Nghiên cứu phát triển chủng nấm sợi và tối ưu điều kiện lên men sản xuất đa enzyme (α amylase, glucoamylase, cellulase) ứng dụng trong chế biến thức ăn chăn nuôi TT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM DƯƠNG THU HƯƠNG NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN CHỦNG NẤM SỢI VÀ TỐI ƯU ĐIỀU KIỆN LÊN MEN SẢN XUẤT ĐA ENZYME α-AMYLASE, LUCOAMYLASE, CELLULASE ỨNG DỤNG TRONG CHẾ B

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

DƯƠNG THU HƯƠNG

NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN CHỦNG NẤM SỢI

VÀ TỐI ƯU ĐIỀU KIỆN LÊN MEN SẢN XUẤT

ĐA ENZYME (α-AMYLASE, LUCOAMYLASE, CELLULASE) ỨNG DỤNG TRONG CHẾ BIẾN

THỨC ĂN CHĂN NUÔI

Chuyên ngành : Chăn nuôi

Mã số : 9.62.01.05

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ

HÀ NỘI - 2022

Công trình hoàn thành tại:

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

Người hướng dẫn: 1 PGS TS VŨ VĂN HẠNH

2 PGS.TS PHẠM KIM ĐĂNG

Phản biện 1 PGS.TS Nguyễn Văn Đức - Hội Chăn nuôi

Phản biện 2 PGS.TS Nguyễn Bá Hiên - Hội Thú y

Phản biện 3 PGS.TS Trần Huê Viên - Trường Đại học Nông lâm, Đại học Thái Nguyên

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án cấp Học viện họp tại: Học viện Nông nghiệp Việt Nam

Vào hồi giờ, ngày tháng năm 2022

Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:

- Thư viện Quốc gia Việt Nam

- Trung tâm Thông tin - Thư viện Lương Định Của,

Học viện Nông nghiệp Việt Nam

PHẦN 1 MỞ ĐẦU

1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Ở nước ta, chăn nuôi lợn đóng vai trò vô cùng quan trọng trong hệ thống sản xuất nông nghiệp cũng như đối với nền kinh tế Trong nhiều năm trở lại đây, ngành chăn nuôi nước ta đã và đang đẩy mạnh phát triển chăn nuôi lợn, nhưng thực trạng ngành chăn nuôi lợn ở Việt Nam vẫn còn gặp rất nhiều khó khăn, đặc biệt là giá thức ăn cao và thường xuyên biến động do phải phụ thuộc nguồn nguyên liệu nhập khẩu, vì vậy đã ảnh hưởng bất lợi cho phát triển chăn nuôi lợn Trong khi đó, Việt Nam là một nước nông nghiệp với nguồn phụ phẩm dồi dào từ trồng trọt, chế biến nông sản như rơm rạ, bã sắn, bã dong riềng, bã mía…Hiện nay Việt Nam có khoảng 100 nhà máy chế biến tinh bột sắn có quy mô lớn với sản lượng từ 1,8 tấn đến 2 triệu tấn tinh bột/ngày, lượng chất thải rắn thải ra từ các nhà máy này khoảng 0,6 triệu tấn/ngày (Nguyễn Thị Hằng Nga & cs., 2016) Lượng bã sắn này phần lớn được thải ra ngoài môi trường, gây lãng phí và ô nhiễm nghiêm trọng Một số ít được phơi khô hoặc ủ chua làm thức ăn cho gia súc, nhưng hiệu sử dụng thức ăn chưa cao, do trong bã sắn có hàm lượng protein thấp, còn chứa nhiều chất xơ và chất kháng dinh dưỡng như hydrogen cyanide (HCN) Vì vậy nếu xử lý được những hạn chế đó, chế biến đúng cách thì bã sắn có thể trở thành nguồn thức ăn chăn nuôi có giá trị, góp phần quan trọng vào việc giảm phụ thuộc nguyên liệu nhập khẩu và giảm giá thành sản xuất từ đó nâng cao khả năng cạnh tranh của ngành Chăn nuôi Việt Nam

Lên men được xác định là một trong số ít các phương pháp hiệu quả trọng việc chế biến, bảo quản phụ phẩm thành thức ăn chăn nuôi giàu dinh dưỡng (Ubalua, 2007; Aro, 2008) Tuy nhiên, phần lớn các nguồn phụ phẩm đều chứa hàm lượng

xơ và tinh bột cao, hầu hết các vi sinh vật không thể sử dụng trực tiếp Vì vậy, để nâng cao hiệu quả của quá trình lên men cần bổ sung thêm các enzyme phân giải tinh bột (amylase) và cellulase hoặc lựa chọn các chủng có khả năng sản sinh các enzyme này Hiện nay, enzyme amylase và cellulase thương mại chủ yếu được

chiết chủ yếu từ nấm sợi với các loài thuộc chi Trichoderma, Humicola, Penicillium, Aspergillus (Sukumaran & cs., 2005; Ariffin & cs., 2006; Ghani & cs.,

2013) Do nhu cầu về sử dụng enzyme trong chăn nuôi cũng như các lĩnh vực công, nông nghiệp và thực phẩm ngày càng tăng nên việc mở rộng nghiên cứu, tăng cường cải thiện chất lượng cũng như nâng cao sản lượng thông qua việc cải tiến chủng, tối ưu môi trường và tìm kiếm quá trình lên men hiệu quả và giảm chi phí sản xuất là rất cần thiết

1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI

1.2.1 Mục tiêu tổng quát

Nâng cao hiệu quả sử dụng phụ phẩm trồng trọt và chế biến nông sản bằng ứng dụng chế phẩm sinh học

1.2.2 Mục tiêu cụ thể

Chọn lọc được 1 chủng đột biến từ chủng nấm sợi Aspergillus niger A45.1 có

khả năng sinh đa enzyme (α-amylase, glucoamylase và cellulase) với hoạt tính cao Tối ưu được điều kiện lên men xốp cho sản xuất đa enzyme (α-amylase, glucoamylase và cellulase) của chủng đột biến chọn lọc

Đánh giá được hiệu quả của việc sử dụng thức ăn lên men tạo ra từ bã thải chế biến tinh bột được xử lý bằng đa enzyme (α-amylase, glucoamylase và cellulase) ở lợn thịt

1.3 PHẠM VI NGHIÊN CỨU

1.3.1 Đối tượng nghiên cứu

Chủng nấm sợi Aspergillus niger A45.1 được sàng lọc từ bộ giống của phòng

Các chất chức năng Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học

và Công nghệ Việt Nam

Bã sắn tươi: được thu gom trực tiếp từ các cơ sở chế biến tinh bột thuộc xã Cát Quế, huyện Hoài Đức, Hà Nội

Lợn lai F1 (Landrac x Yorkshire): 72 lợn cái và 72 lợn đực thiến giai đoạn 20

kg đến xuất chuồng

1.3.2 Địa điểm nghiên cứu

Phòng các chất chức năng sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Việt Nam

Phòng Thí nghiệm trung tâm, Khoa Chăn nuôi, Học Viện Nông nghiệp Việt Nam Phòng thí nghiệm bộ môn Di truyền giống, khoa Chăn nuôi, Học Viện Nông nghiệp Việt Nam

Trung tâm Giống lợn chất lượng cao, Học viện Nông nghiệp Việt Nam

1.3.3 Thời gian nghiên cứu

Thời gian nghiên cứu: tháng 6 năm 2015 – tháng 6 năm 2019

1.4 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI

Đề tài đã cải tiến chủng dại Aspergillus niger A45.1 bằng đột biến ngẫu nhiên

và chọn lọc được 1 chủng đột biến Aspergillus niger GA15 có khả năng sinh đa

enzyme (α-amylase, glucoamylase và cellulase) với hoạt tính cao

Chế biến được bã thải tinh bột sắn thành thức ăn giàu dinh dưỡng cho chăn nuôi lợn thịt bằng đường hóa và lên men đồng thời sử dụng chế phẩm chứa đa enzyme từ chủng đột biến và lợi khuẩn

1.5 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI

1.5.1 Ý nghĩa khoa học

Đề tài đã tạo ra được một chủng nấm sợi đột biến có khả năng sinh đa enzyme (α-amylase, glucoamylase và cellulase) với hoạt tính cao và tối ưu môi trường lên men xốp cho sản xuất đa enzyme

Đề tài đã chế biến được bã thải tinh bột sắn thành thức ăn giàu dinh dưỡng cho gia súc bằng đường hóa và lên men đồng thời sử dụng chế phẩm đa enzyme và vi sinh vật có lợi

Kết quả nghiên cứu góp phần cung cấp thêm tư liệu phục vụ cho giảng dạy và

nghiên cứu về phát triển chủng bằng kỹ thuật đột biến, chế biến thức ăn chăn nuôi giàu

dinh dưỡng từ bã thải tinh bột bằng đa enzyme hoạt tính cao và lợi khuẩn

1.5.2 Ý nghĩa thực tiễn

Có thể cung cấp chủng giống đột biến cho sản xuất enzyme công nghiệp, giảm thiểu chi phí, đáp ứng nhu cầu sử dụng enzyme ngày càng tăng trong chăn nuôi cũng như các lĩnh vực công nghiệp

Tận dụng được nguồn phụ phẩm rẻ tiền từ các cơ sở sản xuất tinh bột sắn thành nguồn nguyên liệu giàu dinh dưỡng làm thức ăn chăn nuôi, góp phần giảm chi phí

về thức ăn trong chăn nuôi và ô nhiễm môi trường

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Ngày này, hầu hết hầu hết các enzyme cellulase và amylase quan trọng trong

công nghiệp đều được tạo ra bởi nấm sợi với các loài thuộc chi Trichoderma, Humicola, Penicillium, Aspergillus (Sukumaran & cs., 2005; Ariffin & cs., 2006;

Ghani & cs., 2013) Trong những năm gần đây, với sự tăng lên theo cấp số nhân về ứng dụng của enzyme trong nhiều lĩnh vực khác nhau đã đặt ra yêu cầu cấp thiết là phải mở rộng và tăng cường cả việc cải tiến chất lượng và nâng cao về số lượng thông qua việc cải tiến chủng, tối ưu môi trường, và tìm kiếm quá trình lên men hiệu quả để tăng sản lượng enzyme Việc cải tiến chủng chủ yếu tập trung vào sự gia tăng hiệu suất của quá trình lên men, giảm chi phí và tăng các lợi ích kinh tế và cũng có thể có thêm một số đặc tính mong muốn khác (Prabakaran & cs., 2009; Singh & cs., 2011) Đột biến là một công cụ thường được sử dụng để cải tiến chủng, là phương pháp có hiệu quả trong cải tiến các vi sinh vật công nghiệp để tạo

ra được những chủng có hiệu suất enzyme cao hoặc những đặc tính mong muốn (Singh & cs., 2011; Pathak & cs., 2015) Trong quá trình sản xuất enzyme công nghiệp, việc tối ưu môi trường lên men luôn được tiến hành để tăng sản lượng của sản phẩm mong muốn Lên men xốp được đánh giá là con đường tốt nhất để sản xuất enzyme và các sản phẩm bền nhiệt khác Lên men xốp ngày càng được sử dụng rộng rãi trong sản xuất cũng như trong nghiên cứu vì những ứng dụng mang tính thực tiễn và kinh tế của nó Lên men xốp được dùng trong công nghiệp chế biến và sản xuất thực phẩm chủ yếu là lĩnh vực sản xuất các loại hương liệu, sản xuất enzyme (a-amylase, fructosyl transferase, lipase, pectinase, xylanase), các acid hữu cơ (acid lactic, acid citric)

Thức ăn lên men đã được nghiên cứu rộng rãi để thay thế việc sử dụng kháng sinh làm chất kích thích tăng trọng trong nhiều năm gần đây và để giám giá thành của thức ăn chăn nuôi bằng việc sử dụng các phụ phẩm công – nông nghiệp (Wang

& cs., 2018) Thức ăn lên men mang lại nhiều lợi ích cho vật nuôi do sự có mặt của các vi sinh vật có lợi với các đặc tính probiotic, kháng khuẩn, chống oxy hóa, sản sinh các peptit…Chúng có khả năng biến đổi thành phần hóa học của nguyên liệu thức ăn trong suốt quá trình lên men làm tăng cường giá trị dinh dưỡng, cải thiện

chất lượng cảm quan, an toàn thực phẩm và có hiệu quả trong bảo quản thức ăn Bên cạnh đó, các vi sinh vật còn có khả năng phân hủy các thành phần độc hại, các chất kháng dinh dưỡng có trong thức ăn, sinh ra các chất kháng khuẩn, chống oxy hóa, kích thích đặc tính probiotic và các hợp chất tăng cường sức khỏe cho vật chủ (Tamang & cs., 2016; Wang & cs., 2018)

Ở nước ta, trong những năm gần đây nhiều nhà máy sản xuất và chế biến tinh bột sắn ra đời Hiện nay, Việt Nam có khoảng 100 nhà máy chế biến tinh bột sắn

có quy mô lớn với sản lượng từ 1,8 tấn đến 2 triệu tấn tinh bột/ngày, lượng chất thải rắn thải ra từ các nhà máy này khoảng 0,6 triệu tấn/ngày Chỉ một phần nhỏ bã sắn được sử dụng làm thức ăn cho gia súc nhưng giá trị dinh dưỡng không cao, phần lớn được thải ra ngoài môi trường, gây lãng phí và ô nhiễm môi trường nghiêm trọng Vì vậy, việc tìm kiếm các giải pháp kỹ thuật để xử lý bã sắn làm thức ăn chăn nuôi cần phải đặt ra đúng mức để có thể đưa nguồn phụ phẩm này trở thành thức ăn hữu ích cho vật nuôi, góp phần khai thác các ưu thế tại chỗ và góp phần hạn chế ô nhiễm môi trường

PHẦN 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Nội dung 1: Gây đột biến chủng Aspergillus niger A45.1 và tối ưu điều kiện lên

men chủng nấm đột biến chọn lọc để sinh tổng hợp đa enzyme (α- amylase, glucoamylase và cellulase) cao

Nội dung 2: Xử lý bã sắn thành thức ăn chăn nuôi bằng chế phẩm đa enzyme

của chủng đột biến chọn lọc và vi sinh vật probiotic bằng công nghệ đường hóa và lên men đồng thời

Nội dung 3: Đánh giá ảnh hưởng của việc sử dụng bã sắn lên men trong khẩu

phần ăn đến năng suất chăn nuôi lợn thịt

3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.2.1 Gây đột biến chủng Aspergillus niger A45.1 và tối ưu điều kiện lên men

chủng nấm sợi đột biến chọn lọc để sinh tổng hợp đa enzyme (α- amylase, glucoamylase và cellulase) cao

a Phương pháp hoạt hóa và nuôi cấy nấm sợi

Giống gốc là bào tử của chủng nấm sợi Aspergillus niger A45.1 (đựng trong

ống eppendorf) bảo quản trong glycerol 30%, điều kiện lạnh sâu (-700C) Trước khi đem giống gốc đi hoạt hóa cần để ở nhiệt độ phòng trong khoảng 30 phút Tiến hành pha loãng giống gốc bằng nước cất vô trùng đến nồng độ 10-5, 10-6, 10-7 Mỗi

độ pha loãng hút 100µl vào đĩa petri có môi trường PDA đã chuẩn bị, tiến hành cấy trải bằng que cấy trang Ủ các đĩa nuôi cấy ở điều kiện phòng khoảng 5-7 ngày

Kiểm tra độ thuần khiết của các khuẩn lạc nấm

b Phương pháp gây đột biến

Chủng nấm sợi Aspergillus niger A45.1 được nuôi cấy trong môi trường PDB ở

28oC, 200 vòng/phút, sau 5 ngày thu 2ml dung dịch bào tử (107 bào tử/ml), ly tâm 10.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC), thu bào tử, loại dịch nổi Bào tử được hòa vào 500µl dung dịch NTG và lắc kỹ Đổ dung dịch vào đĩa petri (9cm x 1,5 cm), bật tia UV (50 Watte), khoảng cách từ nguồn UV đến đĩa là 30 cm Sau 30, 60, 90,

120 và 180 phút chiếu UV, 50 µl dịch đã chiếu được hút cho vào các ống eppendorf và được rửa bằng nước muối sinh lý 3 lần, sau đó pha loãng và cấy trải trên môi trường PDA có bổ sung ampicillin (100mg/l), nuôi cấy ở nhiệt độ phòng trong 4-6 ngày Sau khi nấm đã mọc, đếm số lượng khuẩn lạc trên đĩa thí nghiệm

và đối chứng (không gây đột biến) để dựng đồ thị về tỷ lệ (%) sống sót của bào tử sau chiếu UV Từ các đĩa nấm đã mọc, nhặt ngẫu nhiên 5 khuẩn lạc/liều gây đột biến, cấy trên đĩa PDA, ủ ở nhiệt độ phòng trong 7 ngày, sau đó tiến hành lên men

để xác định hoạt độ enzyme theo phương pháp được mô tả bởi Vũ Văn Hạnh & cs (2012) và Kaur & cs.(2014)

c Phương pháp lên men xốp và chiết tách enzyme thô

Tiến hành lên men sản xuất enzyme theo Vu & cs (2011) có cải tiến về việc sử dụng

cơ chất Cấy (1x1 cm2) nấm sợi đã nuôi 7 ngày tuổi từ đĩa thạch vào bình tam giác 250 ml chứa môi trường cám gạo dịch thể (10%, w/v), nuôi lắc 200 vòng/phút, ở 30oC, sau 3 ngày thu giống cấp 1 Lấy 10% giống cấp 1 trộn vào môi trường lên men xốp (10 cám

gạo, độ ẩm 30%), trộn đều, trong 5 ngày ở nhiệt độ phòng

Lấy 1g sản phẩm sau 5 ngày lên men xốp trộn với 9 ml nước cất vô trùng đựng trong ống falcon 50 ml Hỗn hợp được lắc 200 vòng/phút, ở 30oC trong 60 phút, sau đó ly tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút, thu dịch nổi và sử dụng làm nguồn enzyme thô

d Phương pháp xác định hoạt tính enzyme cellulase, α - amylase và glucoamylase

Hoạt tính của enzyme α – amylase, glucoamylase và cellulase sau lên men xốp được xác định theo mô tả của Grajek (1987) và Vu & cs (2010): 1 ml hỗn hợp phản ứng enzyme gồm 50µl enzyme pha loãng và 50µl carboxymethyl cellulose 1% (w/v) (CMC) hoặc hồ tinh bột 1% trong đệm axetat (50 mM, pH 5) Hỗn hợp phản ứng được ủ tại 50oC trong 30 phút và đường khử sau phản ứng được xác định bằng phương pháp xác định hàm lượng đường khử (Miller, 1959)

Xây dựng đường chuẩn glucose và maltose

Nồng độ đường khử trong mẫu được xác định nhờ vào đường chuẩn glucose và đường chuẩn maltose đã dựng

Dựa vào đường chuẩn glucose xác định được hoạt tính cellulase (cơ chất CMC)

và glucoamylase (cơ chất tinh bột), dựa vào đường chuẩn maltose xác định hoạt tính của α-amylase

Một đơn vị hoạt tính enzyme (Unit: U) được xác định là lượng enzyme cần thiết để tạo ra 1µM glucose hoặc maltose từ cơ chất trong 1 phút ở điều kiện thí nghiệm Hoạt tính cellulase, α – amylase và glucoamylase được thể hiện bằng đơn

vị trên 1 gam cám gạo lên men (U/g)

Hoạt tính enzyme (U/g) =

Trong đó: X: hàm lượng đường khử (µM) được giải phóng trong dung dịch sau

phản ứng enzyme; k: hệ số pha loãng; t: thời gian phản ứng (phút)

e Tối ưu điều kiện lên men dòng đột biến chọn lọc có khả năng sinh đa enzyme cao

Các thông số được nghiên cứu bao gồm: Cơ chất (cám mì, cám gạo, vỏ trấu, mùn cưa) Độ ẩm cơ chất (20, 30, 40, 50, 60 và 70%, w/v) Nhiệt độ lên men (20,

25, 30, 35, 40 và 45oC) pH ban đầu của cơ chất lên men (3,0; 3,5; 4; 4,5; 5; 5,5; 6; 6,0; 6,5 và 7) Thời gian lên men (từ 2, 3, 4, 5, 6, 7 và 8 ngày), tuổi giống (1, 2, 3

và 4 ngày) Nguồn carbon và nitrogen: Nguồn carbon gồm glucose, maltose, tinh bột gạo, sucrose, mỗi loại 1% được bổ sung vào cơ chất lên men xốp Nguồn nitrogen như: ure, cao nấm men, tryptone, peptone, NH4Cl, NH4NO3, mỗi loại 1% được bổ sung vào cơ chất lên men xốp

Tiến hành: Tiến hành tối ưu đơn biến từng thành phần theo thứ tự các thông số lên men như sau:

Tối ưu cơ chất lên men: Lên men xốp chủng nấm sợi đột biến chọn lọc với các

cơ chất khác nhau (cám mì, cám gạo, vỏ trấu, mùn cưa), độ ẩm 30%, pH 4,5, tuổi giống 3 ngày tuổi, lên men ở nhiệt độ 30oC trong 5 ngày Sau khi lên men, xác định hoạt tính cellulase, α–amylase và glucoamylase, lựa chọn cơ chất thích hợp nhất cho sự sản sinh các enzyme của chủng nấm sợi chọn lọc

Tối ưu độ ẩm lên men: Tiến hành lên men xốp chủng nấm sợi chọn lọc với cơ

chất tối ưu, điều chỉnh cơ chất lên men ở các độ ẩm khác nhau (20, 30, 40, 50, 60

và 70%), pH 4,5, tuổi giống 3 ngày tuổi, nhiệt độ 30oC, thời gian lên men 5 ngày Lựa chọn độ ẩm thích hợp nhất cho sự sản sinh các enzyme

Tối ưu nhiệt độ lên men: Lên men xốp chủng nấm sợi chọn lọc ở cơ chất tối ưu

với độ ẩm thích hợp, pH 4,5, tuổi giống 3 ngày tuổi, lên men trong 5 ngày ở các nhiệt độ khác nhau (20, 25, 30, 35, 40 và 45oC) Xác định hoạt tính của các enzyme cellulase, α–amylase và glucoamylase và lựa chọn pH thích hợp nhất

Tối ưu pH: Lên men xốp chủng nấm sợi chọn lọc ở cơ chất tối ưu với độ ẩm

thích hợp, điều chỉnh pH của môi trường lên men ở các mức khác nhau (3,0; 3,5; 4; 4,5; 5; 5,5; 6; 6,0; 6,5 và 7), tuổi giống 3 ngày tuổi, lên men trong 5 ngày ở nhiệt

độ tối ưu Xác định hoạt tính của các enzyme cellulase, α–amylase và glucoamylase và lựa chọn pH thích hợp nhất

Tối ưu thời gian lên men: Tiến hành lên men xốp chủng nấm sợi chọn lọc ở cơ

chất tối ưu, điều chỉnh cơ chất ở độ ẩm và pH thích hợp, bổ sung giống 3 ngày tuổi, lên men từ 2, 3, 4, 5, 6, 7 và 8 ngày ở nhiệt độ tối ưu Sau các thời gian lên men, xác định hoạt tính enzyme và lựa chọn thời gian lên men thích hợp nhất cho

sự sản sinh cellulase, α–amylase và glucoamylase của chủng nấm chọn lọc

Tối ưu tuổi giống: Lên men chủng nấm sợi chọn lọc với cơ chất đã được lựa

chọn, điều chỉnh độ ẩm, pH ban đầu ở mức thích hợp, bổ sung giống ở các tuổi giống khác nhau (1, 2, 3 và 4 ngày tuổi), lên men ở nhiệt độ và thời gian thích hợp Lựa chọn tuổi giống thích hợp nhất cho sự sản sinh các enzyme

Lựa chọn nguồn cacbon bổ sung: Tiến hành lên men xốp chủng nấm sợi ở các

điều kiện tối ưu đã được lựa chọn, bổ sung 1% nguồn cacbon (glucose, maltose, tinh bột gạo, sucrose) Xác định hoạt tính enzyme và lựa chọn nguồn carbone bổ

sung thích hợp nhất cho sự sản sinh cellulase, α–amylase và glucoamylase của chủng nấm chọn lọc

Lựa chọn nguồn nitơ bổ sung: Tiến hành lên men xốp chủng nấm sợi ở các điều

kiện tối ưu đã được lựa chọn, bổ sung 1% nguồn cacbon thích hợp và 1% các nguồn nitơ khác nhau (ure, cao nấm men, tryptone, peptone, NH4Cl, NH4NO3) Xác định hoạt tính enzyme và lựa chọn nguồn nitơ bổ sung thích hợp nhất cho sự sản sinh cellulase, α–amylase và glucoamylase của chủng nấm chọn lọc

3.2.2 Xử lý bã sắn thành thức ăn chăn nuôi bằng công nghệ đường hoá và lên

men đồng thời

a Đường hóa bã sắn bằng enzyme

Để lựa chọn nồng độ enzyme thích hợp trong việc đường hóa, bã sắn sau khi hòa vào nước với tỷ lệ 30% (w/v) được bổ sung chế phẩm đa enzyme thô ở các nồng độ khác nhau (0, 2, 4, 6, 8, 10%) (tính theo khối lượng cơ chất) Ủ hỗn hợp trong bình kín ở nhiệt độ phòng, sau 24 giờ tiến hành lấy mẫu xác định hàm lượng tinh bột, xơ thô và hàm lượng đường khử Thí nghiệm được tiến hành lặp lại 3 lần Thời gian đường hóa bã sắn thích hợp được xác định thông qua việc tiến hành ủ dung dịch bã sắn với enzyme ở nồng độ thích hợp ở điều kiện như mô tả ở trên trong 60 giờ Cứ sau 12 giờ ủ, mẫu được lấy để xác định lượng đường khử Thí nghiệm được tiến hành lặp lại 3 lần

b Đường hóa và lên men bã sắn đồng thời tạo sản phẩm giàu protein

Xác định mức bổ sung (NH4)2SO4 thích hợp: Cân 10 g bã sắn cho vào bình tam giác 250 ml, điều chỉnh độ ẩm 30% bằng HCl 0,01%, bổ sung chế phẩm enzyme thô ở hàm lượng thích hợp và 0,5% chế phẩm probiotic (theo khối lượng cơ chất)

Bổ sung (NH4)2SO4 vào hỗn hợp lên men với hàm lượng 0; 0,5; 1; 1,5 g/100g bã sắn (tương ứng 0; 0,5; 1; 1,5 %) Tiến hành lên men ở nhiệt độ phòng Sau 48 giờ xác định hàm lượng Protein thô, Protein thực, lượng protein tăng để xác định hàm lượng bổ sung (NH4)2SO4 thích hợp

Lượng Protein tăng (protein gain - PG, % VCK) được xác định bằng công thức:

PG = Pf - Po

Trong đó: Po: Hàm lượng protein ở thời điểm bắt đầu (0 giờ) (% VCK)

Pf: Hàm lượng protein sau khi lên men (48 giờ) (% VCK)

Xác định thời gian tối ưu: Lên men lỏng bã sắn có bổ sung enzyme, chế phẩm probiotic (như mô tả ở trên) cùng nitơ ở nồng độ thích hợp Lên men trong 96 giờ

ở nhiệt độ phòng, sau mỗi 24 giờ lấy mẫu phân tích hàm lượng protein thực, xác định thời gian lên men thích hợp cho đường hóa và lên men đồng thời bã sắn Thí nghiệm được tiến hành lặp lại 3 lần

c Lên men bã sắn ở điều kiện tối ưu làm thức ăn cho lợn

Cân 80kg bã sắn tươi vào thùng lên men (dung tích 120l), bổ sung 400g chế phẩm probiotic (tương ứng 0,5%), chế phẩm đa enzyme và (NH4)2SO4 với hàm lượng thích hợp, trộn đều, điều chỉnh về độ ẩm 30% bằng nước máy Đặt các bình lên men ở trong phòng kín Sau thời gian lên men thích hợp, tiến hành lấy mẫu xác

định thành phần dinh dưỡng (protein thô, protein thực, tinh bột, xơ thô, lipit thô, khoáng tổng số, axit hữu cơ tổng số, HCN), pH và chất lượng cảm quan

d Phương pháp phân tích mẫu

Phương pháp lấy mẫu phân tích theo TCVN 4325:2007

Xác định hàm lượng vật chất khô theo TCVN 4326:2007

Định lượng khoáng tổng số (tro thô) theo TCVN 4327:2007

Định lượng xơ thô theo TCVN 4329: 2007

Xác định hàm lượng lipit thô theo TCVN 4321:2007

Định lượng canxi theo TCVN 1526: 2001

Định lượng protein thô được tính toán trên cơ sở xác định hàm lượng nitơ tổng

số bằng phương pháp Kjeldahl theo TCVN 4328:2007

Phương pháp xác định hàm lượng Protein thực: Nghiền nhỏ mẫu, hòa với nước cất trong bình tam giác, đun cách thủy trong 30 phút Để nguội, kết tủa protein bằng axit tricloaxetic Tách kết tủa, rửa sạch và định lượng nitơ theo phương pháp của Kjeldahl

Phương pháp xác định hàm lượng tinh bột: Tinh bột được thủy phân thành đường trong dung dịch HCl 10% ở điều kiện đun sôi trong bình cách thủy trong 90 phút Dung dịch thủy phân được làm nuội và trung hòa bằng NaOH với chỉ thị methyl da cam Hàm lượng đường sau khi thủy phân được xác định bằng phương pháp DNS theo mô tả của Miller (1959)

Bảng 3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm

KL bắt đầu TN (kg) 20,04 ± 1,49 20,37 ± 1,59 20,41 ± 1,56 19,80 ± 1,57

Thức ăn sử dụng trong thí nghiệm gồm có bã sắn sau lên men (BSLM) phối trộn với các nguyên liệu thông thường đang được sử dụng để cân đối khẩu phần dựa trên tiêu chuẩn NRC (2012) Công thức thức ăn hỗn hợp cho lợn thí nghiệm chia làm 2 giai đoạn 20-50 kg và 50 kg đến xuất bán (Bảng 3.2)

Lợn được cho ăn 3 lần/ngày Trong chuồng có hệ thống núm uống nước tự động cho lợn uống tự do Lợn con được tiêm phòng vaccine đầy đủ theo quy trình của Trung tâm giống lợn Chất lượng cao – Học viện Nông nghiệp Việt Nam

Các chỉ tiêu theo dõi bao gồm: khả năng sinh trưởng và tiêu tốn thức ăn, năng suất thân thịt, chất lượng và thành phần hóa học của thịt lợn

Bảng 3.2 Thành phần và giá trị dinh dưỡng khẩu phần thí nghiệm

Lô

TN1

Lô TN2

Lô TN3

Thành phần nguyên liệu (% VCK)

Ngô hạt 47,30 42,00 33,50 28,80 48,50 40,20 34,50 31,40 Cám mì 24,00 20,30 18,00 14,00 30,00 30,00 26,00 19,00 Khô đỗ tương 20,00 20,00 19,00 16,50 13,00 12,00 13,00 13,10 Bột cá nhạt 5,00 3,90 3,80 4,80 4,50 3,50 1,50 1,30 Dầu ăn 1,00 1,10 3,00 3,20 1,00 1,30 2,00 2,20 Premix khoáng (*) 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 Methionine 0,10 0,10 0,10 0,10 0,10 0,10 0,10 0,10 lysine 0,20 0,20 0,20 0,20 0,10 0,10 0,10 0,10 D.C.P 18% 1,80 1,80 1,80 1,80 2,00 2,00 2,00 2,00 Bazyme P 0,00 0,00 0,00 0,00 0,10 0,10 0,10 0,10 Muối ăn 0,25 0,25 0,25 0,25 0,35 0,35 0,35 0,35 Toxisorb 0,10 0,10 0,10 0,10 0,10 0,10 0,10 0,10 BSLM 0,00 10,00 20,00 30,00 0,00 10,00 20,00 30,00 Thành phần dinh dưỡng

Protein thô (%) 19,01 19,01 19,01 19,04 16,76 16,66 16,53 16,76 Lipit thô (%) 5,03 4,59 4,11 3,72 4,77 4,3 3,81 3,43

Xơ thô (%) 5,13 6,07 7,02 7,87 5,33 6,49 7,42 8,14 Khoáng tổng số (%) 4,06 4,59 4,94 5,61 3,8 4,23 4,42 4,87 Canxi (Ca) (%) 0,79 0,77 0,79 0,85 0,81 0,79 0,73 0,75 Photpho (P) (%) 0,88 0,98 1,11 1,25 0,91 1,03 1,1 1,2 NLTĐ

(ME, kcal/kg)

3039,07 3069,18 3145,93 3178,37 2982,7 2991,75 2912,55 3044,75

b Phương pháp phân tích và xác định các chỉ tiêu theo dõi

Phân tích thành phần hóa học nguyên liệu và thức ăn tại Phòng thí nghiệm trung tâm Khoa Chăn nuôi- Học viện Nông nghiệp Việt Nam theo phương pháp ở mục 3.3.3.4

Xác định năng lượng trao đổi (ME) theo công thức của Noblet & Perez (1993):

ME (kcal/kg VCK) = 4168 – 12,3 x KTS + 1,4 x Protein thô + 4,1 x Lipit thô – 6,1 x xơ thô (Trong đó: ĐVT của biến: g/kg/VCK)

Khả năng sinh trưởng: khối lượng bắt đầu (kg), khối lượng kết thúc giai đoạn nuôi (kg),

sinh trưởng tích luỹ qua các tháng tuổi (kg), sinh trưởng tuyệt đối (ADG) (g/ngày)

Khối lượng của từng cá thể được xác định tại thời điểm bắt đầu và kết thúc thí nghiệm bằng cân điện tử Mettler Toledo (Trung Quốc), lợn được cân từng con vào buổi sáng trước khi cho ăn Tăng khối lượng (g/ngày) được tính dựa trên chênh lệch về khối lượng kết thúc và khối lượng bắt đầu của từng cá thể và số ngày nuôi thí nghiệm

Hệ số chuyển hóa thức ăn (FCR): Tổng lượng thức ăn thu nhận/ tổng khối

lượng lợn tăng lên trong giai đoạn thí nghiệm

Năng suất thịt: khối lượng giết mổ (kg), khối lượng móc hàm (kg), khối lượng

thịt xẻ (kg), tỷ lệ thịt móc hàm (%), tỷ lệ thịt xẻ (%), chiều dài thân thịt (cm), độ

dày mỡ lưng (mm) và dày cơ thăn (mm)

Kết thúc thí nghiệm, mỗi lô chọn 6 lợn thịt của 3 lần lăp lại (tỷ lệ đực cái: 1:1, lợn có khối lượng bằng khối lượng trung bình của lô trong mỗi lần lặp lại) để xác định các chỉ tiêu về năng suất thân thịt Lợn mổ khảo sát được cho nhịn đói 24 giờ trước khi giết mổ

Sau khi xác định khối lượng sống, tiến hành giết mổ cạo lông, bỏ tiết và nội tạng cân xác định khối lượng móc hàm Tỷ lệ móc hàm được tính dựa trên khối lượng trước khi giết thịt và khối lượng móc hàm Khối lượng thịt xẻ được cân sau khi đã bỏ đầu và 4 chân Tỷ lệ thịt xẻ được tính dựa trên khối lượng thịt xẻ và khối lượng trước giết thịt Dài thân thịt được xác định bằng thước dây đo từ đốt sống cổ

số một (đốt Atlas) đến xương Pubis

Dày mỡ lưng và dày cơ thăn được đo bằng máy đo siêu âm Agroscan AL với đầu dò ALAL 350 (ECM, France) ở vị trí xương sườn 3-4 cuối, cách đường sống lưng 6 cm trên từng cá thể sống cùng với thời điểm cân khối lượng kết thúc theo

phương pháp được mô tả trong nghiên cứu của Youssao et al (2002) trên con lai

(LY) Ước tính tỷ lệ nạc bằng phương trình hồi quy được Bộ Nông nghiệp Bỉ khuyến cáo năm 1999 dựa trên dày mỡ lưng và dày cơ thăn: y = 59,902386 - 1,060750X1 + 0,229324X2; trong đó: y = tỷ lệ nạc ước tính (%), X1 = độ dày mỡ lưng, bao gồm da (mm), X2 = độ dày cơ thăn (mm)

Tổng số 24 mẫu cơ thăn (6 mẫu/công thức: 3 cái và 3 đực) được lấy ngay sau khi giết thịt ở vị trí xương sường 13-14, bảo quản trong hộp đá và vận chuyển về phòng thí nghiệm Cơ thăn được cắt thành 2 mẫu với độ dày từ 4 cm (01 mẫu được bảo quản ở nhiệt độ 4°C để phân tích các chỉ tiêu cảm quan ở 24 giờ sau giết thịt, 01 mẫu còn lại được bảo quản ở nhiệt độ -50oC để phân tích thành phần hoá học thịt) Giá trị pH được đo bằng máy Testo 230 (Đức) tại các thời điểm 45 phút (pH45) và

24 giờ (pH24) sau giết thịt Màu sắc thịt được xác định bằng máy Minolta CR-410 (Nhật Bản) với các chỉ số L* (lightness), a* (redness) và b* (yellowness) tại thời điểm

24 giờ (L*, a*, b*) sau giết thịt Tỷ lệ mất nước bảo quản (%) được xác định dựa trên khối lượng mẫu trước và sau bảo quản ở thời điểm 24 giờ Tỷ lệ mất nước chế biến (%) được xác định dựa trên khối lượng mẫu trước và sau chế biến (mẫu cơ thăn được hấp cách thủy bằng máy Waterbach Memmert ở nhiệt độ 75oC trong 50 phút) Độ dai của

cơ thăn (N) được xác định bằng máy Warner Bratzler 2000D (Mỹ) tại thời điểm 24 giờ sau giết thịt

3.2.4 Xử lý số liệu

Số liệu được xử lý bằng phần mềm Excel và SAS 9.0, phân tích phương sai

(ANOVA) với phép thử TURKEY ở mức ý nghĩa P < 0.05

Mô hình tuyến tính tổng quát GLM được sử dụng để phân tích ảnh hưởng của khẩu phần và tính biệt đến các chỉ tiêu về sinh trưởng, năng suất thân thịt, chất lượng và thành phần hoá học thịt

yijk = µ + Di + Sj + Di*Sj + εijk

Trong đó: yijk : chỉ tiêu về sinh trưởng, năng suất thân thịt, chất lượng thịt và thành phần hoá học thịt

µ : trung bình quần thể

Di : ảnh hưởng của khẩu phần thứ ith (i = 4: ĐC, TN1, TN2 và TN3)

Sj : ảnh hưởng của tính biệt thứ jth (j = 2: đực và cái)

Di*Sj: ảnh hưởng tương tác giữa khẩu phần và tính biệt

εijk : sai số ngẫu nhiên

PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 GÂY ĐỘT BIẾN CHỦNG ASPERGILLUS NIGER A45.1 VÀ TỐI ƯU ĐIỀU

KIỆN LÊN MEN CHỦNG NẤM SỢI ĐỘT BIẾN CHỌN LỌC CHO SINH TỔNG HỢP ĐA ENZYME (α-AMYLASE, GLUCOAMYLASE VÀ CELLULASE) CAO

4.1.1 Hoạt hóa giống

Từ chủng giống gốc Aspergillus niger A45.1 đã tiến hành hoạt hóa thành công

giống trên môi trường PDA Giống hoạt hóa có đặc điểm: khuẩn lạc tròn, màu sắc của khuẩn lạc thay đổi theo thời gian, tương ứng với các giai đoạn sinh trưởng và phát triển, từ trắng đến vàng và nâu, hệ sợi nấm mọc thưa, bào tử đen.Quan sát

hình thái của chủng Aspergillus niger A45.1 dưới kính hiển vi thấy, cành bào tử

dạng bông, bào tử đính kép hai lớp, bào tử không nằm trong bọc bào tử, cuống sinh thể bình phình ra rõ rệt ở 2 đầu tạo bọng hình cầu

4.1.2 Ảnh hưởng của tia UV, NTG đến khả năng sống sót của chủng nấm sợi

Aspergillus niger A45.1

Tiến hành gây đột biến chủng Aspergillus niger A45.1 bằng việc hòa tan bào tử

vào dung dịch NTG và chiếu tia UV trong thời gian từ 0 đến 180 phút Kết quả cho thấy, tia UV và NTG có ảnh hưởng rõ rệt đến khả năng sống sót của các bào tử nấm

do tia UV và NTG đã tạo nên các đột biến gây chết Thời gian chiếu UV hoặc xử lý NTG càng dài thì tỷ lệ sống sót của các bào tử càng giảm

Hình 4.1 Mối quan hệ giữa tỷ lệ (%) bào tử nấm Aspergillus niger A45.1 còn sống sót

và thời gian chiếu tia UV và xử lý NTG

0 20

Số lượng bào tử ở thời điểm chưa xử lý (0 phút) là 10 (bào tử/ml) sau đó giảm dần theo thời gian gây đột biến Tỷ lệ sống sót của các bào tử chỉ còn 26,73% sau

30 phút, 3,82% sau 60 phút và 0,4% sau 90 phút Sau 120 phút xử lý, tỷ lệ sống sót bào tử chỉ với 0,12% Từ sau 150 phút xử lý, lượng bào tử bị gây chết hoàn toàn

4.1.3 Hoạt tính enzyme của các dòng đột biến

Lựa chọn ngẫu nhiên các chủng nấm sợi còn sống sót sau khi gây đột biến Mỗi liều chọn 5 khuản lạc và tiến hành xác định khả năng sản sinh các enzyme α-amylase, glucoamylase và cellulase

Bảng 4.1 Hoạt tính enzyme của các dòng đột biến (n=3) Thời gian gây

đột biến (phút)

Dòng đột biến Hoạt tính enzyme (U/g) (LSM)*

Glucoamylase α-amylase Cellulase

0 A45.1 (Chủng dại) 12,47fhi 19,60cdef 6,40bcdef

30

GA11 10,88hi 15,01defg 4,26efGA12 14,41efh 20,90cde 6,31bcdefGA13 18,41cdef 27,57bc 4,66defGA14 21,41abcd 32,57ab 11,81a

GA15 27,41 a 38,68 a 12,16 a

60

GA21 7,98hi 10,18ghi 6,08cdefGA22 21,53abcd 32,76ab 8,81abcdfGA23 15,69def 23,04cd 12,68aGA24 21,31abcd 32,40ab 10,91abGA25 12,10fhi 6,16hi 8,38abcde

90

GA31 15,82edf 8,02ghi 7,99abcdefGA32 20,38bcde 10,30ghi 9,42abcdGA33 22,43abcd 11,33fghi 6,55bcdefGA34 26,60ab 13,41efgh 5,77cdefGA35 26,16ab 13,19efgh 9,77abc

* Trong cùng một cột, những giá trị LSM có các chữ cái khác nhau thì sai khác nhau có ý nghĩa thống kê (P<0,05).

Kết quả cho thấy, hoạt tính enzyme của các dòng đột biến có sự sai khác đáng

kể (p<0,001) Hoạt tính glucoamylase cao thuộc về chủng đột biến GA15, GA14 (ở liều gây đột biến 30 phút), GA22, GA24 (liều gây đột biến 60 phút), GA33, GA34, GA35 (liều gây đột biến 90 phút), chủng GA42 (liều gây đột biến 120 phút) với hoạt tính enzyme trong khoảng 21,41 – 27,41 (U/g) Hoạt tính α-amylase cao ở các liều gây đột 30 phút với dòng GA15, GA14 và ở 60 phút với dòng GA22 và GA24 là 32,4 – 38,68 (U/g) Hoạt tính cellulase cao ở các liều gây đột biến 30, 60, 90 phút thuộc về các dòng GA15, GA14, GA23, GA24, GA25, GA31, GA32 và GA35, là 9,42 – 12,68 (U/g) Trong số các dòng đột biến kể trên, dòng GA15 là dòng có hoạt tính của cả 3 enzyme cao nhất So với chủng dại, hoạt tính của α-amylase cao gấp