Tổng hợp và khảo sát hoạt tính gây độc tế bào của các dẫn xuất mới của artemisinin

Bên cạnh tác dụng chống sốt rét, nhiều hoạt tính mới của artemisinin và dẫn xuất của nó đã được phát hiện, đặc biệt là tác dụng kháng ung thư dựa trên nguyên lý tương tự tác dụng chống s

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

VŨ TUẤN KIÊN

TỔNG HỢP VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO

CỦA CÁC DẪN XUẤT MỚI CỦA ARTEMISININ

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

Hà Nội – 2022

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

VŨ TUẤN KIÊN

TỔNG HỢP VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO

CỦA CÁC DẪN XUẤT MỚI CỦA ARTEMISININ

Ngành: Hóa học

Mã số: 9440112

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1 PGS.TS TRẦN KHẮC VŨ

2 PGS.TS VŨ ĐÌNH HOÀNG

Hà Nội – 2022

LỜI CAM ĐOAN

Tác giả cam đoan rằng: Luận án tiến sĩ “Tổng hợp và khảo sát hoạt tính gây độc tế bào của các dẫn xuất mới của Artemisinin” là công trình nghiên cứu

được hoàn thành dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Trần Khắc Vũ và PGS.TS Vũ

Đình Hoàng- Bộ môn công nghệ Hóa dược và BVTV -Viện kỹ thuật hóa học - trường Đại học Bách khoa Hà Nội Các kết quả trong luận án này là hoàn toàn trung thực và chưa được công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác

Tác giả luận án

Vũ Tuấn Kiên

Vũ Tuấn Kiên

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS TS Trần Khắc Vũ , PGS.TS.Vũ Đình Hoàng đã hướng dẫn tận tình, chu đáo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện luận án này tại bộ môn Hóa dược – Trường Đại Học Bách Khoa

Hà Nội

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô trong bộ môn Hóa Dược và Hóa chất bảo vệ thực vật, các thầy cô giáo trong trường, và ban lãnh đạo viện Kỹ thuật Hóa học, đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian làm luận án

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu trường Đại học Bách Khoa Hà Nội cùng các thầy cô ở trường đã tạo điều kiện về thời gian và hỗ trợ khác giúp tôi thực hiện luận án

Cuối cùng tôi muốn cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã cổ vũ động viên tôi trong suốt thời gian qua

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm 2022

Vũ Tuấn Kiên

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT v

DANH MỤC CÁC BẢNG vii

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ viii

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ viii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỒNG QUAN 2

1.1 Giới thiệu về cây thanh hao hoa vàng và artemisinin 2

1.1.1 Vài nét về cây thanh hao hoa vàng 2

1.1.2 Vài nét về artemisinin 3

1.2 Sinh tổng hợp artemisinin 7

1.3 Ung thư và hoạt tính kháng ung thư của artemisinin 8

1.3.1 Khái niệm ung thư 8

1.3.2 Artemisinin trong điều trị ung thư 9

1.3.3 Cơ chế tác dụng của artemisinin 12

1.3.4 Vai trò của sắt liên quan đến cơ chế kháng u của artemisinin 12

1.3.5 Artemisinin và sự kháng thuốc 14

1.4 Một số dẫn xuất của artemisinin có hoạt tính kháng ung thư 14

1.4.1 Dẫn xuất acetal của artemisinin 14

1.4.2 Dẫn xuất non-acetal của artemisinin 17

1.5 Dẫn xuất dimer của artemisnin 24

1.6 Dẫn xuất 11-aza-artemisinin 26

1.7 Histone deaceylase 27

1.7.1 Histon acetyltransferase (HAT) 27

1.7.2 Histon deacetylase (HDAC) 27

1.7.3 Cấu trúc của enzyme HDAC và cơ chế phản ứng deacetyl hóa 28

1.7.4 Mối liên hệ giữa ung thư và HDAC 29

1.8 Chất ức chế enzym histone deacetylase (HDACi) 29

1.8.1 Định nghĩa HDACi 29

1.8.2 Cơ chế tác dụng của các chất ức chế HDAC 31

CHƯƠNG 2 THIẾT BỊ, DỤNG CỤ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33

2.1 Thiết bị, dụng cụ dùng trong tổng hợp 33

2.2 Hóa chất dùng trong thực nghiệm 33

2.3 Các phương pháp sử dụng trong tổng hợp và tinh chế sản phẩm 35

2.4 Các phương pháp nghiên cứu cấu trúc sản phẩm 35

2.5 Các phương pháp tổng hợp 35

2.6 Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học 35

2.6.1 Phương pháp xác định tính độc tế bào ung thư (cytotoxic assay) 35

2.6.2 Phương pháp xác định khả năng ức chế enzyme histone deacetylases (HDAC) trên dòng tế bào MCF7 37

2.7 Phương pháp mô hình docking 38

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM 39

3.1 Tổng hợp các dẫn xuất triazole của artemisinin 39

3.2 Tổng hợp các dẫn xuất dime artemisinin 62

3.2.1 Tổng hợp chất trung gian 10β-aminoartemisinin (64) 62

3.2.2 Quy trình chung tổng hợp chất 65a-e 63

3.2.3 Tổng hợp chất 65f, g 67

3.4 Tổng hợp các dẫn xuất artemisinin chứa nhóm axit hydroxamic (67a-g) 74

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 81

4.1 Tổng hợp các dẫn xuất triazole artemisinin 61a-l, 62a-l sử dụng phản ứng Click 81

4.2 Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của các dẫn xuất triazole artemisinin 86

4.3 Tổng hợp các hợp chất dime artemisinin 66a-g 88

4.4 Hoạt tính gây độc tế bào của các dimer artemisinin 66a-g và 65a-g 96

4.5 Tổng hợp các dẫn xuất mới artemisinin chứa nhóm hydroxamic 76a-g 98

4.6 Hoạt tính ức chế HDAC và độc tế bào của các 67a-g 103

KẾT LUẬN 107

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT

13C-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13 (Carbon 13 Nuclear

Magnetic Resonance spectroscopy)

1H-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (Proton Magnetic Resonance

DMAP Dimethyl aminoprydin

DMSO-d 6 Dimethylsulfoxid deutri hóa

EtOAc Ethyl acetate

HAT Histon acetyltransferase

HDAC Histon deacetylase

HRMS Phổ khối phân giải cao

UV Ultraviolet

δ độ dịch chuyển hóa học

δ (ppm) Độ chuyển dịch hóa học (tính theo phần triệu)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1 Hiệu suất các chất triazole 61a – i và 62a – i 84 Bảng 2 Hoạt tính gây độc tế bào in vitro các dẫn xuất triazole 87 Bảng 3 Cấu trúc và hiệu suất các hợp chất 66a-g 96

Bảng 4 Hoạt tính gây độc tế bào in vitro của các dimer artemisinin 66a-g và 65a-g

với một số dòng tế bào ung thư 96 Bảng 5 Hoạt tính ức chế HDAC và gây độc tế bào của chất 67a-g 103 Bảng 6: Ái lực liên kết của 67a và 67g với HDAC2 105

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Hình 1: Cây thanh hao hoa vàng 2

Hình 2 Sinh tổng hợp artemisinin trong cây 7

Hình 3 Cơ chế tác dụng của ART 14

Hình 4: Một số dẫn xuất ete và este của artemisinin 15

Hình 5 Benzyldeoxoartemisinin (19) 18

Hình 6: Dẫn xuất 37a, 37b 22

Hình 7: Dẫn xuất 38a và 38b 22

Hình 8: Chất lai hóa artemisinin với 4-amino-7-chloroquinoline 41 và 42 23

Hình 9 Một số dimer và trime non acetal 25

Hình 10: Cấu trúc tinh thể của HDAC8 kết hợp với suberoylanilide 28

Hình 11: Một số chất ức chế HDAC làm thuốc ung thư 30

Hình 12: Cấu trúc chung của các chất ức chế HDACi 31

Hình 13: Cấu trúc các chất ức chế HDAC 32

Hình 14 Phổ 1H NMR của chất 61a 83

Hình 15 Phổ giãn 1H NMR của chất 61a 84

Hình 16 Phổ giãn 1H NMR của chất 61a 84

Hình 17 Phổ 13C NMR của chất 61a 85

Hình 18 Hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất triazole 88

Hình 19 Artemisinin, dihydroartemisinin (DHA), và các dẫn xuất dimer, trimer artemisinin [118, 119] 89

Hình 20 Phổ 1H NMR của chất 65a 90

Hình 21 Phổ giãn 1H NMR của chất 65a 91

Hình 22 Phổ giãn 1H NMR của axit 65a 92

Hình 23 Phổ 13C NMR của chất 65a 93

Hình 24 Phổ 1H NMR của chất 66g 94

Hình 25 Phổ giãn 1H NMR của chất 66g 94

Hình 26 Phổ 13C NMR của chất 66g 95

Hình 27 Phổ ESI-HRMS của chất 66g 95

Hình 28 Một số chất ức chế HDAC 99

Hình 29 Thiết kế các dân xuất artemisinin chứa nhóm hydroxamic axit 99

Hình 30 Phổ 1H NMR của 67c 101

Hình 31 Phổ giãn 1H NMR của 67c 101

Hình 32 Phổ giãn 1H NMR của 67c 102

Hình 33 Phổ 13C NMR của chất 67c 102

Hình 34 Phổ ESI-HRMS của chất 67c 103

Hình 35 Hình ảnh liên kết của SAHA và liên kết mô phỏng của các hợp chất 67a và 67g với HDAC2 SAHA được thể hiện có màu cam 106

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 1: Tổng hợp (+)-artemisinin 6

Sơ đồ 2 Tổng hợp các dẫn xuất 14a-g 16

Sơ đồ 3 Tổng hợp các dẫn xuất C10-oxa dime artemisinin 17

Sơ đồ 4: Tổng hợp deoxoartemisinin (18) 17

Sơ đồ 5: Tổng hợp dẫn xuất furan deoxoartemisinin (21) 18

Sơ đồ 6: Tổng hợp chất 26 19

Sơ đồ 7: Tổng hợp các dẫn xuất Pyrrole Mannich 29, 30 20

Sơ đồ 8: Tổng hợp 32 20

Sơ đồ 9: Tổng hợp 34 từ 32 21

Sơ đồ 10: Tổng hợp 36 a-c 21

Sơ đồ 11: Tổng hợp chất lai artemisinin và primaquine hybrid 40 23

Sơ đồ 12: i) TMSCl, NaBr, toluene 0 °C, ii và iii) amine, Et3N, CH2Cl2, 0-20 °C, iii) CH2Cl2, N-methylmorpholine-N-oxide, MS, tetrapropylammonium perruthenate 24

Sơ đồ 13 Tổng hợp các dime phosphate 44a, 44b 25

Sơ đồ 14: Tổng hợp các dẫn xuất của 11-azaartemisin (53a-c) 26

Sơ đồ 15: Tổng hợp các chất trung gian 58a-i, 59a-i; 40

Sơ đồ 16: Tổng hợp các triazole sử dụng phản ứng Click 41

Sơ đồ 17 Tổng hợp chất 63 60

Sơ đồ 18: Tổng hợp các chất trung gian 65a-g 62

Sơ đồ 19 Tổng hợp các dimer artemisinin 66a-g 69

Sơ đồ 20 Tổng hợp các dẫn xuất artemisinin chứa nhóm hydroxamic axit 75

MỞ ĐẦU

Ung thư là căn bệnh có tỷ lệ tử vong lớn chỉ sau bệnh về tim mạch Mặc dù

có rất nhiều tiến bộ trong chẩn đoán và điều trị, ung thư vẫn là căn bệnh gây nên 8 triệu ca tử vong mỗi năm, con số này tương đương với khoảng 15% số ca tử vong trên toàn thế giới Tuy có nhiều phát triển trong các biện pháp trong điều trị ung thư như hóa trị, phẫu thuật và xạ trị Các phương pháp này vẫn tồn tại những hạn chế Theo dự báo của WHO, có khoảng 22 triệu người có thể phát triển ung thư hàng năm trong vòng hai thập kỷ tới và con số tử vong có thể lên 13 triệu ca mỗi năm

Vì vậy, việc nghiên cứu phát triển các thuốc trị hiệu quả, an toàn và chọn lọc luôn là đòi hỏi cấp bách

Artemisinin là một sesquiterpen lactone chiết xuất từ cây thanh hao hoa vàng

Artemisia annua L Artemisinin và một số dẫn xuất của nó như artemether, arteether

và artesunat đã được sử dụng trên lâm sàng điều trị sốt rét Bên cạnh tác dụng chống sốt rét, nhiều hoạt tính mới của artemisinin và dẫn xuất của nó đã được phát hiện, đặc biệt là tác dụng kháng ung thư dựa trên nguyên lý tương tự tác dụng chống sốt rét thông qua gốc tự do tạo ra từ tương tác của cầu peroxit của artemisinin và sắt trong nhân hem.Trong đó HDAC điều chỉnh sự biểu hiện và hoạt động của rất nhiều loại protein có liên quan đến cả giai đoạn đầu và giai đoạn phát triển ung thư.Sự biểu hiện bất thường của các HDAC được báo cáo có liên quan đến một số căn bệnh ung thư ở người Nhằm tìm kiếm các hợp chất mới có tác dụng kháng u, đề tài luận văn đặt vấn đề ““Tổng hợp và khảo sát hoạt tính gây độc tế bào của các dẫn xuất mới của Artemisinin”’’ nhằm giải quyết mục tiêu sau đây

1 Nghiên cứu tổng hợp các dãy hợp chất mới chứa khung artemisinin

2 Đánh giá hoạt tính kháng một số dòng tế bào ung thư của các chất tổng hợp được

CHƯƠNG 1 TỒNG QUAN 1.1 Giới thiệu về cây thanh hao hoa vàng và artemisinin

1.1.1 Vài nét về cây thanh hao hoa vàng

Cây thanh hao hoa vàng (Artemisia annua L.), Họ cúc (Asteraceae) là loài

thảo dược, sống hàng năm, mọc hoang thành từng đám ở vùng đồi ven suối, ven sông, ở những nước ôn đới và nhiệt đới như Trung Quốc, Mông Cổ, Iran, Châu Âu, Bắc và Nam Mỹ, một số nước Đông Nam Á Cây thanh hao hoa vàng là cây thân thảo, sống trong vòng 1 năm, cao từ 1-3m; lá mọc so le, phiến lá nhẵn, dọc gân chính và thân non có lông thưa, ngắn; cụm hoa là những đầu nhỏ, tụ lại ở ngọn thân

và cành; quả hình trứng, lá và hoa có mùi thơm đặc trưng, vị hơi đắng [1]

Hình 1: Cây thanh hao hoa vàng

Cây thanh hao hoa vàng được người Trung Quốc phát hiện một cách tình cờ từ rất lâu Trong cuộc khai quật khảo cổ ở miền Nam Trung Quốc, khi đào một ngôi

mộ cổ, đã phát hiện bản ghi đã mờ có tên “Ngũ thập nhị bệnh phương” về một công thức trà thảo dược từ năm 168 trước Công Nguyên Kể từ đó, người Trung Quốc đã dùng dịch chiết từ lá cây này để chữa bệnh sốt nóng Tuy nhiên, mãi đến năm 1972,

Tu Youyou, nhà khoa học Trung Quốc mới chiết được một loại tinh thể không màu

được xem là hoạt chất chính có tác dụng trị bệnh sốt rét từ lá khô của cây thanh hao

hoa vàng bằng dung môi n-hexan và gọi là qinghaosu (QHS) tên sau này là artemisinin Sau đó, Qinghaosu đã được phân lập từ các chồi của Artemisia annua

L ở dạng tinh khiết và cấu trúc của nó được xác định vào năm 1979 [2, 3] Vì vậy

bà đã được trao giải thưởng Nobel năm 2015 về sinh lý học và y học Năm 1992, ở Việt Nam nhiều cơ sở cũng chiết được artemisinin từ loài cây này Hiện nay, cây Thanh hao hoa vàng được trồng ở nhiều tỉnh phía Bắc và một số tỉnh phía Nam như Tiền Giang, Lâm Đồng, Long An để nhằm đáp ứng cho nhu cầu chiết xuất artemisinin

1.1.2 Vài nét về artemisinin

1.1.1.1 Cấu trúc và tính chất vật lý của artemisinin

Artemisinin (1) có tên IUPAC: (3R,5aS,6R,8aS,9R,12S,12aR)-Octahydro-3,6,9

trimethyl-3,12-epoxy-12H-pyrano[4,3-j]-1,2-benzodioxepin-10(3H)-one Khối lượng phân tử: 282,33g/mol ART là một lactone sesquiterpene chứa vòng lactone

và cầu endoperoxide Trong phân tử ART có năm nguyên tử oxi, trong đó hai oxi tạo thành cầu peroxide; hai oxi khác tham gia vào cấu trúc vòng lactone ART có 7 trung tâm bất đối Artemisinin ở trạng thái tinh thể hình kim, màu trắng, không mùi, vị hơi đắng, tan được trong CHCl3, EtOH, ete dầu hỏa và axeton; tan ít

trong n-hexane, benzene, toluene và hầu như không tan trong nước ART bị thủy

phân và phân hủy trong các dung môi phân cực ở nhiệt độ cao; dễ phân hủy trong môi trường axit, bazơ [2, 3]

1.1.1.2 Dược động học

Artemisinin có thể dùng uống hoặc đặt hậu môn Sau khi uống, artemisinin hấp thu nhanh, nồng độ đỉnh đạt được trong huyết tương trong vòng 1 giờ Sự hấp

thu qua trực tràng của hỗn dịch trong nước kém và thay đổi so với dùng uống hoặc tiêm bắp dung dịch dầu Sau khi đặt hậu môn, liều 10 mg/kg ở người, nồng độ trong máu của artemisinin là 8,6 nanogam/ml sau 30 phút và đạt tới nồng độ tối đa trong máu khoảng 110 nanogam/ml 6 giờ sau khi dùng thuốc Sau khi tiêm bắp, artemisinin hấp thu chậm hơn chút ít so với khi uống hoặc tiêm tĩnh mạch, thời gian bán thải là 3,85 – 5,38 giờ Nồng độ đỉnh trong huyết tương đạt được khoảng 2 giờ sau khi dùng Sau khi tiêm tĩnh mạch artemisinin cho chuột, một lượng đáng kể chất này được phát hiện trong não, chứng tỏ thuốc đi qua được hàng rào máu não Ðiều này có thể có liên quan đến tác dụng của artemisinin đối với sốt rét thể não

Artemisinin liên kết mạnh với protein huyết tương và với hồng cầu (hemoglobin) Sự liên kết với protein huyết tương ở người là 64% Thuốc phân bố rất rộng vào cơ thể với thể tích phân bố ở chuột cống trắng là 1,1 lít/kg Thực nghiệm cho thấy gan là nơi chuyển hóa chính của artemisinin

Artemisinin bị thủy phân nhanh trong cơ thể thành chất chuyển hóa còn hoạt tính là dihydroartemisinin Bốn chất chuyển hóa chính khi uống artemisinin là deoxyartemisinin, deoxydihydroartemisinin, dihydroxydihydroartemisinin và một chất được gọi là crystal-7 có thể phân lập được ở nước tiểu Các chất này đều không

có nhóm peroxid và đều không còn hoạt tính trên ký sinh trùng sốt rét 80% liều dùng được thải qua phân và nước tiểu trong vòng 24 giờ Sau khi tiêm tĩnh mạch cho chuột cống trắng và thỏ, thời gian bán thải trong huyết tương của artemisinin khoảng 30 phút, còn của dihydroartemisinin là 5-21 giờ Chỉ một lượng rất nhỏ artemisinin được thải nguyên dạng qua nước tiểu [4]

1.1.1.3 Phương pháp sản xuất artemisinin

Cho đến nay có nhiều phương pháp đã được phát triển và ứng vào việc chiết xuất artemisinin từ nguyên liệu lá thanh hao hoa vàng Có thể tóm tắt một số phương pháp như sau

1.1.1.4 Chiết bằng n-hexan

Phương pháp chiết xuất artemisinin bằng dung môi n-hexan là phương pháp

truyền thống được áp dụng tại Việt Nam cũng như các nước trên thế giới ngay từ khi phát hiện ra khả năng chữa bệnh của artemisinin Ở phương pháp này, lá thanh

hao hoa vàng được phơi khô, xay thô và cho vào nồi chiết Dung môi chiết n-hexan

với tỷ lệ dược liệu/dung môi là 1/5, chiết ở nhiệt độ 30 -50°C, thời gian chiết trong

3 giờ, thời gian chiết khoảng 3 giờ, dịch chiết lần 3 được sử dụng làm dung môi chiết lần 1 của mẻ khác Các dịch chiết được gộp lại, cô thu hồi dung môi rồi rút ra

để kết tinh ít nhất trong 24 giờ, artemisinin sẽ kết tinh lẫn với sáp Loại phần dung dịch bằng cách gạn, loại sáp bằng nhiệt độ và xăng công nghiệp nóng thu được artemisinin thô Artemisinin thô đã loại hết sáp được hòa tan trong etanol sôi, thêm than hoạt tính và đun sôi trong 20 phút với sinh hàn hồi lưu Lọc nóng loại than hoạt tính và để kết tinh ở nhiệt độ thường tối thiểu trong 24 giờ Vẩy ly tâm rửa tinh thể bằng cồn và sấy ở 80°C

1.1.1.5 Phương pháp chiết siêu âm

Năm 2017, Zhang và cộng sự đã dùng phương pháp chiết xuất bằng siêu âm

sử dụng dụng môi propylene glycol methyl ether (PGME) Đây là dung môi không gây ô nhiễm môi trường, được sử dụng rộng rãi trong tổng hợp dược phẩm và mỹ phẩm 1g bột khô cho bình 40ml chứa 20ml dung môi PGME và được tác động siêu

âm dưới một công suất nhất định trong một thời gian nhất định Cặn không hòa tan tách ra khỏi dung dịch bằng cách lọc bằng giấy lọc Nồng độ artemisinin trong dịch lọc được xác định định lượng bằng HPLC PGME trong dung dịch được loại bỏ trong chân không ở 60°C để thu được hỗn hợp giống như gel có chứa artemisinin, sáp, Sau đó metanol được thêm vào để hòa tan hỗn hợp gel đem kết tinh rồi lọc thu được artemisinin thô Phương pháp chiết xuất siêu âm mang lại hiệu suất cao trong thời gian ngắn với chi phí năng lượng thấp, điều này khiến nó trở thành một

kỹ thuật đầy hứa hẹn có thể được sử dụng trong công nghiệp [5]

1.1.1.6 Phương pháp chiết sử dụng CO 2 siêu tới hạn

Carbon dioxide là dung môi rẻ tiền, thân thiện với môi trường Độ hòa tan của

CO2 siêu tới hạn cao hơn một đến hai bậc so với các dung môi khác, cho phép chuyển khối nhanh chóng, dẫn đến tốc độ chiết xuất lớn hơn Vì vậy, từ những năm

1997, Marcel Kohler và cộng sự đã thử nghiệm sử dụng CO2 siêu tới hạn để chiết

artemisinin và axit artemisinic từ sáu mẫu thanh hao hoa vàng và so sánh với phương pháp thông thường Kết quả cho thấy chiết bằng CO2 siêu tới hạn cho hiệu suất cao hơn cả các phương pháp khác [6] Ở Việt Nam, khoảng gần mười năm sau, Phạm Thị Hiền và cộng sự cũng đã nghiên cứu sử dụng phương pháp chiết CO2 siêu

tới hạn để chiết xuất artemisinin Kết quả cho thấy rằng, nếu phương pháp chiết Soxhlet khoảng hơn 20 giờ thì chỉ cần thời gian 2 giờ, áp suất 200bar, nhiệt độ

50˚C, sử dụng đồng dung môi n-hexan thu được hiệu suất chiết artemisinin đạt trên

80% Mặc dù vậy phương pháp trên lại tồn tại một số nhược điểm như dòng CO2siêu tới hạn không có tính chọn lọc nên artemisinin sẽ bị lẫn nhiều tạp Thêm vào

đó, quy trình vận hành khó khăn, về mặt kinh tế tốn kém nhiều chi phí là một trong nhưng trở ngại của phương pháp này [7]

1.1.1.7 Phương pháp tổng hợp toàn phần

Kể từ khi artemisinin được phát hiện, rất nhiều công trình tổng hợp toàn phần artemisinin đã được báo cáo Dưới đây là công trình có tính minh họa cho tổng hợp toàn phần artemisinin (Sơ đồ 1)

Sơ đồ 1: Tổng hợp (+)-artemisinin

a) MVK (5 mol %), ethyl 3,4-dihydroxy-benzoate (20 mol %), 0–4 oC, 48 giờ,

70%; b) KOH (0.1N aq, 1.0 equiv), n-Bu4NOH (40% aq), Et2O: THF: 2O (3:1:3), hồi lưu, 8 giờ, 84%; c) CH3MgI, Et2O, 2 giờ, nhiệt độ phòng, 92%; d) SnCl4, benzene: Et2O (4:1), 0 oC, 65%; e) 9-BBN, 3 N NaOH, H2O2, 85% (f) Oxy hóa Swern, 94% (g) NaClO2, NaH2PO4, 0oC, 80% (h) CH3I, K2CO3, acetone, nhiệt độ

phòng 89%; (i) (i) O2, 30oC, 6 giờ, CH3CN, (ii) O2, Cu(OTf)2, CH3CN, 2 oC, (iii) TsOH, CH2Cl2, 4 giờ, nhiệt độ phòng, 25%

Quá trình tổng bắt đầu từ (R)-(+)-citronellal phản ứng với methyl vinyl keton

(MVK) có mặt xúc tác proline và ethyl-3,4- dihydroxybenzoate làm đồng xúc tác

thu được hợp chất 2 Thực hiện phản ứng Aldol nội phân tử của 2 trong môi trường KOH trong điều kiện hồi lưu cho 3 Sau đó 3 được cho tác dụng với methyl magnesium iodide thu được đồng phân 4 và 4a Hỗn hợp đồng phân thu được đem

phản ứng với SnCl4 trong benzene-diethyl ether (4:1) cho 5 Tiếp theo, hydro hóa olefin 5 sử dụng 9-BBN tạo thành 6 Hợp chất này thực hiện phản ứng oxi hóa Swern cho aldehyde 7 và sau đó thành axit 8 bằng cách sử dụng NaClO2 và NaH2PO4 Este hóa chất 8 với methyl iodua với sự có mặt của K2CO3 sau đó là phản

ứng đóng vòng cho (+)-artemisinin (1) [8]

1.2 Sinh tổng hợp artemisinin

Hình 2 Sinh tổng hợp artemisinin trong cây

Quá trình sinh sinh tổng hợp artemisinin trong cây Artemisia annua L được

tạo ra bởi quá trình quang hợp trong lục lạp thực vật được chuyển hóa acetyl-CoA

trong dịch bào Trước hết nhờ quá trình quang hóa, CO2 chuyển thành đường Dưới tác dụng của coenzym acetyl-CoA và enzym farnesyl diphosphate (FPP) Chất trung gian quan trọng được hình thành: artemisininic acid và dihydro artemisininic Cuối cùng dưới tác dụng của ánh sáng mặt trời, xúc tác cho sự chuyển hóa dihydro artemisininic thành artemisinin (Hình 2) [9]

1.3 Ung thư và hoạt tính kháng ung thư của artemisinin

1.3.1 Khái niệm ung thư

Ung thư được đặc trưng bởi sự phát triển không kiểm soát của các tế bào và thường có thể di căn từ nguồn gốc đến các vị trí xa của cơ thể [10] Sau các bệnh về

hệ tim mạch, ung thư vẫn là nguyên nhân phổ biến thứ hai gây tử vong ở Ví dụ theo số liệu thống kê Ireland hàng năm trung bình có gần chín ngàn ca tử vong từ năm 2011 đến năm 2012 [11] Hơn nữa, cứ 1 trong 3 nam giới và 1 trong 4 phụ nữ

ở Ireland sẽ phát triển một số hình thức ung thư xâm lấn trong cuộc đời của họ với ung thư phổi, vú và tuyến tiền liệt nhiều nhất các loại ung thư phổ biến được báo cáo [11] Do dân số già ngày càng tăng, người ta dự đoán rằng tổng số ca ung thư xâm lấn mới sẽ tăng 84% đối với nữ và 107% đối với nam trong giai đoạn 2010-

2040 [12] Ung thư ở châu Âu cũng đang gia tăng với hơn một phần tư triệu số ca tử vong do ung thư được ghi nhận vào năm 2013 [13] Hơn nữa, ung thư là nguyên nhân chính của tử vong trên toàn thế giới với khoảng 8,2 triệu ca tử vong do ung thư được báo cáo trong 2012, ảnh hưởng đến dân số ở tất cả các quốc gia và tất cả các khu vực [14]

Phẫu thuật, xạ trị và hóa trị thường được sử dụng kết hợp để điều trị khối u

ác tính để cải thiện kết quả của bệnh nhân [15-19] Loại bỏ khối u trong phẫu thuật vẫn là một trong những phương pháp điều trị ung thư hiệu quả nhất hiện nay [20] Tuy nhiên, phẫu thuật bị hạn chế do không thể tiếp cận một số loại khối u như khối

u não và những khối u đã di căn đến các cơ quan quan trọng Sự bóc tách khối u có thể được thực hiện, trong đó một số, nhưng không phải tất cả khối u được loại bỏ để ngăn ngừa thiệt hại đến các cơ quan quan trọng Bệnh bạch cầu hiện diện trong dòng máu và không hình thành khối u Do đó, loại ung thư này không thể được loại

bỏ bằng phẫu thuật [21] Hơn nữa, thường rất khó để loại bỏ tất cả các tế bào khối u dẫn đến ung thư tái phát [20] Ung thư di căn, nguyên nhân gây ra hầu hết các ca tử

vong do ung thư, không thể chữa khỏi chỉ bằng phẫu thuật vì chúng lây lan đến các

mô và cơ quan khác nhau [22-24] Xạ trị cũng được sử dụng trong điều trị ung thư

và liên quan đến việc phơi nhiễm tế bào ung thư đối với bức xạ ion hóa tạo ra các loại oxy phản ứng gây tổn thương DNA và quá trình apoptosis [25-28] Tuy nhiên, nồng độ oxy thấp thường hiện diện ở các khu vực trong khối u làm giảm hiệu quả của xạ trị [29] Ngoài ra, xạ trị có liên quan đến phát triển khối u thứ phát ở bệnh nhân ung thư não [30]

Hóa trị là việc sử dụng một hoặc nhiều loại thuốc chống ung thư để tiêu diệt

tế bào ung thư [31] Tiến bộ vượt bậc đã đạt được trong việc phát triển thuốc chống ung thư mới Các loại thuốc thường nhắm vào các cơ chế cụ thể được điều chỉnh trong tế bào ung thư bao gồm sao chép DNA, hình thành mạch, di căn, tín hiệu tăng sinh và khả năng chống lại sự chết của tế bào [32, 33] Ví dụ sự bất ổn định bộ gen

đã được nhắm mục tiêu bằng các chất ức chế poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) để ngăn chặn các tế bào ung thư bắt đầu sửa chữa sợi đơn DNA[34] Hơn nữa, hầu hết liệu pháp hóa học được sử dụng trong phòng khám nhắm mục tiêu sao chép DNA để nhắm đến mục tiêu sự phân chia của tế bào ung thư [35] Thuốc dẫn đến việc tạo ra các gốc hoạt tính (ROS), chẳng hạn như artemisinin (ART), được sử dụng để nhắm đến mục tiêu mức độ cao hơn của stress oxy hóa và hệ thống chống oxy hóa thường hiện diện trong tế bào ung thư 8586 Tầm quan trọng của ROS tạo

và phản ứng chống oxy hóa glutathione trong điều trị ung thư Hóa trị đã chứng minh [36] hiệu quả trong điều trị một số bệnh ung thư nhưng bị hạn chế bởi độc tính đối với tế bào không phải tế bào khối u Sự phân chia nhanh các tế bào không phải khối u như nang và lông, biểu mô dạ dày và các tế bào tạo máu khi hóa trị dễ dẫn đến rụng tóc, loét và thiếu máu [20] Do đó, vẫn còn một nhu cầu cấp thiết để tiếp tục phát triển các liệu pháp điều trị ung thư và nhắm đích để giảm thiểu ung thư giảm thiểu tác dụng phụ ở bệnh nhân ung thư

1.3.2 Artemisinin trong điều trị ung thư

ART lần đầu tiên được phát hiện có hoạt tính chống ung thư vào năm 1993 khi một số ART và dẫn xuất bao gồm artesunate đã được nghiên cứu trên tế bào khối u cổ trướng Ehrlich (dòng tế bào có nguồn gốc từ khối u tuyến vú trên mô hình chuột) Tất cả các hợp chất thể hiện hoạt tính trên dòng tế bào khối u với IC50 dao động từ 12,2 đến 29,8 μM [37] Tuy nhiên, giá trị IC50 trên tế bào khối u cao hơn rõ rệt khi so sánh với hoạt tính của ART trong điều trị bệnh sốt rét (1,3 μM) cho thấy

rằng liều ART cao hơn là cần thiết để có hoạt tính chống ung thư [37] Nghiên cứu đầy hứa hẹn này đã dẫn đến việc đánh giá ART và dẫn xuất của nó trong một số

dòng tế bào ung thư in vitro Artesunate và DHA là các dẫn xuất thường được khảo

sát nhiều nhất Artesunate đã được thử nghiệm với 55 loại dòng tế bào khối u khác nhau Kết quả rất đáng khích lệ với giá trị IC50 nhỏ hơn 20 μM trong hầu hết các dòng tế bào được thử nghiệm Bệnh bạch cầu và các tế bào ung thư ruột kết là nhạy cảm nhất với artesunate với giá trị IC50 trung bình tương ứng là 1,11 μM và 2,13

μM [38] Một số tế bào ung thư khác cũng nhạy cảm bao gồm ung thư hắc tố, tuyến tiền liệt, ung thư vú và ung thư buồng trứng Tác giả kết luận rằng hoạt tính của ART có thể so sánh với các tác nhân gây độc tế bào tiêu chuẩn khác đã được sử dụng lâm sàng trong điều trị một số loại tế bào ung thư bao gồm bệnh bạch cầu, vú

và ung thư tuyến tiền liệt [38] Artesunate cũng có hiệu quả trong một nhóm bệnh u nguyên bào thần kinh tế bào có IC50 từ 5 μM trở xuống trong gần như tất cả các dòng tế bào được thử nghiệm

DHA được chứng minh là có hiệu quả với tế bào bệnh bạch cầu MOLT-4 với tốc độ chết tế bào nhanh sau 8 giờ với 27,5% tế bào trải qua quá trình apoptosis

Các hợp chất nhóm ART (chủ yếu là artesunate và DHA) đã được thử nghiệm in

vivo sử dụng một số mô hình động vật về bệnh ung thư bao gồm bệnh bạch cầu

[39], sarcoma [40] và ung thư vú [41], tuyến tụy [42,43], gan [44,45] và ruột kết [46] Ví dụ, ART được phát hiện làm trì hoãn sự phát triển của 7,12-dimethylbenz [a] anthracene (DMBA) gây ung thư vú ở mô hình chuột tại một liều lượng khoảng

8 mg/kg/ngày trong 40 tuần [41] Một nghiên cứu khác báo cáo rằng artesunate ở liều 167mg/Kg/ngày làm giảm hiệu quả sự phát triển của khối u đến khoảng 30% nhóm đối chứng không được điều trị ở chuột sacoma [40] Ở chuột mang khối u xenograft BxPC-3 (ung thư tuyến tụy), DHA ức chế sự phát triển của khối u phụ thuộc vào liều lượng; DHA (50 mg/kg/ngày) dẫn đến giảm kích thước khối u xuống 27% so với việc kiểm soát khối u không được điều trị bằng DHA ở ngày thứ 18 [47] Trên bằng chứng của những nghiên cứu này, ART có thể làm chậm lại đáng kể

khối u phát triển in vivo ở liều tương đối cao (50-200 mg/kg/ngày) mà không có các tác dụng phụ đáng kể được báo cáo ở những liều lượng này Nghiên cứu in vivo này

cho thấy rằng các hợp chất ART có tiềm năng được sử dụng trong điều trị ung thư ở người Tuy nhiên, cần có thêm các thử nghiệm lâm sàng trước khi điều trị ART có thể phát triển xa hơn

Ngoài ra, ART đã được nghiên cứu trong một số ít các nghiên cứu lâm sàng cho đến nay trong điều trị một số loại ung thư bao gồm ung thư cổ tử cung [48], phổi [49] và ung thư da [50] Các nghiên cứu trường hợp đầu tiên liên quan đến việc điều trị bệnh nhân ung thư bằng ART và các hợp chất liên quan trên cơ sở tự nguyện, trong đó tiêu chuẩn hóa trị đã được chứng minh là không hiệu quả Một bệnh nhân có tế bào vảy thanh quản ung thư biểu mô được điều trị bằng cả hai liều uống (50 mg) và tiêm (60mg) artesunate hàng ngày Kích thước khối u đã giảm khoảng 70% sau 2 tháng điều trị với sự cải thiện được báo cáo về các triệu chứng của bệnh nhân [50] 2 bệnh nhân bị u ác tính màng bồ đào di căn tiến triển cũng được điều trị bằng artesunate kết hợp với hóa trị chuẩn [51] Sự kết hợp liệu pháp này cho thấy được dung nạp tốt mà không có thêm tác dụng phụ nào được báo cáo Phát triển khối u ổn định ở một trong những bệnh nhân sau khi điều trị bằng artesunate và dacarbazine; điều trị này cũng làm giảm di căn Bệnh nhân vẫn còn sống 47 tháng sau lần chẩn đoán đầu tiên là u ác tính màng bồ đào giai đoạn IV; thời gian sống sót trung bình đối với bệnh ung thư giai đoạn cuối này thường là từ 2-5 tháng [51]

Những nghiên cứu điển hình ban đầu này đã dẫn đến sự phát triển của các thử nghiệm lâm sàng được kiểm soát nhiều hơn Một thử nghiệm lâm sàng ở bệnh ung thư phổi không tế bào nhỏ tiến triển đã nghiên cứu sự kết hợp điều trị bằng artesunate [49] Vinorelbine và cisplatin được dùng có hoặc không có tiêm ART tĩnh mạch (120 mg) kết quả đã cải thiện đáng kể tỷ lệ kiểm soát bệnh của nhóm thử nghiệm (88,2%) khi so sánh với nhóm chứng (72,7%) Một lần nữa, artesunate dung nạp rất tốt ở tất cả các bệnh nhân Một nghiên cứu lâm sàng riêng biệt đã thử nghiệm artenimol, một este succinate của DHA, trong điều trị ung thư cổ tử cung Các triệu chứng của bệnh thuyên giảm trong vòng ba tuần sau khi điều trị bằng thuốc Artenimol (200 mg / ngày) ở tất cả người bệnh Thời gian sống sót tăng lên cũng được quan sát thấy [48] Thử nghiệm đối chứng ngẫu nhiên với giả dược được thực hiện trên 23 bệnh nhân ung thư biểu mô đại trực tràng Bệnh nhân được dùng artesunate uống (200 mg) hoặc giả dược Kết quả cho thấy sau 42 tháng, chỉ có một bệnh nhân được điều trị ART phát triển khối u mãn tính khi so sánh với sáu bệnh nhân được điều trị bằng giả dược [52]

1.3.3 Cơ chế tác dụng của artemisinin

Cơ chế chống ung thư của ART đã được nghiên cứu in vitro Cầu

endoperoxide của ART rất quan trọng với hoạt tính chống ung thư và hoạt tính chống sốt rét [53] Khi cầu endoperoxide bị loại bỏ khỏi DHA, kết quả là làm giảm 50-130 lần độc tính ở tế bào HL60 và tế bào bệnh bạch cầu Jurkat khi so sánh với DHA chứa endoperoxide [53] Nghiên cứu cho thấy sự bẻ gãy cầu endoperoxide tạo nên trung gian ROS, gây hư hỏng DNA và chết tế bào [54] Giả thuyết này đã được

hỗ trợ bởi nhiều nghiên cứu [55-57] Một nghiên gần đây cho thấy artesunate gây ra

sự ức chế tăng sinh, quá trình apoptosis và sự suy giảm glutathione trong các tế bào bệnh bạch cầu KG-1a ở người để đáp ứng lại sự sản sinh ra ROS [55] Quá trình apoptosis nội tại, qua trung gian ti thể, được cho là được kích hoạt để đáp ứng với các ROS [56] Ví dụ, điều trị bằng DHA được phát hiện là gây ra quá trình apoptosis ở tế bào ung thư biểu mô gan Sự khử phân cực của màng ty thể, giải phóng cytochrome C

và kích hoạt enzyme caspase đã được báo cáo [57]

Vai trò của sắt liên quan đến cơ chế tác dụng của artemisinin Sắt cần thiết cho hoạt tính của ART vẫn còn đang được tranh luận Hai cơ chế tác dụng đã được giả thuyết (Hình 2) [58]; (i) ART tích lũy trong endosome trước khi được kích hoạt bởi sắt không liên kết Điều này dẫn đến việc tạo ra của các ROS gây ra tổn thương lysosome, làm gián đoạn quá trình vận chuyển nội tiêu hóa và quá trình apoptosis qua trung gian ti thể; và (ii) một kiểu tác dụng thay thế bao gồm sự hoạt hóa của ART bởi nhân hem trong ty thể dẫn đến sản xuất của các gốc carbon tự do Các gốc này sau đó tạo thành các sản phẩm cộng có thể can thiệp vào chuỗi vận chuyển điện

tử bằng cách tương tác với các protein liên kết với hem Điều này dẫn đến việc tạo

ra ROS, giải phóng cytochrome C từ ti thể và quá trình chết qua trung gian caspase [56, 59]

1.3.4 Vai trò của sắt liên quan đến cơ chế kháng u của artemisinin

Hàm lượng hem và sắt rất quan trọng đối với hoạt tính chống ung thư của ART và dẫn xuất [60-62] Sự hoạt hóa cầu endoperoxide của ART được cho là được kích hoạt bởi hem nội bào dẫn đến sản sinh ra ROS, gây tổn thương DNA và apoptosis [59] Khi tế bào ung thư phát triển đã làm tăng sự tổng hợp hem và do đó tăng hàm lượng sắt nội bào để tạo điều kiện cho sự phát triển và tăng sinh nhanh chóng [63, 64] Transferrin (Tf) là một loại protein được tìm thấy trong huyết thanh người, hỗ trợ vận chuyển sắt trong tế bào [65] Biểu hiện của thụ thể Tf có thể cao

gấp 100 lần ở tế bào ung thư hơn tế bào không phải khối u [66] Hơn nữa, tình trạng thiếu oxy được cho là làm tăng cường biểu hiện transferrin thông qua sự gắn với yếu tố phiên mã HIF-1 [67]

Các dẫn xuất ART đã được chứng minh là có tác dụng gây độc có chọn lọc trong các tế bào ung thư do tăng hoạt tính sinh học qua trung gian sắt [68] Sự kích thích tổng hợp hem trong các tế bào khối u đã được chứng minh là làm tăng hoạt tính của ART [69] Hơn nữa, hiệu quả của ART đã được cải thiện khi bổ sung sắt hoặc Tf Một nghiên cứu đầu năm 1995 báo cáo rằng việc đồng điều trị DHA với Tf được phát hiện làm tăng hoạt tính trong tế bào bệnh bạch cầu molt-4 [70] Hơn nữa, phương pháp điều trị này được chứng minh là có tính chọn lọc đối với các tế bào ung thư và có hoạt tính mạnh 100 lần trên tế bào bệnh bạch cầu molt-4 hơn các tế bào lympho không phải khối u [70] Các tế bào được đồng xử lý với Tf được giả thuyết là tăng hoạt hóa peroxit dẫn đến tăng hoạt tính chống ung thư Tế bào ung thư thường chứa mức độ biểu hiện thụ thể Tf và Tf cao hơn để duy trì sự phát triển của tế bào [71, 72] Có thể giả thuyết rằng mức độ cao hơn của những protein, có liên quan đến việc hấp thu và vận chuyển sắt, có thể làm tăng nhạy cảm với ART

Ví dụ, các tế bào ung thư vú được đồng điều trị với DHA và Tf đã được chứng minh là có độc tính chọn lọc đối với các tế bào ung thư vú [60]

Tế bào ung thư tuyến tiền liệt cũng có số lượng thụ thể Tf thường cao hơn [73] Sản phẩm cộng liên hợp của ART-Tf gây ra quá trình apoptosis trong tế bào ung thư tuyến tiền liệt DU145 [66] Hơn nữa, hoạt tính của liên hợp ART-Tf giảm đáng kể khi các thụ thể Tf bị chặn bởi sự tương tác của RNA ngắn (siRNA) [66] Một nghiên cứu khác đã báo cáo độc tính chọn lọc của liên hợp DHA-Tf chống lại các tế bào bệnh bạch cầu khi so sánh đối chứng với trường hợp không có khối u [74] Để kết luận, sắt là trung tâm của hoạt tính chống ung thư của ART và có thể giải thích tại sao tính chọn lọc được quan sát thấy trong các tế bào ung thư, dẫn đến tiềm năng tuyệt vời để khai thác cơ chế do sắt trung gian để điều trị lâm sàng bệnh ung thư với ART bằng cách điều chỉnh tổng hợp hem và vận chuyển sắt trong các tế bào đích

Hình 3 Cơ chế tác dụng của ART

1.3.5 Artemisinin và sự kháng thuốc

Việc thiếu khả năng đề kháng với artesunate có triển vọng trong việc điều trị

các khối u kháng với hóa trị liệu Một nghiên cứu in vitro về artesunate trên một số

dòng tế bào đa kháng thuốc biểu hiện khác biệt gen-1 kháng đa thuốc (MDR-1), protein-1 kháng đa thuốc (MRP-1) và gen protein kháng ung thư vú (BCRP) cho thấy tất cả các dòng tế bào được thử nghiệm đều không có kháng chéo với artesunate [75] Một nghiên cứu riêng biệt đã so sánh mRNA cơ bản biểu hiện trong các tế bào khối u đáp ứng ứng với artesunate, arteether hoặc artemether [76] Kết quả phân tích mối tương quan của giá trị IC50 và sự biểu hiện mRNA của hơn 400 gen gợi ý rằng các gen liên quan đến tăng sinh tế bào có thể đóng một vai trò quan trọng trong cơ chế tác dụng kháng u của ART [76]

1.4 Một số dẫn xuất của artemisinin có hoạt tính kháng ung thư

1.4.1 Dẫn xuất acetal của artemisinin

Trong số rất nhiều các dẫn xuất của artemisinin đã được tổng hợp thông qua

chất trung gian dihydroartemisinin (10) đến nay, các dẫn xuất acetal là dẫn xuất

sớm nhất được tổng hợp và đánh giá hoạt tính sinh học Ba dẫn xuất nổi tiếng trong

số này đã trở thành thuốc trị sốt rét rất hiệu quả là artemether (11), arteether (12) và

artesunate (13) Ngoài tác dụng trị sốt rét hiệu quả cao hơn nhiều lần so với

artemisinin, các dẫn xuất này thể hiện các hoạt tính kháng nhiều dòng tế bào ung

thư in vitro và in vivo

Hình 4: Một số dẫn xuất ete và este của artemisinin

Năm 2006, nhóm của Chandan đã tổng hợp một loạt các dẫn xuất ether mới

14a-g của DHA (Sơ đồ 1.10) [77] qua phản ứng của dihydroartemisinin 10 với các

ancol tương ứng trong CH2Cl2 có mặt xúc tác axit Lewis BF3 Et2O ở nhiệt độ -10 o

C đến -5oC Sản phẩm thu được với hiệu suất 65-99% ở dạng hỗn hợp các đồng phân

α và β, với các đồng phân β là các sản phẩm chính Thử nghiệm hoạt tính sinh học cho thấy các dẫn xuất đồng phân α có hoạt tính mạnh hơn các đồng phân β Một vài trong số các hợp chất có hoạt tính gấp 2-4 lần β-arteether Các dẫn xuất mới này có tính thân dầu cao (log P=5.51-7.19) so với β-arteether (logP=3.84) Dẫn xuất α-

ether biphenyl 14e (logP=6.91) có hoạt tính mạnh nhất, với liều 12 mg/kg×4ngày

ngăn chặn 100% chuột bị nhiễm bệnh trong khi β-arteether ngăn chặn 100% và 20% chuột nhiễm bệnh phải dùng với liều 48 mg/kg×4ngày và 24 mg/kg×4ngày

Sơ đồ 2 Tổng hợp các dẫn xuất 14a-g

Posner và cộng sự [78] đã tiến hành tổng hợp các dẫn xuất acetal dime của

artemisinin và đánh giá hoạt tính kháng u Các chất dimer 15a-e trong đó hai phân

tử artemisinin được liên kết với nhau thông qua liên kết liên kết chuỗi polyethylen glycol, carbon hoặc liên kết disulfide Sử dụng hợp chất DHA là chất khởi đầu cho

quá trình tổng hợp Các dimer dihydroartemisinin polyethylen glycol 15a-c thể hiện hoạt tính mạnh hơn artemisinin Các β, β-dimer 15d và 15e còn có khả năng chống

đông máu Trong một nghiên cứu khác, Grellepois và cộng sự [79] đã tổng hợp các dẫn xuất C10 oxa dimer 17 thông qua phản ứng olefinic methathesis sử dụng hợp

chất 16 Hoạt tính ức chế tăng sinh in vitro trên 60 dòng tế bào ung thư ở người cho

thấy dimer 17 có hiệu quả trong ức chế tăng sinh các tế bào ung thư như ung thư

bạch cầu HL-60, ung thư phổi NCI-H226, ruột kết COLO 205, … [78, 79]

Sơ đồ 3 Tổng hợp các dẫn xuất C10-oxa dime artemisinin

1.4.2 Dẫn xuất non-acetal của artemisinin

Các dẫn xuất acetal của artemisinin có nhược điểm kém bền vững, dễ dàng bị

chuyển thành chất trung gian DHA (10) Để khắc phục sự kém bền này, các dẫn xuất non-acetal đã được nghiên cứu tổng hợp Deoxoartemisinin (18) là dẫn xuất

artemisinin non acetal đầu tiên được tổng hợp từ artemisinin [90] Phản ứng khử một bước của artemisinin với NaBH4 với sự hiện diện của BF3.Et2O trong THF cho

18 hiệu suất 71% Hợp chất này đã được thử nghiệm trên chủng ký sinh trùng sốt rét Indochina (W2) Kết quả cho thấy 18 mạnh hơn tám lần so với artemisinin và có

thời gian bán hủy trên 213 giờ trong môi trường axit

Sơ đồ 4: Tổng hợp deoxoartemisinin (18) Benzyldeoxoartemisinin (19) có giá trị IC50 nhỏ hơn 0,17 mg/mL với chủng W2 và mạnh hơn artemisinin bảy lần [81] và có thời gian bán hủy 285,6 giờ trong dung dịch axit (1mg / mL, 0,01 N HCl) với pH là 2 ở 37 °C Năm 2002, Lee và Oh

đã báo cáo tổng hợp của sản phẩm này với hiệu suất tổng là 32,5% bắt đầu từ

artemisinin (1) [82]

Hình 5 Benzyldeoxoartemisinin (19)

O'Dowd và cộng sự đã tổng hợp một loạt các dẫn xuất C10-non acetal

artemisinin chứa nhân furan 21 thể hiện hoạt tính mạnh nhất với chủng NF54 của P

falciparum [83] Tổng hợp các dẫn xuất bắt đầu từ artemisinin hoặc

dihydroartemisinin; hai epime thu được qua hợp chất trung gian 20 và cả hai đều có các hoạt tính chống sốt rét nhưng rất khác nhau Đồng phân 21b có hoạt tính

chống sốt rét in vitro cao hơn 35 lần đồng phân 21a và đồng phân 21b là chính sản

phẩm chính với hiệu suất 71%

Sơ đồ 5: Tổng hợp dẫn xuất furan deoxoartemisinin (21)

Dẫn xuất 26 là một dẫn xuất trong lớp riêng của nó với một liên kết anken liền kề với cacbon C-10 trong cấu trúc artemisinin Để điều chế, artemisinin (1)

được phản ứng với 2-lithiothiazole ở -65 °C sau đó được acyl hóa để thu được sản

phẩm cộng thiazole carbonyl (22) Chất này sau đó trong sự có mặt của TMSOTf chuyển thành trung gian 9,10 anken (23) với hiệu suất cao Anken thiazole này tiếp

theo được N-metyl hóa, khử và bị thủy phân thành thành anđehit không no ở C9-10

(24) (Sơ đồ 6) Các phản ứng tiếp theo với n-butyl lithium, tetrapropylamoni perruthenate và N-metylmorpholin N-oxit cho 26 với hiệu suất 48% từ 1 Hợp chất

26 có hoạt tính in vitro chống NF54 mạnh hơn hai lần artemisinin [83]

Sơ đồ 6: Tổng hợp chất 26

Pacorel và cộng sự đã đưa nhóm pyrrole Mannich vào vị trí C-10 của artemisinin (Sơ đồ 7) [84] Một trong những lý do chính cho điều này là để khám phá khả năng của các dẫn xuất này dưới dạng muối tan trong nước Dẫn xuất có hoạt tính mạnh nhất kháng lại chủng nhạy chloroquine K1 có chứa nhóm morpholin

(29) hoặc nhóm metyl (30) Các các giá trị logP được tính toán là 3,01 cho 29 và 3,33 cho 30 Một dẫn xuất phi acetal khác ở C-10 chứa nhóm morpholine có giá trị

logP là 3,05, và có hoạt tính gây độc tế bào tế bào và độc thần kinh được nhóm của nhóm của Haynes và cộng sự tổng hợp năm 2007 Nguyên nhân của độc tính vẫn chưa được xác định có hay không do logP hoặc nhóm chức morpholine

Sơ đồ 7: Tổng hợp các dẫn xuất Pyrrole Mannich 29, 30

Năm 1992, lần đầu tiên dẫn xuất 10β-allyldeoxoartemisinin (32) được báo

bởi nhóm Haynes [85] Bắt đầu từ DHA được cho phản ứng với benzoyl chloride

trong pyridin để cho hợp chất trung gian 10α-benzoyldihydroartemisinin (31) (Sơ

đồ 8) với hiệu suất gần như toàn lượng Hợp chất này sau đó được cho phản ứng với allyltrimethylsilane trong dung môi dichloroethane sử dụng xúc tác ZnCl2 ở O oC

cho 32 vợi hiệu suất 81% [86] Hợp chất 32 thể hiện hoạt tính in vitro kháng sốt rét

chủng W2 và D6 với IC50 tương ứng 0.59 và 1.06 nM

Sơ đồ 8: Tổng hợp 32

Một quan sát thú vị ở hai đồng phân 10-(2-hydroxy-1-naphthyl) deoxoartemisinin là hai đồng phân này có giá trị ED50 và ED90 rất khác nhau [87] Điều này dẫn đến việc tổng hợp các đồng phân α và β-deoxoartemisinin trong đó 3,

3-dimetyl-2-butanol (34) có hoạt tính mạnh nhất (Sơ đồ 9) [88] Nói chung, các

đồng phân β có hoạt tính mạnh hơn nhiều đồng phân α Điều này cũng đúng với các

đồng phân tổng hợp 18 Đồng phân β hoạt tính mạnh hơn ít nhất năm lần so với

đồng phân α Trong số năm đồng phân khác nhau được tổng hợp, ba đồng phân β hoạt tính mạnh hơn các đồng phân α chống lại cả chủng W2 và D6 Đối với hai

đồng phân còn lại, đồng phân β được phát hiện có hoạt tính mạnh hơn đối với chủng W2 và các đồng phân α hoạt tính mạnh hơn đối với chủng D6 [88]

Sơ đồ 9: Tổng hợp 34 từ 32

Trong một nỗ lực để tăng sinh khả dụng của các dẫn xuất, các dẫn xuất chứa

nhóm axit cacboxylic 36 a-c được tổ hợp vào cấu trúc deoxoartemisinin [89] Mặc

dù độ hòa tan của các hợp chất không được báo cáo, nhưng hoạt tính mạnh hơn hai mươi lăm lần với chủng W2, hai mươi lần mạnh hơn với chủng Ghana (RO-33) so

với artemisinin (1) Dẫn xuất artemisinin chứa nhóm aldehyt 33 (Sơ đồ 10) được khử thành rượu 35 bằng natri borohydrid trong metanol Chất này sau đó được phản

ứng với các anhydrit axit cacboxylic khác nhau với sự có mặt của pyridin và 4 –

dimetylaminopyridin cho 36 a-c (Sơ đồ 10)

Sơ đồ 10: Tổng hợp 36 a-c

Năm 2005, nhóm của Trần Khắc Vũ và cộng sự cũng đã báo cáo loạt các dẫn xuất 10-non acetal deoxoartemisinin chứa nhóm amino ở mạch nhánh nhằm tăng độ

hoạt tan trong nước nhờ khả năng tạo muối của amin và đánh giá hoạt tính kháng sốt rét với hai chủng W2 và Ghana (RO-33) Kết quả cho thấy dù hoạt tính không

mạnh bằng các dẫn xuất chứa nhóm cacboxylic 36a-c ở trên, nhưng dẫn xuất 37a, 37b vẫn mạnh hơn gần 10 lần so với artemisinin với hai chủng đã thử (Hình 6) [90]

Hình 6: Dẫn xuất 37a, 37b

Năm 2018, nhóm của Nguyễn Văn Tuyến và cộng sự cũng tổng hợp loạt các dẫn xuất 10-deoxoartemisinin chứa nhóm amino ở mạch nhánh và thử nghiệm tác

dụng gây độc tế bào ung thư KB và HepG-2 Kết quả cho thấy hai chất 38a và 38b

thể hiện hoạt tính gây độc mạnh hơn DHA (Hình 7) [91]

Hình 7: Dẫn xuất 38a và 38b

Các dẫn xuất non-actetal của artemisinin lai hóa với thuốc cũng thu hút được

sự quan tâm nghiên cứu Trong số các dẫn xuất lai hóa này, chất lai giữa giữa

artemisinin và primaquine 40 được lần đầu tiên tổng hợp vào năm 2011 (Sơ đồ 11) Chất 40 có giá trị IC50 thấp hơn một chút so với artemisinin (1) Đây có thể là một

hợp chất có hoạt tính tốt, nhưng sinh khả dụng và độ ổn định chuyển hóa thấp hơn

artemisinin Giá trị logP được tính toán cho chất 40 là 5,25 và cao hơn nhiều artemisinin (logP 2,90) Để tổng hợp, 10β- (2-carboxyetyl) deoxoartemisinin (39)

được phản ứng với primaquine trong sự có mặt của

O-(benzotriazol-1-yl)-N,N,N‘,N‘-tetramethyluronium tetrafluoroborate (TBTU) và TEA in DCM Hiệu

suất tổng là 23% [92,93]

Sơ đồ 11: Tổng hợp chất lai artemisinin và primaquine hybrid 40

Cũng theo hướng tổng hợp các chất lai hóa, Araújo sau này đã tổng hợp chất

41 và 42 chứa 4-amino-7-chloroquinoline trong cấu trúc (Hình 8) Điều này cho

phép tạo ra một thuốc lai hóa có thể tích tích lũy trong không bào có tính axit Cả hai dẫn xuất này đều có hoạt tính mạnh hơn artemisinin Chất 10β-(2-hydroxyetyl) -

deoxoartemisinin (35) bị oxy hóa thành anđehit tương ứng, sau đó andehit phản ứng với amin và tiếp theo bị khử bởi natri triacetoxyborohydrid để tạo ra 41 Để tổng hợp 42, cần phải oxy hóa 35 thành axit cacboxylic và sau đó chuyển nó thành clorua

axit bằng oxalyl clorua sau đó thực hiện phản ứng amid hóa [94]

Hình 8: Chất lai hóa artemisinin với 4-amino-7-chloroquinoline 41 và 42 Trong số các dẫn xuất non acetal, artemisone (43), dẫn xuất C-10

alkylamino-artemisinin là một hợp chất rất hấp dẫn vì nó không bị chuyển hóa về

dihydroartemisinin và không gây độc cho thần kinh [95, 96] Nó có giá trị logP là 2,49, thời gian bán hủy kéo dài hơn so với các dẫn xuất làm thuốc từ artemisinin có sẵn trên thị trường; hoạt tính kháng ký sinh trùng rất mạnh và bền vững Việc tổng

hợp bao gồm phản ứng halogen hóa dihydroartemisinin (10) với thiomorpholine

dioxide Ngoài ra, sau khi halogen hóa dihydroartemisinin, nó được phản ứng với

thiomorpholine được oxy hóa để cho artemisone (43) với hiệu suất tổng là 58%

Thời gian bán hủy của artemisone là 5 giờ và đạt nồng độ tối đa trong máu trong vòng 1,5 giờ, có thể so sánh với các dẫn xuất của artemisinin đang được sử dụng trên lâm sàng Artemisone mạnh hơn 10 lần artesunate (Hình 9) chống lại 12 chủng

P falciparum khác nhau và cũng mạnh hơn 4–10 lần so với artesunate trong các mô

hình động vật gặm nhấm Ngoài ra, artemisone có hiệu quả trong điều trị sốt rét thể não hơn artesunate [95, 96]

Sơ đồ 12: i) TMSCl, NaBr, toluene 0 °C, ii và iii) amine, Et 3 N, CH 2 Cl 2 , 0-20 °C, iii) CH 2 Cl 2, N-methylmorpholine-N-oxide, MS, tetrapropylammonium

perruthenate

1.5 Dẫn xuất dimer của artemisnin

Các dẫn xuất dimer artemisinin được quan tâm nghiên cứu cả về hoạt tính chống sốt rét và hoạt tính kháng ung thư do có sự tương đồng về cơ chế Năm 2004, nhóm nghiên cứu của M P O’Neill đã công bố hàng loạt các dẫn xuất dimer C-10

phi axetal được điều chế từ 10β-allyldeoxoartemisinin (32) qua phản ứng với oxone sau đó khử hóa cho 10β- (2-hydroxyetyl) deoxoartemisinin (35) Phản ứng của ancol này với các alkyl phosphorodichloridate cho 44a và 44b Tất cả các dimer

được điều chế thể hiện hoạt tính chống sốt rét rất mạnh với các chủng K1 và HB3

của Plasmodium falciparum Trong đó đáng chú ý là các dimer photphat 44a mạnh

hơn 50 lần artemisinin và 15 lần artemether Tuy nhiên, hầu như tất cả các chất dimer đều thể hiện hoạt tính chống ung thư kém ngoại trừ este trioxan photphat

dimer 44a và 44b thể hiện giá trị ức chế tăng sinh với các dòng tế bào ung thư GI50

ở mức nM và đều đều mạnh hơn thuốc doxorubicin Nghiên cứu này cho thấy tầm quan trọng của hai đơn vị trioxan đối với hoạt tính chống tăng sinh và vai trò quan trọng của cầu nối (linker) trong các dẫn xuất dime này [86]

Sơ đồ 13 Tổng hợp các dime phosphate 44a, 44b

Cũng theo hướng này, năm 2009 Jung và cộng sự đã báo báo việc tổng hợp các dẫn xuất dime và trime C-10 non acetal artemisinin và đánh giá hoạt tính kháng một số dòng tế bào ung thư (Hình 9) Kết quả cho thấy một số dẫn xuất thể hiện

hoạt tính in vitro rất tiềm năng với một số dòng tế bào đã thử [97]

Hình 9 Một số dimer và trime non acetal

1.6 Dẫn xuất 11-aza-artemisinin

Artemisinin và các dẫn xuất acetal bị hạn chế do bản chất không bền của cầu peroxide và đặc điểm dễ bị thủy phân của vòng lactone trong axit dịch vị Do đó việc thay thế vòng lactone bởi lactam là một cách làm tăng thêm sự bền vững Các dẫn chất 11-aza-artemisinin là một giải pháp hiệu quả, không làm giảm hoạt tính

chống sốt rét in vitro và in vivo [98] Nhiều dẫn chất 11-aza-artemisinin đã được

phát triển và có tác dụng chống kí sinh trùng sốt rét rất tốt Theo H Ziffer và cộng

sự, dẫn chất N-(2-acetaldehydro)-11- azzaartemisinin 26a có tác dụng chống kí sinh

trùng sốt rét mạnh hơn artemisinin 26 lần in vitro và 4 lần in vivo và tương đương hoạt tính của arteether in vivo [98] Theo nghiên cứu của M A Avery về tổng hợp

và thử tác dụng sinh học của các dẫn chất N-methyl- 11- azaartemisinin, cho thấy

chất 26b có tác dụng mạnh hơn 5 lần artemisinin trên chủng P falciparum [98]

Ở Việt Nam, Lê Nguyễn Thành và cộng sự đã tổng hợp 15 dẫn xuất của 11- azaartemisin dựa trên phản ứng đa cấu tử Ugi

Sơ đồ 14: Tổng hợp các dẫn xuất của 11-azaartemisin (53a-c)

Trong nghiên cứu này, tác giả sử dụng phản ứng Ugi để tổng hợp các azzaartemisinin chứa mạch amit thông qua phản ứng của chất trung gian carboxylic

11-52, paraformaldehyd, benzyl isocyanide và các amin khác nhau Kết quả thử

nghiệm hoạt tính kháng FcB1, một chủng P falciparum kháng cloroquin cho thấy

tất cả chúng đều thể hiện sự ức chế chủng sốt rét này ở nồng độ 100 ng/mL, trong

đó các hợp chất 50a, 50b và 50c có hoạt tính mạnh hơn cả artemether (IC50 = 19nM)

1.7 Histone deaceylase

1.7.1 Histon acetyltransferase (HAT)

Histon acetyltransferase (HAT) xúc tác chuyển nhóm acetyl coenzym A đến liên kết với nhóm amino của lysin ở phần liên kết N của histon Sự acetyl hóa histon làm tháo xoắn nhiễm sắc thể bằng cách trung hòa điện tích dương của phần đầu N của histon, điều này làm giảm ái lực của histon với phần điện tích âm trên ADN Vì vậy acetyl hóa histon làm nới lỏng cấu trúc nhiễm sắc thể và hoạt hóa gen [99]

1.7.2 Histon deacetylase (HDAC)

Histon deacetylase là một nhóm các enzym xúc tác quá trình loại bỏ nhóm acetyl từ ԑ- N acetyl lysin amino acid của histon HDAC có tác dụng đối lập với histon acetyltransferase (HAT)- enzym xúc tác chuyển nhóm acetyl từ acetyl conezym A đến ԑ-amino của lysin ở đầu N của histon [100] Cho đến nay người ta phát hiện có tất cả 18 histone deacetylases ở người và được chia thành 4 nhóm chính dựa vào sự tương đồng của nó với protentin nấm men [100] Nhóm I bao gồm HDAC1, HDAC 2, HDAC3, HDAC8 Nhóm này có sự tương đồng nấm men RPD3 Các HDAC này được xác định ở nhân tế bào và có thể deacetylate 4 histones quan trọng và điều chỉnh khả năng tiếp cận bộ gen để phiên mã [101] Nhóm I là các HDAC mạnh nhất, còn các lớp chất còn lại thường ưu tiên cho các vật chất nền khác Do đó HDAC nhóm I đóng vai trò quan trọng trong sự tồn tại và phát triển của tế bào

Nhóm II: được chia thành 2 nhóm nhỏ gồm IIa và IIb trong đó nhóm Iia gồm HDAC4, HDAC5, HDAC7, HDAC9; nhóm Iib bao gồm: HDAC6, HDAC10 Các HDAC nhóm IIa có sự tương đồng với HDA1 và HDAC6 và HDAC10 chứa 2 vị trí xúc tác Những HDAC này được tìm thấy ở giữa tế bào chất và nhân Mỗi một

HDAC lại có một vai trò cụ thể trong mô tế bào HDAC5 và HDAC9 điều hòa các khuyết điểm thuộc về tim Trong khi HDAC7 điều hòa thiếu sót trong duy trì mạch máu [10] HDAC6 là một histone deacetylase chính đóng vai trò trong sự sinh trưởng của tế bào chất Do đó HDAC6 trở thành mục tiêu nhận được nhiều sự quan tâm trong các nghiên cứu điều trị ung thư [100] Nhóm III: sirtuins (SIRT1, SIRT2, SIRT3, SIRT4, SIRT5, SIRT6 và SIRT7) Nhóm IV: HDAC 11 HDAC11 là hợp chất duy nhất thuộc nhóm IV và mới được phát hiện gần đây Nó có sự liên quan đến các HDAC nhóm I và nhóm II Tuy nhiên, HDAC 11 không được xếp vào 2 nhóm trên do sự tương đồng quá nhỏ [102] Gần đây, người ta đã phát hiện ra HDAC11 có hoạt tính deacetyl hóa lysine mạnh hơn các HDAC khác và khử SHMT2 do đó ảnh hưởng đến sự sụt giảm của thụ thể IFN [103]

1.7.3 Cấu trúc của enzyme HDAC và cơ chế phản ứng deacetyl hóa

Xác định cấu trúc của các HDAC và làm sáng tỏ cơ chế xúc tác của phản ứng deacetyl hóa là một trong những điều kiện cần thiết để hướng tới mục tiêu thiết kế các chất ức chế HDAC Trong đó HDAC8 là enzyme đầu tiên được xác định cấu trúc 3D nhờ vào sử dụng phương pháp kết tinh tạo tinh thể và chụp tia X [104] Theo các nghiên cứu đã được công bố HDAC có trung tâm xúc tác là ion Zn2+

và các enzyme túi hình ống Các ion Zn2+ này liên kết với phần đuôi histone bằng liên kết phối trí Các chất ức chế HDAC càng mạnh với phần Zn2+ thì tác dụng ức chế HDAC càng mạnh Còn cấu trúc của túi hình ống rất đa dạng và có thể thay đổi theo chiều dài các cơ chất khác nhau [104]

Hình 10: Cấu trúc tinh thể của HDAC8 kết hợp với suberoylanilide