XÁC ĐỊNH OCHRATOXIN A TRONG THỨC ĂN CHĂN NUÔI BẰNG PHƯƠNG PHÁP LÀM SẠCH QUA CỘT MIỄN DỊCH ÁI LỰC VÀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO DETECTOR HUỲNH QUANG

T I Ê U C H U Ẩ N Q U Ố C G I A TCVN :2018 Dự thảo 2 Thức ăn chăn nuôi – Xác định Ochratoxin A trong thức ăn chăn nuôi bằng phương pháp làm sạch qua cột ái lực miễn dịch và sắc ký lo

TCVN T I Ê U C H U Ẩ N Q U Ố C G I A

Dự thảo 2 - TCVN:2018

Xuất bản lần 1

THỨC ĂN CHĂN NUÔI – XÁC ĐỊNH OCHRATOXIN A TRONG THỨC ĂN CHĂN NUÔI BẰNG PHƯƠNG PHÁP LÀM SẠCH QUA CỘT MIỄN DỊCH ÁI LỰC VÀ SẮC KÝ LỎNG

HIỆU NĂNG CAO DETECTOR HUỲNH QUANG

Animal feeding stuffs – Determination of Ochratoxin A in animal feed by immunoaffinity column clean-up and High Performance Liquid Chromatography with fluorescence

detection

HÀ NỘI – 2018

Lời nói đầu

TCVN :2018 được xây dựng dựa theo EN 16007;

TCVN :2018 do Viện Chăn nuôi biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông

thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố

T I Ê U C H U Ẩ N Q U Ố C G I A TCVN :2018

Dự thảo 2

Thức ăn chăn nuôi – Xác định Ochratoxin A trong thức ăn chăn nuôi bằng phương pháp làm sạch qua cột ái lực miễn dịch và sắc ký lỏng hiệu năng cao detector huỳnh quang

Animal feeding stuffs - Determination of Ochratoxin A in animal feed by immunoaffinity column clean-up and High Performance Liquid Chromatography with fluorescence detection

1 Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định Ochratoxin A (OTA) trong thức ăn chăn nuôi có thành phần cơ bản là ngũ cốc, sử dụng phương pháp làm sạch trên cột ái lực miễn dịch và sắc ký lỏng hiệu năng cao detector huỳnh quang

CHÚ THÍCH: nồng độ khối lượng OTA đã thẩm định trong khoảng 39 µg/kg to 338 µg/kg

2 Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì

áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có)

ISO 1042, Dụng cụ thủy tinh phòng thí nghiệm - Bình định mức một vạch (ISO 1042: 1998)

TCVN 4851:1989 (ISO 3696:1987), Nước dùng để phân tích trong phòng thí nghiệm – Yêu cầu kỹ

thuật và phương pháp thử.

3 Nguyên tắc

Chiết OTA ra khỏi mẫu thử bằng hỗn hợp metanol - dung dịch nước natri bicarbonate 3 % Dịch chiết được lọc, pha loãng với PBS và và làm sạch bằng cách sử dụng cột sắc ký ái lực miễn dịch (IAC) Tách rửa OTA ra khỏi cột IAC đầu tiên bằng metanol và sau đó bằng nước nước, dịch tách rửa được thêm nước đến đủ thể tích đã định và tiến hành lượng định bằng phương pháp HPLC với detector huỳnh quang

4 Thuốc thử

Trong quá trình phân tích, trừ khi có quy định khác, chỉ sử dụng các thuốc thử loại phân tích Các dung môi phải có chất lượng HPLC hoặc chất lượng tốt hơn

4.1 Metanol, CH 3 OH, loại kỹ thuật

4.2 Metanol, CH 3 OH, loại HPLC

4.3 Nước, nước (loại 1 trong TCVN (ISO 3696) và nước (loại 3 trong TCVN ISO 3696) hoặc tương đương

4.4 Kali clorua, KCI.

4.5 Natri clorua, NaCl.

4.6 Dinatri hydrogenphosphate dodecahydrate, Na2HPO4.12 H2O

4.7 Acetonitrile, CH3CN, loại HPLC

4.8 Axit acetic đậm đặc (băng), CH3COOH, tối thiểu 96 %

4.9 Dung dịch acetonitril/axit acetic băng, acetonitrile (4.7) và axit axetic băng (4.8) theo tỷ lệ 99/1

(thể tích)

4.10 Toluene, C6H5CH3, loại phân tích

4.11 Dung dịch Toluene/Axit acetic, Toluene (4.10)/axit axetic băng (4.8) với tỷ lệ 99/1 (thể tích) 4.12 Hydro cacbonat natri, NaHCO3, độ tinh khiết tối thiểu 99 %

4.13 PBS đậm đặc, muối đệm phosphate Hoà tan các thành phần sau đây trong 1800 ml nước (nước

loại 1 trong TCVN):

- 4 g KCl (4.4);

- 160 g NaCl (4.5);

- 72 g Na2HPO4.12H2O (4.6)

4.14 PBS sẵn sàng để sử dụng

Pha loãng 100 ml dung dịch PBS (4.13) đến 1000 ml với nước (nước loại 1 trong TCVN ) Điều chỉnh

pH 7,4 bằng HCl 1 mol/l và thêm nước đủ 2000 ml (nước loại 1 trong TCVN )

hoặc

Viên nén PBS, viên muối đệm phosphate,

Một viên nén PBS hòa tan trong 200 ml nước (nước loại 1 trong TCVN ) thu được dung dịch đệm phosphat 0,01 mol/lit, kali clorua 0,0027 mol/lit và natri clorua 0,137 mol/lit, pH 7,4, ở 25 °C (ví dụ Sigma P4417)

4.15 Dung dịch nước natri hydro cacbon 3%

Cho 30 g natri hydro cacbonat (4.12) vào 1000 ml nước (nước loại 3 trong TCVN )

4.16 Dung môi chiết, metanol/dung dịch nước natri hydro cacbonat 3% theo tỷ lệ 50/50 (thể tích).

Cho 500 ml metanol (4.1) vào 500 ml dung dịch nước natri hyđro cacbonat 3% (4.15) Trộn đều

4.17 Dung dịch nước axit axetic băng.

Cho 30 ml acxit acetic băng (4.8) vào 870 ml nước (nước loại 1 trong TCVN ) và lọc

4.18 Pha động HPLC, acetonitrile/metanol/dung dịch nước axit axetic băng theo tỷ lệ 35/35/30 (thể

tích)

Trộn 1050 ml metanol (4.2) với 1050 ml acetonitrile (4.7) và 900 ml dung dịch nước axit axetic băng (4.17) Trộn đều và khử bọt khí

4.19 OTA, ochratoxin A.

OTA tinh khiết dạng tinh thể, dạng màng khô, dạng bột hoặc trong dung dịch

4.20 Dung dịch chuẩn OTA gốc

Chuẩn bị từ OTA (4.19) dung dịch 20 μg/ml trong dung dịch toluene/axit axetic (4.11)

Để xác định nồng độ chính xác, thực hiện đo và dựng đồ thị mật độ quang của dung dịch này trong khoảng bước sóng giữa 300 nm và 370 nm dùng cuvet thạch anh 1 cm đối chiếu với dung dịch axit toluene/axitc axetic (4.11), sử dụng máy đo quang phổ UV (5.21) Xác định bước sóng mà tại đó có hấp thụ tối đa Tính nồng độ khối lượng của OTA, ρota, micrograms trên mililit bằng công thức (1):

trong đó:

Amax là mức hấp thụ cực đại xác định được theo đồ thị hấp thụ (ở đây: ở bước sóng 333 nm);

M là khối lượng phân tử mol, tính bằng gam trên mol, của OTA (M = 403,8 g/mol);

c là hệ số hấp thụ phân tử, tính bằng mét vuông trên mol, của OTA trong dung dịch toluene/axit axetic (4.11), (ở đây: 544 m2/mol);

b là chiều dài đường quang của cuvet thạch anh, tính bằng cm

4.21 Nitơ.

4.22 Dung dịch OTA gốc pha loãng để hiệu chuẩn.

Chuẩn bị 10 ml dung dịch chuẩn OTA gốc pha loãng để dựng đồ thị hiệu chuẩn bằng cách pha loãng

100 lần dung dịch chuẩn OTA gốc (4.20) với pha động (4.18) Để thực hiện việc này, dùng pipet lấy 100

μl dung dịch OTA gốc cho vào bình (ống) định mức thể tích, làm bay hơi dung dịch gốc bằng cách nhe nhàng thổi nitơ (4.21) ở 40ºC và hoàn thành đủ đến vạch bằng pha động (4.18)

CHÚ THÍCH: Để hòa tan hoàn toàn OTA trong pha động, đầu tiên chỉ cho pha động vào bình định mức khoảng 1/3 thể tích, làm cho OTA tan và sau đó cho thêm vào đến vạch và lắc

4.23 Các dung dịch hiệu chuẩn

Từ dung dịch chuẩn OTA gốc pha loãng để hiệu chuẩn (4.22) chuẩn bị sáu dung dịch hiệu chuẩn với 6 nồng độ bằng cách cho các thể tích dung dịch chuẩn OTA gốc pha loãng như trong Bảng 1 dưới đây vào 6 bình định mức và hoàn thành đủ đến vạch bằng pha động (4.18)

Bảng 1 – Các dung dịch hiệu chuẩn (4.23) được khuyến cáo để xác định OTA

Thứ tự các bình

dung dịch hiệu

chuẩn

dung dịch OTA gốc pha loãng để hiệu chuẩn (4.22) (µl)

Thể tích bình định mức (5.5) (ml)

Nồng độ OTA (ng/ml)

4.24 IAC với kháng thể đặc hiệu cho OTA

IAC chứa kháng thể đặc hiệu cho OTA Các cột OTA phải có tổng dung tích không nhỏ hơn 100 ng OTA Mức độ thu hồi OTA không được nhỏ hơn 85% khi áp dụng mức 5 ng OTA trong 50 ml hỗn hợp gồm 4 phần thể tích dung môi chiết (4.16) và 96 phần thể tích PBS Sẵn sàng để sử dụng (4.14)

4.25 Dung dịch thêm chuẩn

OTA trong dung dịch aceticitril/axit axetic băng theo tỷ lệ 99/1 (v/v) Nồng độ OTA trong dung dịch thêm chuẩn phụ thuộc vào mức yêu cầu Thể tích dung dịch cấy nên ở khoảng 500 μl Dung dịch cấy có thể được chuẩn bị từ dung dịch chuẩn OTA gốc (4.20) bằng cách tương tự như khi chuẩn bị dung dịch chuẩn OTA pha loãng để hiệu chuẩn (4.22)

5 Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các trang thiết bị thí nghiệm thông thường và các thiết bị, dụng cụ sau:

5.1 Dụng cụ thủy tinh phòng thí nghiệm thông thường, như ống đong định mức, cốc, pipet định

mức

5.2 Cân phân tích, có thể cân đến 0,1 mg

5.3 Máy lắc ngang hoặc đứng

5.4 Hệ thống hút chân không SPE tự động

5.5 Bình định mức (loại A, TCVN (ISO 1042), 5 ml, 10 ml, 100 ml

5.6 Giấy lọc đã được gấp nếp trước, giữ được hạt 30 μm

5.7 Các bình có nút vặn, 250 ml và 500 ml

5.8 Phễu thủy tinh, đường kính trong 9 cm

5.9 Bể chứa, polypropylene, thích hợp để gắn trên đỉnh cột IAC, dung tích từ 50 đến 75 ml

5.10 Xiranh bằng chất dẻo, 5 ml

5.11 Micropipet đã hiệu chuẩn, 100 μl, 500 μl và 1000 μl (thể tích thay đổi)

5.12 Hệ thống lọc dung môi hút chân không, phù hợp với bộ lọc 47 mm

5.13 Bộ lọc vi sợi thủy tinh, giữ được hạt 1,6 μm

5.14 Máy trộn vortex

5.15 Hộp chứa lọc ống bơm HPLC, nylon kích thước lỗ 0,45 μm

5.16 Bể siêu âm

5.17 Lọ thủy tinh màu hổ phách, dung tích khoảng 2 ml và có nắp vặn hoặc tương đương

5.18 Hệ thống HPLC

Hệ thống HPLC bao gồm:

- Bơm không xung, tốc độ bơm 0,5 ml/min đến 1,5 ml/min;

- Hệ thống bơm mẫu, bằng tay hoặc bộ lấy mẫu tự động, có kim thích hợp để bơm 100 μl đến 300 μl;

- Detector huỳnh quang, thích hợp để đo ở bước sóng kích thích 333 nm và phát xạ ở 467 nm;

- Bộ máy vi tính

5.19 Cột phân tích HPLC pha đảo, C18 cột -RP phù hợp để cho phép tách hiệu quả OTA từ các

thành phần khác; Cột có đầy đủ các đặc tính về kích thước và đặc tính pha tĩnh dài 250 mm x đường kính trong 4,6 mm x kích thước hạt 5 μm

5.20 Cột trước (cột bảo vệ), có cùng vật liệu pha tĩnh như cột phân tích, đường kính trong 4,0 mm,

pha tĩnh với cỡ hạt 5 μm

5.21 Máy đo quang phổ UV.

6 Chuẩn bị mẫu

6.1 Chiết OTA

- Cân 25,0 g, chính xác đến 0,1 g, mẫu thử cho vào một hộp chứa đủ lớn có nắp, ví dụ: Bình dung tích

500 ml có nắp vặn xoáy (5.67)

CHÚ THÍCH 1: Các mẫu đưa đi nghiên cứu liên phòng thí nghiệm [3] được nghiền nhỏ đến kích thước hạt là khoảng 0,5 mm

- thêm 200,0 ml dung môi chiết (4.16), đóng chặt nắp và lắc mạnh bằng tay trong vài giây; để cho vật liệu phân tán đều (kiểm tra trực quan)

- đặt hộp chứa lên máy lắc (5.3) trong 40 min, chọn tốc độ sao cho các thành phần được trộn đều mà không tích tụ lại ở phần trên của bình Giải pháp khác để thay cho máy lắc là dùng máy đánh mẫu siêu

âm xử lý trong 15 min; trong trường hợp này lắc nhanh hộp chiết bằng tay vài giây

- Để yên mẫu cho lắng xuống sau khi lắc

- Lọc dịch chiết qua giấy lọc gấp nếp (5.6) và thu dịch chiết đã lọc đã vào bình có nắp vặn 250 ml (5.7), và

- Lấy khoảng 10 ml dịch chiết đã lọc cho vào hệ thống lọc hút chân không và lọc qua bộ lọc vi sợi thủy tinh (5.13) có sử dụng hút chân không nhe (5.12) Hủy bỏ lượng dịch chiết này và lọc tất cả phần dịch chiết đã lọc còn lại và thu vào một bình có nắp vặn 250 ml (5.7) có được dịch chiết trong xuốt để phân tích tiếp Tiến hành ngay công đoạn làm sạch qua cột IAC (6.2)

CHÚ THÍCH 2: Không sử dụng chân không mạnh lúc mới bắt đầu lọc để không làm vẩn đục dịch chiết sau lọc

6.2 Làm sạch và dung dịch thử

- Dùng một IAC (cột ái lực miễn nhiễm 4.24) cho từng dịch chiết;

- Gắn cột vào bể chứa (5.9), không tháo dung dịch bảo quản cột ra khỏi cột;

- Cho 4,00 ml dịch chiết đã lọc hai lần vào bình định mức 100 ml (5.5), hoàn thành đủ đến vạch bằng PBS sẵn sàng để sử dụng (4.14) và lắc;

- Cho 50,0 ml dịch chiết đã pha loãng vào bồn chứa đã gắn ở cột IAC; Lượng dịch này tương đương với 2,00 ml dịch chiết đã lọc hai lần chưa pha loãng;

- Mở lỗ thoát của cột IAC;

- Cho dịch chiết đi qua cột IAC nhờ trọng lực với tốc độ dòng chảy ổn định cho đến khi toàn bộ dịch chiết đi hết qua cột miễn dịch ái lực và mẻ dung môi cuối cùng đi chạm đáy cột;

- Sau khi dịch chiết đã chảy hết hoàn toàn qua cột, rửa cột IAC bằng 10 ml nước (nước loại 1 trong TCVN ); đảm bảo rằng nước có pH trung tính;

- Thổi không khí qua IAC (ví dụ sử dụng một ống bơm lớn nối với cột) để thổi nước dư thừa;

- Đặt bình định mức (5.5) phía dưới IAC và thêm 0,75 ml metanol (4.2) vào IAC;

- Thu dịch rửa giải vào bình định mức 5 ml;

- Sau khi những giọt metanol cuối cùng đi qua IAC, để cho metanol ở lại trong IAC trong khoảng 1 min; sau đó cho thêm 0,75 ml metanol (4.2) nữa vào cột và tiếp tục lấy thu lấy eluate thoát ra, tiếp theo cho thêm 0,50 ml nước (nước loại 1 trong TCVN );

- Cẩn thận thổi không khí qua IAC để thu hồi tối đa lượng metanol và nước đã thêm vào cột;

- Thêm ngay 1,5 ml dung dịch axit acetic băng (4.17) vào bình định mức; và

- Thêm nước (nước loại 1 trong TCVN ) vào đầy đến vạch bình định mức và lắc bằng máy vortex

Trong trường hợp dịch chiết mẫu bị đục, tiến hành lọc các dịch thử qua hộp chứa lọc ống bơm HPLC (5.15) với một ống bơm nhựa (5.10) Dịch này có thể được sử dụng trực tiếp như là dung dịch thử CHÚ THÍCH: Thay cho quy trình ái lực miễn nhiễm là cách làm sạch và rửa giải Có thể thực hiện việc này bằng bộ chuẩn bị mẫu tự động, với điều kiện là các thể tích và aliquots vẫn không thay đổi

6.5 Quy trình thêm chuẩn

Để xác định độ thu hồi, thêm dung dịch chuẩn OTA gốc vào mẫu thức ăn chăn nuôi không chứa OTA hoặc dung dịch pha loãng của nó Mức thêm chuẩn phải phù hợp và nồng độ dung dịch được sử dụng

là 500 µl Để yên mẫu thêm chuẩn trong khoảng 30 min để đảm bảo dung môi bay hơi

7 Tiến hành đo

7.1 Điều kiện hoạt động HPLC

Sử dụng các thiết bị nêu trong 5.18, các điều kiện sau đây đã được chứng minh là cho kết quả đạt yêu cầu:

- Pha động: như trong 4.18;

- Tốc độ dòng: từ 0,7 ml/min đến 1,5 ml/min;

- lượng bơm: 100 μl

- cột RP-HPLC, (5.19);

- cột tiền (cột bảo vệ): C18 (5.20);

- detector huỳnh quang: Bước dóng kích thích λ: 333 nm (5.18);

- bước sóng phát xạ λ: 467 nm;

- Không kiểm soát nhiệt độ

7.2 Xác định OTA trong các dung dịch thử nghiệm

Bơm các xuất dung dịch hiệu chuẩn (4.23) và các dung dịch mẫu (6.2) vào máy sắc ký, áp dụng cùng điều kiện hoạt động

7.3 Hiệu chuẩn

Dựng đường chuẩn, lấy tín hiệu (diện tích các pic hoặc chiều cao các pic) của tất cả các dung dịch hiệu chuẩn đã xác định được và giá trị nồng độ OTA tương ứng Không sử dụng giá trị trung bình của nhiều lần bơm Với sự ước lượng hồi qui tuyến tính của đồ thị nối các điểm trên tọa độ để vẽ được

đường đồ thị hiệu chuẩn Thực hiện kiểm tra giao điểm và độ tuyến tính.

7.5 Nhận biết pic

Việc nhận biết các pic OTA trong dung dịch thử bằng cách đối chiếu thời gian lưu của dung dịch thử với thời gian lưu của các dung dịch hiệu chuẩn Tín hiệu (diện tích pic hoặc chiều cao pic) của OTA trong dung dịch thử phải nằm trong khoảng hiệu chuẩn Nếu tín hiệu OTA trong dung dịch thử vượt quá các tín hiệu cao nhất của dung dịch hiệu chuẩn, thì cần pha loãng dung dịch thử để đưa nồng độ của dung dịch thử vào trong khoảng tuyến tính nồng độ dung dịch hiệu chuẩn sau đó tiến hành phân tích lại hai lần (bơm mẫu hai lần) Hệ số pha loãng phải được hợp nhất lại và đưa vào mọi tính toán sau đó

8 Xác định nồng độ

Sử dụng các độ dốc ước tính và giao điểm từ hồi quy tuyến tính (7.3) để tính ra các nồng độ của OTA (cT (OTA)) trong các dung dịch thử (6.2) như sau:

Để tính được các phần khối lượng (cSMP) của các chất phân tích trong các vật liệu ban đầu, sử dụng công thức sau:

Trong đó:

cT là nồng độ tính được của OTA, đã được điều chỉnh theo pha loãng nếu cần (ng/ml);

W là khối lượng của vật liệu thử (mẫu) đã lấy để chiết (25,0 g);

Solvent là tổng thể tích của dung môi chiết (200,0 ml);

Aliquot là phần dịch chiết đã sử dụng để rửa cột IAC (2,0 ml), (4 ml/100 ml x 50 ml = 2 ml); Elution là thể tích cuối cùng đạt được sau khi tách rửa (elution) từ cột IAC (5,0 ml);

Nếu khối lượng của vật liệu thử và các thể tích quy định trước đây được giữ nguyên, thì phương trình (3) trên có thể được giản lược thành:

9 Độ chụm