Nghiên cứu thành phần hóa học và khảo sát một số hoạt tính sinh học của loài lycopodiella cernua (l ) pic serm và kadsura coccinea (lem ) a c sm ở việt nam

Hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập được từ loài Thông đất L.. Các công bố về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các loài thuộc chi Lycopodiella Holub.. Th

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

LÊ THỊ THÙY

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ KHẢO SÁT

MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA LOÀI

LYCOPODIELLA CERNUA (L.) PIC SERM VÀ KADSURA

COCCINEA (LEM.) A C SM Ở VIỆT NAM

Ngành: Hoá học

Mã số: 9440112

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

Hà Nội - 2022

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan luận án này là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS TS Trần Thu Hương và TS Nguyễn Hải Đăng Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa được ai công bố dưới bất kỳ hình thức nào ngoài tôi và tập thể hướng dẫn.

Hà Nội, ngày… tháng….năm ….

TS Nguyễn Hải Đăng

Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới PGS TS Trần Thu Hương và TS Nguyễn Hải Đăng – là những người Thầy đã tận tâm hướng dẫn, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thiện luận án.

Tôi xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Hoài Nam, TS Nguyễn Xuân Cường, TS Trần Thị Hồng Hạnh, TS Trần Hồng Quang và các anh chị em phòng Dược liệu biển - Viện Hóa sinh biển - Viện Hàn lâm khoa học công nghệ Việt Nam đã quan tâm, hỗ trợ tôi để có thể hoàn thành bản luận án này.

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô Bộ môn CN Hóa dược và Bảo vệ thực vật,

Bộ môn Hóa hữu cơ, các thầy cô Ban lãnh đạo Viện Kỹ Thuật Hóa học đã luôn ủng

hộ, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu Tôi xin cảm ơn anh Hào, em Hoằng ở Sapa đã giúp đỡ tôi thu thập mẫu dược liệu, em Đạt đã giúp đỡ tôi đo phổ và thử một số hoạt tính sinh học cùng các anh chị em đồng nghiệp khác đã hỗ trợ tôi trong quá trình thực hiện luận án.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới gia đình, bạn bè và những người thân đã luôn luôn quan tâm, khích lệ, động viên tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.

Và đặc biệt, xin gửi tặng món quà này đến bố mẹ kính yêu của tôi.

Xin trân trọng cảm ơn!

MỤC LỤC

Trang

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan chung về chi Lycopodiella Holub. 3

1.2 Tổng quan về loài Thông đất (Lycopodiella cernua (L.) Pic Serm.) 3

1.2.1 Đặc điểm thực vật 3

1.2.1.1 Phân loại khoa học 3

1.2.1.2 Mô tả cây 3

1.2.1.3 Phân bố, thu hái, chế biến 4

1.2.1.4 Tính vị, tác dụng, công dụng 4

1.2.2 Thành phần hóa học của loài Thông đất 4

1.2.2.1 Các nghiên cứu ngoài nước 4

1.2.2.2 Các nghiên cứu trong nước 13

1.2.3 Hoạt tính sinh học của loài Thông đất 13

1.2.3.1 Hoạt tính gây độc tế bào 13

1.2.3.2 Hoạt tính chống oxi hóa 13

1.2.3.3 Hoạt tính kháng viêm 13

1.2.3.4 Hoạt tính ức chế enzyme xanthine oxidase (XO) 14

1.2.3.5 Hoạt tính kháng nấm Candida 14

1.2.3.6 Hoạt tính ức chế acetycholinesterase 14

1.3 Tổng quan về chi Kadsura Juss. 14

1.3.1 Tổng quan chung về thành phần hóa học chi Kadsura Juss. 14

1.3.2 Các terpenoid 15

1.3.3 Flavonoid 15

1.3.4 Lignan 15

1.4 Tổng quan về loài Na rừng (Kadsura coccinea (Lem.) A C Sm.) 15

1.4.1 Đặc điểm thực vật cây Na rừng 15

1.4.1.1 Phân loại khoa học 15

1.4.1.2 Mô tả cây 16

1.4.1.3 Phân bố, thu hái, chế biến 16

1.4.1.4 Tính vị, tác dụng, công dụng 16

1.4.2 Thành phần hóa học cây Na rừng 17

1.4.2.1 Các nghiên cứu ngoài nước 17

1.4.2.2 Các nghiên cứu trong nước 22

1.4.3 Hoạt tính sinh học 22

1.4.3.1 Hoạt tính gây độc tế bào 22

iii

1.4.3.2 Hoạt tính kháng HIV 23

1.4.3.3 Hoạt tính ức chế sản sinh nitric oxide (NO) 23

1.4.3.4 Hoạt tính khác 23

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.1 Đối tượng nghiên cứu 25

2.1.1 Loài Thông đất (Lycopodiella cernua (L.) Pic Serm.) 25

2.1.2 Loài Na rừng (Kadsura coccinea (Lem.) A C Sm.) 25

2.2 Phương pháp nghiên cứu 25

2.2.1 Phương pháp phân lập chất 25

2.2.2 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học các chất 26

2.2.2.1 Góc quay cực riêng 26 2.2.2.2 Phổ khối lượng (MS) 26

2.2.2.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 26

2.2.2.4 Phổ lưỡng sắc tròn (CD) 26

2.2.3 Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học 26

2.2.3.1 Hoạt tính gây độc tế bào và ức chế sinh trưởng tế bào ung thư 26

2.2.3.2 Hoạt tính ức chế sản sinh nitric oxide (NO) 28

2.2.3.3 Phương pháp xác định cấu hình đường bằng thủy phân acid 30

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM 31

3.1 Phân lập các hợp chất từ loài Thông đất (Lycopodiella cernua (L.) Pic. Serm.) 31

3.1.1 Quy trình phân lập các chất 31

3.1.2 Thông số vật lý và dữ liệu phổ của các hợp chất phân lập từ loài Thông đất 33 3.1.2.1 Hợp chất LC1: Lycocernuaside E (hợp chất mới) 33

3.1.2.2 Hợp chất LC2: Lycocernuaside A 33

3.1.2.3 Hợp chất LC3: Bombasin 4-O-β-D-glucopyranoside 33

3.1.2.4 Hợp chất LC4: Dihydrodehydrodiconiferyl alcohol 4-O-β-D-glucopyranoside 33

3.1.2.5 Hợp chất LC5: Cedrusin 33

3.1.2.6 Hợp chất LC6: Lycernuic B (hợp chất mới) 34

3.1.2.7 Hợp chất LC7: Lycocernuic ketone F (hợp chất mới) 34

3.1.2.8 Hợp chất LC8: Lycernuic ketone C 34

3.1.2.9 Hợp chất LC9: Lycernuic ketone B 34

3.1.2.10 Hợp chất LC10: Lycoclavanol 34

3.1.2.11 Hợp chất LC11: 3-epi-lycoclavanol 34

3.1.2.12 Hợp chất LC12: Methyl lycernuate B 34

3.1.2.13 Hợp chất LC13: Lycernuic acid B 34

3.1.2.14 Hợp chất LC14: 3β,21β,24-trihydroxyserrat-14-en-16-one 34

3.1.2.15 Hợp chất LC15: Apigenin-4′-O-(2′′-O-p-coumaroyl)-β-D-glucopyranoside 34

3.1.2.16 Hợp chất LC16: Apigenin-4′-O-(6′′-O-p-coumaroyl)-β-D-glucopyranoside 35

3.1.2.17 Hợp chất LC17: Apigenin-4′-O-(2′′,6′′-di-O-trans-p-coumaroyl)-β-D-glucopyranoside 35

3.1.2.18 Hợp chất LC18: Cernuine 35

3.1.2.19 Hợp chất LC19: Lycocernuine 35

3.1.2.20 Hợp chất LC11: Cermizine C N-Oxide 35

3.2 Phân lập các chất từ loài Na rừng (Kadsura coccinea (Lem.) A C Sm.) 35 3.2.1 Quy trình phân lập chất 35

3.2.1.1 Từ thân cây 35

3.3.1.2 Từ lá cây 36

3.2.2 Thông số vật lý và dữ liệu phổ của các hợp chất phân lập từ loài Na rừng 37 3.2.2.1 Hợp chất KC1: Kadnanolactone H 37

3.2.2.2 Hợp chất KC2: Micrandiactone H 37

3.2.2.3 Hợp chất KC3: Kadcoccilactone V (hợp chất mới) 38

3.2.2.4 Hợp chất KC4: Kadnanolactone I 38

3.2.2.5 Hợp chất KC5: Kadsuracin A (hợp chất mới) 38

3.2.2.6 Hợp chất KC6: Interiotherin C 38

3.2.2.7 Hợp chất KC7: (S)-1-phenylethyl-6-α-L-arabinopyranosyl-β-D-glucopyranoside (hợp chất mới) 38

3.2.2.8 Hợp chất KC8: 3,4-dihydroxyphenylethanol-5-O-β-D-glucose 38

3.2.2.9 Hợp chất KC9: Cimidahurinine 38

3.2.2.10 Hợp chất KC10: Thalictoside 38

3.2.2.11 Hợp chất KC11: Icariside E3 39

3.2.2.12 Hợp chất KC12: Phloridzin 39

3.2.2.13 Hợp chất KC13: Seco-coccinic acid A 39

3.2.2.14 Hợp chất KC14: Seco-coccinic acid F 39

3.2.2.15 Hợp chất KC15: Schisanlactone B 39

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 40

4.1 Các hợp chất phân lập từ loài Thông đất (L.cernua) 40

4.1.1 Hợp chất LC1: Lycocernuaside E (hợp chất mới) 40

v

4.1.2 Hợp chất LC2: Lycocernuaside A 44

4.1.3 Hợp chất LC3: Bombasin 4-O-β-D-glucopyranoside 45

4.1.4 Hợp chất LC4: Dihydrodehydrodiconiferyl alcohol 4-O-β-D-glucopyranoside 47

4.1.5 Hợp chất LC5: Cedrusin 48

4.1.6 Hợp chất LC6: Lycernuic B (hợp chất mới) 49

4.1.7 Hợp chất LC7: Lycocernuic ketone F (hợp chất mới) 55

4.1.8 Hợp chất LC8: Lycernuic ketone C 61

4.1.9 Hợp chất LC9: Lycernuic ketone B 62

4.1.10 Hợp chất LC10: Lycoclavanol 63

4.1.11 Hợp chất LC11: 3-epi-lycoclavanol 65

4.1.12 Hợp chất LC12: Methyl lycernuate B 66

4.1.13 Hợp chất LC13: Lycernuic acid B 67

4.1.14 Hợp chất LC14: 3β,21β,24-trihydroxyserrat-14-en-16-one 69

4.1.15 Hợp chất LC15: Apigenin-4′-O-(2′′-O-p-coumaroyl)-β-D-glucopyranoside 70

4.1.16 Hợp chất LC16: Apigenin-4′-O-(6′′-O-p-coumaroyl)-β-D-glucopyranoside 72

4.1.17 Hợp chất LC17: Apigenin-4′-O-(2′′,6′′-di-O-trans-p-coumaroyl)-β-D-glucopyranoside 73

4.1.18 Hợp chất LC18: Cernuine 74

4.1.19 Hợp chất LC19: Lycocernuine 75

4.1.20 Hợp chất LC20: Cermizine C N-oxide 76

4.2 Các hợp chất phân lập từ loài Na rừng (K.coccinea) 78

4.2.1 Hợp chất KC1: Kadnanolactone H 78

4.2.2 Hợp chất KC2: Micrandiactone H 80

4.2.3 Hợp chất KC3: Kadcoccilactone V (hợp chất mới) 81

4.2.4 Hợp chất KC4: Kadnanolactone I 86

4.2.5 Hợp chất KC5: Kadsuracin A (hợp chất mới) 87

4.2.6 Hợp chất KC6: Interiotherin C 93

4.2.7 Hợp chất KC7: (S)-1-phenylethyl-6-α-L-arabinopyranosyl-β-D-glucopyranoside (hợp chất mới) 94

4.2.8 Hợp chất KC8: 3,4-dihydroxyphenylethanol-5-O-β-D-glucose 100

4.2.9 Hợp chất KC9: Cimidahurinine 101

4.2.10 Hợp chất KC10: Thalictoside 102

4.2.11 Hợp chất KC11: Icariside E3 103

4.2.12 Hợp chất KC12: Phloridzin 104

4.2.13 Hợp chất KC13: Seco-coccinic acid A 105

4.2.14 Hợp chất KC14: Seco-coccinic acid F 107

4.2.15 Hợp chất KC15: Schisanlactone B 108

4.3 Đánh giá hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập được 110

4.3.1 Hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập được từ loài Thông đất (L cernua) 110

4.3.1.1 Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế sản sinh nitric oxide (NO) 110

4.3.1.2 Kết quả đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư 111

4.3.2 Hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập được từ loài Na rừng (K coccinea) 112

4.3.2.1 Kết quả sàng lọc hoạt tính ức chế sản sinh nitric oxide (NO) 112

4.3.2.2 Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế sinh trưởng tế bào ung thư 113

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 115

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN 117

TÀI LIỆU THAM KHẢO 118

vii

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan chung về chi Lycopodiella Holub.

Chi Thông đất nhỏ (Lycopodiella Holub.) thuộc họ Thạch tùng hay họ Thông đất

(Lycopodiaceae) Trên thế giới có khoảng 25-30 loài thuộc chi này, phân bố chủyếu ở khu vực châu Mỹ, châu Đại dương và New Guinea [2]

Trong danh mục các loài thực vật Việt Nam [3], duy nhất 1 loài là Lycopodiella

cernua (L.) Pic Serm thuộc chi này xuất hiện tại nước ta.

Các công bố về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các loài thuộc chi

Lycopodiella Holub chủ yếu là các công bố về loài Lycopodiella cernua (L.) Pic.

Serm

1.2 Tổng quan về loài Thông đất (Lycopodiella cernua (L.) Pic Serm.)

1.2.1 Đặc điểm thực vật

1.2.1.1 Phân loại khoa học

- Tên Việt Nam: Thông đất, còn có tên gọi khác là Thạch Tùng nghiên

- Tên khoa học: Lycopodiella cernua (L.) Pic Serm.

- Tên gọi khác: Lycopodium cernuum L., Palhinhaea cernua (L.) Franco & Vasc.

- Giới: Thực vật

- Ngành: Thông đất - Lycopodiophyta

- Lớp: Thông đất - Lycopodiopsida

- Bộ: Thông đất - Lycopodiales

- Họ: Thông đất - Lycopodiaceae

- Chi: Thông đất nhỏ - Lycopodiella Holub.

- Loài: Lycopodiella cernua (L.) Pic Serm.

1.2.1.2 Mô tả cây

Hình 1.1 Hình ảnh cây Thông đất (Lycopodiella cernua (L.) Pic Serm.)

Hình ảnh được lấy từ trang web https://www.alamy.com/stock-photo/lycopodium-cernuum.html

Cây mọc trên đất rồi vươn lên; thân cao 30-50 cm, phân nhánh nhiều Lá mọc sítnhau, hình dải nhọn Bông rất nhiều tương đối nhỏ, treo thõng ở đầu các cành nhỏbên, màu nâu nhạt Túi bào tử gần hình cầu, hai mảnh vỏ không đều nhau

Cây Thông đất thường gặp ở độ cao đến 1200 m, ít khi hơn Ưa sáng, có thể chịuhạn và ẩm Thường mọc thành đám trong các trảng cây bụi thưa hay trảng cỏ thứsinh ở ven rừng, trên vách đá và đất trống bỏ hoang [1].

1.2.1.3 Phân bố, thu hái, chế biến

- Phân bố: Rất rộng, hầu như khắp các vùng đồi núi thấp của cả nước Còn có ở khắp các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới của thế giới

- Bộ phận dùng: Toàn cây

1.2.1.4 Tính vị, tác dụng, công dụng

Cây Thông đất có vị đắng, cay, tính ấm, có tác dụng khư phong khử thấp, thư cânhoạt huyết, trấn khái, thu liễm chỉ huyết và lợi tiểu Ở Vân Nam (Trung Quốc), câyđược xem như có vị ngọt, hơi đắng, tính bình; có tác dụng thanh can minh mục, khưphong chỉ khái, giải độc, chỉ huyết an thai, thư cân hoạt huyết, lợi niệu

Người ta thường dùng chữa viêm gan cấp tính, mắt đỏ sưng đau, phong thấp đaunhức xương và ho mạn tính Liều dùng 20-24 g, sắc uống, hay phối hợp với các vịthuốc khác

Ở Vân Nam (Trung Quốc), được dùng trị đau khớp xương, mồ hôi trộm, quáng gà, tiểu tiện bất lợi, có triệu chứng đẻ non, bỏng lửa, trẻ em bị tê liệt sau di chứng

Ở Malaysia, nước sắc cây dùng làm thuốc rửa trị phù thũng và cũng dùng trị ho Tro cây ngâm trong giấm dùng chườm chữa phát ban da [1]

1.2.2 Thành phần hóa học của loài Thông đất

Thành phần hoạt chất chính trong loài Thông đất chủ yếu là alkaloid, flavonoidvà đặc biệt là các terpenoid

1.2.2.1 Các nghiên cứu ngoài nước

a Các alkaloid

Họ Thông đất được biết đến là nguồn nguyên liệu tiềm năng để phân lập ra cácalkaloid, đặc biệt là các Lycopodium alkaloid Hầu như trong tất cả các loài thuộchọ này đều có chứa thành phần alkaloid, nổi bật là các hợp chất huperzine A,huperzine B…với hoạt tính ức chế AChE rất mạnh

Lycopodium alkaloid là một nhóm các chất có liên quan cấu trúc và được phân

lập từ các loài thực vật thuộc chi Lycopodium L Cho đến năm 2004, có 201 Lycopodium alkaloid đã được công bố từ 54 loài của chi Lycopodium L Những

alkaloid này thường chứa bộ khung gồm 16 carbon, đôi khi là 32 carbon (xuất hiệndạng dime) hoặc ít hơn 16 carbon (do sự phân cắt liên kết) Chúng là những alkaloid

dạng quinolizine, pyridine và α-pyridone.

A W Ayer đã chia Lycopodium alkaloid thành 4 nhóm cấu trúc: lycopodine,lycodine fawcettimine và hỗn hợp Bộ khung của các nhóm chất này như sau [4]:

Theo công bố của Zhao và cộng sự vào năm 2010 và 2012, các Lycopodium

alkaloid phân lập từ loài này gồm có: palhinine A (1), acetyllycoposerramine M (2),

4

palcernine A (3), lycoflexine N-oxide (4), lycodine (5), lycoflexine (6), α-obscurine

(7), dehydroisofawcettiine (8), lycopodine (9), 5-acetyllycofoline (10), acetylfawcettiine (11) [5, 6].

Năm 2016, sáu hợp chất Lycopodium alkaloid mới đã được phân lập và xác định

cấu trúc là palhicerine A-F (12-17) từ phân đoạn alkaloid bởi nhóm nghiên cứu của

Tang và cộng sự [7] Cũng trong nghiên cứu này, các nhà khoa học đã phân lập

được các Lycopodium alkaloid đã biết là lycopoclavamine A (18), lycoposerramine

M (19), clavolonine (20), diacetyllycofoline (21), anhydrolycodoline (22), gnidioidine (23), huperzine E (24), 12-deoxyhuperzine O (25), fawcettimine (26),

phlegmariurine B (27), lycodine (28), des-N-methyl-α-obscurine (29) [7].

Năm 2012, các nhà khoa học Trung Quốc đã phân lập được lycopalhine A

(30)-một Lycopodium alkaloid với bộ khung chưa từng có trước đây Đến năm 2013,

nhóm này tiếp tục công bố sự xuất hiện của isopalhinine A ( 31) - một pentacyclic (5/6/6/7) Lycopodium alkaloid mới và palhinine B (32), palhinine C (33) [8, 9].

Ngoài các Lycopodium alkaloid, trong cây Thông đất còn chứa các cernuane

alkaloid là cernuine (34), lycocernuine (35) và 2-hydroxycernuine (36) [6], cernuine

N-oxide (37), lycocernuine N-oxide (38) [10].

Bảng 1.1 Một số alkaloid phân lập từ loài Lycopodiella cernua (L.) Pic Serm.

Bảng 1.2 Một số flavonoid phân lập từ loài Lycopodiella cernua (L.) Pic Serm.

c Các terpenoid

Thông đất là loài thực vật chứa lượng lớn các terpenoid Theo các công bố trênthế giới và Việt Nam, các terpenoid phân lập từ loài này chủ yếu là các serratanetriterpenoid

Serratane triterpenoid là các triterpene gồm 5 vòng ngưng tụ, trong đó có 1 vòng

7 cạnh (vòng C) và có chứa 2 nhóm methoxy ở vị trí C-3 và C-21 Hợp chất này cómột liên kết đôi nằm ở vị trí C-14/C-15, đôi khi nó có thể bị oxy hóa thành nhómhydroxyl hoặc cầu oxy [15]

Năm 2002 Zhang và các

lycernuic acid C-E (56-58),cộng sự đã phân lập được 6 serratane-triterpenoid mới làlycernuic ketone A-C (59-61) [16].

56

57

58

3β,21α,24-trihydroxyserrat-14-en-3-(4′-tetrahydroxy-16-oxoserrat-14-en (67) [11].

Trong một nghiên cứu tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học ở loài Thôngđất, nhóm các nhà khoa học Trung Quốc đã phân lập được các serratane triterpenoid

là lycernuic ketone D (68), lycernuic ketone E (69),

3α,21β,24-trihydroxyserrat-14-en-16-one (70) và lycernuic A (71) [17].

Theo một nghiên cứu trên dịch chiết n-hexane của mẫu cây Lycopodiella cernua

(L.) Pic Sem thu hái ở Lâm Đồng vào năm 2015, 3 hợp chất triterpene thuộc khung

serraten là serrat-14-en-3α,21β-diol (75) và lycernuic acid B (76) đã được phân lập[14]

10

Bảng 1.3 Một số terpenoid phân lập từ loài Lycopodiella cernua (L.) Pic Serm.

Theo công bố của Jing Li và cộng sự năm 2017, ngoài các terpenoid, còn có các

neolignan, trong đó có 3 hợp chất neolignan mới là lycocernuaside B-D (86-88) và

4 hợp chất đã biết (7R,8S)-3,5′-dimethoxy-4′,7-epoxy-8,3′-neolignane-5,9,9′-triol

(89),

(7R,8S)-4,3′,9,9′-tetrahydroxyl-3-methoxy-7,8-dihydrobenzofuran-1′-propylneolignan (90),

1.2.2.2 Các nghiên cứu trong nước

Tại Việt Nam vào năm 2015, nhóm của Trần Mạnh Hùng và cộng sự đã công bố

sự xuất hiện các flavonoid là rhamnazin (42), quercetin 3,3′-dimethyl ether (43), apigenin (44), isoschaftoside (45) và schaftoside (46) [14].

Năm 2015, nhóm của Van Thu Nguyen đã phân lập được 3 triterpene khung

serratane mới gồm: 3β,21β,29-trihydroxyserrat-14-en-24-oic

Cũng trong nghiên cứu của Trần Mạnh Hùng năm 2015, có các hợp chất phenolic

như 4-hydroxy-3-methoxyphenyl-1-O-β-D-glucopyranoside (80), guaiacylglycerol

(81), 4-hydroxy-3-methoxyphenyl-β-D-glucopyranoside-(1→

6)-β-D-glucopyranoside (82), dihydrodehydrodiconiferyl alcohol-4-O-β-D-6)-β-D-glucopyranoside (83) , bombasin-4-O-β-D-glucopyranoside (84), lycocernuaside A (85) [14].

1.2.3 Hoạt tính sinh học của loài Thông đất

1.2.3.1 Hoạt tính gây độc tế bào

Các serratane triterpenoid 56-62 được thử hoạt tính gây độc tế bào trên 3 dòng tế

bào ung thư ở người (K562, SMMC-7221 và SGC7901) theo phương pháp MTT

Kết quả cho thấy hợp chất 61 có khả năng gây độc trên cả 3 dòng tế bào ung thư với

IC50 lần lượt là 20,3; 34,0 và 22,5 µg/mL khi so sánh với chất chuẩn mitomycin Cvới IC50 dao động từ 13,0 - 22,1 µg/mL Hợp chất 52 thể hiện hoạt tính trên dòng tế

bào K562 với IC50 56,1 µg/mL [18]

1.2.3.2 Hoạt tính chống oxi hóa

Hoạt tính chống oxi hóa của dịch chiết methanol của cây Thông đất được đánhgiá bằng phương pháp quét gốc tự do DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) chothấy sự có mặt của các phân tử chống oxi hóa có khả năng cho điện tử để khử phân

tử DPPH Kết quả cho thấy dịch chiết methanol của phần trên mặt đất và dưới mặtđất của loài thực vật này có hoạt tính quét gốc tự do lần lượt là 19,13± 0,88% và12,21 ± 0,9% Tuy nhiên hoạt tính này tương đối thấp khi so sánh với một số loại

thực vật như Ipomoea batatas (89,53 ± 0,2 %) và Corchorus olitorius (63,76 ± 4,1

%) sử dụng 1 mg/mL ascorbic acid làm chất chuẩn [20]

1.2.3.3 Hoạt tính kháng viêm

Hoạt tính kháng viêm của hoạt chất thể hiện bằng khả năng ức chế enzymecyclooxygenase 2 (COX-2) và cyclooxygenase 1 (COX-1) Nồng độ của dịch chiếtlà 100 ppm, mỗi cặn chiết được thử nghiệm 2 lần (4 vòng lặp lại/lần), sử dụng chấtđối chứng là celecoxib (Celebrex) Kết quả cho thấy cặn chiết methanol của loàiThông đất thể hiện hoạt tính kháng viêm khá cao trên enzyme COX-2 với % ức chếCOX-2 là 74,78 ± 18,61% và COX-1 là 57,8 ± 3,46%, chỉ số chọn lọc là 1,29 Khi

so sánh với các thuốc kháng viêm đang dùng trên thị trường thì chỉ số chọn lọc của

nó nhỏ hơn Aspirin (2) nhưng lớn hơn Ibuprofen (0,67) COX-1 được sản sinh ra từnhiều mô quan trọng trong các chức năng sinh sinh lý như bảo vệ hệ thống tiêu hóa

và cân bằng thành mạch Trong khi đó, COX-2 lại được tạo ra khi có các kích thíchtiền viêm, được cho là có liên quan đến quá trình gây viêm Như vậy, việc chọn lọcức chế COX-2 là hữu ích hơn trong việc điều trị viêm [20].

1.2.3.4 Hoạt tính ức chế enzyme xanthine oxidase (XO)

Xanthine oxidase (XO) là một enzyme quan trọng tham gia vào quá trình chuyểnhóa purin, việc ức chế XO có thể làm giảm nồng độ uric acid trong huyết thanh Vìvậy, chất ức chế XO có thể sử dụng để điều trị sự tăng uric acid trong máu và cácbệnh lý liên quan, bao gồm bệnh gout

Các hợp chất 68-70 và 86-92 được thử nghiệm khả năng ức chế XO với chất

chuẩn là allopurinol (IC50: 25,12 ± 0,32 µM) Kết quả cho thấy các hợp chất 86 cho

hoạt tính mạnh nhất với IC50 là 30,36 ± 0,53 µM, tiếp đến là hợp chất 92 có IC50

35,33 ± 0,68 µM và cuối cùng là hợp chất 87 có IC50 42,65 ± 1,12 µM [17]

1.2.3.5 Hoạt tính kháng nấm Candida

Các aspartic proteases (SAP) được tiết ra của nấm Candida albicans được cho là

yếu tố gây độc chính trong việc nhiễm nấm Candida Để kiểm soát tình trạng bệnh

này, việc ức chế SAP được cho là cách tiếp cận mới Các hợp chất 37, 56-61 đã được thử hoạt tính ức chế SAP, kết quả cho thấy hợp chất 37 và 56 cho hoạt tính

mạnh nhất với IC50 lần lượt là 20 và 8,5 µg/mL với chất chuẩn pepstatin A có IC50là 0,0015 µg/mL [16]

1.2.3.6 Hoạt tính ức chế acetycholinesterase

Các chất ức chế acetylchlolinesterase (AChE) giúp làm tăng sản sinhacetylcholine trong hệ thần kinh trung ương, hứa hẹn là những loại thuốc tốt để điềutrị bệnh Alzheimer

Năm 2014, nhóm nghiên cứu của Nguyễn Ngọc Chương và cộng sự đã tiến hànhphân lập, thu được phân đoạn alkaloid của loài Thông đất và thử hoạt tính ức chế

enzyme AChE Kết quả cho thấy, trên nghiên cứu in vitro, phân đoạn này cho hoạt tính ức chế enzyme AChE rất mạnh; trên nghiên cứu in vivo, tác dụng tăng nhận

thức trên chuột bị mất trí nhớ gây ra bởi scopolamine được chứng minh bằng thửnghiệm né tránh thụ động và mê cung nước Merris Tác dụng ức chế AChE trên vỏnão phía trước của chuột, vùng dưới đồi và hệ thống striatum (tân thể vân) thể hiệnqua giá trị IC50 lần lượt là 26,7; 32,2 và 25,7 µg/mL Điều này cho thấy, loại dượcliệu này rất có tiềm năng trong việc điều trị suy giảm nhận thức [21]

Trong công bố của Trần Mạnh Hùng và cộng sự năm 2015, hợp chất

isoschaftoside (45) cho hoạt tính ức chế AchE cao nhất với IC50 0,23 µM Hợp chất

schaftoside (46) có khả năng ức chế tốt nhất với butyrylcholinesterase và

β-secretase 1 với IC50 lần lượt là 0,62 và 2,16 µM Hợp chất guaiacylglycerol (81) có

IC50 với AChE là 1,56 µM [14]

1.3 Tổng quan về chi Kadsura Juss.

1.3.1 Tổng quan chung về thành phần hóa học chi Kadsura Juss.

Chi Na rừng còn gọi là Nắm cơm (Kadsura Juss.) thuộc họ Ngũ vị

(Schisandraceae Blume.) có khoảng 16 loài, phân bố chủ yếu ở khu vực châu Á TạiViệt Nam, theo Phạm Hoàng Hộ thì chi này có 4 loài [22], theo Nguyễn Tiến Bân

có 5 loài và 1 thứ là: Nắm cơm lá hẹp ( K angustifolia A.C Smith), Na rừng (K.

coccinea (Lem.) A C Smith.), Xưn xe tạp (K heteroclita (Roxb.) Craib.), Ngũ vị

14

nam (K longipedunculata Fin & Gagnep.), Nắm cơm lá thuôn (K oblongifolia Merr.), Xưn xe trung bộ (K coccinea var annamensis (Gagnep.) Ban) [3].

Thành phần hóa học chính của các thực vật thuộc chi này là các terpenoid,

flavonoid và lignan

1.3.2 Các terpenoid

Ở chi này, các terpenoid đặc trưng nhất là các triterpenoid và tập trung vào 4 bộ khung

chính là: lanostane (3,4-seco-lanostane; 14(13→

12)-abeolanostane; 18 (13→

12)-abeolanostane, norlanostane và các nhóm lanostane triterpenoid khác); kadlongilactone;

cycloartane (cycloartane; 3,4-secocycloartane; 14(13→

12)-abeo-cycloartane;

3,4:9,10-disecocycloartane); schinortriterpenoid và các triterpenoid khác [23].

Hình 1.2 Cấu trúc khung terpenoid từ chi Kadsura Juss.

1.3.3 Flavonoid

Có rất ít công bố về flavonoid từ các loài thuộc chi Kadsura Juss Các flavonoid

phần lớn thuộc dẫn xuất của catechin [24] và anthocyanin [25]

1.3.4 Lignan

Đây là nhóm chất chính được phân lập từ các loài thuộc chi Kadsura Juss Trong

thời gian từ 2014-2021 đã có 81 lignan được công bố [26] và tập trung vào 5 bộkhung chính là: dibenzocyclooctadiene, spirobenzofuranoid, alryltetralin,diarylbutane và tetrahydrofuran

Hình 1.3 Cấu trúc khung lignan từ chi Kadsura Juss.

1.4 Tổng quan về loài Na rừng (Kadsura coccinea (Lem.) A C Sm.)

1.4.1 Đặc điểm thực vật cây Na rừng

1.4.1.1 Phân loại khoa học

- Tên Việt Nam: Na rừng, tên khác: Nắm cơm, (dây) Xưn xe, Ngũ vị nam…

- Tên khoa học: Kadsura coccinea (Lem.) A C Sm.

- Giới: Thực vật

- Ngành: Ngọc lan - Magnoliophyta

- Lớp: Ngọc lan - Magnoliopsida

- Phân lớp: Ngọc lan - Magnoliidae

- Bộ: Hồi - Illiciales

- Họ: Ngũ vị - Schisandraceae

- Chi: Kadsura Juss.

- Loài: Kadsura coccinea (Lem.) A C Sm.

1.4.1.2 Mô tả cây

Hình 1.4 Hình ảnh cây Na rừng (Kadsura coccinea (Lem.) A C Sm.)

Hình ảnh được lấy từ trang web http://www.plantsoftheworldonline.org và https://www.sciencedirect.com/ science/article/pii/S1674638420300538

Thuộc loại dây leo to có nhánh mọc trườn, mảnh, phủ lớp long tuyến màu sậm,rồi về sau lại có lỗ bì hình dải Lá bầu dục hay thuôn, dạng góc ở gốc, thon hẹp, tù,dài 6-10 cm, rộng 3-4 cm, nhạt màu ở dưới, rất nhẵn Hoa đơn tính ở nách lá dài 15

mm, rộng 10 mm, màu tía Quả giống như một quả na to Cây na rừng phân bố rảirác trong rừng, ở độ cao 400-800 m Ra hoa vào tháng 5-6, có quả tháng 8-9 [1]

1.4.1.3 Phân bố, thu hái, chế biến

Phân bố ở vùng Lào Cai, Yên Bái, Thái Nguyên (Đại Từ, Linh Thông), Lạng Sơn(Văn Quan), Vĩnh Phúc (Tam Đảo), Hà Nội (Ba Vì), Quảng Trị (Đông Trị), KonTum, Lâm Đồng (Di Linh, Braian, Bảo Lộc) Còn có ở Trung Quốc, Lào, Thái Lan,Myanmar

1.4.1.4 Tính vị, tác dụng, công dụng

- Tính vị, tác dụng: Rễ có vị cay ấm, hơi đắng, có hương thơm; có tác dụng hànhkhí chỉ thống, hoạt huyết tán ứ, khư phong tiêu thũng Quả cũng có tác dụng hành khíchỉ thống, hoạt huyết, tán ứ Thân, lá có vị chua, ngọt, tính hơi ấm; có tác dụng noãn

vị, tán ứ, tiêu thũng, giải độc, hành khí, chỉ thống

- Công dụng: Quả ăn được, quả Na rừng rang lên làm thuốc an thần, gây ngủ Rễ

có tác dụng viêm ruột mạn tính, viêm dạ dày ruột cấp tính, viêm loét dạ dày, hành tátràng, phong thấp đau xương, đòn ngã ứ đau, đau bụng trước khi hành kinh, sản hậu ứđau, sưng vú

16

Trong dân gian thường dùng vỏ thân, vỏ rễ làm thuốc bổ, kích thích thích tiêuhóa, giảm đau [1].

1.4.2 Thành phần hóa học cây Na rừng

Các công trình nghiên cứu trên thế giới và trong nước đã phân lập và xác địnhthành phần hóa học của Na rừng Trong đó tìm thấy các thành phần hóa học gồm:terpenoid, flavonoid, lignan và steroid

1.4.2.1 Các nghiên cứu ngoài nước

lanostane phải kể đến coccinilactone A-B (93-94) [28], kadcoccinone D-F (95-97)

[29]; bộ khung seco-lanostane là seco-coccinic acid A-B (98-99) [30]; bộ khung

kadlongilactone là kadcoccilactone K-M (100-102) [31]; các cycloartane

triterpenoid có kadcoccilactone Q (103) [31]; seco-cycloartane có coccinetane A-B

(104-105) [32] và nortriterpenoid như kadcoccilactone A-E (106-110) [33].

Năm 2008, Gao và cộng sự đã phân lập được từ dịch chiết acetone của thân cây

Na rừng các triterpenoid là kadcoccilactone A-J (106-115); 2 triterpenoid đã biết là

kadsuphilactone A và micrandilactone B [33]

Trong một công bố của Wang và cộng sự vào năm 2008, 7 hợp chất triterpenoid

khung lanostane đã được phân lập từ rễ của loài này Đó là các seco-coccinic acid

A-B (98-99), seco-coccinic acid C-F (116-119) và coccinilactone A (93) [28].

Đến năm 2009, nhóm này tiếp tục phân lập được 5 triterpenoid khung lanostane

mới từ dịch chiết ethanol của rễ cây Na rừng bao gồm: Coccinone A-D (120-123) và coccinilactone B (94) [34].

Theo Li và cộng sự vào năm 2012, các triterpenoid từ cây Na rừng có thể kể đến

neokadsuranic acid B (124), kadsuracoccin acid A (125) và anwuweizonic acid (126) [35].

Năm 2010, một triterpenoid mới thuộc bộ khung lanost-9(11)-3-one được cácnhà khoa học Trung Quốc phân lập từ rễ cây Na rừng là hợp chất 3-hydroxy-12-

acetoxycoccinic acid (127) [36].

Huang và cộng sự đã phân lập được thêm 2 triterpenoid mới từ thân cây trong

một công bố năm 2019 Đó là kadsuricoccin A-B (128-129) [37].

Ngoài các triterpenoid đặc trưng, các nhà khoa học còn phân lập được cácsesquiterpenoid Năm 2016, Hu và cộng sự đã công bố sự xuất hiện của kadcoccinin

A (131) và kadcoccinin B (132) – các sesquiterpenoid được phân lập từ thân cây Na

rừng [38]

18

Bảng 1.5 Một số terpenoid phân lập từ loài Kadsura coccinea (Lem.) A C Sm.

Năm 2020, Mi Hee Woo và cộng sự đã công bố một số flavonoid phân lập từ rễ

của loài thực vật này là: (-)epi-catechin (133), (+)gallocatechin (134), catechin (135)

[24]

cinnamoyl và butyryl Một số trong đó bao gồm: schisantherin P-Q (136-137) [41], kadsuralignan I (138) [42], kadsuralignan J (139), kadsuralignan F (140)[43], neokadsuranin (141) [44], kadsuralignan G (142) [45], isovaleroylbinankadsurin A (143) [39].

*Spirobenzofuranoid dibenzocyclooctadiene lignan

Fang và cộng sự đã phân lập được 5 spirobenzofuranoid dibenzocyclooctadiene

lignan từ cặn ethyl acetate của rễ cây K.coccinea, gồm schiarisanrin B (144),

heteroclitin D (145) kadsulignan H-I (146-147), và schiarisanrin A (148) [46].

Li và cộng sự cũng công bố sự xuất hiện của kadsulignan E ( 149) và F (150)

trong một nghiên cứu từ rễ của cây Na rừng [47]

*Arylnaphthalene lignan

Li và cộng sự đã phân lập được kadsuralignan C (151) từ dịch chiết chloroform

của thân cây Na rừng, đây là hợp chất đầu tiên trong nhóm này được báo cáo [48]

20

Yeon và cộng sự thu được (7′

S,8′S,8R)-(8β,8′α)-dimethyl-4,4′-dihydroxy-5,3′-dimethoxy-5′-cyclolignan glucoside (152) [49].

Năm 2007, nhóm nghiên cứu của Li đã phân lập được kadsuralignan H (153) từ

cặn chiết ethyl acetate của rễ cây Na rừng [42]

*Diarylbutane lignan

Kadsurindutin E (154), coccilignan A (155) và meso-dihydroguaiaretic acid (156)

đã được nhóm nghiên cứu của Fang và cộng sự phân lập và xác định cấu trúc từ cặnchiết ethyl acetate của rễ cây Na rừng [46] Bên cạnh đó còn có hợp chất

kadcoccilignan (157) cũng được công bố bởi Gao và cộng sự vào năm 2012 [40].

Bảng 1.6 Các lignan phân lập từ loài Kadsura coccinea (Lem.) A C Sm.

d Các hợp chất khác

Ngoài thành phần chính là terpeneoid, lignan, flavonoid, trong cây Na rừng còn

chứa một số hợp chất khác như β-sitosterol (158) và

β-sitosteryl-3-O-β-D-glucopyranoside (159) [39].

1.4.2.2 Các nghiên cứu trong nước

Tại Việt Nam, năm 2009, nhóm nghiên cứu của Ninh Khắc Bản và cộng sự đã

phân lập được một hợp chất 3,4-seco-lanostane triterpenoid là seco-coccinic acid F

(119) và 1 hợp chất đã biết là 20(R),24(E)-3-oxo-9β-lanosta-7,24-dien-26-oic acid

(130) từ cặn chiết methanol từ rễ cây Na rừng [39].

Trong một báo cáo tại Hội nghị khoa học ở Việt Nam vào năm 2009, từ rễ cây

Na rừng ở Tràng Định, Lạng Sơn, các nhà khoa học đã tiến hành chiết tách tinh dầuvà xác định thành phần hóa học của chúng Kết quả cho thấy đã xác định được 36

hợp chất có trong tinh dầu rễ cây Na rừng, một số trong đó là α-pinene, camphene,

α-terpeniol, β-caryophyllene, 1,2,3-trimethyl, β-himachalene…[50]

1.4.3 Hoạt tính sinh học

Các hợp chất và dịch chiết được phân lập từ cây Na rừng đã thể hiện nhiều hoạttính sinh học bao gồm gây độc tế bào, kháng HIV, chống viêm gan, chống oxi hóavà tác dụng bảo vệ thần kinh

1.4.3.1 Hoạt tính gây độc tế bào

Hợp chất kasuracin A thể hiện tác dụng chống tăng sinh đáng kể với giá trị IC50dao động từ 1,05 đến 11,31 µg/mL trên 4 dòng tế bào ung thư người là HCT116,A549, HL-60 và HepG2

Hợp chất heilaohulignan C đã chứng minh hoạt tính gây độc tế bào rất tốt trêndòng tế bào ung thư HepG-2 ở người với IC50 9,92 µg/mL được báo cáo bởi Liu và

cộng sự [51] Seco-coccinic acid F, G và K cho thấy tác dụng ức chế tăng sinh tế

22

bào trên dòng tế bào bạch cầu HL-60 ở người với GI50 lần lượt là 16,6; 15,2 và 28,4µM.

Kadlongilactone A-B và longipedlactone A được báo cáo là thể hiện hoạt tínhgây độc tế bào trên dòng tế bào K562, Bel-7402 và A549 với IC50 lần lượt là 0,1;0,1 và 1,0 µM

Hu và cộng sự trong một công bố năm 2015 cho rằng kadcoccinone A-F thể hiệnhoạt tính gây độc tế bào trên 6 dòng tế bào ung thư người là HL-60, SMMC7721,A-549, MCF-7, SW-480 và HeLa Mối liên quan cấu trúc - tác dụng củakadcoccinone A và B chỉ ra rằng sự phân cắt và phản ứng hemiketal giữa C-12 vàC-14 có thể làm giảm hoạt tính gây độc tế bào Bên cạnh đó, độc tính của

kadcoccinone E cao hơn kadcoccinone D cho thấy cấu hình 23S,24R của nhóm epoxy làm hoạt tính tăng lên so với cấu hình 23R,24S [52].

1.4.3.2 Hoạt tính kháng HIV

Liang và cộng sự đã công bố về hoạt tính kháng HIV của kadcotrione A và C với

EC50 là 47,91 và 32,66 µg/mL [53] Trong một nghiên cứu khác, kadcoccitone B và

12β-hydroxycoccinic acid cho thấy hoạt tính kháng HIV với EC50 là 30,29 và 54,81µg/mL Liu và cộng sự đã nghiên cứu về kadsulignan M và các hợp chất tương tự

về khả năng kháng HIV của chúng Kết quả cho thấy hợp chất kadsulignan M thể

hiện hoạt tính trên in vivo với IC50 1,19 x 10-4 M và EC50 6,03 x 10-6 M Liên quancấu trúc và tác dụng chỉ ra rằng nhóm benzoyl ở C-6 và nhóm hydroxyl ở C-7 tronghợp chất kadsulignan M làm tăng khả năng kháng HIV Ngoài ra, các nhóm thế 2,3-methylenedioxy và 12,13-dimethoxy trên vòng thơm cũng làm tăng hoạt tính khángHIV [54]

1.4.3.3 Hoạt tính ức chế sản sinh nitric oxide (NO)

Hu và cộng sự đã công bố về khả năng ức chế sản xuất NO từ cặn chiết ethylacetate của thân rễ cây Na rừng Trong khi đó, từ các phân đoạn trong cặn chiếtethyl acetate đã phân lập được dibezocyclooctadiene lignan là kadsuraligan G-L cóhoạt tính ức chế sinh NO mức độ trung bình [45]

Fang và cộng sự đánh giá một số hợp chất được phân lập từ loài thực vật này vềkhả năng ức chế sản sinh NO do LPS gây ra trên tế bào BV-2 bằng phương phápGriess Kết quả cho thấy hợp chất acetylschisantherin L, schiarisanrin B,heteroclitin D, kadsulignan H-I và schiarisanrin A có thể ức chế mạnh sản sinh NO

do LPS gây ra trong tế bào BV-2 của chuột [46]

1.4.3.4 Hoạt tính khác

Ninh Khắc Bản và cộng sự đã báo cáo rằng hợp chất acetylepigomisin R,isovaleroylbinankadsurin A và binankadsurin A được phân lập từ Na rừng thể hiện

hoạt tính bảo vệ đối với tổn thương tế bào gan của chuột gây ra bởi t-butyl

hydroperoxide với giá trị ED50 lần lượt là 135,7; 26,1 và 79,3 µM [39] Myeong-JinGoh và cộng sự đã công bố về khả năng ức chế tổng hợp melanin của hợp chấtkadsuralignan F thông qua quá trình ức chế enzyme tyrosinase [43] Sun và cộng sự

đã đáng giá hoạt tính chống oxy hóa của quả cây Na rừng bằng phương pháp DPPH.Kết quả cho thấy các phenolic acid thể hiện hoạt tính chống oxi hóa đáng kể [55].Kadcoccinin A-B được đánh giá về khả năng kháng nấm nhưng cả 2 đều cho hoạttính yếu, không đáng kể

Như vậy, có thể thấy loài Thông đất và Na rừng là các loài thực vật có thànhphần hóa học phong phú và thể hiện nhiều hoạt tính sinh học thú vị, nổi bật là hoạttính gây độc tế bào, ức chế sản sinh NO Trong khi các công bố trên thế giới về hailoài này khá nhiều, thì các công bố ở Việt Nam còn rất khiêm tốn Chính vì vậy,những nghiên cứu sâu hơn về thành phần hóa học và hoạt tính của chúng sẽ gópphần làm sáng tỏ cơ sở khoa học cho công dụng trong y học cổ truyền và làm tănggiá trị của các loài dược liệu này.

24

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Loài Thông đất (Lycopodiella cernua (L.) Pic Serm.)

Toàn bộ thân cây Thông đất (Lycopodiella cernua (L.) Pic Serm.) được thu hái

tại Sapa, Lào Cai, Việt Nam vào tháng 3 năm 2017 Mẫu thực vật được định danhbởi TS Nguyễn Thế Cường, Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, Viện Hàn lâmKhoa học và Công nghệ Việt Nam (VAST) Mẫu tiêu bản (NCCBG.01.20) được lưutại Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, VAST

2.1.2 Loài Na rừng (Kadsura coccinea (Lem.) A C Sm.)

Lá cây Na rừng (Kasura coccinea (Lem.) A C Smith) được thu hái vào tháng 5

năm 2017, thân cây được thu hái vào tháng 5 năm 2018 ở Tam Đảo, Vĩnh Phúc.Mẫu thực vật được định danh bởi PGS TS Trần Huy Thái, Viện Sinh thái và Tàinguyên Sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam (VAST) Mẫutiêu bản (KC201705 và KC201805) được lưu tại Viện Kỹ thuật Hóa học, Đại họcBách Khoa Hà nội

Chemical, Tokyo, Japan), nhựa Sephadex ™ LH-20 (GE Healthcare Bio-Sciences

AB, Uppsala, Thụy Điển) và YMC RP-18 (30–50 µm, Fuji Silysia Chemical)

Sắc ký lớp mỏng (TLC) sử dụng các tấm silica gel 60 F254 (1.05554.0001,Merck) và RP-18 F254S (1.15685.0001, Merck) tráng trước và phát hiện chất bằngcách phun dung dịch nước H2SO4 10% và đun nóng trong 1,5-2 phút

2.2.2 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học các chất

Cấu trúc các hợp chất phân lập được xác định dựa vào các thông số vật lý kết hợpvới các phương pháp phổ hiện đại

2.2.2.1 Góc quay cực riêng

của một hợp chất quang hoạt chứa các trung tâm bất đối, được đo trên máyJASCO P-2000 Polarimeter (Tokyo, Nhật Bản) tại Viện Hóa sinh biển, VAST

2.2.2.2 Phổ khối lượng (MS)

Phổ HR-ESI-MS: Phổ khối lượng phân giải cao cho phép xác định pic ion mảnh

hay phân tử có độ chính xác cao HR-ESI-MS đo trên máy Agilent 6530 Mass spectrometer (CA, Mỹ) tại Viện Hóa học, VAST

Accurate-2.2.2.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

- Phổ NMR đo trên máy Bruker AVANCE III HD 500 (Brucker, Đức), BrukerAVANCE III HD 500 (MA, Mỹ) FT-NMR của Viện Hóa học, VAST, máy đo phổJEOL JNM-AL 400 MHz Chất nội chuẩn là TMS (Tetramethyl silane)

- Các kỹ thuật phổ NMR được sử dụng bao gồm:

+ Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều: 1H-NMR, 13C-NMR

+ Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều: HSQC, HMQC, HMBC, 1H-1H COSY,NOESY

+ Dung môi được sử dụng bao gồm các dung môi DMSO-d 6 , methanol-d 4,

chloroform-d 1 , pyridine-d 5 Việc lựa chọn dung môi đo phụ thuộc vào bản chất củatừng mẫu, trên nguyên tắc là dung môi phải hòa tan hoàn toàn mẫu đo

2.2.2.4 Phổ lưỡng sắc tròn (CD)

Phổ CD cho phép xác định cấu trúc tuyệt đối của các hợp chất phân lập từ tựnhiên có các trung tâm carbon bất đối, được đo trên máy Chirascan spectrometer(Applied Photophysics, Vương quốc Anh) tại Viện Hóa sinh biển, VAST

2.2.3 Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học

2.2.3.1 Hoạt tính gây độc tế bào và ức chế sinh trưởng tế bào ung thư

Hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các mẫu dịch chiết và các chất sạch đượcthực hiện trên một số dòng tế bào ung thư: HepG2 (ung thư gan), SK-Mel-2 (ungthư da melanoma), MCF7 (ung thư vú) tại phòng Sinh học Thực nghiệm, ViệnCông nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Khả năng ức chế sinh trưởng tế bào ung thư trên các dòng tế bào HCT-15 (ungthư đại tràng), NUG-3 (ung thư dạ dày), NCI-H23 (ung thư phổi), ACHN (ung thưthận), PC-3 (ung thư tuyến tiền liệt), MDA-MB-231 (ung thư vú) được thực hiện tạiPhòng thí nghiệm hóa học các sản phẩm tự nhiên biển, Viện Khoa học và Côngnghệ Đại dương Hàn Quốc, Busan, Hàn Quốc

Hóa chất sử dụng:

- FBS của GIBCO, Invitrogen, TCA (Sigma), SRB (Sigma)

26

- Đĩa 96 giếng nhựa (Corning, USA), pipette, eppendorf, máy đọc ELISA 96 giếng (Bio-Rad), đầu đọc vi tấm VersaMax (LLC, Sunnyvale, CA, USA)

- Chất tham khảo: Ellipticine (Sigma, USA), adriamycin (Sigma, USA)

- Các hóa chất thông thường khác

- Các dòng tế bào ung thư do GS TS J M Pezzuto, Trường Đại học Hawaiivà GS Jeanette Maier, trường Đại học Milan, Italia và American Type CultureCollection (Manassas, VA, USA) cung cấp

❖ Nguyên lý của phép thử [56]:

Phương pháp thử độ độc tế bào ung thư in vitro được Viện Ung thư Quốc gia

Hoa Kỳ (National Cancer Institute – NCI) xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩnnhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt

TBUT ở điều kiện in vitro Phép thử này được thực hiện theo phương pháp của

Monks

Phép thử tiến hành xác định hàm lượng protein tế bào tổng số dựa vào mật độquang học (OD - Optical Density) đo được khi thành phần protein của tế bào đượcnhuộm bằng sulforhodamine B (SRB) Giá trị OD máy đo được tỉ lệ thuận vớilượng SRB gắn với phân tử protein, do đó lượng tế bào càng nhiều (lượng proteincàng nhiều) thì giá trị OD càng lớn Phép thử được thực hiện trong điều kiện cụ thểnhư sau:

- Các mẫu thử nghiệm được hòa tan trong DMSO và được chuẩn bị ở các nồngđộ khác nhau (0,5; 2; 10; 20 và 40 μM) bằng cách pha loãng tương ứng với môi trườngM) bằng cách pha loãng tương ứng với môi trườngtăng trưởng

- Trypsin hóa tế bào thí nghiệm để làm rời tế bào và đếm trong buồng đếm để điều chỉnh mật độ cho phù hợp với thí nghiệm

- Chất thử (10 L) đã pha ở các nồng độ vào các giếng của đĩa 96 giếng, thêm

190 L tế bào đã điều chỉnh nồng độ phù hợp ở trên vào các giếng này sao cho nồng độ chất thử trong giếng là 100 g/mL, 20 g/mL; 4 g/mL; 0,8 g/mL

- Ủ trong tủ ấm 48 giờ Giếng không có chất thử nhưng có TBUT (190 L) sẽđược sử dụng làm đối chứng ngày 0 Sau 1 giờ, giếng đối chứng ngày 0 tế bào sẽ đượccố định bằng trichloracetic acid 50% (50 µg/mL) – TCA

- Sau 48 giờ, tế bào được cố định bằng TCA trong 1 giờ, được nhuộm bằng SRB 0.4% trong 30 phút ở 37 oC, rửa 3 lần bằng acetic acid 1% rồi để khô ở nhiệt độ phòng

- Thuốc nhuộm liên kết với protein được chiết với base Tris 10 mM ở pH 10,5 đểxác định mật độ quang học

- Đọc kết quả OD ở bước sóng 515-540 nm trên máy đọc ELISA (Bio-Rad) và đầu đọc vi tấm VersaMax

- Phần trăm ức chế sự phát triển của tế bào khi có mặt chất thử sẽ được xác định thông qua công thức sau:

[OD (chất thử) – OD (ngày 0)] x 100

% ức chế = 100%

-OD (đối chứng âm) – -OD (ngày 0)

- Phép thử được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác

- Ellipticine ở các nồng độ 10 g/mL; 2 g/mL; 0,4 g/mL; 0,08 g/mL được sử dụngnhư là chất đối chứng dương trong thử nghiệm gây độc tế bào; adriamycin được sử dụnglàm chất đối chứng dương trong thử nghiệm ức chế sinh trưởng tế bào ung thư

- DMSO 10% luôn được sử dụng như đối chứng âm Giá trị IC50 (nồng độ ức chế50% sự phát triển) sẽ được xác định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve 2Dv4.

- Theo tiêu chuẩn của Viện ung thư quốc gia Hoa Kỳ (NCI), cặn chiết được coi

có hoạt tính tốt với IC50 20 μM) bằng cách pha loãng tương ứng với môi trườngg/mL, trong khi chất tinh khiết được coi có hoạt tính tốt(hit compound) khi IC50 5 μM) bằng cách pha loãng tương ứng với môi trườngM [59]

Trong đó:

HighConc/LowConc: chất thử ở nồng độ cao/chất thử ở nồng độ thấp

HighInh%/LowInh%: % ức chế ở nồng độ cao/% ức chế ở nồng độ thấp

2.2.3.2 Hoạt tính ức chế sản sinh nitric oxide (NO)

Hoạt tính ức chế sản sinh NO của các dịch chiết và các chất sạch được thực hiệntheo phương pháp của Griess trên đại thực bào của chuột (RAW264.7 đối với cácchất từ cây Na rừng (thực hiện tại khoa Dược - Đại học Tôn Đức Thắng - Thànhphố Hồ Chí Minh và BV-2 với các chất từ cây Thông đất, thực hiện tại Đại họcDược Wonkwang, Hàn Quốc) kích thích bởi LPS [57]

a Nguyên lý chung:

Gốc tự do nitric oxide (•NO) được sản sinh ở nhiều loại tế bào khác nhau Khixuất hiện các đáp ứng viêm, dạng •NO xuất tiết có mặt ở các tế bào như đại thựcbào, nguyên bào sợi hay tế bào gan thường được sản sinh với lượng lớn

*Phương pháp gián tiếp để xác định •NO là xác định màu sắc của sản phẩm của nó(nitrate và nitrite) Trong phản ứng này, nitrate (NO3 -

) chuyển thành nitrite (NO2

-),

do tác động của nitrate reductase

Khi xử lý với thuốc thử Griess, nitrite chuyển thành màu hồng theo phản ứngsau:

*Phương pháp MTT (3-(4,5-dimethythiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazoliumbromide) là một phương pháp so màu, đo độ suy giảm màu để đánh giá khả năngsống sót của tế bào Ở các tế bào sống, hệ enzym oxidoreductase hoạt động mạnh,những enzyme này có khả năng phân giải MTT thành dạng formazan không hoà tan,màu tím đậm theo phương trình phản ứng sau:

28

Do vậy, tỉ lệ tế bào sống sót được suy ra từ lượng formazan tạo thành từ MTT.

Lượng formazan tạo thành được hoà tan bởi dung môi hữu cơ (DMSO, propanol) và

đo độ hấp thụ ở bước sóng 570 mm Khả năng gây độc tế bào của các mẫu thử

nghiệm được suy ra từ việc đánh giá khả năng sống sót của tế bào [61]

b Phương pháp thực hiện

Tế bào (RAW264.7 hoặc BV-2) được nuôi cấy với nồng độ 5 x 105 tế bào/mL

trong môi trường DMEM ở 37oC, 5% CO2 với 10% FBS, penicillin G (100 U/mL),

streptomycin (100 mg/L) và L-glutamine (2 mM) Sau đó, môi trường được thay thế

bằng môi trường mới chứa 100 g/mL LPS và các hợp chất thử ở nhiều nồng độ khác

nhau, giữ ổn định trong 24 h Sự sản sinh NO được đánh giá dựa vào sự tích tụ

nitrite trong dịch nổi của tế bào sử dụng thuốc thử Griess Dung dịch DMSO 1%

được sử dụng làm mẫu trắng, butein, dexamethasone, sulfuretin được sử dụng làm

mẫu đối chứng [57]

NaNO2 ở các nồng độ khác nhau được sử dụng để xây dựng đường chuẩn Độ

hấp thụ được đo ở 570 nm

Phần tế bào còn lại sau khi đã sử dụng để đánh giá các hoạt tính in vitro được bổ

sung dung dịch MTT (0,5 mg/mL pha trong PBS), ủ 4 h ở 37oC và 5% CO2 Sau đó

hút bỏ hết môi trường trên bề mặt, kết tủa formazan được hòa tan trong isopropanol

Độ hấp thụ được đo ở 570 nm

Khả năng ức chế nitrite cho nồng độ ức chế trung bình IC50 – giá trị được tính

toán bằng chương trình GraphPad Prism, version 8.4.0 (GraphPad Software Inc.,

USA)

- Tính giá trị CS % (% Cell Survival)

Giá trị CS: là khả năng sống sót của tế bào ở nồng độ ban đầu của mẫu thử,

Giá trị CS (%) được tính theo công thức:

Trong đó:

OD: mật độ quang

σ: độ lệch tiêu chuẩn được tính theo công thức:

Trong đó: xi: giá trị OD tại giếng i,

: giá trị OD trung bìnhn: số giếng thử lặp lại

- Tính giá trị IC 50

Nồng độ ức chế 50%, IC50 được xây dựng trên 5 nồng độ thử nghiệm Giá trị IC50được xác định theo phương pháp hồi quy tuyến tính trên phần mềm Graphpad Prism8.4.0

Trong đó:

HighConc/LowConc: chất thử ở nồng độ cao/chất thử ở nồng độ thấp

HighInh%/LowInh%: % ức chế ở nồng độ cao/% ức chế ở nồng độ thấp

2.2.3.3 Phương pháp xác định cấu hình đường bằng thủy phân acid

Quy trình thủy phân đường bằng acid để xác định cấu hình của đường được thựchiện theo phương pháp đã công bố trước đây [58, 59, 60]

Hợp chất cần thử (1,0 mg) được thủy phân bằng cách đun nóng trong 100 μM) bằng cách pha loãng tương ứng với môi trườngLdung dịch H2SO4 10% ở 80 °C trong 3 giờ, sau đó làm lạnh đến nhiệt độ phòng vàpha loãng với 4 mL nước Hỗn hợp sau phản ứng được trung hòa bằng BaCO3, vàlọc, sau đó dịch lọc được chiết bằng ethyl acetate (3 × 4 mL) Lớp nước được cô đặc

để thu được cặn đường, hòa tan cặn đường trong 1 mL pyridine và đun nóng với 6

mg L-cysteine methyl ester ở 60 oC trong 60 phút, sau đó thêmphenylisothiocyanate (0,1 mL) vào hỗn hợp phản ứng và tiếp tục phản ứng ở 60 oCtrong 60 phút để tạo ra dẫn xuất arylthiocarbamate theo phản ứng sau:

0,7 mg sản phẩm được hòa tan trong acetonitrile và được phân tích bằng HPLCpha đảo tiêu chuẩn (Kinetex C18: 4,6 mm x 250 mm, 5 μM) bằng cách pha loãng tương ứng với môi trườngm) với pha động là hỗnhợp 20% acetonitrile trong nước ở tốc độ dòng 0,8 mL/phút, phát hiện bằng detector

UV (ở 250 nm) ở điều kiện phân tích là 0 phút (80% nước/20% ACN) - 50 phút

(20% nước/80% ACN) Các đường với cấu hình khác nhau sẽ cho sản phẩm có thờigian lưu khác nhau khi phân tích trên HPLC

30

bố lần lượt với n-hexane, ethyl acetate và cô quay dưới áp suất giảm thu được các cặn chiết n-hexane (H), cặn chiết ethyl acetate (E) và dịch chiết nước (W) Sơ đồ

ngâm chiết được thể hiện trên hình 3.1.

Hình 3.1 Sơ đồ ngâm chiết thân cây Thông đất

Dịch nước được phân tách trên cột Diaion HP-20 và rửa giải với hệ dung môi

MeOH/nước với tỷ lệ lần lượt là 100/1; 50/50 và 100/0) thu được 3 phân đoạn 3

W1-Phân đoạn W2 (3,2 g) được tiến hành sắc ký cột pha đảo RP18 sử dụng hệ dungmôi rửa giải là MeOH/nước (1/2 đến 2/1) thu được 4 phân đoạn nhỏ (W2A-W2D)

Hợp chất LC1 (1,0 mg) thu được từ phân đoạn W2A tinh chế trên cột pha đảo

RP18 hệ MeOH/acetone/H2O (8/1/1) và chạy qua cột Sephadex™ LH-20

Phân đoạn W2C được chạy sắc ký cột pha thường với hệ dung môi

CH2Cl2/MeOH/acetone/H2O (6/5/0,04/0,1) thu được 3 phân đoạn nhỏ W2C3

W2C1-Hợp chất LC18 (3,0 mg) thu được bằng cách tinh chế phân đoạn W2C1 trên cột

silica gel pha thường với hệ dung môi rửa giải là EtOAc/MeOH/H2O (7/1/0,1) vàqua cột SephadexTM LH-20 sử dụng hệ dung môi MeOH/H2O (1/1)

Tinh chế phân đoạn W2C3 (150 mg) trên sắc ký cột pha thường với hệ dung môiEtOAc/MeOH/H2O (7/1/0,1) và sắc ký cột pha đảo RP18 hệ dung môi MeOH/H2O

(1/3 và 1/2) thu được hợp chất LC19 (4,0 mg) và LC20 (13,0 mg) và LC2 (4,0 mg).

Phân đoạn W2D (640,0 mg) được tiến hành sắc ký cột pha thường hệ dung môi

CH2Cl2/MeOH/acetone/H2O (6,5/1/0,04/0,1) và cột Sephadex™ LH-20 rửa giảibằng hệ dung môi MeOH/acetone/H2O (8/1/1) thu được hợp chất LC3 (3,0 mg) và

LC4 (24,0 mg).

Hình 3.2 Sơ đồ phân lập dịch nước của cây Thông đất

Cặn chiết Ethyl acetate (60 g) được tách thành 4 phân đoạn nhỏ E1-E4 bằng

cách sắc ký cột pha thường sử dụng hệ dung môi n-hexane/EtOAc (10/1 đến 0/1) Phân đoạn E3 (30 g) được tiến hành sắc ký cột pha thường hệ dung môi n-

hexane/EtOAc (20/1 đến 1/1) thu được 4 phân đoạn nhỏ E3A-E3D

Tinh chế phân đoạn E3B (7,0 g) trên cột sắc ký pha đảo RP18 hệ dung môiacetone/H2O (4/3) thu được hợp chất LC6 (2,5 mg) và LC12 (9,0 mg).

Phân đoạn E3C (14,0 g) được tiến hành sắc ký cột pha đảo hệ dung môi MeOH/

H2O (1/1) và tinh chế thêm trên cột sắc ký pha thường hệ dung môi CH2Cl2/acetone

(6/1) thu được các hợp chất LC5 (10,0 mg); LC7 (2,0 mg); LC8 (4,0 mg) và LC9

(5,0 mg);

Tinh chế phân đoạn E3D (2,8 g) trên cột sắc ký pha đảo RP18 hệ dung môiacetone/H2O (1/3) và tinh chế thêm trên cột silica gel pha thường hệ dung môi

CH2Cl2/MeOH (20/1) thu được hợp chất LC16 (10,0 mg) và LC17 (5,0 mg)

Tiến hành sắc ký cột pha thường phân đoạn E4 (15g) hệ dung môi

n-hexane/EtOAc (6/1 đến 1/1) thu được 4 phân đoạn nhỏ E4A-E4D.

Tinh chế phân đoạn E4A (1,4 g) trên sắc ký cột pha đảo RP18 hệ dung môiMeOH/H2O (8/1) và cột Sephadex™ LH-20 sử dụng hệ MeOH/H2O (1/1) thu được

hợp chất LC10 (10,0 mg); LC11 (50,0 mg); LC13 (15,5 mg) và LC14 (5,0 mg).

32

Phân đoạn E4D (1,0 g) được tinh chế trên sắc ký cột pha đảo RP18 với hệ dungmôi acetone/H2O và tiếp tục sắc ký cột pha thường, rửa giải bằng hệ dung môi

CH2Cl2/MeOH (15/1) thu được hợp chất LC15 (6,0 mg).

Hình 3.3 Sơ đồ phân lập cặn EtOAc của cây Thông đất

3.1.2 Thông số vật lý và dữ liệu phổ của các hợp chất phân lập từ loài Thông đất

3.1.2.1 Hợp chất LC1: Lycocernuaside E (hợp chất mới)

Chất bột màu trắng

HR-ESI-MS: m/z 559,1587 [M+Cl]−

KLPT chính xác (tính toán) [C25H32O12Cl]-: 559,1588

Công thức phân tử: C25H32O12, Mw = 524 g/mol

1H-NMR (500 MHz, CD3OD) và 13C-NMR (125 MHz, CD3OD): xem Bảng 4.1.1

H-NMR (500 MHz, CD3OD) và 13C-NMR (125 MHz, CD3OD): xem Bảng 4.1.3

3.1.2.4 Hợp chất LC4: Dihydrodehydrodiconiferyl alcohol

H-NMR (500 MHz, CD3OD) và 13C-NMR (125 MHz, CD3OD): xem Bảng 4.1.6

3.1.2.7 Hợp chất LC7: Lycocernuic ketone F (hợp chất mới)

Dạng dầu không màu

1H-NMR (500 MHz, CD3OD) và 13C-NMR (125 MHz, CD3OD): xem Bảng 4.1.9