mẫu trước khi phân tích MA, MDMA bằng GC/M

Sơ đồ 1: Sơ đồ tóm tắt quy trình xử lý mẫu máu, nước tiểu phân tích MA, MDMA

Bước 1: Chuẩn bị mẫu

- Ly tâm mẫu 10 phút tách lớp ở tốc độ khoảng 8000 rpm

Chuẩn bị mẫu máu, mẫu nước tiểu: Thêm chất nội chuẩn, thủy phân mẫu bằng acid và nhiệt độ, ly tâm loại bỏ cắn Bước 1

Hoạt hóa cột chiết pha rắn C8 loại 3ml bằng Methanol, H2O

và dung dịch đệm phosphate

Nạp mẫu: Cho mẫu chảy qua cột với tốc độ từ 1 – 2ml/phút

Rửa tạp chất hấp phụ trên cột C8 bằng methanol, nước,

Rửa giải thu lấy chất phân tích MA, MDMA và IS

Dẫn xuất MA, MDMA, IS bằng TFAA Bước 6

Bước 5

Bước 4

Bước 3

Bước 2

- Chuyển lớp nước vào ống nghiệm 50ml

- Thêm 500ul NaOH 2N (điểu chỉnh pH đưa về 6-7)

- Thêm 10ml dung dịch đệm 0,1M phosphate pH 6.0, lắc 10 phút

- Điều chính pH khoảng 6.0 ±0.5 bằng NaH2PO4 hoặc Na2HPO4

*Mẫu nước tiểu:

- Cho 10,00 ml nước tiểu (mẫu nước tiểu giám định, mẫu nước tiểu thêm chuẩn, mẫu nước tiểu không có ma túy) vào ống nghiệm 50ml, thêm 100µl dung dịch nội chuẩn MDA-d5 có nồng độ 2µg/ml Thêm 1ml HCl 5N, để cách thuỷ 800C trong 40 phút

- Ly tâm loại bỏ cặn

- Thêm khoảng 1ml NaOH 2N (điều chỉnh pH về 6-7)

- Thêm 5ml dung dịch đệm 0,1M phosphate pH 6.0, lắc 10 phút

- Điều chính pH khoảng 6.0 ±0.5 bằng NaH2PO4 hoặc Na2HPO4

Bước 2: Hoạt hóa cột C8

- 3ml methanol

- 3ml nước loại ion

- 1ml dung dịch đêm 0,1M phosphate, pH6

Chú ý không làm khô cột

Bước 3: Nạp mẫu qua cột C8

-Tốc độ 1-2ml/phút

Bước 4: Rửa cột loại tạp chất

- 3ml nước loại ion

- 1ml dung dịch 0,1M acid acetic trong nước cất loại ion

Bước 6: Tạo dẫn xuất TFA hoặc HFBA

- Thêm 0,1ml dung dịch 1% HCl trong Methanol vào mẫu

- Làm khô bay hơi dung môi dưới dòng khí nitơ, nhiệt độ 400C

- Thêm 200µl ethyl acetate và 35µl TFAA hoặc HFBA

- TFAA: Nhiệt độ 400C, Thời gian 15 phút

- HFBA: Nhiệt độ 600C, Thời gian 60 phút

- Làm khô dưới dòng khí nitơ, không dùng nhiệt

- Hoà tan lại mẫu bằng ethyl acetate Khoảng 100µl

Sau khi tạo dẫn xuất xong và hòa tan mẫu bằng ethylacetate, tiến hành bơm khoảng 2µl vào máy GC/MS

2.3.4 Định tính và định lượng MA, MDMA [8,13,14]

Đề tài nghiên cứu sử dụng phương pháp phân tích là GC/MS Do đó việc định tính sự có mặt của MA, MDMA trong mẫu phân tích dựa vào 2 dấu hiệu là so sánh thời gian lưu của MA, MDMA trong mẫu chuẩn với mẫu phân tích và tỷ lệ mảnh phổ của chất MA, MDMA trong mẫu chuẩn với mẫu phân tích Tỷ lệ mảnh

mẫu trên GC/MS ở chế độ Scan Hiện nay việc định tính thông thường chỉ sử dụng khoảng 3 mảnh phổ cho mỗi chất phân tích

*Định lượng

Một số kỹ thuật dùng để định lượng trong phân tích sắc ký khí là chuẩn hóa diện tích pic, ngoại chuẩn, thêm chuẩn và chuẩn nội

Chuẩn hóa diện tích pic: Kỹ thuật tính toán này coi tỷ lệ phần trăm diện tích

pic trong sắc ký đồ tương ứng với tỷ lệ phần trăm lượng chất Kỹ thuật này được dùng chủ yếu phân tích các mẫu tinh dầu, không được sử dụng trong phân tích lượng vết

Ngoại chuẩn: Kỹ thuật này tính toán dựa trên đường ngoại chuẩn được xây

dựng biểu diễn tương quan tuyến tính giữa nồng độ chất chuẩn trong dung dịch với diện tích píc sắc ký Đường ngoại chuẩn được xây dựng thường dựa vào từ 3 điểm nồng độ trở lên

Thêm chuẩn: Kỹ thuật thêm chuẩn được tính toán dựa vào nồng độ chất

chuẩn thêm vào chính mẫu đã phân tích trước đấy Kỹ thuật này không phải dựng đường ngoại chuẩn nhiều điểm Tuy nhiên mất nhiều thời gian khi phân tích nhiều mẫu hoặc tính toán giữa các ngày khác nhau

Chuẩn nội: Ngoài các kỹ thuật tính toán trên thì kỹ thuật dùng nội chuẩn để

định lượng trong phân tích sắc ký khí có độ chính xác hơn cả Kỹ thuật này loại trừ được sai số trong quá trình bơm mẫu, độ đáp ứng của detector với chất phân tích giữa các ngày khác nhau Đường nội chuẩn được xây dựng dựa vào tương quan tuyến tính giữa tỷ lệ diện tích pic và tỷ lệ lượng chất phân tích Trong phân tích GC/MS thì mảnh phổ dùng để định lượng là mảnh phổ có tín hiệu mạnh nhất tức là cho diện tích pic lớn nhất Mảnh phổ này được xác định sau khi phân tích mẫu trên GC/MS ở chế độ Scan

Đề tài định lượng chất ma túy MA và MDMA dựa vào phương trình hồi quy tuyến tính được đưa ra sau khi xây dựng đường nội chuẩn trên 6 điểm nồng độ Chất chuẩn nội được dùng là MDA-d5 Đường nội chuẩn được xây dựng dựa trên