Xây dựng các cấu trúc biểu hiện thụ thể kháng nguyên khảm hướng đích cd19 để điều trị lơ xê mi cấp dòng lympho và thử nghiệm hiệu quả in vitro

So với liệu pháp điều trị sử dụng kháng thể đơn dòng, ngoài tính hướng đích cao, liệu pháp CAR-T có ưu điểm vượt trội là cho phép điều trị hiệu quả ngay cả khi các liệu phá

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Xây dựng các cấu trúc biểu hiện thụ thể kháng nguyên khảm hướng đích CD19 để điều trị lơ xê mi cấp dòng lympho và thử

nghiệm hiệu quả in vitro

NGUYỄN THỊ PHƯƠNG THẢO

Thao.NTPCA190017@sis.hust.edu.vn

Ngành Công nghệ Sinh học

Giảng viên hướng dẫn: TS Lê Quang Hòa

Viện: Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực Phẩm

HÀ NỘI, 10/2021

Chữ ký của GVHD

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

BẢN XÁC NHẬN CHỈNH SỬA LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ và tên tác giả luận văn: Nguyễn Thị Phương Thảo

Đề tài luận văn: “Xây dựng các cấu trúc biểu hiện thụ thể kháng nguyên khảm

hướng đích CD19 để điều trị lơ xê mi cấp dòng lympho và thử nghiệm hiệu quả

STT Nội dung Hội đồng

yêu cầu chỉnh sửa Phản hồi của học viên

1

Phần viết tắt, nên

tách chữ viết tắt, chữ

tiếng Anh và dịch

tiếng Việt thành 3

cột (phần) cho đỡ rối

và đẹp mắt hơn

Đã chỉnh sửa phần viết tắt bao gồm tách chữ viết tắt, chữ Tiếng Anh và dịch Tiếng Việt thành 3 cột khác nhau trong danh mục viết tắt, trang xiii

2

Bảng 1.2 cần Việt

hóa, hoặc đưa vào

danh mục viết tắt

Thêm tài liệu tham

STT Nội dung Hội đồng

yêu cầu chỉnh sửa Phản hồi của học viên

3

Tổng quan về ALL

viết gọn lại hơn nữa,

Đã chỉnh sửa phần Tổng quan về ALL bao gồm:

- Loại bỏ phần phân loại chi tiết của ALL, chỉ nhắc đến tiêu chuẩn phân loại (tế bào, miễn dịch

và sinh học phân tử) trong Chương 1, mục 1.1.4, dòng thứ 3 từ dưới lên, trang 4

- Đã mô tả về liệu pháp điều trị nhắm đích trong Chương 1, mục 1.1.5, dòng thứ 3 từ dưới lên của trang 5 đến dòng thứ 7 từ trên xuống của trang

6

4

Tài liệu tham khảo

cần bổ sung tài liệu

tiếng Việt về số liệu

mắc ALL và xem lại

các sử dụng thông

tin trên website

- Đã bổ sung thông tin về số liệu mắc ALL của Viện Huyết học –Truyền máu TW và Bệnh viện Truyền máu Huyết học trong chương 1, mục 1.1.1, dòng thứ 19 – 23 từ trên xuống, trang 3

- Cách sử dụng thông tin trên website trong tài liệu tham khảo trong luận văn đúng với hướng dẫn thủ tục bảo vệ luận văn thạc sỹ (Áp dụng cho các học viên bảo vệ từ tháng 01/2020) do Phòng đào tạo thông báo quy định ngày 15/01/2020

+ Tài liệu tham khảo số 47 và 55, trong chương

3, mục 3.1, dòng thứ 7 từ trên xuống, trang 40

STT Nội dung Hội đồng

yêu cầu chỉnh sửa Phản hồi của học viên

+ Tài liệu tham khảo số 31 cho Hình 1.1, trong chương 1, mục 1.1.5, trang 7

+ Tài liệu tham khảo số 43 cho Hình 1.2, trong chương 1, mục 1.2.2, trang 10

+ Tài liệu tham khảo số 49 cho Hình 1.3, trong chương 1, mục 1.2.2, trang 11

+ Tài liệu tham khảo số 74 cho Hình 1.4, trong chương 1, mục 1.3.3, trang 17

Ngày 18 tháng 11 năm 2021

TS Lê Quang Hòa Nguyễn Thị Phương Thảo

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

PGS TS Tô Kim Anh

ĐỀ TÀI LUẬN VĂN

Đề tài: “Xây dựng các cấu trúc biểu hiện thụ thể kháng nguyên khảm hướng

đích CD19 để điều trị lơ xê mi cấp dòng lympho và thử nghiệm hiệu quả in vitro"

Giáo viên hướng dẫn

Ký và ghi rõ họ tên

LỜI CAM ĐOAN

Tôi là Nguyễn Thị Phương Thảo, học viên cao học khoá 2019A, mã số học viên: CA190017, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội, chuyên ngành Công nghệ Sinh học, xin cam đoan:

1 Đây là luận văn do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn của

TS Lê Quang Hòa

2 Công trình này không trùng lặp với bất kỳ nghiên cứu nào khác đã được công bố tại Việt Nam

3 Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác, trung thực và khách quan, đã được xác nhận và chấp thuận của cơ sở nơi nghiên cứu Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật về những cam kết này

Học viên Nguyễn Thị Phương Thảo

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, em xin bày tỏ sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc tới TS Lê Quang Hòa, người thầy đã hướng dẫn, động viên, giúp đỡ em trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn này

Em xin bày tỏ lời biết ơn chân thành đến ThS Trần Thanh Tùng, ThS Phạm Tiến Dũng cùng các em sinh viên đang học tập và nghiên cứu tại các phòng thí nghiệm 306-B1 đã giúp đỡ em trong quá trình thí nghiệm

Đặc biệt là em xin chân thành cảm ơn Bộ Khoa Học Công Nghệ đã cấp kinh

phí cho đề tài “Nghiên cứu ứng dụng liệu pháp tế bào CAR-T trong điều trị

bạch cầu nguyên bào lympho cấp”, mã số: KC10/16-20 để em có thể hoàn thành

được nghiên cứu này

Em xin bày tỏ lời biết ơn sâu sắc đến gia đình và những người thân đã luôn ủng hộ, động viên, tạo mọi điều kiện cho em trong suốt thời gian học tập

TÓM TẮT NỘI DUNG LUẬN VĂN

Bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho (ALL) là một trong những bệnh ung thư phổ biến nhất ở trẻ em trên thế giới So với liệu pháp điều trị sử dụng kháng thể đơn dòng, ngoài tính hướng đích cao, liệu pháp CAR-T có ưu điểm vượt trội là cho phép điều trị hiệu quả ngay cả khi các liệu pháp điều trị khác đã thất bại Liệu pháp CAR-T đã được cấp phép để điều trị ALL ở Mỹ từ năm 2017 Để hướng tới việc ứng dụng liệu pháp CAR-T trong điều trị ALL tại Việt Nam, nghiên cứu này

đã được tiến hành với các mục tiêu cụ thể sau: (i) Xây dựng các cấu trúc biểu hiện

thụ thể kháng nguyên khảm hướng đích CD19; (ii) Thử nghiệm hiệu quả in vitro

của khối tế bào CAR-T hướng đích CD19

Các kết quả nghiên cứu thu được trong luận văn này là đã xây dựng thành công cấu trúc CAR-T hướng đích CD19 thế hệ thứ hai (CD19RCD137/pSB) và thế hệ thứ

tư (CAR19-iCasp9-IL15/pSB); đã hoàn thiện được quy trình tạo khối tế bào

CAR-T như sau: sau khi được phân tách bằng phương pháp ly tâm tỷ trọng với Paque và được hoạt hóa bằng bi từ Dynabeads™ Human T-Activator CD3/CD28, 2x107 PBMC được chuyển nạp bằng hỗn hợp chứa 1 µg mRNA SB100X và 10 µg plasmid pSB trên hệ thống xung điện Amaxa 4D Nucleofector; các dòng tế bào CAR-T sau chuyển nạp được tăng sinh đặc hiệu với sự có mặt của tế bào trình diện kháng nguyên nhân tạo aAPC 1D2 đã được chiếu xạ (tỉ lệ CAR-T:aAPC là 1:2) và IL2 (50 U/mL) trong 28 ngày (7 ngày thay môi trường một lần) Kết quả cho các khối tế bào CAR-T đạt mức xấp xỉ 2,5-5×109 tế bào với hơn 99% biểu hiện CAR

Ficoll-Các kết quả thử nghiệm in vitro cho thấy khối tế bào CAR-T: (i) có khả năng diệt

các tế bào ung thư Daudi và aAPC 1D2 (CD19+) từ 70-80% ở tỷ lệ CD19+

:CAR-T cao nhất là 1:10; (ii) có khả năng sinh các cytokine tiền viêm khi đồng nuôi cấy với các dòng tế bào ung thư CD19+ (31 ng/mL đối với IL2, 210 ng/mL đối với IFN-γ và 64 ng/mL đối với TNF-α); (iii) có khả năng tăng sinh khi đồng nuôi cấy với tế bào Daudi và aAPC 1D2; (iv) AP20187 ở nồng độ 20 nM giúp diệt trên 97%

tế bào CAR-T thế hệ thứ tư, mở ra khả năng kiểm soát sự tăng sinh của tế bào CAR-T trong cơ thể người bệnh

HỌC VIÊN

Ký và ghi rõ họ tên

MỤC LỤC

MỤC LỤC vii

DANH MỤC HÌNH VẼ x

DANH MỤC BẢNG BIỂU xii

DANH MỤC VIẾT TẮT xiii

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho (ALL) 3

1.1.1 Tình hình mắc ALL trên thế giới và Việt Nam 3

1.1.2 Sinh lý bệnh ALL 3

1.1.3 Chẩn đoán ALL 4

1.1.4 Phân loại ALL 4

1.1.5 Điều trị ALL 5

1.2 Liệu pháp tế bào CAR-T trong điều trị ALL 8

1.2.1 Lịch sử hình thành và phát triển của liệu pháp tế bào CAR-T 8

1.2.2 Cấu trúc CAR-T 10

1.2.3 Các thế hệ tế bào CAR-T 11

1.3 Quy trình công nghệ sản xuất tế bào CAR-T trong điều trị ALL 14

1.3.1 Thu tế bào đơn nhân máu ngoại vi (PBMC) và làm giàu quần thể tế bào T 14

1.3.2 Kích hoạt tế bào T 14

1.3.3 Chuyển gen tạo tế bào CAR-T 15

1.3.4 Tăng sinh tế bào sau chuyển gen 18

1.4 Thử nghiệm lâm sàng sử dụng liệu pháp CAR-T cho bệnh nhân mắc bệnh ALL 21

1.5 Tính an toàn của liệu pháp tế bào CAR-T 23

1.6 Cách tiếp cận, tính mới, tính sáng tạo của đề tài 24

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.1 Vật liệu, hóa chất 26

2.1.1 Các dòng tế bào 26

2.1.2 Hóa chất 26

2.1.3 Oligonucleotide 27

2.1.4 Thiết bị 28

2.2 Phương pháp nghiên cứu 28

2.2.1 Phương pháp xây dựng các cấu trúc CAR-T hướng đích CD19 282.2.2 Phương pháp tạo khối tế bào CAR-T 352.2.3 Đánh giá khả năng tăng sinh của các khối tế bào CAR-T khi đồng nuôi cấy với các dòng tế bào ung thư CD19+ 372.2.4 Đánh giá khả năng diệt tế bào ung thư CD19+ của các khối tế bào CAR-T 382.2.5 Đánh giá khả năng sinh các cytokin của khối tế bào CAR-T khi đồng nuôi cấy với các dòng tế bào ung thư CD19+ 382.2.6 Đánh giá khả năng kiểm soát tế bào CAR-T bằng chất cảm ứng dimer hóa AP20187 392.2.7 Phương pháp xử lý số liệu 39

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 40 3.1 Xây dựng các cấu trúc CAR-T hướng đích CD19 để điều trị lơ xê mi cấp dòng lympho 40 3.1.1 Tổng hợp gen nhân tạo cấu trúc CD19RCD137 40 3.1.2 Tổng hợp gen nhân tạo cấu trúc iCasp9-IL15 41

3.1.3 Xây dựng vector biểu hiện cấu trúc CD19RCD137/pSB (CAR-T thế

hệ thứ hai) 433.1.4 Xây dựng vector biểu hiện cấu trúc CAR19-iCasp9-IL15/pSB (CAR-T thế hệ thứ tư) 44

3.2 Hoàn thiện quy trình tạo tế bào CAR-T 46

3.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của lượng PBMC đến hiệu quả biểu hiện CAR thế hệ thứ hai ở tế bào T 463.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của lượng plasmid đến số lượng tế bào T biểu hiện cấu trúc CAR thế hệ thứ hai 47

3.3 Tạo và đặc tính hóa các khối tế bào CAR-T hướng đích CD19 thế hệ thứ hai và thế hệ thứ tư 48

3.3.1 Đánh giá hiệu quả tạo khối tế bào T biểu hiện cấu trúc CAR thế hệ thứ hai và thế hệ thứ tư 483.3.2 Đánh giá khả năng tăng sinh và sự biểu hiện CAR của các khối tế bào CAR-T khi nuôi cấy với sự có mặt của tế bào trình diện kháng nguyên nhân tạo đã được chiếu xạ (aAPC) 51

3.4 Thử nghiệm hiệu quả diệt tế bào ung thư, khả năng sinh các cytokine và

khả năng tăng sinh trong in vitro của các khối tế bào CAR-T hướng đích CD19

53

3.4.1 Đánh giá khả năng diệt tế bào ung thư CD19+ của khối tế bào

CAR-T thế hệ thứ hai và thế hệ thứ tư 53

3.4.2 Đánh giá khả năng sinh các cytokine của tế bào CAR-T thế hệ thứ

hai khi đồng nuôi cấy với các dòng tế bào ung thư CD19+ 55

3.4.3 Đánh giá khả năng tăng sinh của các tế bào CAR-T thế hệ thứ hai và thế hệ thứ tư khi đồng nuôi cấy với các dòng tế bào ung thư CD19+ 57

3.4.4 Đánh giá khả năng kiểm soát tế bào CAR-T thế hệ thứ tư bằng chất cảm ứng dimer hóa AP20187 59

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN 61

4.1 Kết luận 61

4.2 Hướng phát triển của đồ án trong tương lai 61

PHỤ LỤC 62

1 Trình tự thiết kế của cấu trúc CD19RCD137 62

2 Trình tự thiết kế của cấu trúc PGK-IL15-P2A-iCasp9-T2A-Blas 62

3 Trình tự các oligonucleotide để tổng hợp gen cấu trúc CD19RCD137 67

4 Trình tự các oligonucleotide để tổng hợp gen cấu trúc PGK-IL15-P2A-iCasp9-T2A-Blas 69

5 Kết qủa giải trình cấu trúc CD19RCD137 73

6 Kết quả giải trình tự cấu trúc PGK-IL15-P2A-iCasp9-T2A-Blas 74

TÀI LIỆU THAM KHẢO 79

DANH MỤC HÌNH VẼ

Hình 1.1 Quy trình sản xuất tế bào CAR-T 7

Hình 1.2 Cấu trúc chung của thụ thể khảm trên tế bào lympho 10

Hình 1.3 Cấu trúc của bốn thế hệ tế bào CAR-T 11

Hình 1.4 Cơ chế hoạt động của hệ thống Sleeping Beauty 17

Hình 2.1 Sơ đồ cấu trúc của vector pSB 29

Hình 2.2 Chiến lược thiết kế và xây dựng các cấu trúc CAR-T hướng đích CD19 30

Hình 2.3 Sơ đồ nguyên tắc phương pháp tổng hợp gen gapless PCR 31

Hình 3.1 Kết quả điện di sản phẩm “full length” PCR tổng hợp gen nhân tạo cấu trúc CD19RCD137 41

Hình 3.2 Kết quả sàng lọc các khuẩn lạc mang plasmid pJet1.2-CD19RCD137 41 Hình 3.3 Kết quả điện di sản phẩm “full length” PCR tổng hợp gen nhân tạo cấu trúc iCasp9-IL15 42

Hình 3.4 Kết quả sàng lọc các khuẩn lạc mang plasmid pJet1.2-iCasp9-IL15 42

Hình 3.5 Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid pSB bằng NcoI và XbaI 43

Hình 3.6 Kết quả sàng lọc các khuẩn lạc mang plasmid CD19RCD137/pSB 44

Hình 3.7 Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid CD19RCD137/pSB bằng PmlI và EcoRI 45

Hình 3.8 Kết quả sàng lọc các khuẩn lạc mang plasmid CD19RCD137-iCasp9-IL15/pSB (CAR19-iCasp9-CD19RCD137-iCasp9-IL15/pSB) 45

Hình 3.9 Ảnh hưởng của lượng PBMC được sử dụng trong một lần chuyển nạp đến hiệu quả biểu hiện CAR ở tế bào T (n=3) 47

Hình 3.10 Tối ưu hóa lượng plasmid CD19RCD137/pSB cho một lần chuyển nạp (n=3) 48

Hình 3.11 Hiệu suất chuyển nạp vào PBMC khi sử dụng các cấu trúc plasmid CAR-T thế hệ thứ hai và thế hệ thứ tư (n=3) 49

Hình 3.12 Tỉ lệ tế bào CD3+ biểu hiện CAR sống sau chuyển nạp với các cấu trúc plasmid CAR-T thế hệ thứ hai và thế hệ thứ tư (n=3) 50

Hình 3.13 Số tế bào sống CD3+ khi tăng sinh với IL-2 (n=3) 50

Hình 3.14 Sự tăng sinh của tế bào CAR-T thế hệ thứ hai và thế hệ thứ tư theo thời gian (n=3) 51

Hình 3.15 Tỉ lệ tế bào biểu hiện thụ thể CAR sau 21 ngày tăng sinh (n=3) 52

Hình 3.16 Phân tích biểu hiện CAR trên bề mặt tế bào CD3+ thu nhận được sau 28 ngày tăng sinh trên các dòng tế bào CAR-T 53

Hình 3.17 Tỉ lệ tế bào K562 bị ly giải sau 6 giờ đồng nuôi cấy với PBMC hoặc các khối tế bào CAR-T thế hệ thứ hai và thế hệ thứ tư 54

Hình 3.18 Tỉ lệ tế bào Daudi bị ly giải sau 6 giờ đồng nuôi cấy với PBMC hoặc các khối tế bào CAR-T thế hệ thứ hai và thế hệ thứ tư 54

Hình 3.19 Tỉ lệ tế bào aAPC 1D2 bị ly giải sau 6 giờ đồng nuôi cấy với PBMC hoặc các khối tế bào CAR-T thế hệ thứ hai và thế hệ thứ tư 55Hình 3.20 Nồng độ IL-2 trong dịch nuôi cấy của tế bào CAR-T và PBMC với các dòng tế bào ung thư 56Hình 3.21 Nồng độ IFN-γ trong dịch nuôi cấy của tế bào CAR-T và PBMC với các dòng tế bào ung thư 56Hình 3.22 Nồng độ TNF-α trong dịch nuôi cấy của tế bào CAR-T và PBMC với các dòng tế bào ung thư 57Hình 3.23 Khả năng tăng sinh của tế bào CAR-T thế hệ thứ hai và thế hệ thứ tư khi đồng nuôi cấy với tế bào CD19+ 58Hình 3.24 Khả năng tăng sinh của tế bào CAR-T thế hệ thứ hai và thế hệ thứ tư khi không có sự hiện diện của tế bào CD19+ 59Hình 3.25 Ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứng AP20187 đến khả năng kiểm soát của tế bào CAR-T thế hệ thứ tư 60

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1 Phương pháp tăng sinh CAR-T 19

Bảng 1.2 Một số thử nghiệm lâm sàng sử dụng CD19R CAR-T điều trị ALL 22

Bảng 2.1 Trình tự các oligonucleotide để khuếch đại và sàng lọc các cấu trúc 27 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng overlap PCR 32

Bảng 2.3 Thành phần phản ứng full length PCR 32

Bảng 2.4 Thành phần phản ứng cắt sản phẩm PCR và vector 33

Bảng 2.5 Thành phần phản ứng nối sản phẩm PCR vào vector biểu hiện 33

Bảng 2.6 Thành phần phản ứng PCR sàng lọc gen mục tiêu 34

Bảng 2.7 Bảng chu trình nhiệt của phản ứng PCR sàng lọc 34

Bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho

ADCC Antibody-dependent cellular

cytotoxicity

Độc tế bào phụ thuộc kháng thể

CAR Chimeric antigen receptor Thụ thể kháng nguyên khảm CAR-T Chimeric antigen receptor T

Độc tế bào phụ thuộc bổ thể

CD4 Cluster of differentiation 4 Kháng nguyên bề mặt tế bào

lympho T CLL Chronic Lymphocytic

Leukemia

Bệnh bạch cầu mạn dòng lympho

CID Chemical inducer of

dimerization

Cảm ứng hóa học dimer hóa

DNA DeoxyriboNucleic Acid Phân tử DNA mang thông tin di

truyền FDA Food and Drug Aministration Cục quản lý dược và thực phẩm

Mỹ GMP Good Manufacturing

Phức hợp tương thích mô chính

MRD Minimal residual disease Tồn dư tối thiểu của bệnh

PCR Polymerase Chain reaction Phản ứng chuỗi polymerase

TSS Transcriptional start site Vị trí bắt đầu sao chép

WHO World Health Organization Tổ chức y tế thế giới

ĐẶT VẤN ĐỀ

Bệnh Lơ xê mi cấp dòng lympho (ALL) là một trong những bệnh ung thư phổ biến nhất trên thế giới, chiếm khoảng 75% tất cả các loại ung thư máu ở trẻ em ALL xuất hiện khi quá trình tạo tế bào máu trong tủy xương bị biến đổi, tạo ra các tế bào bạch cầu bất thường, ác tính Không giống các tế bào máu bình thường, các tế bào máu ác tính không chết đi mà có thể tăng sinh liên tục, lấn át các dòng tế bào máu bình thường khác, làm cho chúng không thực hiện được chức năng bình thường Theo thống kê trên thế giới, tỷ lệ mắc ALL hàng năm khoảng 1 đến 4 ca/ 100.000 dân tùy vào vùng địa lý trong đó tỷ lệ mắc mới của ALL gặp nhiều nhất

ở lứa tuổi từ 2-5 tuổi Tại Hoa Kỳ, tỷ lệ mắc ALL hàng năm khoảng 41 trường hợp trên 1 triệu người 0 tuổi đến 14 tuổi và khoảng 17 trường hợp trên 1 triệu người từ

15 đến 19 tuổi Trong năm 2021 tại Mỹ, ước tính có khoảng gần 6000 ca mắc mới và hơn 1500 người chết vì ALL Theo sự hiểu biết của chúng tôi, chưa có một nghiên cứu có hệ thống đánh giá tỷ lệ mắc ALL hàng năm tại Việt Nam Tuy nhiên, theo thống kê của Bệnh viện Nhi Trung Ương, hàng năm có 150-180 trẻ được chẩn đoán mắc bệnh bạch cầu cấp, trong đó 2/3 là ALL

Điều trị bệnh ALL là nhằm tiêu diệt các tế bào bạch cầu ác tính và phục hồi tuỷ xương trở lại bình thường Liệu pháp điều trị chủ yếu hiện được sử dụng cho ALL là hóa trị liệu, thường chia thành 3 giai đoạn: cảm ứng, củng cố và duy trì Hạn chế của các liệu pháp hóa trị liệu là hầu như không có khả năng chữa khỏi bệnh hoàn toàn mà chỉ hướng đến thuyên giảm toàn phần để có thể được điều trị tiếp bằng liệu pháp ghép tế bào gốc Cấy ghép tế bào gốc tạo máu từ tủy xương là quá trình thay thế tế bào gốc bất thường bằng những tế bào gốc khỏe mạnh của người hiến tặng Mặc dù, phương pháp này cũng cho thấy hiệu quả tốt trong điều trị nhưng có hạn chế là cần phải tìm được người hiến tặng có tế bào miễn dịch phù hợp với cơ thể của người bệnh Ngoài ra, liệu pháp sử dụng miễn dịch cũng đã được phát triển là sử dụng kháng thể đơn dòng trong điều trị ALL Kháng thể đơn dòng nhận biết các tế bào ung thư bằng cách liên kết đặc hiệu với các kháng nguyên trên bề mặt tế bào và sẽ tiêu diệt tế bào ung thư Hiệu quả điều trị của phương pháp sử dụng kháng thể đơn dòng trong điều trị ALL đã được khẳng định

Gần đây, một hướng tiếp cận khác đang được các nhà khoa học đề xuất là liệu pháp sử dụng tế bào T mang thụ thể khảm nhân tạo CAR (Chimeric antigen receptors) Nguyên tắc của liệu pháp CAR-T trong điều trị ung thư là nhằm tạo ra các tế bào T mang các thụ thể nhân tạo có khả năng nhận biết các kháng nguyên đặc hiệu trên bề mặt tế bào ung thư từ đó kích hoạt khả năng phân giải tế bào ung thư của tế bào T So với liệu pháp sử dụng kháng thể đơn dòng, liệu pháp CAR-T cũng có khả năng trị liệu trúng đích, nhưng vượt trội về tính hiệu quả Đối với ALL, liệu pháp CAR-T hiệu quả ngay cả trong các ca đã điều trị thất bại

Tại Việt Nam, cùng với các tiến bộ vượt bậc của chuyên ngành huyết học trong thời gian qua, các phác đồ hóa trị liệu bệnh ALL tại nước ta hiện đã bắt kịp với trình độ thế giới, với rất nhiều biến thể tùy thuộc vào các tiêu chí như tuổi bệnh nhân, di truyền, triệu chứng lâm sàng, miễn dịch Như đã nói ở trên, ghép tế bào gốc tạo máu hiện cũng được coi là liệu pháp hiệu quả để điều trị ALL Cho đến nay, rất nhiều cơ sở chuyên ngành huyết học tại nước ta đã làm chủ được kỹ thuật này, điển hình là Viện Huyết học – Truyền máu Trung ương Gần đây, Bệnh viện Truyền máu - Huyết học TP.HCM và Bệnh viện Trung Ương Quân đội 108 cũng

đã ứng dụng thành công kỹ thuật này để điều trị cho các bệnh nhân bạch cầu tủy cấp và mãn tính Tuy nhiên, cho đến nay, chưa có nhóm nghiên cứu, Bệnh viện nào tại Việt Nam ứng dụng liệu pháp tế bào CAR-T để điều trị ung thư nói chung và ALL nói riêng Điều này có thể do liệu pháp CAR-T là công nghệ mới, cần thiết phải làm chủ được nhiều bước công nghệ phức tạp như tạo cấu trúc biểu hiện CAR, sản xuất vector vi rút đạt chuẩn GMP

Để hướng tới việc ứng dụng liệu pháp CAR-T trong điều trị ALL tại Việt

Nam nghiên cứu “Xây dựng các cấu trúc biểu hiện thụ thể kháng nguyên khảm

hướng đích CD19 để điều trị lơ xê mi cấp dòng lympho và thử nghiệm hiệu

quả in vitro” đã được tiến hành với các các mục tiêu cụ thể sau:

1 Xây dựng cấu trúc biểu hiện thụ thể kháng nguyên khảm hướng đích CD19 nhằm tạo tế bào CAR-T để điều trị bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho;

2 Thử nghiệm hiệu quả in vitro của khối tế bào CAR-T hướng đích CD19

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho (ALL)

1.1.1 Tình hình mắc ALL trên thế giới và Việt Nam

Bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho (ALL) là một trong những bệnh ung thư phổ biến nhất trên thế giới, chiếm khoảng 75% tất cả các loại ung thư máu ở trẻ em [1, 2] ALL xuất hiện khi quá trình tạo tế bào máu trong tủy xương bị biến đổi, tạo ra các tế bào bạch cầu bất thường, ác tính Không giống các tế bào máu bình thường, các tế bào máu ác tính không chết đi mà có thể tăng sinh liên tục, lấn át các dòng

tế bào máu bình thường khác, làm cho chúng không thực hiện được chức năng bình thường Theo thống kê trên thế giới, tỷ lệ mắc ALL hàng năm khoảng 1 đến

4 ca/ 100.000 dân tùy vào vùng địa lý trong đó tỷ lệ mắc mới của ALL gặp nhiều nhất ở lứa tuổi từ 2-5 tuổi [3] Tại Hoa Kỳ, tỷ lệ mắc ALL hàng năm khoảng 41 trường hợp trên 1 triệu người 0 tuổi đến 14 tuổi và khoảng 17 trường hợp trên 1 triệu người từ 15 đến 19 tuổi [4] Trong năm 2021 tại Mỹ, ước tính có khoảng gần

6000 ca mắc mới và hơn 1500 người chết vì ALL [5]

Theo sự hiểu biết của chúng tôi, chưa có một nghiên cứu có hệ thống đánh giá tỷ lệ mắc ALL hàng năm tại Việt Nam Tuy nhiên, theo thống kê của Bệnh viện Nhi Trung Ương, hàng năm có 150-180 trẻ được chẩn đoán mắc bệnh bạch cầu cấp, trong đó 2/3 là ALL [6] Tại bệnh viện Truyền Máu Huyết Học, từ năm

2000 đến 2005 có 340 bệnh nhân người lớn được chẩn đoán mắc ALL [7] Theo

số liệu thống kê trong vòng 5 năm từ năm 2010 đến 2014 tại Viện Huyết học – Truyền máu Trung Ương, số bệnh nhân mắc ALL chiếm đến 46,5% các bệnh về máu [8]

1.1.2 Sinh lý bệnh ALL

Nguyên nhân bệnh lý của ALL liên quan đến sự gia tăng và biệt hóa bất thường của một tập hợp các dòng tế bào lympho Một số nghiên cứu trên trẻ em

đã chỉ ra rằng bệnh nhân mắc các hội chứng di truyền như Down, thiếu máu Fanconi, hội chứng Bloom và hội chứng suy nhược Nijmegen có nguy cơ cao mắc ALL [9-12] Một số nguyên nhân khác gây bệnh ALL bao gồm tiếp xúc với bức

xạ ion hóa, thuốc trừ sâu, một số dung môi hữu cơ hoặc nhiễm vi rút như vi rút Epstein-Barr [13-15] Đột biến nhiễm sắc thể (NST) liên quan đến việc chuyển

đoạn hoặc sắp xếp lại NST cũng là nguyên nhân phổ biến dẫn đến ALL Hầu hết các đột biến gen được tìm thấy ở người lớn mắc ALL cũng tương tự như ở trẻ em nhưng có khác nhau đáng kể về sự phân bố và về sinh bệnh học [15] Ở trẻ nhỏ,

85% có tồn tại đột biến tái cấu trúc ở gen MLL trong khi đột biến đa bội và chuyển

đoạn NST chiếm tỷ lệ nhỏ [16] Ngược lại, ở trẻ vị thành niên, đột biến đa bội lại

chiếm tỷ lệ khá lớn (25%) trong khi các đột biến trên gen MLL chỉ chiếm 5% Bên cạnh đó, có đến 25% các ca ở trẻ vị thành niên mang đột biến trên gen lai TEL-

AML1 [17]

Bệnh có thể gây ra nhiều dấu hiệu và triệu chứng khác nhau Song, hầu hết các biểu hiện lâm sàng của ALL là kết quả của sự thiếu hụt các tế bào máu bình thường, sự tích tụ của các tế bào lympho ác tính, chưa được biệt hóa ở tủy, máu ngoại vi và các vị trí ngoài tủy Triệu chứng ALL bao gồm: mệt mỏi, chóng mặt, khó thở, da nhợt nhạt ALL cũng thường có một số triệu chứng không đặc hiệu như giảm cân, sốt, đổ mồ hôi đêm [18, 19] Các triệu chứng lâm sàng bao gồm: (i) hội chứng thiếu máu; (ii) hội chứng xuất huyết; (iii) hội chứng nhiễm trùng; (iv) triệu chứng tắc mạch do tăng bạch cầu [20]

1.1.3 Chẩn đoán ALL

Chẩn đoán ALL có thể dựa vào triệu chứng lâm sàng điển hình của bệnh đã trình bày ở trên Ngoài ra, việc chẩn đoán được dựa vào xét nghiệm tuỷ đồ thấy tế bào blast > 20% tế bào có nhân trong tuỷ [18] Các đánh giá dựa trên hình thái học hoặc sử dụng kỹ thuật phân tích tế bào theo dòng chảy, xét nghiệm miễn dịch và xét nghiệm tế bào đều có giá trị trong công tác chẩn đoán và phân tầng nguy cơ của ALL

1.1.4 Phân loại ALL

Hiện nay ALL được phân thành nhiều nhóm, điển hình là ALL dòng lympho

B và ALL dòng lympho T, trong đó ALL dòng lympho B chiếm tới 75% các trường hợp [21, 22] Tổ chức Y tế thế giới (WHO) đã phân loại bệnh theo đặc điểm tế bào, miễn dịch và bất thường di truyền sinh học phân tử cũng như tiền sử điều trị [20, 23]

1.1.5 Điều trị ALL

Nguyên tắc điều trị dựa trên các tiêu chí: lâm sàng, miễn dịch, đặc điểm di truyền tế bào và sự đáp ứng với liệu pháp điều trị Các yếu tố tiên lượng của ALL bao gồm: tuổi, số lượng tế bào bạch cầu, các bất thường về di truyền, đáp ứng với điều trị, tình trạng của bệnh trong và sau quá trình điều trị [23]

Điều trị ALL là nhằm tiêu diệt các tế bào bạch cầu ác tính và phục hồi tuỷ xương trở lại bình thường Liệu pháp điều trị chủ yếu hiện được sử dụng cho ALL

là hóa trị liệu, thường chia thành 3 giai đoạn: cảm ứng, củng cố và duy trì Giai đoạn điều trị cảm ứng là nhằm đạt tới tình trạng thuyên giảm bệnh Các đợt điều trị tiếp theo có mục đích củng cố tình trạng của người bệnh hướng tới tiêu diệt hoàn toàn các tế bào ung thư Cuối cùng là giai đoạn điều trị duy trì Trong giai đoạn này, bệnh nhân được điều trị ngoại trú với liều thấp, kéo dài nhằm ngăn chặn

sự tái phát của bệnh Các loại thuốc được sử dụng phổ biến bao gồm: daunorubicin, L-asparaginase, 6-mercaptopurine, methotrexate, cyclophosphamide, prednisone, dexamethasone Trường hợp một số bệnh nhân mắc ALL tái phát hoặc ở dạng bệnh dai dẳng, liệu pháp điều trị sẽ thường là sử dụng các loại thuốc mới với liều lượng cao như cytarabine, clofarabine, vincristine, và/hoặc nelarabine Hạn chế của các liệu pháp hóa trị liệu là hầu như không có khả năng chữa khỏi bệnh hoàn toàn mà chỉ hướng đến thuyên giảm toàn phần để có thể được điều trị tiếp bằng liệu pháp ghép tế bào gốc Cấy ghép tế bào gốc tạo máu từ tủy xương là quá trình thay thế

tế bào gốc bất thường bằng những tế bào gốc khỏe mạnh của người hiến tặng Người bệnh sau khi thuyên giảm bệnh hoàn toàn có thể lựa chọn điều trị bằng phương pháp ghép tế bào gốc tạo máu dị thân (Allo-SCT) để khôi phục tủy xương Đối với các bệnh nhân có tiên lượng xấu hoặc các bệnh nhân bị tái phát bệnh/khó chữa, Allo-SCT từ lâu đã được coi là phương pháp điều trị tiêu chuẩn và là cơ hội tốt nhất để có đáp ứng lâu dài Điển hình là thử nghiệm LALA-94 đã cho thấy lợi ích của Allo-SCT so với phương pháp hóa trị liệu thông thường ở những bệnh nhân này [24] Tuy nhiên, hạn chế chủ yếu của phương pháp này là phải tìm được người hiến tặng có tế bào miễn dịch phù hợp với cơ thể của người bệnh

Liệu pháp nhắm trúng đích (Targeted therapy) là liệu pháp điều trị ung thư bằng cách sử dụng các thuốc làm hạn chế sự tăng trưởng và lan tràn của bệnh ung thư, thường được áp dụng trên những bệnh nhân ung thư giai đoạn muộn, tiến triển

và di căn xa mà các phương pháp điều trị tại chỗ như phẫu thuật, xạ trị không thể thực hiện được Liệu pháp này hoạt động bằng cách tấn công và ngăn chặn các gen hay protein chuyên biệt mà những gen và protein này được tìm thấy ở tế bào ung thư hoặc những tế bào có liên quan đến sự phát triển của khối u [25] Hai loại liệu pháp nhắm đích phổ biến nhất là thuốc phân tử nhỏ và kháng thể đơn dòng Trong

đó, việc sử dụng kháng thể đơn dòng trong điều trị ALL đã được chứng minh là cho hiệu quả điều trị cao [26] Kháng thể đơn dòng nhận biết các tế bào ung thư bằng cách liên kết đặc hiệu với các kháng nguyên trên bề mặt tế bào và sẽ tiêu diệt

tế bào ung thư thông qua các cơ chế tác động phụ thuộc vào vùng thụ thể Fc, bao gồm gây độc tế bào qua trung gian kháng thể (ADCC) và gây độc tế bào phụ thuộc

bổ thể (CDC) [27] Ví dụ điển hình của phương pháp điều trị này là Blinatumomab, một loại kháng thể đơn dòng đặc biệt bởi vì nó có thể gắn vào hai tác nhân đích cùng một lúc Một phần của blinatumomab sẽ gắn với thụ thể CD19, vốn tồn tại trên tất cả các dòng tế bào B (bao gồm cả các tế bào ung thư bạch cầu và ung thư hạch, nhưng lại không tồn tại trong tế bào gốc tạo máu) Một phần khác của blinatumomab gắn với CD3, vốn là thụ thể kích thích hoạt động của tế bào T Bằng cách liên kết với hai thụ thể này, blinatumomab sẽ giúp các tế bào T tiếp cận với các tế bào ung thư, qua đó thực hiện quá trình ly giải các tế bào ung thư [28] Một loại kháng thể đơn dòng khác cũng được dùng để điều trị ALL là Inotuzumab ozogamicin (Besponsa) Đây là kháng thể nhận biết thụ thể CD22 và được cộng hợp với calicheamicin, vốn là một chất gây độc tế bào [29] Các tế bào B (bao gồm

tế bào ung thư bạch cầu) thường mang thụ thể CD22 Do vậy, dựa vào liên kết đặc hiệu giữa phần kháng thể với thụ thể CD22 trên bề mặt tế bào B, calicheamicin sẽ gây độc tế bào ung thư Tuy nhiên, nhược điểm của liệu pháp này là người bệnh cần được truyền thuốc qua đường tĩnh mạch thường xuyên, gây bất tiện cho người bệnh và giá thành điều trị rất cao

Một hướng tiếp cận mới là liệu pháp sử dụng tế bào T mang thụ thể nhân tạo CAR (Chimeric antigen receptors) Nguyên tắc của liệu pháp CAR-T trong điều trị ung thư là nhằm tạo ra các tế bào T tự thân mang các thụ thể nhân tạo có khả năng nhận biết các kháng nguyên đặc hiệu trên bề mặt tế bào ung thư từ đó kích hoạt hoạt tính ly giải tế bào của tế bào T Liệu pháp CAR-T thường bao gồm các bước sau (Hình 1.1): (i) tách tế bào T từ máu ngoại vi, (ii) chuyển gen vào tế bào

T để biểu hiện các thụ thể khảm nhân tạo có khả năng nhận biết các kháng nguyên đặc trưng của tế bào ung thư; (iii) nuôi cấy tăng sinh tế bào CAR-T; (iv) kiểm tra chất lượng của khối tế bào CAR-T; (v) truyền các tế bào CAR-T ngược trở lại người bệnh [30]

Hình 1.1 Quy trình sản xuất tế bào CAR-T [31]

Hiện nay, liệu pháp CAR-T thành công nhất là các cấu trúc CAR nhận biết thụ thể CD19 Khi tổng hợp các kết quả của 11 thử nghiệm lâm sàng sử dụng liệu pháp CAR-T hướng đích CD19, Lorentzen và đồng tác giả đã thấy có đến 60/72 (83%) bệnh nhân ALL đã thuyên giảm hoàn toàn bệnh [32] So với liệu pháp sử dụng kháng thể đơn dòng, liệu pháp CAR-T cũng có khả năng trị liệu trúng đích, nhưng vượt trội về tính hiệu quả Đối với ALL, liệu pháp CAR-T hiệu quả ngay

cả trong các ca đã điều trị thất bại [33] Đặc biệt, tế bào CAR-T có thể tự tăng sinh

và tồn tại lâu dài trong cơ thể người bệnh để diệt các tế bào ung thư tái phát (nguyên nhân chính khiến trị liệu ung thư hiện nay thất bại) do vậy giúp giảm kinh phí điều trị

Tại Việt Nam, cùng với các tiến bộ vượt bậc của chuyên ngành huyết học trong thời gian qua, các phác đồ hóa trị liệu bệnh ALL tại nước ta hiện đã bắt kịp với trình độ thế giới, với rất nhiều biến thể tùy thuộc vào các tiêu chí như tuổi bệnh nhân, di truyền, triệu chứng lâm sàng, miễn dịch Như đã nói ở trên, ghép tế bào gốc tạo máu hiện cũng được coi là liệu pháp hiệu quả để điều trị ALL Cho đến

nay, rất nhiều cơ sở chuyên ngành huyết học tại nước ta đã làm chủ được kỹ thuật này Điển hình là Viện Huyết học – Truyền máu Trung ương đã bắt đầu triển khai

kỹ thuật này từ năm 2006 Tính đến tháng 9/2018, đã có tổng cộng 336 ca bệnh được thực hiện kỹ thuật này, trong đó có 25 ca được ghép từ nguồn máu dây rốn cộng đồng Hiện Viện Huyết học – Truyền máu Trung ương đã thiết lập được một Ngân hàng Tế bào gốc với trên 3000 mẫu tế bào gốc máu dây rốn cộng đồng, sẵn sàng cung cấp nguồn tế bào gốc để điều trị các bệnh máu ác tính như ALL Gần đây, Bệnh viện Truyền máu - Huyết học TP.HCM và Bệnh viện Trung Ương Quân đội 108 cũng đã ứng dụng thành công kỹ thuật này để điều trị cho các bệnh nhân bạch cầu tủy cấp và mãn tính

Tuy nhiên, cho đến nay, chưa có nhóm nghiên cứu, Bệnh viện nào tại Việt Nam ứng dụng liệu pháp tế bào CAR-T để điều trị ung thư nói chung và ALL nói riêng Điều này có thể do liệu pháp CAR-T là công nghệ mới, cần thiết phải làm chủ được nhiều bước công nghệ phức tạp như tạo cấu trúc biểu hiện CAR, sản xuất vector vi rút đạt chuẩn GMP

1.2 Liệu pháp tế bào CAR-T trong điều trị ALL

1.2.1 Lịch sử hình thành và phát triển của liệu pháp tế bào CAR-T

Lịch sử của tế bào CAR-T bắt đầu từ năm 1989 khi Eshhar và cộng sự lần đầu tiên tạo ra cấu trúc mã hóa thụ thể khảm của tế bào T (chimeric TCR gene) Cấu trúc di truyền này có thể được biểu hiện ở tế bào T của người và giúp tế bào

T nhận diện và phản ứng với các kháng nguyên đích với độ đặc hiệu cao, tương tự như phản ứng kháng nguyên-kháng thể Ngoài ra, phản ứng của các tế bào T chuyển gen này không bị hạn chế bởi sự nhận diện phân tử MHC [34] Năm 1993, nhằm kết hợp ưu điểm về tính đặc hiệu của kháng thể và hoạt động gây độc tế bào của tế bào T CD8+, nhóm nghiên cứu của Eshhar đã nối vùng biến thiên đơn chuỗi (single chain variable region hay scFv) của một phân tử kháng thể với vùng hằng định của thụ thể tế bào T (thường là chuỗi zeta của phức hợp TCR/CD3) [35] Tiếp theo các kết quả này, Eshhar và đồng tác giả đã tạo ra cấu trúc thụ thể khảm (chimeric receptor gene) đầu tiên ở tế bào T và đây chính là tế bào CAR-T thế hệ đầu tiên [36] Tuy nhiên, các tế bào CAR-T thế hệ đầu này chỉ cho hiệu quả điều trị hạn chế trong thử nghiệm lâm sàng do không thể gia tăng lượng tế bào CAR-T trong cơ thể [37] Do vậy, tế bào CAR-T thế hệ thứ hai đã được phát triển vào năm

1998, bằng cách gắn thêm một phân tử đồng kích thích (costimulatory signaling domain) của CD28 hoặc 4-1BB (CD137) vào giữa vùng scFv và chuỗi CD3ζ Việc

bổ sung thêm phân tử đồng kích thích này đã giúp kích hoạt tế bào T một cách bền vững, từ đó, tăng sự tiết cytokine và khuếch đại sự tăng sinh tế bào T khi tiếp xúc với kháng nguyên [38]

Năm 2003 đánh dấu sự khởi đầu của liệu pháp CAR-T nhắm đến thụ thể CD19 trên tế bào lympho B Nhóm nghiên cứu của Tiến sỹ Sadelain tại Trung tâm Nghiên cứu Ung thư Memorial Sloan-Kettering lần đầu tiên chỉ ra rằng tế bào CAR-T nhắm đích kháng nguyên CD19 có khả năng diệt tế bào B ác tính trên mô hình chuột SCID/Beige Ngoài ra, việc đồng cảm ứng bằng CD80 và IL-15 cũng giúp tăng sinh tế bào CAR-T và tăng khả năng diệt tế bào ung thư Vào năm 2009, quy trình công nghệ sản xuất tế bào CAR-T nhắm đích kháng nguyên CD19 lần đầu tiên được công bố; dựa vào đó, thử nghiệm lâm sàng Pha I đã được tiến hành trên các bệnh nhân mắc bạch cầu lympho mãn tính (CLL) và bạch cầu lympho cấp tính (ALL) [39] Kết quả của cuộc thử nghiệm lâm sàng này lần đầu được công bố vào năm 2013, chỉ ra sự thuyên giảm bệnh đáng kể ở những người bệnh tham gia, đặc biệt là trên những bệnh nhân trưởng thành mắc B-ALL Cụ thể, toàn bộ 5 bệnh nhân sau khi điều trị bằng liệu pháp CAR-T 19-28z đều đạt trạng thái MRD âm tính (minimal residual disease negative) Ngoài ra, sau khi được điều trị, không

còn phát hiện được đột biến tái tổ hợp ác tính trên gen IGH của các bệnh nhân [40]

Dựa vào những kết quả nghiên cứu trên, liệu pháp sử dụng tế bào CAR-T nhắm đích CD19 đã được Cục Quản lý Dược và Thực phẩm Mỹ (FDA) công nhận là một bước đột phá, mở đường cho nhiều nghiên cứu và tiến bộ trong lĩnh vực này [41] Đến năm 2017, FDA đã cấp phép cho liệu pháp CAR-T hướng đích CD19 để điều trị B-ALL ở người lớn và trẻ em [42]

Theo dữ liệu đăng ký trên CellTrials.org, hiện có 190 thử nghiệm lâm sàng dùng tế bào CAR-T đang được thực hiện tại Mỹ và 73% trong số đó nhắm tới điều trị ung thư máu; 27% nhắm tới các loại ung thư thể rắn Ngoài ra liệu pháp CAR-

T cũng đã được cấp phép thử nghiệm ở châu Âu như Anh (16 thử nghiệm), Bỉ (10 thử nghiệm), Đức (6 thử nghiệm) và Pháp (3 thử nghiệm) Ở châu Á, Trung Quốc đứng đầu với 357 thử nghiệm lâm sàng, Nhật bản (3 thử nghiệm) và Singapore (1 thử nghiệm)

1.2.2 Cấu trúc CAR-T

Thụ thể kháng nguyên khảm (CAR) là các cấu trúc thụ thể nhân tạo, được thiết kế để có cả chức năng liên kết đặc hiệu với kháng nguyên đích, từ đó truyền tín hiệu kích hoạt tế bào T Hiện nay, công nghệ CAR-T đã phát triển đến thế hệ thứ tư, tuy nhiên, tất cả các cấu trúc CAR-T đều bao gồm 3 mô-đun: mô-đun ngoại bào (ectodomain), mô-đun xuyên màng (transmembrane) và mô-đun nội bào (endodomain) (Hình 1.2)

Hình 1.2 Cấu trúc chung của thụ thể khảm trên tế bào lympho [43]

 Mô-đun ngoại bào:

Mô-đun ngoại bào của cấu trúc CAR-T gồm có tín hiệu peptit dẫn đường (signal peptide), vùng nhận diện kháng nguyên (scFv), và “vùng đệm” (spacer) [43] Tín hiệu peptit dẫn đường có nhiệm vụ dẫn protein CAR đi qua mạng lưới nội chất đến biểu hiện trên bề mặt tế bào [44] Vùng nhận diện kháng nguyên bắt nguồn từ vùng siêu biến của kháng thể đơn dòng dạng đơn chuỗi (scFv chuỗi nặng

VH liên kết với chuỗi nhẹ VL thông qua linker (GGGGS)n) Vùng đệm “spacer”

là vùng nối giữa scFv và vùng xuyên màng, thường có dạng “hinge-CH2–CH3 Fc” của kháng thể IgG1 [45]

 Mô-đun xuyên màng:

Vùng xuyên màng có cấu tạo bao gồm các chuỗi xoắn alpha, có nhiệm vụ giữ ổn định cho cấu trúc CAR Hiện nay, mô-đun xuyên màng của tế bào CAR-T thường được xây dựng dựa trên vùng xuyên màng của thụ thể CD3, CD4, CD8 và

CD28 Tuy nhiên, thiết kế dựa trên CD8 và CD28 được cho là ổn định và thường

được sử dụng nhất trong thiết kế tế bào CAR-T [46, 47]

 Mô-đun nội bào:

Mô-đun nội bào là nơi thực hiện chức năng hoạt hóa tế bào CAR-T Vùng này luôn có chuỗi zeta của thụ thể tế bào T (CD247/CD3z) đi kèm với motif ITAM (immunoreceptor tyrosine-based activation motif) [43, 48] Motif thường có dạng:

Y – XX – L/I – X(6-8) – Y – XX – L/I (Y: tyrosine, X: amino axit bất kì, L: leucine, I: isoleucine)

Sau khi mô-đun ngoại bào tương tác với kháng nguyên đích, vùng nội bào có nhiệm vụ truyền tín hiệu đến nhân tế bào nhằm kích hoạt hoạt động tế bào CAR-

T Ngoài ra, tế bào CAR-T cũng cần tín hiệu từ vùng đồng kích thích (costimulatory domain) để có thể thực hiện đầy đủ các chức năng Vùng đồng kích thích thường được sử dụng là CD28, CD134 (OX40) và CD137 (4-1BB)

1.2.3 Các thế hệ tế bào CAR-T

Công nghệ CAR-T hiện nay đã phát triển đến thế hệ thứ tư Sự khác biệt về mặt cấu trúc giữa các thế hệ CAR-T được trình bày tóm tắt trong Hình 1.3 dưới đây

Hình 1.3 Cấu trúc của bốn thế hệ tế bào CAR-T [49]

 Tế bào CAR-T thế hệ thứ nhất:

Tế bào CAR-T thế hệ thứ nhất có đặc điểm nổi bật là sử dụng chuỗi CD3 zeta hoặc FcεRIγ làm mô-đun nội bào Tuy nhiên, thiết kế này khiến tế bào CAR-T

không sản xuất đủ IL-2 cần thiết để duy trì hoạt động diệt tế bào ung thư Vì vậy, việc sử dụng tế bào CAR-T thế hệ thứ nhất trong điều trị thường yêu cầu bổ sung IL-2 [50] Hầu hết các nghiên cứu sử dụng CAR-T thế hệ đầu đều không đạt được kết quả như mong đợi

 Tế bào CAR-T thế hệ thứ hai:

Đặc trưng của thế hệ thứ hai là sử dụng tín hiệu kép cho việc hoạt hóa tế bào

Tín hiệu đầu được phát đi khi mô-đun ngoại bào tương tác với kháng nguyên đích Tín hiệu thứ hai được phát đi bởi một phân tử đồng kích thích CD28/B7/4-1BB giúp tăng sự tổng hợp IL-2 để kích hoạt tế bào CAR-T một cách hoàn toàn và tránh hiện tượng “apoptosis” (chết tế bào theo chương trình) Chính vì vậy, các thiết kế CAR-T thế hệ hai đã tích hợp một phân tử đồng kích thích như CD28, CD134 (OX40) hoặc CD137 (4-1BB) vào cấu trúc CD28 có vai trò rất quan trọng trong điều chỉnh sự tăng sinh và tồn tại của tế bào lympho T, đặc biệt là trong hình thành

tế bào memory và tế bào effector CD134 giúp duy trì sự tăng sinh và tăng sự tổng hợp IL-2 CD137 giúp duy trì tín hiệu đáp ứng của tế bào T, đóng vai trò quan trọng trong khả năng tồn tại của tế bào T nói chung và hình thành bộ nhớ cho tế bào T CD8+ [51, 52] Rất nhiều các nghiên cứu đã chỉ ra công hiệu của các cấu trúc dạng này, điển hình như các cấu trúc CAR-T scFvCD19-CD137-CD3ζ hoặc scFvCD19-CD28-CD3ζ cho điều trị tế bào B ác tính [53, 54] Hơn nữa, nghiên cứu trên mô hình chuột (được cấy ghép tế bào ung thư B-ALL) đã chỉ ra rằng CD137 hoạt động tốt hơn so với CD28 trong cấu trúc CAR Cụ thể, tế bào CAR-

T với cấu trúc scFvCD19-CD137-CD3ζ tồn tại ít nhất 180 ngày so với mức 150 ngày của cấu trúc scFvCD19-CD28-CD3ζ [47, 55]

 Tế bào CAR-T thế hệ thứ ba:

Tế bào CAR-T thế hệ thứ ba có đặc trưng là trong cấu trúc có sử dụng đồng thời nhiều vùng đồng kích thích Một số thiết kế điển hình như CD28-OX40-CD3ζ hoặc CD28-CD137-CD3ζ, với mục đích tăng cường hơn nữa khả năng sinh IL-2

và khả năng diệt tế bào ung thư Nhiều thử nghiệm lâm sàng sử dụng CAR-T thế

hệ thứ ba cho điều trị ung thư bạch cầu lympho B cấp tính hiện đang được tiến hành trên thế giới [56, 57] Tuy vậy, các nghiên cứu so sánh về hiệu quả điều trị giữa các cấu trúc CAR thế hệ thứ hai và thứ ba đưa ra các kết quả trái ngược nhau

Do đó, chưa thể kết luận liệu cấu trúc CAR-T thế hệ thứ ba có thực sự hiệu quả hơn so với thế hệ thứ hai hay không [55, 58]

 Tế bào CAR-T thế hệ thứ tư:

Tế bào CAR-T thế hệ tư được tạo nên từ nền tảng thế hệ thứ hai Về mặt kỹ thuật, CAR-T thế hệ thứ tư được tạo ra bằng cách chuyển hai cấu trúc di truyền vào tế bào T của bệnh nhân Một cấu trúc nhằm biểu hiện thụ thể nhân tạo (CAR)

và cấu trúc còn lại nhằm biểu hiện các cytokine để hoạt hóa tế bào CAR-T Một trong các cytokine thường dùng là IL-12 Khi được biểu hiện cảm ứng, IL-12 sẽ giúp tăng sự sinh tổng hợp IFN-γ, hoạt hóa tế bào NK (Natural Killer cells), đại thực bào (macrophage) để tham gia diệt tế bào ung thư Ngoài ra, IL-12 cũng giúp cải thiện hoạt động của các tế bào lympho T CD4+ và CD8+, giảm sự chết tế bào

T theo chương trình [59, 60] So với các cấu trúc CAR-T thế hệ thứ hai, thế hệ thứ

tư có tính phức tạp hơn do phải chuyển đồng thời hai cấu trúc vào tế bào T của bệnh nhân Ngoài ra, việc tăng sự biểu hiện của IL-12 cũng có thể gây ra một số hiệu ứng phụ “on-target, off-tumor”, gây độc cho phần mô khỏe mạnh của bệnh nhân [61] Ngoài IL-12, IL-15 cũng đã được sử dụng trong một số cấu trúc CAR-

T thế hệ thứ tư nhắm đích CD19 để điều trị B-ALL Chức năng miễn dịch kháng khối u của IL-15 chủ yếu là dựa vào duy trì cân bằng nội sinh tế bào T CD8+ và giúp tăng thời gian tồn tại trong cơ thể người bệnh [62] Khi sử dụng vector retrovirus để đồng biểu hiện cấu trúc CAR-T và IL-15 trong tế bào T của chuột, Lanitis và cộng sự [63] đã chỉ ra sự đồng biểu hiện IL-15 không những giúp tăng cường khả năng xâm nhập và kiềm chế phát triển khối u của CAR-T, mà còn nâng cao ảnh hưởng của IL-15 nội sinh đến sự phát triển của khối u Ngoài ra, việc đồng biểu hiện IL-15 còn cho phép giảm thời gian tăng sinh tế bào CAR-T từ 28 ngày xuống còn 2 ngày, mở ra cơ hội giảm chi phí sản xuất tế bào CAR-T [64] CAR-T đồng biểu hiện IL-15 cũng đã được chứng minh hiệu quả trong các thử nghiệm lâm sàng Feng và cộng sự đã thiết kế các tế bào CAR-T nhắm đích CD5 kết hợp với biểu hiện phức hợp IL-15/IL-15 Sushi (protein IL-15 liên kết với vùng sushi IL-15Rα của thụ thể IL-15) [65] Trong thử nghiệm lâm sàng pha I (NCT04594135), các tế bào CAR-T này đã được thử nghiệm về tính an toàn và hiệu quả ở một bệnh nhân mắc ung thư hạch bạch huyết đã di căn hệ thần kinh trung ương Trong thử nghiệm này, các triệu chứng chèn ép hệ thần kinh trung

ương đã giảm đáng kể sau 3 tuần điều trị với tế bào IL-15-CD5-CAR-T, và khối

mơ mềm giảm đáng kể sau 8 tuần điều trị Hiện nay, CAR-T đồng biểu hiện IL-15 cũng đang được đánh giá trong các thử nghiệm lâm sàng NCT03721068, NCT04377932 nhằm điều trị nhiều khối u rắn (ung thư gan, sarcoma, u nguyên bào sợi) Mục tiêu của các nghiên cứu này là xác định liều lượng an toàn tối đa của tế bào CAR-T và thời gian chúng tồn tại trong cơ thể

1.3 Quy trình cơng nghệ sản xuất tế bào CAR-T trong điều trị ALL

Một cách khái quát, quy trình sản xuất tế bào CAR-T bắt đầu bằng việc thu

tế bào đơn nhân máu ngoại vi (PBMC) từ người bệnh thơng qua “leukapheresis”

Từ quần thể tế bào ban đầu, các tế bào CD3+ cĩ thể được làm giàu ex vivo và được

chuyển gen nhằm biểu hiện cấu trúc CAR hướng đích kháng nguyên là thụ thể của

tế bào ung thư Các tế bào T sau đĩ được tăng sinh trong mơi trường nuơi cấy rồi được kiểm tra chất lượng trước khi được truyền lại vào cơ thể người bệnh

1.3.1 Thu tế bào đơn nhân máu ngoại vi (PBMC) và làm giàu quần thể tế bào

T

Cho đến nay, “leukapheresis” vẫn là phương pháp hiệu quả nhất để cĩ được lượng tế bào T ban đầu đủ lớn cho các giai đoạn tiếp theo Phương pháp này bao gồm lấy máu tồn phần từ người bệnh và ly tâm tỷ trọng nhằm phân tách các thành phần máu Sau đĩ, phân lớp tế bào PBMC (chứa lymphocyte và monocyte) được hút ra để sử dụng cho các bước tiếp theo Đây là cách tiếp cận phổ biến nhất hiện nay do đã được FDA cơng nhận

1.3.2 Kích hoạt tế bào T

Trong điều kiện tự nhiên, tế bào T “nạve” được kích thích tăng sinh và biệt hĩa nhờ các tế bào trình diện kháng nguyên (APCs), thơng qua tương tác của thụ thể tế bào T TCR và phân tử MHC và các phân tử đồng kích thích như CD28, CD137, và OX-40 nằm trên bề mặt tế APCs Dựa vào quá trình kích thích tế bào

T trong tự nhiên, các phương pháp kích hoạt và tăng sinh tế bào T trong cơng nghệ

tế bào CAR-T đã được phát triển [66] Phổ biến nhất cĩ thể kể đến (i) sử dụng kháng thể đơn dòng kết hợp với interleukin, (ii) bi từ gắn kháng thể kháng CD3/CD28 (kết hợp với interleukin), và (iii) tế bào trình diện kháng nguyên nhân tạo (aAPCs)

Trong sản xuất tế bào CAR-T, quần thể tế bào thu được sau “leukapheresis” thường được kích hoạt và tăng sinh bằng bi từ gắn anti-CD3/CD28 trước và sau khi tải nạp [67] Ngoài ra, các hạt bi từ có thể được dễ dàng loại bỏ khỏi môi trường nuôi cấy bằng nam châm [68]

1.3.3 Chuyển gen tạo tế bào CAR-T

Chuyển gen là bước tối quan trọng trong sản xuất tế bào CAR-T, quyết định hiệu quả của liệu pháp điều trị cũng như giá thành sản xuất Hiện nay, có rất nhiều phương pháp chuyển gen có thể được áp dụng vào tế bào T như tải nạp bằng vector

vi rút, transposons, hoặc sử dụng hạt nano, liposome, kỹ thuật xung điện (electroporation) Tuy nhiên, có hai loại phương pháp chính đã được thử nghiệm lâm sàng là tải nạp bằng vi rút và transposon-transposase kết hợp với kỹ thuật xung điện

 Tải nạp bằng vector vi rút

Tải nạp bằng vector vi rút hiện đang là phương pháp phổ biến để tạo tế bào CAR-T Các vector vi rút bao gồm retrovirus (lentivirus và γ-retrovirus) và adenovirus có khả năng lây nhiễm nhưng không còn khả năng nhân bản Quy trình sản xuất vector vi rút đạt chuẩn GMP rất phức tạp và phải được thực hiện trong môi trường vô trùng Để sản xuất một mẻ vector vi rút thường cần hai tuần Hầu hết thời gian trên được dành cho việc tạo đủ lượng tế bào vật chủ, có thể là HEK293T hoặc PG13 để phục vụ quá trình “đóng gói” vi rút Đầu tiên, các tế bào vật chủ được tăng sinh trên môi trường nuôi cấy thích hợp đến liều lượng nhất định trước khi được chuyển nạp với 4 plasmid bao gồm: (i) cấu trúc Gag/Pol mã hóa protein Gag và enzyme Pol của vi rút; (ii) cấu trúc mã hóa lớp vỏ glycoprotein dị nguyên đã được thiết kế nhằm loại bỏ khả năng nhân bản; (iii) cấu trúc mã hóa gen

rev trong trường hợp sử dụng lentivirus; (iv) cấu trúc mã hóa CAR và các trình tự

khác nhằm đảm bảo hiệu quả phiên mã ngược, đóng gói và tích hợp gen chuyển vào hệ gen vật chủ Khoảng 48 giờ sau tải nạp, các hạt vi rút chứa cấu trúc CAR bắt đầu được tạo ra Trong các ngày tiếp theo, vi rút có thể được thu hoạch theo

mẻ bằng cách thay mới môi trường nuôi cấy Sau đó, vector vi rút được tinh sạch

và làm giàu bằng các bước lọc, loại bỏ cặn tế bào và các tạp chất khác, lọc vô trùng

và bảo quản ở -80oC Trước khi sử dụng, các vector vi rút được kiểm tra chất lượng theo quy trình của FDA [69]

Ưu điểm của phương pháp tải nạp bằng vector vi rút là hiệu quả chuyển gen cao và sự tích hợp cấu trúc CAR vào hệ gen vật chủ một cách ổn định Hai đặc trưng của retrovirus khiến chúng đặc biệt thích hợp để làm vector chuyển gen là: (i) phần lớn hệ gen vi rút có thể được thay bằng một hoặc nhiều transgene mong muốn; (ii) khi chuyển nạp, bộ gen của vi rút được tích hợp vĩnh viễn vào hệ gen của tế bào vật chủ Vì những lí do này, một số γ-retrovirus đơn giản như “Moloney murine leukemia virus” (Mo-MLV) đã được ứng dụng thành công để phục vụ tải nạp gen Các lentivirus cũng thường được sử dụng và ngày càng được lựa chọn nhiều hơn so với γ-retrovirus, điển hình như các vector thiết kế dựa trên vi rút HIV Thông thường, tế bào T sẽ được hoạt hóa bằng bi từ gắn kháng thể kháng OKT3, CD28 (hoặc Dynabead CD3/CD28) trước khi cho ủ với vector chuyển gen Sau khi vi rút dung hợp với màng tế bào T, lõi vi rút mang cấu trúc CAR sẽ được chuyển vào tế bào chất, di chuyển dọc theo các vi ống đến nhân tế bào để thực hiện quá trình tích hợp với hệ gen vật chủ Phương pháp này cho phép tạo tế bào CAR-

T với hiệu suất lên đến 68% [70, 71]

Tuy nhiên, để đạt được những tiêu chí an toàn cao trong nghiên cứu lâm sàng, vector vi rút được sử dụng phải được chứng minh không có khả năng nhân bản, ít gây độc tế bào và ít gây phản ứng miễn dịch Vì thế, giá thành sản xuất của phương pháp này khá cao, tạo nên rào cản lớn trong việc sử dụng rộng rãi liệu pháp CAR, đặc biệt tại các quốc gia đang phát triển như Việt Nam

 Transposon-Transposase

Transposon là các yếu tố di truyền kép, bao gồm một plasmid mang cấu trúc CAR và một plasmid mang gen mã hóa transposase Một số hệ thống điển hình có thể kể đến như “Sleeping Beauty” (SB) và “piggyBac” thường sẽ được chuyển trực tiếp vào tế bào chủ bằng kỹ thuật xung điện nhằm tích hợp cấu trúc di truyền vào

hệ gen của tế bào vật chủ một cách ổn định [72, 73] Cơ chế của các phương pháp này (Hình 1.4) là enzyme transposase sẽ nhận biết và bám vào các vùng ITR (inverted termial repeats: trình tự lặp đầu cuối đảo ngược) tại hai đầu của cấu trúc cần chuyển, sau đó cắt và dán cấu trúc di truyền vào hệ gen tế bào chủ (hệ thống

“Sleeping Beauty” sẽ cắt và dán gen chuyển vào vùng trình tự giàu TA trong hệ gen vật chủ)

Hình 1.4 Cơ chế hoạt động của hệ thống Sleeping Beauty [74]

So với các vector vi rút truyền thống, transposon có ưu điểm cơ bản là giá thành sản xuất thấp hơn nhiều lần (do bản chất của các cấu trúc là các plasmid) và

có tính an toàn cao hơn So với hệ thống “piggyBac”, “Sleeping Beauty” có lợi thế hơn trong chuyển gen vào tế bào T do khả năng tích hợp ngẫu nhiên vào các vùng trình tự giàu TA trong hệ gen tế bào chủ; trong khi đó, công nghệ “piggyBac” thường tích hợp gen chuyển vào gần vùng điều hòa gen (regulatory region) như

“Transcriptional start site” (TSS) và các đảo CpG [75]

Bằng cách sử dụng các dạng SB transposase cải tiến như SB100X, các nghiên cứu đã cho thấy hiệu quả chuyển gen vào tế bào T là tương đương so với các vector

vi rút [76] Thông thường, quần thể PBMC sẽ được kích hoạt trước khi chuyển nạp bằng kỹ thuật xung điện với hỗn hợp hai plasmid (một plasmid mã hóa transposase

và một plasmid mã hóa cấu trúc CAR) hoặc một hỗn hợp bao gồm một plasmid

mã hóa cấu trúc CAR và một mRNA mã hóa SB transposase Lượng plamid mã hóa CAR thường sử dụng từ 10 đến 20 µg kết hợp cùng với 5 µg plasmid hoặc 1

µg mRNA mã hóa SB transposase [77, 78]

Việc chuyển nạp sử dụng mRNA có một số lợi thế so với cách sử dụng DNA hay vi rút, ví dụ như không cần phiên mã, khiến cho protein được biểu hiện nhanh chóng sau khi chuyển nạp Ngoài ra, RNA ở lại tế bào chất mà không vào nhân tế bào, khiến cho hiệu suất biểu hiện được cải thiện và biểu hiện gen không lâu dài

Trong quy trình tạo tế bào CAR-T bằng công nghệ Sleeping Beauty, enzyme

transposase có thể được biểu hiện trong tế bào thông qua chuyển nạp mRNA thay

vì sử dụng DNA plasmid Qua đó, transposase chỉ được biểu hiện trong thời gian ngắn, tránh hiện tượng biến đổi DNA chủ thể không đặc hiệu và loại bỏ hoàn toàn nguy cơ hòa nhập thể gen

Trong năm 2017, Monjezi và đồng tác giả đã công bố kết quả nghiên cứu sử dụng công nghệ “Sleeping Beauty” kết hợp với chuyển nạp mRNA mã hóa SB transposase để tạo CAR-T nhắm đích thụ thể CD19 [77] Kết quả giải trình tự trên

hệ thống Illumina của nghiên cứu cho thấy hầu hết các vị trí hòa nhập của transposon đều nằm ngoài các gen liên quan đến ung thư và biểu hiện mạnh Ngoài

ra, không phát hiện thấy DNA của SB transposase sau khi tăng sinh tế bào Khi thử nghiệm trên mô hình chuột, tế bào CAR-T được tạo bởi quy trình này cho phép loại bỏ hoàn toàn các tế bào ung thư Bên cạnh đó, hiệu quả chuyển gen bằng xung điện của các cấu trúc transposon dưới dạng minicircle và SB transposase dưới dạng mRNA là cao hơn nhiều lần so với khi sử dụng plasmid thông thường (49,8% so với mức 12,8% khi sử dụng các plasmid truyền thống)

1.3.4 Tăng sinh tế bào sau chuyển gen

Các tế bào T có khả năng tăng sinh mạnh là những tế bào ít bị biệt hóa hơn

Sự tăng sinh yêu cầu các tín hiệu kích hoạt và môi trường tăng trưởng thích hợp Sau khi tải nạp vi rút tạo tế bào CAR-T, tế bào thường được tăng sinh trong các chai T-flask, túi canh trường, hoặc các bioreactors Hiện nay, có nhiều lựa chọn khác nhau cho môi trường nuôi cấy CAR-T, bao gồm hệ môi trường RPMI-1640

bổ sung huyết thanh bò FBS truyền thống và các hệ môi trường mới sử dụng huyết thanh người AB hoặc không sử dụng huyết thanh Trong các thử nghiệm lâm sàng

tế bào CAR-T cho đến nay, sự tăng sinh thường được thực hiện với thể tích tăng dần, bắt đầu từ nuôi cấy tế bào sau chuyển nạp trong các đĩa nuôi cấy, sau đó cấy chuyển sang các chai nuôi cấy, và tăng thể tích cho nuôi trong các túi chuyên dụng hoặc các bioreactors Trong môi trường nuôi cấy, bi từ gắn anti-CD3/CD28 thường

được sử dụng phổ biến nhất cho tăng sinh lượng lớn CAR-T (được áp dụng đối với sản phẩm Kymriah và liso-cel) Sau tăng sinh, bi từ được loại bỏ bằng nam châm [79] Tuy nhiên, việc sử dụng bi từ có nhược điểm là giá thành đắt Tăng sinh sử dụng các tế bào trình diện kháng nguyên nhân tạo hiện đang được áp dụng trong thử nghiệm lâm sàng và được sử dụng cho cả cách tiếp cận tạo CAR-T bằng tải nạp vi rút và transposon-transposase kết hợp xung điện Các tín hiệu kích thích dùng để tăng sinh tế bào T đã được tóm tắt trong Bảng 1.1

Bảng 1.1 Phương pháp tăng sinh tế bào CAR-T

OKT3 (anti-CD3 clone) Có thể sử dụng với kháng thể đồng kích thích kháng

CD28 hoặc kích hoạt các cytokine (ví dụ: IL-2)

Anti-CD3/CD28

Vùng kháng thể mục tiêu kích hoạt kích thích đến tế bào T

Kháng thể tương tác tế bào T đặc hiệu (BiTEs)

bỏ bằng lực từ của nam châm Hơn nữa, các hạt từ tính phủ kháng thể kháng CD3/CD28 có thể tạo ra các tế bào T ít biệt hóa hơn, có khả năng ít già hơn, khả

năng tăng sinh được nâng cao và phản ứng chống khối u in vivo sớm hơn so với

kích thích bằng OKT-3 và IL-2 liều cao [80, 81] Trong các thử nghiệm lâm sàng

gần đây, việc sản xuất Kymriah® ( Tisagenlecleucel; CTL019)[82, 83]và

Lisocabtagene maraleucel (liso-cel; JCAR017) được sử dụng các hạt từ tính phủ

kháng thể kháng CD3/CD28 [84], trong khi việc sản xuất Yescarta ® (

Axicabtagene Ciloleucel; KTE-019) sử dụng kháng thể kháng CD3 với IL-2 [78]

Một sản phẩm nanomatrix ( T Cell TransAct ™) kết hợp với CD3 và CD28 tái tổ hợp và môi trường không chứa huyết thanh (TexMACS ™) được sử dụng để kích hoạt tế bào trong quá trình sản xuất tế bào CAR-T [85] Chiến lược kích hoạt này hỗ trợ sự tăng sinh của các tế bào T CD4+ với tỷ lệ CD4: CD8 trung bình là 2:

1 và cũng dẫn đến hoạt động phân giải tế bào thấp hơn khi so sánh với sự kích hoạt với chất kháng CD3/CD28 [85]

Tương tự, sự tăng sinh của tế bào CAR-T bằng tế bào trình diện kháng nguyên (APC) hoặc tế bào trình diện kháng nguyên nhân tạo (aAPC) cũng tạo ra

một lượng lớn các tế bào T có khả năng nhân rộng in vivo sau đó [86] Từ đó, tế

bào K562 đã được biến đổi gen trong nhiều nghiên cứu khác nhau để đồng biểu hiện các phân tử kích thích và kháng nguyên khối u [85] Khi được chiếu xạ, tế bào K562 này có thể được sử dụng để tăng sinh số lượng lớn các tế bào CAR-T

Ưu điểm của sử dụng dòng tế bào K562 là không có sự biểu hiện của các phân tử HLA-A hoặc HLA-B và có thể sản xuất tuân thủ theo quy trình thực hành sản xuất tốt (GMP) có sẵn [85]

Nhóm nghiên cứu của TS Cooper tại Đại học Texas, Mỹ đã công bố kết quả thử nghiệm pha I của tế bào CAR-T được chế tạo bằng công nghệ “Sleeping Beauty” [87] Cấu trúc CAR được sử dụng trong nghiên cứu này là CD19RCD28 được chèn vào plasmid “Sleeping Beauty” để chuyển nạp vào 2108 tế bào PBMC bằng thiết bị Nucleofector II cùng với plasmid mã hóa cho SB transposase Các tế bào T sau chuyển nạp được nuôi cấy trong môi trường được bổ sung IL-2, IL-21 với sự có mặt của tế bào trình diện kháng nguyên nhân tạo (artificial antigen presenting cell hay aAPC) là tế bào K562 biểu hiện đồng thời CD19, CD64, CD86 và CD137 Sau 28 ngày nuôi cấy, lượng tế bào T được tăng sinh khoảng hơn 2000 lần, trong đó 84% có biểu hiện cấu trúc CAR, hoàn toàn đáp ứng yêu cầu về liều sử dụng trong điều trị Giải trình tự bằng hệ thống Illumina (7,5 triệu trình tự thô) cho thấy 99,9% các vị trí hòa nhập của cấu trúc “Sleeping Beauty” là vào các vị trí dinucleotide TA và rải đều trên toàn bộ thể gen Hầu hết các vị trí chèn vào thể gen rơi vào vùng không mã hóa, do vậy nguy cơ gây đột biến phát sinh ung thư là rất thấp Khi kết hợp cùng với cấy ghép tế bào gốc tạo máu, sau 30 tháng theo dõi, 83% các bệnh nhân tự ghép đã thuyên giảm hoàn toàn Điều đặc biệt là toàn bộ các bệnh nhân tự ghép đều còn sống, cho thấy tính an toàn của liệu pháp tự ghép Tính

trung bình, tế bào CAR-T tồn tại trong các bệnh nhân tự ghép trong 201 ngày Bên cạnh đó, nhóm nghiên cứu của TS Cooper còn sử dụng công nghệ “Sleeping Beauty” để đồng biểu hiện IL-15 cùng với cấu trúc CAR CD19RCD28 [64] Kết quả nghiên cứu cho thấy sự đồng biểu hiện IL-15 giúp tế bào CAR-T có thể tồn tại lâu hơn với kiểu hình tương tự như các tế bào gốc memory Đặc biệt các thử nghiệm tiền lâm sàng trên chuột cho thấy các tế bào CAR-T CD19RCD28 đồng biểu hiện IL-15 có thể được sử dụng chỉ sau 2 ngày nuôi cấy (thay vì 28 ngày để đạt được liều lượng tế bào CAR-T thông thường) mà vẫn đạt được kết quả điều trị mong muốn Các kết quả khích lệ này cho thấy tính hiệu quả của công nghệ chuyển gen “Sleeping Beauty” cũng như các ưu việt của việc đồng biểu hiện IL-15 cùng với cấu trúc CAR-T

Trong nghiên cứu này, tế bào PBMC được kích hoạt với bi từ Dynalbeads CD3/CD28 trước khi xung điện nhằm tăng hiệu quả chuyển nạp Sau đó, toàn bộ

tế bào sau chuyển nạp được nuôi cùng với các tế bào trình diện kháng nguyên nhân tạo aAPC 1D2 được sản xuất từ đề tài “Tạo dòng tế bào K562 trình diện kháng nguyên nhân tạo cho liệu pháp miễn dịch CAR-T hướng đích CD19” Các tế bào aAPC 1D2 được thiết kế biểu hiện CD19 cùng các phân tử đồng kích thích CD86, CD64, CD137L, và IL-15 bám màng nhằm tăng sinh đặc hiệu tế bào CAR-T hướng đích CD19

1.4 Thử nghiệm lâm sàng sử dụng liệu pháp CAR-T cho bệnh nhân mắc bệnh ALL

Cho đến nay, hầu hết các thử nghiệm lâm sàng tế bào CAR-T điều trị ALL đều tập trung nhắm đích là thụ thể CD19 CD19 là kháng nguyên lý tưởng do nó được biểu hiện mạnh trên bề mặt tất cả các tế bào B nhưng lại không biểu hiện trong tế bào gốc tạo máu [88] Hơn nữa, việc các tế bào B khỏe mạnh bị tiêu diệt

do hiện tượng “on-target, off-tumor” có thể được xử lý bằng cách tiêm bổ sung kháng thể cho người bệnh Các kết quả thử nghiệm cho đến nay đều cho thấy hiệu quả của tế bào CAR-T hướng đích CD19 trong điều trị ALL Trong ba nghiên cứu sử dụng ba thiết kế khác nhau, tỉ lệ thuyên giảm hoàn toàn lên đến 70 – 90% ở cả người lớn và trẻ em, một vài bệnh nhân trong số này đã được xếp loại “nghiêm trọng và không thể chữa khỏi” trước khi tham gia thử nghiệm tế bào CAR-T [82,

88, 89] Một số kết quả thử nghiệm lâm sàng được trình bày trong Bảng 1.2 dưới đây

Bảng 1.2 Một số thử nghiệm lâm sàng sử dụng CD19R CAR-T điều trị ALL

Người tham gia

Thuyên giảm (người)

Kết luận

Tài liệu tham khảo

Các kết quả thử nghiệm lâm sàng tại các nhóm nghiên cứu khác nhau có sự tương đồng cao về mặt thuyên giảm bệnh, tuy nhiên, thời gian tồn tại của tế bào CAR-T trong người bệnh có sự khác nhau tùy vào các cấu trúc di truyền được sử dụng Trong thử nghiệm tại Trung tâm Nghiên cứu Ung thư “Memorial Sloan-Kettering”, cấu trúc CD19-CD28 tồn tại từ 1 đến 3 tháng trong người bệnh [88] Tương tự, cấu trúc scFvCD19-CD28-CD3ζ được sử dụng trong thử nghiệm tại Viện Nghiên cứu Ung thư Mỹ (National Cancer Institute, NCI) tồn tại trong khoảng 68 ngày và sự hồi phục của tế bào B được quan sát thấy sau đó [89] Gần đây, có 2 liệu pháp CD19R CAR-T điều trị ALL đã được FDA thông qua là Kymriah™ và Yescarta™ Kymriah™ được chỉ định cho bệnh nhân nhi và thanh niên nhiễm ung thư bạch cầu lympho B cấp tính Yescarta™ được chỉ định cho bệnh nhân trưởng thành nhiễm ung thư lymphoma tế bào B lớn (large B cell lymphoma) Tỷ lệ phản ứng của bệnh nhân với hai liệu pháp điều trị trên ở mức

cao: 83% bệnh nhân có dấu hiệu thuyên giảm chỉ với một lần tiêm Kymriah™ [93]; trong khi, tỷ lệ đáp ứng với liệu pháp Yescarta™ là 72%

1.5 Tính an toàn của liệu pháp tế bào CAR-T

Trong điều trị ALL bằng liệu pháp tế bào CAR-T, những vấn đề an toàn cần lưu ý là hiện tượng “on-target, off-tumor”, hội chứng bão cytokine và nguy cơ phát sinh các đột biến gây ung thư do sự chèn cấu trúc di truyền vào thể gen của tế bào

T Để giảm thiểu các tác dụng phụ này, cần tối ưu hóa các cấu trúc CAR, quy trình chuyển gen (ví dụ việc sử dụng transposon thay vì vector vi rút) và sử dụng các loại thuốc chống phản ứng viêm Một số phương pháp sau đây có thể được sử dụng nhằm giảm các tác dụng phụ của liệu pháp tế bào CAR-T:

- Chuyển đồng thời 2 cấu trúc CAR vào tế bào T, nhằm nhận biết 2 kháng nguyên khác nhau trên tế bào ung thư: một phân tử CAR cung cấp tín hiệu hoạt hóa (giống như thế hệ thứ nhất) và phân tử CAR còn lại sẽ cung cấp tín hiệu đồng kích thích Một ví dụ cho cách tiếp cận này là cấu trúc anti-CD19-CD3ζ (tín hiệu 1)/anti-PSMA-CD28-4-1BB (tín hiệu 2) [94] Tuy nhiên, hạn chế của phương pháp này là

có thể giảm hiệu quả điều trị;

- Cảm ứng biểu hiện CAR thông qua thụ thể NOTCH nhân tạo Nguyên tắc của phương pháp này là thụ thể NOTCH nhân tạo trên tế bào CAR-T khi tương tác với

1 kháng nguyên đặc hiệu trên tế bào ung thư sẽ cảm ứng sự biểu hiện của cấu trúc CAR Sau đó, phân tử CAR mới sinh sẽ tương tác với kháng nguyên đích và ly giải tế bào ung thư [95];

- Sử dụng chiến lược gen tự sát (suicide gene) trong thiết kế tế bào CAR-T nhằm kiểm soát sự tăng sinh của tế bào CAR-T trong cơ thể người bệnh, hạn chế hiện tượng “on-target, off-tumor” hay phát sinh các tế bào T ung thư [96] Gen sự sát được dùng phổ biến nhất là HSV-TK (herpes simplex virus thymidine kinase) Khi

bổ sung ganciclovir (GCV), HSV-TK cùng với các kinase của người sẽ thực hiện quá trình phosphoryl hóa GCV tạo GCV-triphosphate, vốn có khả năng kết thúc sớm quá trình kéo dài mạch DNA và gây chết tế bào theo chương trình Gần đây,

hệ thống iCasp9 (inducible caspase-9) đã được chứng minh tính hiệu quả trong thử nghiệm lâm sàng cấy ghép tế bào gốc tạo máu Khi bổ sung chất dimer hóa AP20187 (chemical inducer of dimerization, CID), hai tiểu phần caspase-9 sẽ được kết hợp lại thành một phân tử hoàn chỉnh, gây chết tế bào theo chương trình

Nghiên cứu của Hoyos và cộng sự cho thấy cấu trúc CD19 CAR/IL-15/iCasp-9

giúp tăng hiệu quả diệt tế bào ung thư in vivo và có thể gây chết tế bào CAR-T

theo chương trình khi có sự hiện diện của AP20187 [97] Ưu điểm lớn nhất của iCasp9 so với HSV-TK là thời gian tác động rất nhanh của AP20187 (tính bằng phút) Do vậy, các nghiên cứu hiện nay đều có xu hướng sử dụng iCasp9 thay cho HSV-TK

- Chuyển nạp mRNA cũng có thể cải thiện tính an toàn của liệu pháp tế bào

CAR-T, thông qua hạn chế thời gian biểu hiện phân tử CAR Tuy nhiên, hạn chế của biểu hiện CAR ở dạng mRNA là bệnh nhân sẽ phải truyền tế bào nhiều lần để đạt được hiệu quả điều trị Như đã đề cập, một ứng dụng khác của mRNA trong tăng tính an toàn của liệu pháp tế bào CAR-T là biểu hiện transposase ở dạng mRNA thay vì DNA plasmid Qua đó, loại bỏ nguy cơ hòa nhập thể gen

1.6 Cách tiếp cận, tính mới, tính sáng tạo của đề tài

Khi phân tích các công trình nghiên cứu và các thử nghiệm lâm sàng ứng dụng tế bào CAR-T để điều trị ALL, có thể nhận thấy là hầu hết đều sử dụng cấu trúc CAR-T hướng đích là thụ thể CD19 Các cấu trúc CAR-T cho hiệu quả điều trị ALL cao nhất trong các thử nghiệm lâm sàng đều thuộc thế hệ thứ hai sử dụng các phân tử đồng kích thích CD28 và CD137 trong đó CD137 cho phép tế bào CAR-T tồn tại lâu hơn trong cơ thể (đến 180 ngày trong tế bào chuột) Về các kỹ thuật chuyển cấu trúc di truyền CAR vào tế bào T, hiện có 2 cách tiếp cận chủ yếu là: (i) sử dụng vectơ vi rút và (ii) sử dụng công nghệ Sleeping beauty Ưu điểm chủ yếu của việc sử dụng vectơ vi rút là hiệu quả tải nạp rất cao Tuy nhiên, quy trình sản xuất vectơ vi rút đạt tiêu chuẩn GMP là rất phức tạp với giá thành cao; trong khi đó, công nghệ Sleeping beauty lại sử dụng các plasmid vốn có thể được

thu nhận dễ dàng từ E coli Để tăng tính an toàn của cách tiếp cận Sleeping beauty

tạo tế bào CAR-T, mRNA mã hóa SB transposase được sử dụng thay thế plasmid mang gen mã hóa SB transposase truyền thống Một cách tiếp cận khác là đồng biểu hiện IL-15 cùng với cấu trúc CAR-T cũng sẽ giúp tế bào CAR-T tăng sinh tốt và tồn tại lâu hơn trong cơ thể Để đảm bảo tính an toàn của liệu pháp CAR-T, cần

có một giải pháp để kiểm soát sự tăng sinh của tế bào CAR-T trong cơ thể Các cấu trúc iCasp9 hiện đang được ưa chuộng do khả năng tác động rất nhanh của