Nghiên cứu phát triển chủng nấm sợi và tối ưu điều kiện lên men sản xuất đa enzyme (α amylase, glucoamylase, cellulase) ứng dụng trong chế biến thức ăn chăn nuôi

Vì vậy, để nâng cao hiệu quả của quá trình lên men cần bổ sung thêm các enzyme phân giải tinh bột và xơ như amylase, glucoamylase, cellulase, hoặc các chủng vi sinh vật có khả năng sản s

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

DƯƠNG THU HƯƠNG

NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN CHỦNG NẤM SỢI

VÀ TỐI ƯU ĐIỀU KIỆN LÊN MEN SẢN XUẤT ĐA ENZYME

(α-AMYLASE, GLUCOAMYLASE, CELLULASE)

ỨNG DỤNG TRONG CHẾ BIẾN THỨC ĂN CHĂN NUÔI

LUẬN ÁN TIẾN SĨ

NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2022

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

DƯƠNG THU HƯƠNG

NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN CHỦNG NẤM SỢI

VÀ TỐI ƯU ĐIỀU KIỆN LÊN MEN SẢN XUẤT ĐA ENZYME

(α-AMYLASE, GLUCOAMYLASE, CELLULASE)

ỨNG DỤNG TRONG CHẾ BIẾN THỨC ĂN CHĂN NUÔI

Người hướng dẫn khoa học: 1 PGS TS Vũ Văn Hạnh

HÀ NỘI - 2022

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo vệ lấy bất kỳ học vị nào

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã được cám

ơn, các thông tin trích dẫn trong luận án này đều được chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày… tháng… năm…

Tác giả luận án

Dương Thu Hương

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án, tôi đã nhận được

sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình

Nhân dịp hoàn thành luận án, cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Vũ Văn Hạnh và PGS.TS Phạm Kim Đăng đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo,

Bộ môn Sinh lý - tập tính động vật, Khoa Chăn nuôi, Học viện Nông nghiệp Việt Nam

đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận án

Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán bộ viên chức phòng Các chất chức năng sinh học, Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm và Khoa học công nghệ Việt Nam

đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận án./

Hà Nội, ngày tháng năm 20

Nghiên cứu sinh

Dương Thu Hương

2.2.4 Sự cần thiết phải tối ưu môi trường lên men 19

chủng nấm sợi đột biến chọn lọc để sinh tổng hợp đa enzyme (α- amylase,

chủng đột biến chọn lọc cho sinh tổng hợp đa enzyme

4.1.5 Tối ưu điều kiện lên men xốp chủng nấm đột biến chọn lọc cho sinh tổng

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG

4.15 Hàm lượng protein thực ở các thời điểm lên men khác nhau (n=3) 71

biệt đến khả năng sinh trưởng của lợn F1 (LxY) giai đoạn từ 20 kg đến

DANH MỤC HÌNH

TRÍCH YẾU LUẬN ÁN Tên tác giả: Dương Thu Hương

Tên Luận án: Nghiên cứu phát triển chủng nấm sợi và tối ưu điều kiện lên men sản xuất

đa enzyme (α-amylase, glucoamylase, cellulase) ứng dụng trong chế biến thức ăn chăn nuôi

Chuyên ngành: Chăn nuôi Mã số: 9 62 01 05

Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam

Chọn lọc được 1 dòng đột biến từ chủng nấm sợi Aspergillus niger A45.1 có khả

năng sinh đa enzyme (α-amylase, glucoamylase và cellulase) với hoạt tính cao

Tìm được điều kiện lên men xốp tối ưu cho sản xuất đa enzyme (α-amylase, glucoamylase và cellulase) của dòng đột biến chọn lọc

Đánh giá được hiệu quả của việc sử dụng chế phẩm đa enzyme (α-amylase, glucoamylase và cellulase) trong chế biến bã sắn làm thức ăn chăn nuôi lợn thịt

Phương pháp nghiên cứu

1 Gây đột biến ngẫu nhiên chủng nấm sợi Aspergillus niger A45.1 đồng thời bằng

NTG và tia UV Lựa chọn chủng có khả năng sinh α-amylase, glucoamylase và cellulase với hoạt tính cao nhất

2 Tối ưu điều kiện lên men xốp của chủng đột biến chọn lọc: Các thông số tối ưu: Cơ chất (cám mì, cám gạo, vỏ trấu, mùn cưa) Độ ẩm cơ chất (20, 30, 40, 50, 60 và

men (3,0; 3,5; 4; 4,5; 5; 5,5; 6; 6,0; 6,5 và 7) Thời gian lên men (từ 2 đến 8 ngày), tuổi giống (1 đến 4 ngày) Nguồn cacbon (glucose, maltose, tinh bột gạo, sucrose), nguồn nitơ

3 Đường hóa và lên men đồng thời bã sắn bằng chế phẩm đa enzyme (α-amylase, glucoamylase và cellulase) và probitic: Bã sắn tươi hòa vào nước với tỷ lệ 30%, bổ sung

chế phẩm enzyme thô với tỷ lệ 8%, 0,5% chế phẩm probiotic (S cerevisiae, Lactobacillus

lượng từ 0 đến 1,5% Thời gian lên men thích hợp được chọn lựa Một số thành phần hóa

học và sinh học của bã sắn sau lên men được xác định

4 Các thí nghiệm được bố trí để đánh giá ảnh hưởng của sử dụng BSLM vào khẩu phần ăn cho 144 lợn thịt F1 (LxY) giai đoạn từ 20kg đến xuất chuồng Các chỉ tiêu về sinh trưởng, tiêu tốn thức ăn, năng suất thân thịt và thành phần hóa học của thịt lợn được

nghiên cứu

Kết quả chính và kết luận

- Chủng Aspergillus niger GA15 có hoạt tính glucoamylase, α-amylase và cellulase

cao nhất được tạo ra bằng gây đột biến đồng thời bởi tia UV và NTG từ chủng hoang dại

Aspergillus niger A45.1 So với hoạt tính enzyme của chủng hoang dại, hoạt tính của

α-amylase cao gấp 1,97 lần, glucoα-amylase cao gấp 2,2 lần, cellulase cao gấp 1,9 lần

- Điều kiện lên men xốp thích hợp đối với chủng Aspergillus niger GA15 là: cơ chất

tuổi, glucose 1%, ure 1%, với hoạt tính α-amylase, glucoamylase và cellulase đạt lần lượt

là 76,75 ; 50 và 40,11 (U/g), hoạt tính này cao gấp 2; 1,9 và 3,3 lần so với lên men xốp ở điều kiện chưa được tối ưu

- Giá trị dinh dưỡng của bã sắn sau khi đường hóa và lên men đồng thời bằng lên men lỏng với tỷ lệ 30% cơ chất, 8% đa enzyme thô, 0,5% chế phẩm probiotic, 1%

thực tăng 5,5 lần so với bã sắn tươi không lên men, đồng thời HCN giảm còn 1,4 g/kg, hàm lượng axit hữu cơ tăng 5,9 lần, pH 3,7 Bã sắn có màu vàng tương đỗ, mùi thơm, độ chua vừa phải, không có độc tố aflatoxin B1 Vì vậy, bã sắn sau đường hóa và lên men có thể được sử dụng làm thức ăn cho gia súc

- Sử dụng BSLM trong khẩu phần ăn đã cải thiện tốc độ sinh trưởng, hiệu quả sử dụng thức ăn của lợn Ở mức sử dụng 20% BSLM cho hiệu quả tốt nhất, ADG (g/con/ngày) tăng lên 8,97% và 34,46% so với lô đối chứng ở giai đoạn 1 và 2 FCR ở 2 giai đoạn tương ứng là 2,1 và 2,45 Khối lượng móc hàm và khối lượng thịt xẻ tăng lên 11,15% và 11,19 %

so với lô ĐC Việc sử dụng BSLM trong khẩu phần ăn không ảnh hưởng đến năng suất thân thịt, chất lượng thịt và thành phần hóa học của thịt lợn

Đề nghị

Thử nghiệm lên men một số nguồn phụ phẩm nông nghiệp khác bằng chế phẩm

đa enzyme của đề tài để làm thức ăn cho các đối tượng vật nuôi khác nhau.Tiến hành trên quy mô rộng hơn và xác định hiệu quả kinh tế trong việc sử dụng phụ phẩm làm thức ăn chăn nuôi

THESIS ABSTRACT PhD candidate: Duong Thu Huong

Title: Research on strain development of filamentous fungi and optimization of fermentation

conditions to produce multi- enzymes (α-amylase, glucoamylase, cellulase) for processing of animal feed

Major: Animal Science Code: 9 62 01 05

Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA)

Research Objectives

General objective: Improving the efficiency of using crop by-products and

processing agricultural products by applying probiotics

Specific objective:

Selecting a mutant of Aspergillus niger A45.1 which can produce highly active multi-

enzymes (α-amylase, glucoamylase and cellulase)

Investigating the optimal soild state fermentation conditions for the selected mutant strain to produce multi enzymes

Evaluating the effect of a multi enzymes preperation consisting α-amylase, glucoamylase and cellulase to degrade byproducts of cassava starch processing as pig feeding

Materials and methods

1 Inducing random mutagenesis of Aspergillus niger A45.1 by simultaneous treatment of NTG and UV rays Isolating a mutant of Aspergillus niger A45.1 which can

produce multi enzymes (α-amylase, glucoamylase and cellulase) having high activity

2 Optimizing solid state fermentation conditions for the selected mutant strain: Optimal parameters: Substrate (wheat bran, rice bran, rice husk, sawdust) Substrate humidity

Initial pH of the fermentation substrate (3,0; 3,5; 4; 4,5; 5; 5,5; 6; 6,0; 6,5 and 7) Culture time (from 2 to 8 days), age of the wild strain (1÷4 days) Carbon source (glucose, maltose, rice

3 Simultaneous saccharification and fermentation of cassava by products by a multi enzymes preparation and microorganisms: Fresh cassava by products were mixed with water

at the rate of 30% (w/v), then the crude multi enzymes preparation was added at an

appropriate concentration 0,5% probiotic (S cerevisiae, Lactobacillus sp and Bacillus sp

added at a specific concentration and the suitable fermentation time was selected The chemical compositions of cassava by-products after fermentation were analysed

4 Experimental design: Effect fermented cassava starch processing by-products

(BSLM) supplementation to the diet of 144 crossbred pigs F1 (LxY) from 20 kg to slaughter Recored growth parameters, feed consumption, carcass yield, quality and chemical compostions of the carcass

Main findings and conclusions

- A mutant of Aspergillus niger A45.1 was obtained by simultaneous treatment of NTG and UV rays, named Aspergillus niger GA15, with the enhanced ability to produce

multi enzymes (α-amylase, glucoamylase and cellulase) having the highest activity The activity of the α-amylase, glucoamylase and cellulase were 1,97; 2,2 and 1,9 times, respectively higher than that of the wild strain

- Suitable soild state fermentation conditions for a mutant Aspergillus niger GA15

5 days, the age of the wild strain: 2 days old, glucose 1%, ure 1% At these fermentation conditions, the activity of the α-glucoamylase, α-amylase and cellulase were 76,75; 50 and 40,11 (U/g), respectively These values were 1,97; 1,85 and 3,3 folds higher compared to those recorded under the fermentation conditions are not optimal

- Simultaneous saccharification and fermentation cassava by-products by liquid fermentation for 48h (30% cassava by-products, 8% a multi enzymes preparation, 0,5%

and real protein increased by 7,3 and 5,5 times, respectively compared to those of the unfermented cassava by-products Similarly, organic acids concentration increased 5,9 times However, the HCN concentration reduced to 1,4 g/kg The sensory quality of the fermented cassava by-products was yellow-brown, fragrant, sour, without aflatoxin B1 Therefore, the fermented cassava by-products could be use as animal feed

- Using of BSLM to the diet enhanced the growth performance and FCR of pigs Supplemented at 20% BSLM to the diet resulted in the highest improvement At the stage 1 and 2, the ADG (g/head/day) increased by 8,97% and 34,46%, respectively compared to the control group At the 2 feeding stages, the FCR of the BSLM group was 2,1 and 2,45 respectively Slaughter weight and carcass weight of the BSLM group increased by 11,15% and 11,19% compared to the control Supplementation of BSLM to the diet did not alter the quality and chemical composition of carcass

Recommendation: Further work is warranted to explore the potential impacts of the

multi enzymes preparation to ferment others agricultural by-products, which can be used as animal feed Large-scale experiments should be conducted to determine the economic efficiency of using agricultural by-products as animal feed

PHẦN 1 MỞ ĐẦU

1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Ở nước ta, chăn nuôi lợn đóng vai trò vô cùng quan trọng trong hệ thống sản xuất nông nghiệp cũng như đối với nền kinh tế Trong nhiều năm trở lại đây, ngành chăn nuôi nước ta đã và đang đẩy mạnh phát triển chăn nuôi lợn, nhưng thực trạng ngành chăn nuôi lợn ở Việt Nam vẫn còn gặp rất nhiều khó khăn, đặc biệt là giá thức ăn cao và thường xuyên biến động do phải phụ thuộc nguồn nguyên liệu nhập khẩu, vì vậy đã ảnh hưởng bất lợi cho phát triển chăn nuôi lợn Trong khi đó, Việt Nam là một nước nông nghiệp với nguồn phụ phẩm dồi dào từ trồng trọt, chế biến nông sản như rơm rạ, bã sắn, bã dong riềng, bã mía…Hiện nay Việt Nam có khoảng 100 nhà máy chế biến tinh bột sắn có quy mô lớn với sản lượng

từ 1,8 tấn đến 2 triệu tấn tinh bột/ngày, lượng chất thải rắn thải ra từ các nhà máy này khoảng 0,6 triệu tấn/ngày (Nguyễn Thị Hằng Nga & cs., 2016) Lượng bã sắn này phần lớn được thải ra ngoài môi trường, gây lãng phí và ô nhiễm nghiêm trọng Một số ít được phơi khô hoặc ủ chua làm thức ăn cho gia súc, nhưng hiệu sử dụng thức ăn chưa cao, do trong bã sắn có hàm lượng protein thấp, còn chứa nhiều chất

xơ và chất kháng dinh dưỡng như hydrogen cyanide (HCN) Vì vậy nếu xử lý được những hạn chế đó, chế biến đúng cách thì bã sắn có thể trở thành nguồn thức

ăn chăn nuôi có giá trị, góp phần quan trọng vào việc giảm phụ thuộc nguyên liệu nhập khẩu và giảm giá thành sản xuất từ đó nâng cao khả năng cạnh tranh của ngành Chăn nuôi Việt Nam

Lên men được xác định là một trong số ít các phương pháp hiệu quả trong việc chế biến, bảo quản phụ phẩm thành thức ăn chăn nuôi giàu dinh dưỡng (Ubalua, 2007; Aro, 2008) Tuy nhiên, thực tế nghiên cứu đã chỉ ra phần lớn các nguồn phụ phẩm đều chứa hàm lượng xơ cao, hầu hết các vi sinh vật không thể sử dụng trực tiếp Vì vậy, để nâng cao hiệu quả của quá trình lên men cần bổ sung thêm các enzyme phân giải tinh bột và xơ như amylase, glucoamylase, cellulase, hoặc các chủng vi sinh vật có khả năng sản sinh các enzyme này để dịch hóa, tạo

cơ chất cho sự sinh trưởng, phát triển của các vi sinh vật và loại bỏ các yếu tố kháng dinh dưỡng, phân hủy các thành phần thức ăn để cải thiện giá trị dinh dưỡng của nguyên liệu làm thức ăn chăn nuôi

Hiện nay, enzyme amylase và cellulase thương mại chủ yếu được thu nhận

từ nguồn nấm mốc với các loài thuộc chi Trichoderma, Humicola, Penicillium,

Aspergillus (Sukumaran & cs., 2005; Ariffin & cs., 2006; Ghani & cs., 2013) Do

nhu cầu về sử dụng enzyme trong chăn nuôi cũng như các lĩnh vực công, nông nghiệp và thực phẩm ngày càng tăng nên việc nghiên cứu nhằm tăng cường, cải thiện chất lượng cũng như nâng cao sản lượng thông qua việc cải tiến chủng, tối

ưu thành phần môi trường, điều kiện lên men hiệu quả và giảm chi phí sản xuất là rất cần thiết Xuất phát từ những lý do trên, nghiên cứu này tiến hành phát triển chủng nấm sợi, tối ưu thành phần môi trường và điều kiện lên men để nâng cao hiệu quả sinh tổng hợp (α-amylase, glucoamylase, cellulase) ứng dụng trong chế biến thức ăn chăn nuôi

1.2 MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI

1.2.1 Mục tiêu chung

Nâng cao hiệu quả sử dụng phụ phẩm trồng trọt và chế biến nông sản bằng ứng dụng chế phẩm sinh học

1.2.2 Mục tiêu cụ thể

Chọn lọc được 1 chủng đột biến từ chủng nấm sợi Aspergillus niger A45.1 có

khả năng sinh đa enzyme (α-amylase, glucoamylase và cellulase) với hoạt tính cao

Tối ưu được điều kiện lên men xốp cho sản xuất đa enzyme (α-amylase, glucoamylase và cellulase) của chủng đột biến chọn lọc

Đánh giá được hiệu quả của việc sử dụng thức ăn lên men tạo ra từ bã thải chế biến tinh bột được xử lý bằng đa enzyme (α-amylase, glucoamylase và cellulase) ở lợn thịt

1.3 PHẠM VI NGHIÊN CỨU

1.3.1 Đối tượng nghiên cứu

Chủng nấm sợi Aspergillus niger A45.1 được sàng lọc từ bộ giống của

phòng Các chất chức năng Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Bã sắn tươi: được thu gom trực tiếp từ các cơ sở chế biến tinh bột thuộc xã Cát Quế, huyện Hoài Đức, Hà Nội

Lợn lai F1 (Landrace x Yorkshire): 72 lợn cái và 72 lợn đực thiến giai đoạn

20 kg đến xuất chuồng

1.3.2 Địa điểm nghiên cứu

Phòng Các chất chức năng sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Phòng Thí nghiệm trung tâm, Khoa Chăn nuôi, Học Viện Nông nghiệp Việt Nam

Phòng thí nghiệm bộ môn Di truyền giống, khoa Chăn nuôi, Học Viện Nông nghiệp Việt Nam

Trung tâm Giống lợn chất lượng cao, Học viện Nông nghiệp Việt Nam

1.3.3 Thời gian nghiên cứu

Thời gian nghiên cứu: tháng 6 năm 2015 - tháng 6 năm 2019

1.4 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI

Đề tài đã cải tiến chủng dại Aspergillus niger A45.1 bằng đột biến ngẫu nhiên và chọn lọc được 1 chủng đột biến Aspergillus niger GA15 có khả năng sinh

đa enzyme (α-amylase, glucoamylase và cellulase) với hoạt tính cao

Chế biến được bã thải tinh bột sắn thành thức ăn giàu dinh dưỡng cho chăn nuôi lợn thịt bằng đường hóa và lên men đồng thời sử dụng chế phẩm chứa đa enzyme từ chủng đột biến và lợi khuẩn

1.5 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI

1.5.1 Ý nghĩa khoa học

Đề tài đã tạo ra được một chủng nấm sợi đột biến có khả năng sinh đa enzyme (α-amylase, glucoamylase và cellulase) với hoạt tính cao và tối ưu môi trường lên men xốp cho sản xuất đa enzyme

Đề tài đã chế biến được bã thải tinh bột sắn thành thức ăn giàu dinh dưỡng cho gia súc bằng đường hóa và lên men đồng thời sử dụng chế phẩm đa enzyme

và vi sinh vật probiotic

Kết quả nghiên cứu góp phần cung cấp thêm tư liệu phục vụ cho giảng dạy

và nghiên cứu về phát triển chủng bằng kỹ thuật đột biến, chế biến thức ăn chăn nuôi giàu dinh dưỡng từ bã thải tinh bột bằng đa enzyme và lợi khuẩn

1.5.2 Ý nghĩa thực tiễn

Có thể cung cấp chủng giống đột biến cho sản xuất enzyme công nghiệp, giảm thiểu chi phí, đáp ứng nhu cầu sử dụng enzyme ngày càng tăng trong chăn nuôi cũng như các lĩnh vực công nghiệp

Tận dụng được nguồn phụ phẩm rẻ tiền từ các cơ sở sản xuất tinh bột sắn thành nguồn nguyên liệu giàu dinh dưỡng làm thức ăn chăn nuôi, góp phần giảm chi phí về thức ăn trong chăn nuôi và ô nhiễm môi trường

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 TỔNG QUÁT VỀ ENZYME AMYLASE VÀ CELLULASE

Enzyme là chất xúc tác sinh học có bản chất là protein, có nguồn gốc từ sinh vật Nó không chỉ tham gia xúc tác nhanh các phản ứng hóa học bên trong cơ thể mà còn có thể xúc tác cho các phản ứng bên ngoài tế bào

Enzyme đã được nghiên cứu và ứng dụng trong nhiều lĩnh vực của các ngành công nghiệp, xử lý môi trường, công nghệ thực phẩm Ngày nay với xu hướng phát triển của công nghệ sinh học đã tạo ra nhiều ứng dụng mới của enzyme (Sharada & cs., 2013)

2.1.1 Enzyme amylase

Amylase là tên gọi của một nhóm enzym thủy phân, xúc tác phân giải các liên kết glucoside của polysaccharide với sự tham gia của nước Cơ chất tác dụng của amylase là tinh bột và glycogen Sản phẩm tạo thành của quá trình thủy phân

là glucose, maltose và dextrin là các chất có phân tử lượng thấp

Các loại amylase có nguồn gốc khác nhau thì thường khác nhau về tính chất, cơ chế tác dụng cũng như sản phẩm cuối cùng của sự thủy phân Các amylase chủ yếu thủy phân tinh bột thường gặp là: α-amylase, β-amylase và γ-amylase, trong đó 2 nhóm quan trong nhất là α-amylase và γ-amylase (Singh & cs., 2011)

2.1.1.1 α-Amylase (EC 3.2.1.1)

-amylase là một metaloenzyme Mỗi phân tử -amylase đều có chứa từ 1 đến 30 nguyên tử gam Ca/mol, Ca tham gia vào sự hình thành, ổn định cấu trúc bậc 3 và duy trì hoạt động của enzyme Enzyme -amylase có khả năng phân cắt các liên kết α-1,4 glucoside trong mạch amylose và amylopectin của tinh bột hoặc glycogen một cách ngẫu nhiên không theo trật tự nào cả, nó không tấn công liên kết α-1,6 glucoside của amylopectin, sản phẩm thủy phân cuối cùng của -amylase

là tạo ra maltotriose và maltose từ amylose, hoặc maltose, glucose và dextrin tới hạn phân nhánh từ amylopectin α-amylase có khuynh hướng hoạt động nhanh hơn β-amylase vì nó có thể hoạt động bất cứ nơi nào trên cơ chất Khả năng dextrin hóa cao của α-amylase là tính chất đặc trưng của nó Vì vậy, người ta thường gọi loại amylase này là amylase dextrin hóa hay amylase dịch hóa Trong cơ thể người,

cả amylases nước bọt và tuyến tụy đều là α-amylase -amylase cũng tìm thấy

trong thực vật, nấm (Ascomycetes và Basidiomycetes) và vi khuẩn (Bacillus)

(Singh & cs., 2011)

2.1.1.2 β-Amylase (EC 3.2.1.2)

β-amylase là một dạng khác của amylase được tổng hợp bởi vi khuẩn, nấm và thực vật β-amylase xúc tác quá trình thủy phân liên kết β-1,4 glycosidic thứ hai, làm việc từ đầu không khử, tách hai đơn vị glucose (maltose) một lần Trong quá trình chín quả, β-amylase phá vỡ tinh bột thành maltose, dẫn đến hương vị ngọt của trái chín Cả -amylase và β-amylase đều có trong hạt; β-amylase có mặt ở dạng không hoạt động trước khi nảy mầm, trong khi α-amylase xuất hiện khi quá trình nảy mầm bắt đầu Các mô động vật không chứa β-amylase (Singh & cs., 2011)

2.1.1.3 γ-Amylase hay glucoamylase (EC 3.2.1.3)

Đây là enzyme đường hóa quan trọng nhất trong hệ amylase γ-amylase cắt các liên kết α-1,4 và α-1,6 glucoside bắt đầu từ đầu không khử trên mạch amilose

và amilopectin tạo sản phẩm cuối cùng là glucose γ-amylase có khả năng thủy

phân hoàn toàn tinh bột, glucogen, dextrin và maltose thành glucose Không giống như các dạng amylase khác, γ-amylase có hiệu quả nhất trong môi trường axit và

có độ pH tối ưu là 3 Trong số các vi sinh vật có khả năng sinh γ-amylase đã được

biết cho đến nay, chi Aspergillus là chi được biết đến nhiều nhất bởi khả năng sinh glucoamylase rất cao, đặc biệt là loài Aspergillus niger (Singh & cs., 2011)

2.1.2 Enzyme cellulase

Cellulase thủy phân cellulose, cắt liên kết 1,4 - β - glycosidic trong cellulose

và các dẫn xuất oligosaccharide liên quan Cellulase là một phức hệ enzyme bao gồm 3 loại chính là: C1 [(EC 3.2.1.9), (Exo- β-1-4, glucanase)], Cx [(EC 3.2.1.4), (Endo-β-1-4, glucanase, carboxymethyl cellulase, hay CMCase)] và Cb [(EC 3.2.1.21), (β- glucosidase)], chúng tham gia vào những phản ứng kế tiếp nhau để thủy phân cellulose tạo thành oligosaccharides và glucose (Hameed & cs., 2005; Sharada & cs., 2013)

Enzyme (exo- 1,4-β-D- glucanase) (EC 3.2.1.9): Có tác dụng cắt đứt liên kết

hydro ở đầu không khử của chuỗi cellulose và liên tục loại bỏ các đơn vị glucose đơn, biến cellulose tự nhiên thành cellulose phản ứng (cellulose vô định hình)

Enzyme endo-1,4-β-D-glucanase ((EC3.2.1.4): Tấn công ngẫu nhiên vào

các liên kết β-1-4 ở bên trong, thủy phân cellulose phản ứng thành cellobiose Enzym này được chia thành hai loại là: Endocellulase hay Endoglucanase (EG)

có tác dụng thủy phân liên kết β-1,4-glucoside tại các điểm bất kỳ trên mạch phân

tử cellulose Exocellulase hay exoglucanase (CBH) có khả năng phân giải chuỗi

trên thành disaccaride gọi là cellobiose từ đầu không khử Bao gồm hai loại CBHI

và CBHII

β-glucosidase (EC 3.2.1.21): Thủy phân cellobiose thành glucose Là nhóm

enzym khá phức tạp, có khả năng hoạt động ở pH rất rộng từ 4,4 đến 8,4 Trọng lượng phân tử 50- 95 KD, có thể hoạt động ở nhiệt độ cao

2.1.3 Nguồn thu nhận enzyme

Amylase, celullase cũng như các enzyme khác có thể được thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau như dịch tiêu hóa động vật, hạt nẩy mầm và các vi sinh vật Việc sản xuất, thu nhận enzyme từ động vật và thực vật rất phức tạp do nguồn thu nhận nguyên liệu khó khăn, hiệu suất thấp, giá thành cao Ngày nay đa số các enzyme công nghiệp đều được thu nhận từ vi sinh vật do các ưu điểm của nó mang lại như sau: Vi sinh vật có chu kỳ sinh trưởng, phát triển ngắn, quá trình tổng hợp enzyme diễn ra rất nhanh, do đó rút ngắn thời gian thu nhận enzyme và làm giảm giá thành sản xuất Hoạt tính enzyme từ vi sinh vật rất cao, chỉ cần sử dụng một lượng nhỏ enzyme có thể chuyển hóa một lượng cơ chất lớn Hệ enzyme của vi sinh vật rất phong phú, có khả năng tổng hợp nhiều loại enzyme khác nhau, trong

đó một số enzyme động vật và thực vật không tổng hợp được Vi sinh vật không đòi hỏi nghiêm ngặt về mặt dinh dưỡng, có thể sinh trưởng trên nhiều nguồn cơ chất đơn giản, rẻ tiền do đó có thể tận dùng các nguồn phế thải nông nghiệp làm nguồn cơ chất để sản xuất enzyme làm giảm giá thành sản xuất Vi sinh vật chịu ảnh hưởng lớn của thành phần môi trường dinh dưỡng và các tác nhân lý hóa của môi trường Do đó, người ta có thể thay đổi thành phần dinh dưỡng của môi trường nuôi cấy hoặc các tác nhân lý hóa của môi trường, nhằm tạo ra các chủng vi sinh vật sản xuất ra enzyme với hàm lượng lớn và có hoạt tính xúc tác cao Có thể cải tiến và phát triển chủng để tạo ra các chủng đột biến sản xuất enzyme cao sản bằng nhiều phương pháp Dễ dàng sản xuất hàng loạt trên quy mô công nghiệp (Singh

& cs., 2011; Ciloci & cs., 2012)

Các loại vi sinh vật được sử dụng rộng rãi và phổ biến cho việc thu nhận và sản xuất các enzyme công nghiệp bao gồm: vi khuẩn, nấm sợi và nấm men Một

số enzyme công nghiệp phổ biến được sản xuất bởi các vi sinh vật như bảng 2.1

Bảng 2.1 Một số enzyme công nghiệp và nguồn vi sinh vật sản xuất enzyme

Vi khuẩn

Nấm sợi

Nguồn: Vittaladevaram & cs (2017)

2.1.4 Tổng quan về nấm sợi Aspergillus niger

2.1.4.1 Đặc điểm sinh thái và phân loại của Asperillus niger

Chi Aspergillus được chia thành các nhóm theo màu sắc của bào tử Aspergilli có bào tử từ nâu đến đen được xếp vào nhóm Aspergillus niger (A

niger) Mặc dù các loài trong nhóm này khác nhau đáng kể, chỉ có một vài khác

biệt rõ ràng để phân loại các loài riêng biệt (Schuster & cs., 2002) Nhóm

Aspergillus niger (Aspergilli đen) bao gồm 18 loài, trong đó A niger, A tubingensis, A brasiliensis, A acidus, A carbonarius, và A ibericus là phổ biến

nhất, các loài còn lại rất hiếm và được tìm thấy chủ yếu ở các vùng nhiệt đới

(Nielsen & cs., 2009) Nhiều loài của Aspergilli đã được phân lập từ khắp nơi trên thế giới A niger là một loại nấm sợi sinh trưởng hiếu khí trên cơ chất hữu

cơ Trong tự nhiên, nó được tìm thấy trong đất, chất độn chuồng và thực vật đang

phân hủy A niger có thể phát triển trong khoảng nhiệt độ rộng từ 6-47°C, nhiệt

độ tối ưu tương đối cao ở 35-37°C Hoạt độ nước giới hạn cho sự phát triển là

0,88, tương đối cao so với các loài Aspergillus khác A niger có thể phát triển

trong phạm vi pH cực kỳ rộng: 1,4-9,8 Với những đặc điểm đó và khả năng sinh

và phát tán bào tử trong không khí, làm cho chúng có khả năng xuất hiện nhiều

và phổ biến với tần suất cao ở khắp mọi nơi, đặc biệt là ở những ấm ấp và ẩm ướt (Schuster & cs., 2002)

2.1.4.2 Ứng dụng của Asperillus niger

A.niger có khả năng trao đổi chất mạnh, vì vậy nó được coi là một trong

những sinh vật quan trọng được sử dụng trong công nghệ lên men Từ năm 1923,

A.niger đã được khai thác thương mại cho sản xuất axit citric, hầu hết sử dụng

trong thực phẩm, mỹ phẩm và dược phẩm Ngoài việc sản sinh ra axit citric, A.niger

còn là nguồn phong phú các enzyme Pectinase, protease và amyloglucosidase là những enzyme đầu tiên được khai thác bằng nuôi cấy bề mặt Để sản xuất nhiều sản phẩm, tinh bột - một trong những nguồn cacbon dồi dào nhất phải được thủy phân thành glucose, maltose và các dextrin phân tử lượng thấp Amyglucosidase còn được gọi là glucosamylase có khả năng xúc tác, cắt các đơn vị glucose từ đầu không khử của tinh bột Các ngành công nghiệp sản xuất siro và rượu sử dụng

chính các amyglucosidase do A.niger sản xuất Pectin là một heteropolysaccharide,

là thành phần chính trong rau củ và trái cây Một số enzyme được sản xuất bởi

A.niger như pectin esterases, endo và exo-polygalacturonidases và pectin có khả

năng phân hủy pectin; chúng được sử dụng trong sản xuất rượu vang, nước trái cây

để làm giảm độ nhớt của trái cây trước khi chế biến và cải thiện độ trong của sản phẩm (Schuster & cs., 2002)

Các chuyên gia của FAO/WHO đã công nhận các chế phẩm enzyme từ

A.niger gồm chính các sinh vật (FAO/WHO 1972, 1978, 1981, 1987, 1990) FDA

Hoa Kỳ đã chấp nhận nhiều enzyme sử dụng cho thực phẩm: vào đầu những năm

1960 FDA đã thừa nhận rằng α-amylase, cellulase, amyloglucosidase, catalase,

glucose oxidase, lipase và pectinase từ A niger có thể được coi là an toàn (GRAS

- generally regarded as safe), với điều kiện các chủng không gây bệnh, không độc,

hoạt động tốt trong điều kiện sản xuất Tiếp sau đó, một loạt các enzyme từ A.niger

được công nhận là an toàn và sử dụng cho các lĩnh vực thực phẩm, công nghiệp,

dược phẩm như: Carbohydrase, cellulase từ A niger (Schuster & cs., 2002)

Với sự phát triển của công nghệ sinh học, việc sản xuất enzyme của A.niger

được cải thiện rõ rệt Sản xuất phytase tăng 1000 lần nhờ công nghệ tái tổ hợp và

nhiều sản phẩm enzyme có sẵn trên thị trường từ các chủng A niger tái tổ hợp như

α-amylase, arabinofuranosidase, catalase, chymosin, glucoamylase, glucose oxidase, pectin esterase, phospholipase A2, phytase và xylanase (Pariza & Johnson, 2001)

Ngày nay trong sản xuất amylase và cellulase thương mại, người ta chủ yếu

thu nhận nguồn enzyme này nấm sợi với các loài thuộc chi Trichoderma, Humicola,

Penicillium, Aspergillus (Sukumaran & cs., 2005; Ariffin & cs., 2006; Ghani & cs.,

2013) Nhiều loài nấm sợi có khả năng sản sinh các loại enzyme như α-amylase, glucoamylase và cellulase ở các điều kiện và công nghệ lên men khác nhau Các loài

thường được sử dụng là Aspergillus niger, Rhizopus oryzae, Aspergillus awamori và

Aspergillus oryzae (Ciloci & cs., 2012; Imran & cs., 2012; Ho & Ho, 2015)

Công nghệ enzyme nhằm mục đích sản xuất các enzyme bởi các chủng vi khuẩn và nấm khác nhau bằng phương pháp lên men lỏng và rắn Trong những năm gần đây, việc sản xuất enzyme cellulase, α-amylase và glucoamylase bằng lên men rắn đang được quan tâm vì chi phí thấp, hiệu suất cao và có triển vọng trong việc sử dụng nhiều loại phụ phẩm công - nông nghiệp làm cơ chất (Park & cs., 2002) Các phụ phẩm nông nghiệp khác nhau như cám lúa mì, cám gạo, vỏ trấu, bã mía, cám yến mạch, bột hạt bông có thể dùng được cho việc chuyển hóa chúng thành các sản phẩm

có giá trị kinh tế bởi đa enzyme từ nấm sợi (Parbat & Singhal, 2011)

Phức hợp cellulase của Aspergillus niger đã được nghiên cứu đầy đủ nhất

Nó có thể chuyển đổi cellulose tự nhiên cũng như cellulose tổng hợp thành glucose (Devi & Kumar, 2017) Devi & Kumar (2017) đã tối ưu điều kiện môi trường, thu

nhận và tinh sạch được cellulase của A.niger bằng lên men trên mùn cưa và bã thải giấy và cho rằng các chủng A.niger có khả năng phân hủy các bã thải lignocellulosic sinh học A.niger tạo ra cellulase hoạt tính cao khi nuôi trong môi

trường lỏng bằng cả phương pháp lên men bề mặt và lên men chìm, gần đây là bằng lên men bề mặt rắn (Ikram-Ul-Haq & cs., 2005)

Nhiều nghiên cứu trong nước cũng cho biết các chủng nấm sợi Aspergillus

có khả năng sinh ra nhiều loại enzyme và được ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực công nghiệp khác nhau Nhóm enzym amylase (α-amylase, glucoamylase)

được tạo ra bởi Aspergillus oryzae và Aspergillus niger được ứng dụng trong làm

bánh mì, ủ bia rượu và bánh kẹo Enzym cellulase, β-glucanase được tiết ra

bởi Aspergillus niger ứng dụng để thúc đẩy sự tiêu hoá của thực phẩm có sợi, sự tinh lọc nước trái cây và bia Glucose oxidase được tạo ra bởi Aspergillus niger đã

có nhiều ứng dụng trong thực phẩm và y học (Hoàng Kim Anh, 2012) Dương Thị

Hương & Nguyễn Hiền Trang (2018) đã tạo ra chế phẩm hỗn hợp Aspergillus

oryzae KZ3 và Aspergillus awamori HK1 có khả năng sinh protease cao trên môi

trường bán rắn Đỗ Thị Hiền & Huỳnh Phan Phương Trang (2019) đã tạo ra chế

phẩm pectinase dạng bột từ Aspergillus niger bằng phương pháp sấy phun Đặng

Minh Nhật & Bùi Viết Cường (2012) nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme

glucose oxidase từ Aspergillus niger ở dạng đông khô có hoạt độ riêng 7000 UI/g

2.2 CẢI TIẾN CHỦNG VI SINH VẬT VÀ LÊN MEN SẢN XUẤT ENZYME 2.2.1 Sự cần thiết phải cải tiến các chủng vi sinh vật

Trong những thập kỷ gần đây với sự tăng lên theo cấp số nhân về ứng dụng của enzyme trong nhiều lĩnh vực khác nhau đã đặt ra yêu cầu cấp thiết là phải mở rộng và tăng cường cả việc cải tiến chất lượng và nâng cao về số lượng thông qua việc cải tiến chủng, tối ưu môi trường, và tìm kiếm quá trình lên men hiệu quả để tăng sản lượng enzyme

Tăng sản lượng enzyme có thể đạt được bằng tối ưu môi trường nuôi cấy

và điều kiện sinh trưởng nhưng cách tiếp cận này bị giới hạn trong khả năng tổng hợp sản phẩm của cơ thể Việc cải tiến chủng được thực hiện để giảm giá thành bằng cách tăng năng suất hay giảm chi phí sản xuất vì vậy nó có vai trò quan trọng trong công nghiệp lên men Cải thiện chủng là quá trình cải tiến và thao tác trên các chủng vi sinh vật để tăng cường khả năng trao đổi chất cho các ứng dụng của công nghệ sinh học (Gonzalez & cs., 2003) Do hệ thống kiểm soát vốn có của mình, các vi sinh vật thường sản sinh ra các chất trao đổi thương mại ở nồng độ rất thấp chỉ đủ có lợi cho chúng, do đó việc tăng cường sản xuất các chất trao đổi hiếm khi xảy ra và mặc dù năng suất có thể tăng lên bởi việc tối ưu hóa điều kiện môi trường, tuy nhiên năng suất cuối cùng vẫn được kiểm soát bởi bộ gen (genome) của sinh vật (Pathak & cs., 2015) Việc cải tiến chủng chủ yếu tập trung vào sự gia tăng hiệu suất của quá trình lên men, giảm chi phí và tăng các lợi ích kinh tế và cũng có thể có thêm một số đặc tính mong muốn khác (Prabakaran & cs., 2009; Singh & cs., 2011)

Nghiên cứu về biến đổi gen trong những năm qua đã đóng góp lớn để hiểu

cơ chế ổn định và hoạt động cho cải tiến của enzyme công nghiệp Hầu hết các chủng dại mà có tiềm năng sử dụng trong quá trình lên men công nghiệp bắt buộc phải cải tiến để việc lên men đạt hiệu quả kinh tế cao (Mishra & cs., 2014)

2.2.2 Phương pháp cải tiến chủng vi sinh vật để tăng sản xuất enzyme

Việc tăng cường sản xuất các sản phẩm của vi sinh vật có thể đạt được thông qua gây đột biến, chọn lọc/sàng lọc và ứng dụng của kỹ thuật tái tổ hợp ADN Cải tiến các chủng vi sinh vật quan trọng cho công nghiệp được thực hiện bằng nhiều phương pháp khác nhau như đột biến, dung hợp tế bào trần, công nghệ tái tổ hợp

ADN và tạo dòng gene Gây đột biến ngẫu nhiên và dung hợp tế bào trần là đơn giản hơn và được sử dụng phổ biến như là công cụ của kỹ thuật protein để đạt được các chủng với hiệu suất sinh tổng hợp enzyme cao hoặc các đặc tính mong muốn (Singh & cs., 2011; Pathak & cs., 2015)

Đột biến là một công cụ thường được sử dụng để cải tiến chủng Đây là phương pháp có hiệu quả trong cải tiến các vi sinh vật công nghiệp và phải được tiến hành lặp lại bởi các tác nhân đột biến, lựa chọn và sàng lọc những cá thể sống sót thích hợp Đột biến đã được nhiều nhà khoa học sử dụng như một công cụ của

kỹ thuật protein để đạt được những chủng có hiệu suất enzyme cao hoặc những đặc tính mong muốn Sàng lọc đột biến hoặc các chủng sản xuất enzyme cao sản

là rất quan trọng trong việc cải thiện hiệu suất và tính kinh tế trong quá trình sản xuất công nghiệp (Zhao & cs., 2014) Đột biến xảy ra có thể là tự phát (đột biến tự nhiên) hoặc sau khi gây nhiễm (đột biến nhân tạo, đột biến cảm ứng) với các nhân

tố đột biến

a Đột biến tự nhiên

Tỷ lệ của đột biến tự nhiên thường thấp nhưng có thể tăng lên do sử dụng các tác nhân đột biến Tỷ lệ đột biến tự nhiên phụ thuộc vào điều kiện sinh trưởng của sinh vật và tần số đột biến (tỷ lệ đột biến trong quần thể) có thể tăng đáng kể bằng cách sử dụng các tác nhân đột biến

b Đột biến nhân tạo

Các tác nhân làm tăng tần số đột biến cao hơn mức tự nhiên được gọi là các tác nhân gây đột biến, gồm các tác nhân vật lý và hóa học Các đột biến loại này được gọi là đột biến nhân tạo hay đột biến cảm ứng Đối với các vi sinh vật, các tác nhân gây đột biến chủ yếu là tia tử ngoại và một số hóa chất

Các tác nhân vật lí như phóng xạ, tia X, tia tử ngoại Nhiều hóa chất là tác nhân gây đột biến như các đồng đẳng của các bazơ nitric, HNO2 (nitro axit), các chất alkyl hóa mạch

Nhân tố gây đột biến vật lý

Nhân tố gây đột biến vật lý bao gồm tia UV, tia gamma, tia X Trong số đó tia UV được sử dụng rộng rãi nhất trong công nghiệp vì nó rất hiệu quả và không đòi hỏi máy móc hay các thiết bị phức tạp (Pathak & cs., 2015)

Bảng 2.2 Các tác nhân gây đột biến để phát triển chủng

Tác nhân đột biến Đột biến phát sinh Tác động đến ADN Hiệu ứng Bức xạ

dimer và liên kết ngang trong phân tử ADN

Chuyển, mất, lặp, thay thế từ GC -> AT

Trung bình

Yếu tố alky hóa

Nhân tố xen vào

Nguồn: Pathak & cs (2015)

Tia UV có độ dài bước sóng 200-300nm, ADN có khả năng hấp thu cực đại bước sóng 254nm, đây chính là bước sóng làm tăng tần số đột biến ở vi sinh vật Tia

UV kích thích các electron trong phân tử dẫn đến sự hình thành của liên kết giữa các phân tử pyrimidine lân cận, kết quả là tạo ra các các dimer (thymine-thymine, thymine-cytosine và cytosine-cytosine) hoặc giữa các pyrimidine của các chuỗi bổ sung đẫn đến sự hình thành các crosslink Tia UV chủ yếu gây ra các đột biến chuyển, mất, lặp, thay thế các bazơ nitơ (Pathak & cs., 2015) Tia UV được biết đến là thường gây hại, nhưng chúng có khả năng tạo ra các đột biến để cải thiện hiệu suất do thích ứng tốt hơn với môi trường sống (Pathak & cs., 2015) Agrawal & cs (1999) đã chỉ

ra rằng tia UV là một tác nhân đột biến mạnh Hầu hết việc sản xuất các enzyme công nghiệp đều được tăng lên chủ yếu do phương pháp xử lý UV

Nhân tố gây đột biến hóa học

Có nhiều hóa chất có khả năng gây ra biến dị di truyền, đến nay tìm ra những hóa chất cho hiệu quả đột biến cao hơn cả phóng xạ Các tác nhân gây đột biến hóa học có thể kể đến gồm: Các chất ức chế tổng hợp nitơ bazơ trong cấu trúc ADN như coffein, ethyl uretan ; Các chất đồng đẳng với nitơ bazơ như coffein, 5-bromuracil, các chất gần giống với nitơ bazơ, nên nó làm ADN gắn nhầm khi tổng hợp; Các chất alkyl hóa làm đứt mạch ADN như etyl metan sunlfonat (EMS), metyl metaulfonat (MMS), etylen imine (EI), nitrosoguanidin (NG), ; Các chất khác như nhóm oxy hóa, khử Ngược với sai hỏng sao chép, các tác nhân gây đột biến như nitrous axit

và khí ngạt nitơ (nitơ mustard) có thể gây biến đổi trực tiếp trên ADN Các chất chêm vào ADN (proflavine, acridine…)

Đột biến điểm trực tiếp

Gần đây, nhiều nghiên cứu cho thấy tỷ lệ đột biến của các gen đặc thù được tăng lên bởi phương pháp gây đột biến trực tiếp Điều này được thực hiện để thu được tần số tối đa các đột biến mong muốn và đòi hỏi kiến thức rộng về gen điều khiển sản phẩm đích và bản đồ gen của cơ thể sinh vật Gần đây các đột biến invitro được sử dụng bằng tái tổ hợp cùng với kỹ thuật di truyền để làm biến đổi gen được tách ra hay một phần của gen Nó bao gồm thay đổi trình tự bazo của ADN và thay đổi codon trong gene mã hóa cho các axit amin Nó có thể được thực hiện bằng phương pháp kỹ thuật protein Mong muốn cải thiện có thể được tăng khả năng chịu nhiệt, thay đổi dải

cơ chất, giảm ức chế phản hồi tiêu cực, thay đổi dải pH (Pathak & cs., 2015)

2.2.3 Lên men sản xuất enzyme

Trong quá trình sản xuất enzyme, có nhiều phương thức lên men được các nhà sản xuất chấp nhận, trong đó có hai phương pháp chính là lên men chìm

(Submerged fermentation - SmF) và lên men bề mặt rắn (Solid state fermentation

- SSF) Trong những thập kỷ gần đây, các nhà nghiên cứu và sản xuất có xu hướng

sử dụng kỹ thuật lên men bề mặt rắn (SSF) để sản xuất ra nhiều enzyme từ các vi sinh vật (Singh & cs., 2011)

2.2.3.1 Lên men bề mặt rắn/Lên men xốp (Solid state fermentation - SSF)

Lên men bề mặt rắn được định nghĩa là quá trình lên men gồm cơ chất rắn

và được thực hiện trong điều kiện không hoặc gần như không có mặt của nước tự do; tuy nhiên cơ chất phải có đủ độ ẩm để cung cấp cho sự sinh trưởng và quá trình trao đổi chất của vi sinh vật (Singhania & cs., 2009) Tiềm năng của SSF nằm trong việc đưa vi sinh vật nuôi cấy trong môi trường có nồng độ cơ chất cao nhất để lên men, hệ thống SSF giống với môi trường sống tự nhiên của các vi sinh vật do đó đây là lựa chọn thích hợp cho sự sinh trưởng và tạo ra các sản phẩm có giá trị (Singhania & cs., 2009) Quá trình lên men SSF có tiềm năng to lớn trong việc sản xuất enzyme Ngoài các ứng dụng thông thường trong các ngành công nghiệp thực phẩm và lên men, enzyme của vi sinh vật còn có vai trò quan trọng trong chuyển hóa sinh học các dung môi hữu cơ, chủ yếu cho các chất có hoạt tính sinh học (Pandey & cs., 1999)

a Ưu nhược điểm của lên men bề mặt rắn

Lên men bề mặt rắn nhận được nhiều sự quan tâm của của các nhà nghiên cứu cho sản xuất nhiều loại enzyme công nghiệp do những ưu điểm của nó đem lại như sau: Lên men bề mặt rắn dễ thực hiện, quy trình công nghệ thường không phức tạp, yêu cầu đối với các thiết bị lên men đơn giản, không tốn kém, do đó giảm thiểu chi phí trong quá trình sản xuất Môi trường nuôi cấy trong lên men rắn đơn giản Một số cơ chất có thể được sử dụng trực tiếp như là môi trường rắn hoặc được bổ sung thêm một số chất dinh dưỡng Lên men bề mặt rắn cho năng suất cao hơn trong một khoảng thời gian ngắn hơn, lượng enzyme được tạo thành từ lên men bề mặt thường cao hơn rất nhiều so với lên men chìm Đây là đặc điểm ưu việt rất quan trọng trong giải thích tại sao phương pháp nuôi cấy bề mặt hiện nay phát triển mạnh trở lại Sản phẩm thu hồi sau lên men với lượng dung môi ít, hạn chế nước thải ra môi trường Mặt khác, sản phẩm sau khi thu nhận dễ sấy khô và

dễ bảo quản và dễ tinh sạch Hàm lượng ẩm thấp, do đó hạn chế sự lây nhiễm của các

vi sinh vật khác Dễ dàng xử lý khi bị tạp nhiễm trong quá trình lên men (Singhania

& cs., 2009)

Lên men bề mặt rắn mặc dù có nhiều ưu điểm song vẫn còn một số nhược điểm như sau: Các vi sinh vật nuôi cấy bởi phương pháp SSF bị hạn chế bởi rào

cản về hàm lượng ẩm của môi trường Khó khăn trong việc xác định các thông số của môi trường lên men như pH, oxy tự do, CO2 (Singhania & cs., 2009)

b.Vi sinh vật sử dụng cho sản xuất enzyme bằng lên men bề mặt rắn

Trong lên men SSF, hầu hết các nhóm vi sinh vật (nấm men, nấm sợi, vi khuẩn) đều có thể sinh trưởng và phát triển trên bề mặt môi trường rắn để sinh ra các nhóm enzyme khác nhau Việc lựa chọn một chủng đặc thù tùy thuộc vào mục đích, yêu cầu và một số yếu tố, đặc biệt là tính chất của cơ chất và điều kiện môi trường Tuy nhiên, nấm sợi là thích hợp cho lên men SSF vì cơ chất và các điều kiện trong SSF gần giống với điều kiện sống tự nhiên của nấm sợi (Tengerdy & Szakacs, 2003)

Các enzyme thủy phân như cellulase, xylanase, pectinase hầu hết đều được tạo ra bởi các loài nấm sợi, vì các enzyme đó được sử dụng trong tự nhiên

cho sự sinh trưởng của chúng Trichoderma sp và Aspergillus niger đã được sử

dụng rộng rãi nhất cho các enzym này Các enzyme phân giải tinh bột cũng thường được tạo ra bởi nấm sợi và các chủng ưa thích thuộc về các loài thuộc chi

Aspergillus và Rhizopus Mặc dù việc sản xuất thương mại của amylases được thực

hiện bằng cách sử dụng cả các chủng nấm và vi khuẩn, α- amylase của vi khuẩn thường dùng để phân giải tinh bột do sự ổn định với nhiệt độ cao của nó Để đạt được hiệu suất cao với chi phí sản xuất thấp, dường như các dòng biến đổi gen sẽ đóng vai trò chính trong việc sản xuất enzyme (Pandey & cs., 1999)

c Cơ chất sử dụng trong lên men bề mặt rắn để sản xuất enzyme

Trong môi trường lên men bề mặt rắn, các vi sinh vật sẽ phát triển trên bề mặt môi trường, nhận chất dinh dưỡng từ hạt môi trường và sinh tổng hợp ra enzyme nội bào và ngoại bào Các enzyme ngoại bào sẽ thẩm thấu vào trong các hạt môi trường, còn các enzyme nội bào nằm trong sinh khối vi sinh vật

Việc lựa chọn cơ chất cho sản xuất enzyme bằng lên men SSF phụ thuộc vào nhiều yếu tố, chủ yếu liên quan đến chi phí và sự tiện lợi của cơ chất, do đó có thể bao gồm việc lựa chọn một số loại phế thải nông nghiệp Trong quá trình SSF,

cơ chất không chỉ cung cấp chất dinh dưỡng cho sự sinh trưởng của vi sinh vật mà còn còn đóng vai trò như vị trí neo giữ cho các tế bào Cơ chất mà cung cấp tất cả các chất dinh dưỡng cần thiết cho vi sinh vật phát triển được coi là cơ chất lý tưởng Tuy nhiên, một số các chất dinh dưỡng có thể có ở nồng độ dưới mức tối ưu, hoặc thậm chí không có trong các cơ chất Trong những trường hợp như vậy, cần thiết

phải bổ sung thêm các chất dinh dưỡng khác ở bên ngoài Một số loại cơ chất cũng cần phải được xử lý trước trước khi được sử dụng cho SSF (hóa học hoặc cơ học) như ligno-xenlulose, để cho vi sinh vật dễ sử dụng hơn cho sự sinh trưởng của chúng (Pandey & cs., 1999)

Trong số các yếu tố cần thiết cho sự phát triển của vi sinh vật và sản xuất enzyme việc sử dụng cơ chất đặc thù, kích thước hạt và độ ẩm/hoạt độ nước là yếu

tố quan trọng nhất (Pandey & cs., 1999) Vi sinh vật không chỉ phát triển trên bề mặt môi trường, nơi ngăn cách pha rắn (môi trường) và pha khí (không khí) mà còn phát triển trên bề mặt của các hạt môi trường nằm hẳn trong lòng môi trường Môi trường nuôi cấy cần vừa có độ xốp cao và vừa phải có độ ẩm thích hợp Các hạt cơ chất có kích thước càng nhỏ càng cung cấp diện tích bề mặt lớn cho sự tấn công của vi sinh vật, đó là một yếu tố mong muốn Tuy nhiên, kích thước các hạt

cơ chất quá nhỏ làm cho cơ chất bị bết lại có thể gây cản trở cho quá trình hô hấp của các vi sinh vật hiếu khí, làm cho chúng sinh trưởng kém Trái lại, các hạt có kích thước lớn sẽ tạo điều kiện cho hoạt động hô hấp tốt hơn (do tăng không gian giữa các hạt), nhưng cung cấp bề mặt giới hạn cho sự tấn công của vi sinh vật Vì vậy kích thước của các hạt phải được xem xét, lựa chọn cho phù hợp với từng quy trình cụ thể (Pandey & cs., 1999)

Lên men xốp khác với lên men lỏng, vì sự sinh trưởng của vi sinh vật và sản phẩm tạo ra ở trên hoặc cạnh bề mặt của các hạt cơ chất rắn có độ ẩm thấp Do

đó, điều quan trọng là phải cung cấp cấp một hàm lượng nước tối ưu và kiểm soát hoạt độ nước của cơ chất cho quá trình lên men, vì sự có mặt của nước ở nồng độ thấp hơn hoặc cao hơn sẽ ảnh hưởng xấu đến hoạt động của vi sinh vật Hơn nữa, nước có tác động lớn đến các tính chất lý hoá của chất rắn và điều này ảnh hưởng đến năng suất của quá trình lên men (Pandey & cs., 1999)

Phế thải nông nghiệp được coi là nguồn cơ chất tốt nhất cho quá trình SSF Trong những năm gần đây, nhiều phụ phẩm công-nông nghiệp đã được sử dụng làm cơ chất cho SSF như: bã mía, cám mì, cám gạo, cám ngô, cám đậu, rơm rạ, vỏ trấu, bã đậu nành, xơ dừa, bã sắn, bã thải dầu cọ, bột sắn, bột mì, bột ngô, bột giấy, bột củ cải đường, bột đậu phộng Trong đó, bã sắn và bã mía có nhiều lợi thế hơn

so với các cơ chất khác như rơm lúa, vì hàm lượng tro thấp, khả năng giữ nước cao So với bã mía thì bã sắn có lợi thế hơn là nó không yêu cầu quá trình tiền xử

lý và có thể phân hủy bởi hầu hết các vi sinh vật cho các mục đích khác nhau Bã sắn được sử dụng nhiều trong sản xuất axit citric, hương liệu, và các chất trao đổi

khác (Pandey & cs., 1999)

d Các yếu tố ảnh hưởng đến sản xuất enzyme trong các hệ thống lên men bề mặt rắn

Các yếu tố chính ảnh hưởng đến sự tổng hợp enzyme của vi sinh vật trong

hệ thống lên men xốp gồm: lựa chọn cơ chất và vi sinh vật phù hợp; tiền xử lý cơ chất; kích thước hạt (khoảng trống giữa các hạt và diện tích bề mặt) của cơ chất; hàm lượng nước và hoạt độ nước của cơ chất; độ ẩm tương đối; loại và lượng của

vi sinh vật cấy vào; kiểm soát nhiệt độ của vật chất lên men/loại bỏ nhiệt của quá trình trao đổi chất; duy trì tính đồng bộ trong môi trường của hệ thống lên men xốp

và môi trường không khí xung quanh, như tốc độ hấp thụ oxy và giải phóng CO2(Pandey & cs., 1999)

2.2.3.2 Lên men chìm/lên men lỏng (Submerged Fermentation- SmF/ Liquid Fermentation - LF)

Lên men chìm là quá trình nuôi cấy vi sinh vật trong môi trường lỏng, tất

cả các chất dinh dưỡng có trong môi trường cho sự phát triển của vi sinh vật trong quá trình lên men phải ngập nước Các yếu tố cần kiểm soát trong lên men chìm là: nhiệt độ, pH, tốc độ khuấy, nồng độ oxy Các hợp chất hoạt tính sinh học được tiết ra trong môi trường lên men Cơ chất trong quá trình lên men được sử dụng khá nhanh do đó cần phải được thay thế hoặc bổ sung chất dinh dưỡng liên tục (Subramaniyam & cs., 2012) Lên men chìm là phương pháp được sử dụng phổ biến trong quy trình lên men công nghiệp vì có thể kiểm soát được toàn bộ các thông số của quá trình lên men, do đó có thể lên men lớn với thể tích thay đổi từ hàng nghìn đến hàng trăm nghìn lít

a Ưu nhược điểm của lên men chìm

So với phương pháp lên men bề mặt rắn, thì lên men chìm có nhiều ưu điểm đó là: Tốn ít diện tích, vi sinh vật chỉ cần nuôi cấy trong một thiết bị với thể tích lớn, diện tích mặt thoáng nhỏ, do đó việc kiểm soát độ vô trùng tốt, dễ dàng kiểm soát được toàn bộ quy trình, dễ cơ giới hóa và tự động hóa trong quá trình theo dõi, ít cần sử dụng nhân lực và đảm bảo độ đồng nhất của sản phẩm (do chúng cùng được thu từ một thiết bị)

Tuy nhiên phương pháp lên men chìm có một số nhược điểm như sau: Đòi hỏi đầu tư nhiều kinh phí cho trang thiết bị Trong lên men chìm cần phải khuấy

và sục khí liên tục vì vi sinh vật chỉ sử dụng được ôxy hoà tan trong môi trường Khí được nén qua một hệ thống lọc sạch tạp trùng, hệ thống này tương đối phức tạp và dễ gây nhiễm cho môi trường nuôi cấy Nếu một mẻ lên men vì một lý do

nào đó bị xử lý thì không thể xử lý cục bộ được, đa phần phải hủy bỏ cả quá trình lên men, gây tốn kém lớn Phế liệu của quá trình lên men thải ra phải kèm theo công nghệ xử lý chống ô nhiễm môi trường

b Vi sinh vật sử dụng trong lên men chìm

Phương pháp này dùng cho cả vi sinh vật kị khí và hiếu khí Đối với nuôi

vi sinh vật kị khí trong quá trình nuôi không cần sục khí chỉ thỉnh thoảng khuấy trộn còn với vi sinh vật hiếu khí thì phải sục khí liên tục Đây là phương pháp hiện đại đã được dùng trong khoảng nửa cuối thế kỉ XX và cho kết quả rất to lớn đối với công nghệ vi sinh

c Cơ chất sử dụng trong lên men chìm

Một số cơ chất phổ biến được sử dụng trong quá trình lên men chìm là các loại đường hòa tan, rỉ mật, các loại môi trường lỏng, nước ép trái cây, rau quả, và nước thải

d Các yếu tố ảnh hưởng đên lên men chìm

Nuôi cấy chìm hay nuôi cấy bề sâu dùng môi trường dịch thể Chủng vi sinh vật cấy vào môi trường được phân tán khắp mọi điểm và chung quanh bề mặt tế bào được tiếp xúc với dịch dinh dưỡng Đặc điểm này đòi hỏi trong suốt quá trình nuôi cấy phải khuấy và cung cấp ôxy bằng cách sục khí liên tục

Ngày nay phương pháp nuôi cấy chìm được dùng phổ biến trong công nghệ

vi sinh để sản xuất men bánh mì, protein đơn bào, các chế phẩm vi sinh làm phân bón, thuốc trừ sâu, các enzyme, các acid amin, vitamin, các chất kháng sinh, các chất kích thích sinh học v.v

Lên men xốp được đánh giá là con đường tốt nhất để sản xuất enzyme và các sản phẩm bền nhiệt khác Lên men xốp ngày càng được sử dụng rộng rãi trong sản xuất cũng như trong nghiên cứu vì những ứng dụng mang tính thực tiễn và kinh tế của nó Lên men xốp được dùng trong công nghiệp chế biến và sản xuất thực phẩm chủ yếu là lĩnh vực sản xuất các loại hương liệu, sản xuất enzyme (a-amylase, fructosyl transferase, lipase, pectinase, xylanase), các acid hữu cơ (acid lactic, acid citric) và các loại kẹo cao su Trước đây, trong sản xuất enzyme người

ta thường sử dụng kỹ thuật lên men dịch thể Tuy nhiên, khi tiến hành so sánh hiệu quả của các loại hình lên men, người ta thấy hàm lượng enzyme vi sinh vật có thể sinh ra trong lên men xốp cao hơn nhiều lần so với trong lên men dịch thể khi sử dụng cùng một chủng vi sinh vật trong cùng điều kiện lên men (Zambare, 2010)

2.2.4 Sự cần thiết phải tối ưu môi trường lên men

Để quá trình lên men vận hành ổn định, đạt hiệu quả, năng suất cao, chất lượng tốt, chi phí thấp, cần phải đáp ứng các yêu cầu sau: (1) Chủng vi sinh vật dùng trong lên men phải có hoạt tính mạnh, ổn định Thông thường đó là các vi sinh vật đã được tuyển chọn, thuần hóa, và cải biến để phù hợp với điều kiện sản xuất (2) Vi sinh vật cần được cung cấp đầy đủ các dưỡng chất cho sự sinh sản, phát triển và hoạt động Các dưỡng chất này gồm các nguồn cung cấp carbon, nitơ, vitamin, khoáng cũng như các nguyên tố vi lượng khác (3) Môi trường lên men cần được duy trì thường xuyên ở điều kiện tối ưu Các thông số như nhiệt độ, áp suất,

pH, lượng oxy phải được thường xuyên theo dõi và khống chế ở giá trị tối ưu (4) Cần phải có những biện pháp để có sự đồng nhất trong toàn bộ môi trường lên men Điều này đặc biệt quan trọng khi thùng lên men có kích thước lớn, các thành phần của môi trường lên men có khối lượng riêng chênh lệch đáng kể (5) Cần hạn chế

sự nhiễm tạp đến mức thấp nhất Môi trường lên men, thùng lên men, các thiết bị

phụ trợ, không khí cần được tiệt trùng một cách nghiêm ngặt (Singh & cs., 2017)

Trong quá trình sản xuất enzyme công nghiệp, việc tối ưu môi trường lên men luôn được tiến hành để tăng sản lượng của sản phẩm mong muốn Hiện tại, còn có ít nghiên cứu về vai trò của các yếu tố, nồng độ của chúng trong việc kiểm soát sản xuất các chất trao đổi bởi các chủng vi sinh vật khác nhau, các nhà nghiên cứu đã nghiên cứu về nhu cầu dinh dưỡng cho sự sản xuất các chất trao đổi thứ cấp và nhu cầu dinh dưỡng là rất khác nhau giữa các chủng Số lượng và chất lượng của các chất dinh dưỡng và khả năng đồng hóa thành công là những yếu

tố quyết định chính đến sức sống và hoạt động trao đổi chất của vi sinh vật Do

đó, trong suốt quá trình tối ưu môi trường, phải cân nhắc đến nhu cầu sinh trưởng tối thiểu của vi sinh vật có thể sản xuất được tối đa sản phẩm mong muốn (Singh

Raju & cs (2012) đã nghiên cứu sự cải tiến của A.niger cho sản xuất

glucoamylase bằng tác nhân vật lý (UV) và hóa học (Ethyl methyl sulphonate và

ethidium bromide) và báo cáo rằng các chủng đột biến của A.niger có khả năng

sản xuất glucoamylase tốt hơn Vu & cs (2010) đã nghiên cứu việc sản xuất cao sản enzyme phân hủy tinh bột sống (RSDE) bằng việc gây đột biến chủng lặp lại

chủng nấm sợi Aspergillus niger và nhận thấy rằng sự sản sinh RSDE được cải

thiện cao hơn 2 lần so với chủng dại Sự kết hợp đa dạng các nhân tố đột biến như tia γ (Co 60), UV và NTG được kết trong việc đã cho hiệu quả cao hơn trong việc gây đột biến các chủng nấm sợi để lám tăng khả năng sản xuất RSDE Và lên men xốp ở điều kiện tối ưu đã làm tăng hiệu quả sản xuất RSDE cao gấp 19,23 lần so với kiểu dại ở cùng điều kiên Raju & cs (2012) nghiên cứu tác nhân đột biến UV

đối với A.niger cho sản xuất enzyme bằng lên men chìm Zhao & cs (2014) nghiên cứu sự kết hợp của tia UV và 60 Co-γ-ray trong gây đột biến A.niger để tăng

cường hoạt độ của glucoamylase Svensson & Søgaard (1993) đã nghiên cứu ảnh hưởng của đột biến đến cấu trúc và chức năng của glucoamylase và các enzyme liên quan Tiếp theo là những phương pháp đột biến để tăng cường sự sản sinh α-amylase của vi sinh vật Một số chiến lược gây đột biến đã được sử dụng để cải thiện sự sản xuất các enzyme này và các nhân tố gây đột biến truyền thống là công

cụ quan trọng để tạo ra các chủng đột biến sản xuất cao hơn (Ghani & cs., 2013)

Fawzi & Hamdy (2011) tiến hành gây đột biến chủng nấm Chaetomium

cellulolyticum NRRL 18756 bằng tia gamma tạo ra chủng đột biến có khả năng

sản sinh CMCase gấp 1,6 lần so với chủng dại Tối ưu hóa điều kiện sản xuất CMCase bởi chủng đột biến sử dụng lên men xốp đã làm tăng sản lượng CMCase hơn 4 lần so với chủng dại ở môi trường cơ bản Vu & cs (2011) cải tiến chủng

nấm sợi Aspergillus niger SU14 bằng tia Co60, UV và

N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine (NTG) đã lựa chọn được một chủng đột biến có khả năng sản sinh cellulase tăng gấp 2,2 lần so với chủng dại Khi tối ưu điều kiện sản xuất cellulase của chủng đột biến, sản lượng enzyme tăng 8,5 lần so với chủng dại ở môi trường cơ bản

2.3 TÌNH HÌNH SẢN XUẤT VÀ SỬ DỤNG ENZYME TRONG CHĂN NUÔI 2.3.1 Nghiên cứu và sử dụng enzyme trong chăn nuôi trên thế giới

Trong số tất cả các chất phụ gia trong thức ăn chăn nuôi, enzyme là những sản phẩm được nghiên cứu nhiều nhất, đặc biệt trong thức ăn của lợn và gia cầm Việc sử dụng enzyme trong khẩu phần ăn của động vật bắt đầu từ những năm 1980

và bùng nổ vào những năm 1990 Thị trường enzyme thức ăn chăn nuôi toàn cầu được dự đoán sẽ đạt tỷ lệ tăng trưởng hàng năm kép (CAGR - Compounded Annual Growth rate) là 7,3% trong giai đoạn 2021 - 2026 Enzyme có thể được sử dụng

trong công thức thức ăn của động vật để nâng cao khả năng tiêu hóa chất xơ, suy giảm các thành phần có hại hoặc không có giá trị dinh dưỡng trong thức ăn Ngoài

ra, giá trị protein cho động vật cũng có thể được nâng cao nhờ việc bổ sung các enzyme vào khẩu phần ăn Nhận thức và nhu cầu về dinh dưỡng của động vật ngày càng cao cùng với việc cấm sử dụng kháng sinh ở nhiều khu vực trên thế giới đã thúc đẩy ngành chăn nuôi và các nhà máy sản xuất thịt sử dụng chất dinh dưỡng bổ sung trong chăn nuôi An toàn thực phẩm đã trở thành vấn đề tối quan trọng đối với chính phủ nhiều nươc trên thế giới, đặc biệt là các nước ở Bắc Mỹ và Châu Âu Châu

Á - Thái Bình Dương nổi lên như một trong những thị trường phát triển nhất về thức

ăn chăn nuôi và chủ yếu là cho gia súc lớn Enzyme trong chăn nuôi được đánh giá

là chiến lược bổ sung thích hợp để duy trì chức năng đường ruột của vật nuôi, là phụ gia thức ăn được sản xuất thương mại Khi được cho ăn với tỷ lệ thích hợp sẽ cải thiện một số đặc tính như trọng lượng, chuyển hóa thức ăn và thu nhận thức ăn

(Chapman & cs., 2018; Fasim & cs., 2021)

Enzyme được sử dụng trong chăn nuôi để giúp vật nuôi tiêu hóa tốt hơn và đảm bảo cho động vật có chế độ dinh dưỡng đầy đủ Nhu cầu về protein động vật ngày càng cao, đặc biệt là các sản phẩm từ sữa như sữa, pho mát, sữa chua và các sản phẩm khác Liên minh Châu Âu là một trong những thị trường tiêu thụ sữa lớn nhất Vì vậy sản lượng thức ăn chăn nuôi bò sữa tăng trung bình 2% ở khu vực Châu Âu Hoa Kỳ, Trung Quốc và Ấn Độ là những nhà sản xuất thức ăn cho gia súc nhai lại lớn nhất do có số lượng lớn gia súc nhai lại và nhu cầu cao về sữa và thịt Theo Alltech Feed Survey, Hoa Kỳ đã sản xuất 19 triệu tấn thức ăn hỗn hợp cho bò sữa và 21 triệu tấn cho bò thịt vào năm 2018 và trở thành thị trường chính

về enzyme thức ăn cho bò sữa và bò thịt (Fasim & cs., 2021)

Thị trường Châu Á - Thái Bình Dương dự kiến sẽ đạt CAGR cao trong giai đoạn tới Trung Quốc và Ấn Độ là thị trường lớn ở khu vực Châu Á, dân số lớn là một trong những yếu tố giúp châu Á - Thái Bình Dương tiếp tục là thị trường lớn nhất trên thế giới Trung Quốc và Ấn Độ ước tính có khoảng 7,200 nhà máy thức

ăn chăn nuôi, sản xuất gần 227 triệu tấn thức ăn hỗn hợp Trung Quốc đóng góp gần 18% sản lượng thức ăn hỗn hợp toàn cầu Nhu cầu và sản xuất thức ăn hỗn hợp cao ở các nước này được kỳ vọng sẽ thúc đẩy thị trường enzym thức ăn chăn nuôi ở khu vực Châu Á - Thái Bình Dương

Các enzyme thức ăn chủ yếu được sử dụng cho gia cầm là phytase, protease, α-galactosidases, glucanases, xylanases, α-amylases và polygalacturonases (Adrio

& Demain, 2014) Phytase, phân đoạn enzyme lớn nhất trong ngành công nghiệp

thức ăn chăn nuôi, được sử dụng để tận dụng phốt pho tự nhiên liên kết với axit phytic trong thức ăn làm từ ngũ cốc (Lei & Stahl, 2000; Bhat, 2000) Động vật dạ dày đơn không thể tiêu hóa thức ăn từ thực vật có chứa nhiều cellulose và hemicellulose Xylanase và β-glucanase được thêm vào thức ăn của chúng khi các enzym này phân giải hoàn toàn và tiêu hóa lượng tinh bột cao (Bhat, 2000) Protein cũng được sử dụng trong thức ăn chăn nuôi để khắc phục các yếu tố kháng dinh dưỡng bằng cách phân giải protein thành các axit amin cấu thành của chúng Ngoài việc cải thiện giá trị dinh dưỡng của thức ăn để động vật chuyển hóa thức ăn tốt hơn, các enzym thức ăn này đang trở nên quan trọng vì vai trò của chúng trong việc giảm chi phí thức ăn và cải thiện chất lượng thịt (Lei & Stahl, 2000; Adrio & Demain, 2014) Thị trường enzyme chăn nuôi trên thế giới tăng trưởng đều đặn để đáp ứng nhu cầu về sữa và thịt của con người

Hầu hết các enzyme được sản xuất bởi các loại nấm như: Aspergillus,

Trichoderma, Penicillium hoặc bởi các vi khuẩn như Streptomyces, Bacillus Subtilis hoặc Bacillus licheniformis Hiện nay, các quy trình sản xuất dựa trên việc

sử dụng các vi sinh vật biến đổi gen

Hiện nay, bã thải từ các cơ sở chế biến tinh bột từ nguyên liệu (ngô, sắn, củ rong) chứa hàm lượng cao tinh bột (30-50%), chất xơ (cellulose, hemicellulose), đây là nguồn cơ chất tốt để sản xuất enzyme phân hủy tinh bột sống (α-amylase, glucoamylase), enzyme phân hủy chất xơ (cellulase…), đồng thời tạo ra một số enzyme quan trọng khác (proteinase, phytase…), các enzyme này rất quan trọng trong chế biến thức ăn chăn nuôi (TACN) Việc sản xuất TACN cho động vật sử dụng nguyên liệu sắn lát, bã sắn/cám mì, rỉ đường được bổ sung các chủng vi sinh vật có lợi để lên men tạo sản phẩm giàu protein, enzyme, axit amin, axit hữu cơ và các hoạt chất sinh học Sau khi qua một quá trình tiền xử lý, cơ chất được cải thiện bởi các chủng vi khuẩn Công nghệ lên men rắn là phương pháp hợp lý, cho chuyển hóa sinh học và làm tăng giá trị của cơ chất (sắn lát, cám, hạt cốc, rỉ đường)

Enzyme amylase và celulase là những enzyme phổ biến, chiếm một lượng lớn trên thị trường enzyme thế giới Chúng được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như công nghệ thực phẩm, dệt may, công nghệ thuộc da, sản xuất giấy, dược phẩm, y học, chế biến thức ăn chăn nuôi, các ngành công nghiệp lên men (Varalakshmi & cs., 2009; Ciloci & cs., 2012) Trong chăn nuôi, ứng dụng của enzyme amylase và celullase là đáng chú ý vì hiệu quả của nó trong việc cải thiện giá trị của thức ăn chăn nuôi và năng suất của vật nuôi

Trong chăn nuôi, enzyme có thể được thêm vào thức ăn theo một trong hai

cách Lựa chọn thứ nhất là xây dựng lại công thức thức ăn để giảm chi phí chăn nuôi và giúp động vật duy trì được khả năng sinh trưởng, năng suất trứng và chuyển hóa thức ăn ở mức tối thiểu; ví dụ, thay thế một số lúa mì, lúa mạch, ngô với giá thấp hơn, phụ phẩm xơ cao hơn và/hoặc giảm sự bổ sung chất béo trong chế độ ăn Lựa chọn thứ hai là bổ sung enzyme vào thức ăn công thức chuẩn để cải thiện sinh trưởng, sản xuất trứng và chuyển hóa thức ăn để tăng hiệu quả sản xuất bằng cách cải thiện hiệu quả sử dụng thức ăn (Bedford & Partridge, 2001)

Việc sử dụng enzyme ngoại sinh tổng hợp gồm xylanase, cellulase, amylase, protease, pectinase, phytase, β-glucanase…vào trong khẩu phần chứa chất xơ khó tiêu có tác dụng đáng kể trong việc cải thiện khả năng tiêu hóa, tăng trọng, giúp vật nuôi phát triển đạt độ đồng đều, ngăn cản các tác hại của các chất kháng dinh dưỡng có trong khẩu phần, giảm chi phí thức ăn, nâng cao tỷ lệ tiêu hóa năng lượng, protein và axít amin trong khẩu phần, đồng thời giảm thiểu các chất dinh dưỡng dư thừa bài thải ra môi trường so với khẩu phần không bổ sung (Colombatto & cs., 2004; Arvidsson & cs., 2009; Kuhad & cs., 2011)

alpha-Việc tiền xử lý thức ăn ủ chua và ngũ cốc bằng cellulase hoặc xylanases có thể cải thiện giá trị dinh dưỡng của nó Các enzym cũng có thể loại bỏ các yếu tố kháng dinh dưỡng có trong các hạt ngũ cốc, phân hủy các thành phần thức ăn nhất định để cải thiện giá trị dinh dưỡng, và cung cấp các enzyme tiêu hóa bổ sung như protease, amylases và glucanases Ví dụ, chất xơ bao gồm polysaccharides không phải tinh bột như arabinoxylans, cellulose và nhiều thành phần thực vật khác bao gồm các dextrin, inulin, lignin, sáp, chitin, pectin, β-glucan và oligosaccharides,

có thể hoạt động như yếu tố kháng dinh dưỡng cho một số loài động vật như lợn Trong trường hợp này, cellulases có hiệu quả thủy phân yếu tố kháng dinh dưỡng

là cellulose trong nguyên liệu thức ăn thành các thành phần dễ hấp thụ do đó cải thiện sức khỏe và năng suất của vật nuôi (Kuhad & cs., 2011)

β-glucanases và xylanases đã được sử dụng trong chăn nuôi động vật dạ dày đơn, để thủy phân polysaccharides không phải tinh bột như β-glucans và arabinoxylans Cellulases được sử dụng như phụ gia thức ăn một cách độc lập hoặc cùng với protease, có thể cải thiện đáng kể chất lượng của thịt lợn Glucanases và xylanases làm giảm độ nhớt của thức ăn giàu chất xơ như lúa mạch đen và lúa mạch ở gia cầm và lợn Các enzyme này cũng có thể làm tăng trọng ở lợn và gia cầm bởi việc cải thiện tiêu hóa và hấp thu thức ăn (Bhat, 2000; Karmakar & Ray, 2011; Shrivastava & cs., 2011)

Hầu hết các loại thức ăn có chất lượng thấp chứa hàm lượng cao cellulose,

ít protein và chất béo, cùng hàm lượng cao các chất khoáng khi so sánh với thức

ăn chăn nuôi giá trị cao Cellulases có thể được sử dụng để cải thiện việc sản xuất thức ăn ủ chua cho trâu bò để tăng cường khả năng tiêu hóa cỏ Thức ăn cho động vật nhai lại chứa hàm lượng lớn cellulose, hemicellulose, pectin và lignin phức tạp hơn so với chế độ ăn của gà và lợn Chế phẩm enzyme có chứa hàm lượng cao cellulase, hemicellulase, và pectinase đã được sử dụng để cải thiện chất lượng dinh dưỡng của thức ăn cho gia súc nhai lại (Graham & Balnavel, 2008)

Cellulases và hemicellulases chịu trách nhiệm thủy phân lignocellulosic, khử vỏ hạt ngũ cốc, thủy phân của β-glucans, làm mềm và nhũ hóa thức ăn tốt hơn, kết quả làm cải thiện chất lượng dinh dưỡng của thức ăn chăn nuôi Hơn nữa, những enzyme này có thể gây ra thủy phân một phần thành tế bào thực vật trong quá trình ủ chua và bảo quản thức ăn (Kuhad & cs., 2011)

Trong quá trình tiêu hóa các sản phảm có nguồn gốc tinh bột ở động vật, khả năng tiêu hóa thấp của một số loại tinh bột thúc đẩy sự xuất hiện của một số bệnh đường tiêu hóa bởi vì tinh bột không phân hủy và hấp thu ở ruột già có thể hoạt động như cơ chất cho sự lên men của các vi khuẩn trong đó có nhiều vi khuẩn gây bệnh nguy hiểm Cellulases có tác động tích cực lên quá trình lên men bằng cách tăng sản xuất axit propionic, hoạt động như một chất kìm hãm vi khuẩn do

đó có thể làm giảm số lương quần thể vi khuẩn gây bệnh (Pazarlioğlu & cs., 2005)

Chế phẩm amylase được sử dụng riêng rẽ hay phối hợp với các enzym khác như protease, cellulase, pectinase để sản xuất các loại thức ăn dễ tiêu hóa, dễ hấp thu cho gia súc, gia cầm đặc biệt là động vật còn non, giúp vật nuôi tăng trọng nhanh, sinh sản tốt, sức đề kháng cao

Việc sử dụng các enzym trong chăn nuôi ngày càng đóng vai trò quan trọng khi kháng sinh và hoocmon bị cấm sử dụng như chất kích thích sinh trưởng trong chăn nuôi ở nhiều quốc gia, đây có thể được coi là một trong những lựa chọn thích hợp để thay thế kháng sinh và hoocmon sinh trưởng để đem lại sản phẩm chăn nuôi an toàn

2.3.2 Nghiên cứu và sử dụng enzyme trong chăn nuôi ở Việt Nam

Theo Quyết định số 01/2006-QĐ-BNN ra ngày 06/01/2006 của Bộ Nông nghiệp & Phát Triển Nông thôn, trên thị trường Việt Nam được phép buôn bán các chế phẩm có chứa các loại enzyme tiêu hóa do các công ty lớn trên thế giới sản xuất như Novozymes A/S (Đan Mạch, chế phẩm Ronozyme chứa glucanase, xylanase, protease, phytase), Finnfeeds International Ltd; Danisco Animal

Nutrition Finland hoặc England (các chế phẩm Avizyme, Phyzyme, Porzyme), Chemtech (Hàn Quốc) Ngoài các công ty lớn ra còn một số công ty khác trên thế giới cũng đã và đang chào bán các chế phẩm chứa enzyme bổ sung TACN trên thị trường Việt Nam, họ đến từ Đức, Hà Lan, Bỉ, Canada, Pháp, Spain, Mỹ, Brazil, Trung Quốc, Singapore, Malaysia, Philippine Chế phẩm của Trung Quốc chưa có thương hiệu nhưng lại có nhiều công ty tham gia thị trường Mặc dù trên thị trường đã có nhiều sản phẩm thương mại của các công ty ngoại quốc, nhưng chúng ta vẫn nên tự sản xuất nhằm tạo thêm công ăn việc làm cho người lao động, chủ động cung cấp

Hiện nay, trên thị trường Việt Nam đã bán các sản phẩm enzyme sử dụng

bổ sung vào thức ăn chăn nuôi (TACN) cho các đối tượng bò, lợn, gà, vịt; nhưng chưa thấy bán nhiều chế phẩm sinh học thủy phân các nguồn nguyên liệu giàu cellulose và tinh bột làm TACN Những sản phẩm này đều được sản xuất ở nước ngoài Nếu các cơ sở sản xuất trong nước có khả năng sản xuất được các chế phẩm enzyme tương tự, thì sẽ tạo công ăn việc làm cho nhiều người lao động Đặc biệt nếu các chế phẩm enzyme được sản xuất tận dụng các phế thải nông nghiệp và công nghiệp chế biến thực phẩm thì giá thành sẽ rẻ hơn, có sức cạnh tranh hơn

Enzyme ứng dụng trong TACN đòi hỏi phải có những đặc tính phù hợp với điều kiện sản xuất như có hoạt tính cao, chịu nhiệt độ cao của quá trình ép viên, hoạt động tốt trong môi trường axit của dịch dạ dày Nhiều enzyme từ nấm mốc

có tiềm năng ứng dụng trong chăn nuôi Tuy nhiên, việc sử dụng các chủng tự nhiên trong sản xuất enzyme gặp một số khó khăn như lượng enzyme tạo ra thấp

và có thể chứa các thành phần không mong muốn, tế bào nấm sợi dễ bị đứt gãy khi khuấy đảo, sinh khối có thể gây tắc đường ống…Sản xuất enzyme tái tổ hợp sử

dụng hệ biểu hiện Pichia pastoris được coi là lựa chọn thích hợp do mức độ biểu

hiện cao, chủng tái tổ hợp ổn định về di truyền mà không cần duy trì bằng kháng sinh, thành phần môi trường nuôi cấy rẻ tiền, sinh sản dạng đơn bào và phù hợp với lên men công nghiệp (Krainer & cs., 2012)

Bổ sung enzyme vào TACN sẽ giải quyết được hai thách thức quan trọng trong dinh dưỡng vật nuôi: giảm chi phí thức ăn và nâng cao hiệu quả sản xuất Với mục đích đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng về lượng thịt do bùng nổ dân số, đồng thời giảm tác động môi trường của quá trình chăn nuôi, việc sử dụng enzyme

có thể cho phép các nhà sản xuất giảm tổn thất và sử dụng hiệu quả hơn các chất dinh dưỡng