PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GEN VÀO TẾ BÀO THỰC VẬT ( TI – PLASMID )

Ngày nay, các loại cây trồng kháng virus, côn trùng hay kháng thuốc trừ cỏ đã được tạo ra bằng việc áp dụng chuyển các gen mong muốn vào thực vật, đã mang lại những cải thiện quan trọng trong năng suất. Các gen cải thiện sự tăng trưởng của thực vật trong môi trường axit hoặc kiềm và đất nhiễm mặn đã được cô lập. Cây trồng chuyển gen là sự thay thế có hiệu quả, vì chúng có thể biểu lộ nhiều loại prtein, cũng như thực hiện các thay đổi cần thiết để các loại prôtêin đó hoạt động. Hệ thống cây trồng cũng ít khi chứa các loại vi khuẩn có thể là nguồn bệnh đối với động vật.

Đề tài:

PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GEN VÀO TẾ BÀO

THỰC VẬT ( TI – PLASMID )

NHÓM THỰC HIỆN : 05

DANH SÁCH THÀNH VIÊN NHÓM

I MỞ ĐẦU.

Việc sử dụng một khối lượng lớn nhiên liệu hoá thạch giúp chúng ta có được đời sống tiện nghi và hạnh phúc nhưng cũng dẫn đến sự trả giá đắt như hiện tượng ấm lên toàn cầu, sự ô nhiễm và hủy hoại môi trường Do nhiều điều kiện bất lợi của môi trường như sự nhiễm vi khuẩn, virus, các loại côn trùng, sự nhiễm mặn, khô hạn, nhiệt độ cao, … Ngay ở Mỹ, sản lượng nông nghiệp giảm hơn ¼ so với tối đa theo lý thuyết Ngày nay, các loại cây trồng kháng virus, côn trùng hay kháng thuốc trừ

cỏ đã được tạo ra bằng việc áp dụng chuyển các gen mong muốn vào thực vật, đã mang lại những cải thiện quan trọng trong năng suất Các gen cải thiện sự tăng trưởng của thực vật trong môi trường axit hoặc kiềm và đất nhiễm mặn đã được cô lập Cây trồng chuyển gen là sự thay thế có hiệu quả, vì chúng có thể biểu lộ nhiều loại prtein,

cũng như thực hiện các thay đổi cần thiết để các loại prôtêin đó hoạt động Hệ thống cây trồng cũng ít khi chứa các loại vi khuẩn có thể là nguồn bệnh đối với động vật

Thị trường hóa cây biến đổi gen trong nông nghiệp Cho đến năm 1999, diện tích gieo trồng trên thế giới đạt hơn 40 triệu ha Trong đó 20% là ngô, 50% là đậu tương và 1/3 diện tích bông là ở Mỹ Ngoài ra có hơn 70% diện tích cải dầu ở Canada được trồng với giống biến đổi gen Khoảng 90% thực vật biến đổi gen chống chịu thuốc diệt cỏ hoặc sâu bệnh hại Cần chú ý rằng, ở Mỹ sản phẩm đậu tương có trong hơn 20.000 loại thực phẩm khác nhau Điều này cho thấy rằng, công nghệ gen đã ảnh hưởng đến sản xuất thực phẩm của chúng ta

Nhiều phương pháp khác nhau đã được phát minh để đưa gen vào tế bào và mô động vật và thực vật Kỹ thuật đơn giản nhất là chuyển DNA trần bằng vi tiêm (microinjection), xung điện (electroporation), súng bắn gen Các phương pháp phức tạp và hiệu quả hơn bao gồm sử dụng các phức hợp lipid-DNA (liposome), vector virus, tế bào gốc phôi, chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn, chuyển gen bằng súng bắn gen

Tuỳ thuộc vào đối tượng chuyển gen mà người ta lựa chọn phương pháp chuyển gen phù hợp Nhiều nhà khoa học tin rằng chuyển gien cây trồng là cách hiệu quả hơn và rẻ tiền hơn để sản xuất vaccine và thuốc hàng loạt

Lịch sử phát triển công nghệ gen của thực vật chắc chắn có rất nhiều sự kiện quan trọng Ở đây là mốc có ý nghĩa đặc biệt nhằm làm rõ sự phát triển rất nhanh của lĩnh vực này

Đó là, vi khuẩn đất Agrobacterium tumefaciens được sử dụng làm phương

tiện vận chuyển DNA Bình thường vi khuẩn này tạo nên khối u ở thực vật Một phần nhỏ của Ti-plasmid có trong vi khuẩn này, được gọi là T-DNA, được vận chuyển từ

Agrobacterium vào cây hai lá mầm Năm 1980, lần đầu tiên DNA ngoại lai

(transposon Tn7) được chuyển vào thực vật nhờ A tumefaciens, tuy nhiên T-DNA vẫn

chưa được thay đổi Năm 1983, nhiều nhóm nghiên cứu đã biến đổi T-DNA và đưa DNA ngoại lai vào, tạo ra tính kháng một số chất kháng sinh Ngoài ra, các gen tạo khối u được cắt ra DNA ngoại lai cùng với phần còn lại được chuyển vào thực vật và

được biến nạp Thành công này nhờ nghiên cứu chính xác con đường lây nhiễm của A.

tumefaciens trước đó và khả năng của hệ thống chọn lọc đối với thực vật.

Điều này cho thấy ngay từ những năm 80 của thế kỷ 20 kỹ thuật chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn đã được thực hiện và cụ thể là thông qua Ti-Plasmid Để làm rõ hơn vấn đề này nhóm chúng em đã quyết định tìm hiểu về kỹ thuật chuyển gen gián tiếp thông qua Ti-plasmid

II NỘI DUNG.

I.1 Sơ lược về plasmid:

I.1.1 Khái niệm

Plasmid là nhân tố di truyền ngoài nhiễm sắc thể, là phân tử DNA kép, có kích

thước từ 1 đến 200kb Plasmid chỉ sinh sản được trong tế bào vi khuẩn, có khả năng tự nhân đôi và di chuyển từ tế bào này sang tế bào khác

Vector chuyển gen là các phân tử DNA dạng vòng mang đoạn gen cần biến nạp,

có khả năng xâm nhập vào tế bào vi khuẩn kí chủ và sử dụng bộ máy tổng hợp của tế bào kí chủ để tạo ra nhiều bản sao giống vector ban đầu

I.1.2 Cấu trúc của một vector chuyển gen:

+Có 1 đoạn AND khởi động (promoter) Đây là một đoạn ADN có liên quan và cần thiết cho sự khởi đầu phiên mã Nó thường có một vị trí bám cho enzym ARN polymeraza, một điểm khởi đầu phiên mã, và một số vị trí bám khác của các protein điều khiển / điều hoà quá trình phiên mã

+Có một đoạn ADN kết thúc (terminator) Đây là đoạn ADN cần thiết cho sự kết thúc của quá trình phiên mã và giải phóng phân tử mARN khỏi sợi khuôn ADN Đoạn kết này thường có một trật tự tín hiệu polyadenin, như AATTAA hoặc AACCAA, giúp cho phân tử mARN bền vững hơn

+ Một đoạn AND chịu trách nhiệm cho quá trình tái bản, thường có nguồn gốc vi khuẩn VD: E.coli

+ Một đoạn ADN chứa các trật tự nucleotid đặc trưng cho sự nhận biết của các enzyme giới hạn, thường ký hiệu là MCS (multi-cloning sites) Nhờ đoạn ADN người

ta có thể dùng enzym giới hạn đặc hiệu để cắt và tái tổ hợp phân tử ADN của véctơ với đoạn ADN mang gen cần biến nạp

+ Vùng chứa gen chọn lọc (selectable marker genes) và gen chỉ thị (reporter genes)

I.2 Ti-plasmid.

Là một vector chuyển gen có kích thước lớn “Ti” là viết tắt của “Tumour inducing” tức là gây ra khối u

• Cấu trúc của Ti-plasmid

Ti plasmid là một phân tử ADN vòng tương đối lớn, gồm 150.000-200.000 cặp nucleotit Ti-plasmid gồm 5 vùng:

 T-DNA (transferred DNA) - một đoạn gen gồm 20.000-30.000 cặp nucleotit có khả năng thâm nhập vào bộ genom của tế bào chủ T-ADN có chứa các gen gây ra sự sinh trưởng vô điều khiển của các tế bào thực vật Đó là các gen mã hoá auxin và cytokinin gây ra sự sinh sản vô tổ chức của tế bào bị nhiễm

 Đoạn vir (virulence) là nơi có các gen sản xuất protein cần cho sự biến dạng của tế bào thực vật, chịu trách nhiệm chuyển nạp đoạn T-ADN từ plasmid vào trong genom của tế bào chủ để Ti-plasmid có thể thâm nhập

 Vùng tái bản: ORI- vùng mã hóa chức năng tái bản và khởi điểm tái bản giúp gên được nhân lên trong tế bào

 Vùng tiếp hợp: CON- vùng mã hóa chức năng tiếp hợp

Ti plasmid được tìm thấy trong tất cả các dòng A.tumefaciens gây độc Chúng

được duy trì ổn định trong Agrobacterium ở nhiệt độ dưới 30 độ C

• Cơ chế hoạt động của vi khuẩn)

Vi khuẩn A tumefaciens không sản xuất được một số acid amin như octopin,

nopaline Để tồn tại, nó chuyển gen của nó vào thực vật Ti - plasmid mang các gen tổng hợp IAA, các amino acide như octopine hay nopalin để giúp cho vi khuẩn phát triển Trong Ti-plasmid octopine, locus tms mã hóa một enzyme liên quan đến hệ thống cytokinin và sự đột biến ở đây dẫn đến sự tăng sinh rễ từ các khối u hình chóp

đã gây ra ở một số loài (các thể đột biến rễ) Các locus tms 1 và tms 2 liên quan đến sự tổng hợp không điều hòa của auxin và sự đột biến một trong hai locus gây nên sự tăng sinh chồi từ các khối u hình chóp ở nhiều loại thực vật (các thể đột biến chồi) Vì vậy, T-DNA mang các gen (tms 1, tms 2 và tmr) mà sản phẩm của chúng không chịu sự điều hòa bình thường của các con đường chuyển hóa thực vật liên quan đến sự tổng hợp phytohormone và điều này gây ra kiểu hình ung thư Do đó các gen tms 1, tms 2

và tmr được xem là các gen ung thư Trong quá trinh cộng sinh này, vi khuẩn cũng chuyển các gen tổng hợp các chất kích thích sinh trưởng làm các tế bào nhiễm vi khuẩn phân chia vô tổ chức, gây phát sinh khối u ở thực vật

I.3 Quá trình chuyển nạp gen của vi khuẩn.

I.3.1 Thiết kế Ti - plasmid mang gen biến nạp.

Để có thể tiến hành chuyển gen vào tế bào thực vật, đầu tiên ta cần có một đoạn DNA mã hóa cho một tính chất nổi trội của thực vật ( gen biến nạp) được lấy từ một tế bào thực vật Thứ 2, ta cần một vòng plasmid ( vector chuyển gen), tuy nhiên tại phương pháp này ta sẽ sử dụng Ti – plasmid của vi khuẩn Agrobacterium làm vector chuyển gen.

T – DNA được cắt ra từ đoạn gen nhờ ezyme đặc hiệu, enzyme cắt giới hạn

A Ti – plasmid cũng được enzyme cắt giới hạn cắt vùng T - DNA Sợi đơn của T-DNA được giải phóng và kết hợp với protein, chỗ đứt ở sợi đơn thứ hai được tổng hợp bổ sung lấp đầy chỗ trống trong Ti-plasmid Sợi T-DNA tự do được vận chuyển vào tế bào thực vật ở dạng phức hệ DNA-protein.

I.3.2 Nhân vòng vector nhờ vi khuẩn E.coli.

E.coli là tế bào chủ căn bản của kĩ thuật chuyển gene.Nó là sinh vật chuẩn để tạo

dòng gen (cloning gens) của bất kỳ sinh vật nào E coli được coi là tế bào vật chủ đơn giản nhất trong công nghệ gen Vi khuẩn E coli dễ dàng chấp nhận nhiều loại vector

chuyển gen như plasmid hay phage qua biến nạp hay tải nạp

Sau khi chuyển gene của tế bào cho vào thể chuyền plasmid ta cấy vào vi khuẩn e.coli để nhân lên với số lượng lớn

Biến nạp plasmids chứa ADN chưa tái tổ hợp vào tế bào vi khuẩn E.coli

I.3.3 Chuyển vector mang gen biến nạp từ E.coli sang A tumefaciens.

Tế bào vi khuẩn có khả năng hấp thụ DNA tự nhiên, ngay cả DNA của tế bào đã chết Dựa trên sự thay đối tính thấm của màng tế bào làm cho DNA có thể xâm nhập vào trong tế bào

Vector trans hoặc vector nhị thể được dựa trên các plasmid có thể tái bản ở cả E.coli và Agrobacterium, và các plasmid này có chứa các trình tự biên của T-DNA Các vector này có thể được thiết kế sao cho các trình tự biên cạnh MCS ( Multicloning site – trình tự tạo dòng) cho phép xen DNA ngoại lai vào và các marker cho phép chọn lọc trực tiếp các tế bào thực vật đã được biến nạp Plasmid có thể được thao tác ở trong E.coli và được chuyển vào qua sự tiếp hợp với các dòng Agrobacterium mang plasmid

có chứa vùng vir nhưng thiếu T-DNA và các trình tự lặp 25 bp Các plasmid như thế thường là các thể đột biến mất đoạn đơn giản của Ti-plasmid octopine kiểu dại hoặc kiểu nopaline Việc chuyển DNA ngoại lai trên vector tạo dòng vào tế bào thực vật có thể được thực hiện do hoạt động chức năng của vùng vir

pBin19 là một vector nhị thể phổ biến dựa trên đơn vị tái bản (replicon) vật chủ

mở rộng của pRK252 Vì vậy nó có thể tái bản trong cả E.coli và Agrobacterium, cho

phép xen DNA ngoại lai vào vector và sàng lọc trong E coli trước khi chuyển vào

Agrobacterium Vector này chứa marker kháng kanamicin (K mr )

Sự xâm nhập của pBin19 vào A.tumefaciens LBA4404 sử dụng plasmid hỗ trợ pRK2013 và sau đó loại bỏ plasmid hỗ trợ trong Agrobacterium

I.3.4 Quá trình

A.grobacterium chuyển plasmid vào tế bào thực vật.

Khi tế bào trên thân cây bị tổn thương, các tế bào tổn bị thương tiết ra hợp chất

thu hút các tế bào vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens Các tế bào vi khuẩn không

thâm nhập vào tế bào thực vật mà chỉ chuyển nạp vào chúng một loại plasmid đặc hiệu gây nên tình trạng khối u Con người lợi dụng tính chất này của Agrobacterium để chuyển gen vào tế bào thực vật

• Quá trình chuyển T- ADN từ plasmid vào gen nhân thực vật.

Đầu tiên là sử dụng enzyme cắt để hình thành một vết đứt tại vị trí vùng bờ phải của đoạn T- AND Đoạn gen này sau đó được tách ra khỏi plasmid nhờ sự hình thành một đoạn đứt thứ hai ( Đoạn đứt này thường không cố định đối với những plasmid khác nhau).

Trong khi các axid nucleic trống tạo ra trên plasmid được lấp đầy theo nguyên tắc bổ sung của các axid nucleic thì đoạn T- ADN được tách ra được

bám bởi một protein bám sợi đơn (SSBP) Nhờ phức hợp với SSBP này mà đoạn gen T- ADN được chuyển vào nhiễm sắc thể của cây chủ.

I.3.5 Chọn lọc các mô, tế bào được chuyển gen thành công.

Có rất nhiều phương pháp để chọn lọc các mô tế bào, nhưng phương pháp gen chỉ thị thường được sử dụng trong chuyển gen vào tế bào thực vật

Xác nhận sự biểu hiện của luciferase, cơ chất là luciferin, phản ứng này phụ thuộc vào ATP Ánh sáng tạo nên từ phản ứng được định lượng bằng máy.

Xác nhận sự biểu hiện của β-D-glucuronidase, cơ chất nhân tạo là 5-bromo-4-chlor-3-indoyl-β-glucuronid (X-GlcA), chất này được thủy phân nhờ glucuronidase Bằng sự oxy hóa xuất hiện một chất indigo màu xanh Người ta

có thể sử dụng các chất khác thay thế X-Glc, mà sản phẩm thuỷ phân là chất màu phát quang.

I.4 Ứng dụng của phương pháp chuyển gen trong thực tế.

Hiện nay Mỹ đang là quốc gia đang đứng đầu trong việc đưa cây biến đổi gen vào sản xuất chiếm tới 59%, ngoài ra còn một số quốc giá khác như Argentina chiếm 20%, Canada 6,7%, Brazi 6%, Trung Quốc 4,6% Ở châu Á, cây trồng biến đổi gen chủ yếu là bông, được trồng nhiều ở Trung Quốc, Ấn Độ, Philippines và Indonesia

Có 4 loại cây trồng biến đổi gen được thương mại hóa mạnh nhất Đó là: đậu tương kháng thuốc diệt cỏ, ngô kháng thuốc diệt cỏ và kháng sâu, bông kháng thuốc diệt cỏ

và kháng sâu và cải dầu kháng thuốc diệt cỏ Ngoài 4 loại cây trồng biến đổi gen chính

đã được thương mại hóa rộng rãi nói trên, còn có hàng loạt các cây trồng biến đổi gen khác như kháng nấm, kháng virus, chín chậm cũng đã và đang được phổ biến

Ứng dụng chuyển gen qua nách là mần ở đậu tương

Đậu tương đầu tiên được chuyển gen bằng phương pháp gián tiếp thông qua A.

tumefaciens lây nhiễm vào nách lá mầm tổn thương trong nuôi cấy in vitro.

Sơ đồ các bước tiến hành và phương pháp phân tích cây chuyển gen

Kỹ thuật chuyển gen ở thực vật nói chung và chuyển gen ở cây đậu tương nói riêng được hiểu đẩy đủ là: (i) gen ngoại lai (gen chuyển) phải được dung hợp vào hệ gen tế bào chủ; (ii) gen chuyển phải được biểu hiện ở tế bào chủ; (iii) gen chuyển phải được di truyền cho các thế hệ sau; (iv) trong mỗi thế hệ sản phẩm của gen chuyển phải được biểu hiện, và (v) sản phẩm của gen chuyển biểu hiện được chức năng sinh học Chính vì vậy quá trình chọn lọc, phân tích cây chuyển gen trong mỗi thế hệ được thực

hiện bằng hệ thống chọn lọc tế bào và mô chuyển gen, xác định sự có mặt của gen chuyển trong tế bào cây chủ, kiểm tra sự biểu hiện của gen chuyển thông qua xác định sản phẩm biểu hiện là mRNA và protein và phân tích sự biểu hiện chức năng sinh học của gen chuyển

Thành tựu khi chuyển gen vào đậu tương

Cải thiện protein và amino acid

Cải thiện thành phần dầu

Cải thiện một số thành phần khác

Tăng cường khả năng kháng côn trùng và vi sinh vật

Tăng cường khả năng chống chịu các điều kiện bất lợi của ngoại cảnh

Tăng cường khả năng kháng thuốc diệt cỏ

III KẾT LUẬN.

Hiện nay, phương pháp chuyển gen vào cây trồng bằng vi khuẩn Agrobacterium

tumefaciens (At) được xem là một phương pháp rất có hiệu quả và là phương pháp mà

qua đó kết quả chuyển gen (ở phân tích Southern blot) thường biểu hiện kiểu tích hợp gen (DNA integration) tương đối đơn giản - phù hợp với mục tiêu của các nhà công nghệ gen Vì vậy,việc tạo ra các chủng vi khuẩn At mang gen chuyển là yêu cầu rất cần thiết

Ưu điểm của phương pháp: kỹ thuật đơn giản, dễ thực hiện, không đòi hỏi thiết

bị đặt tiền

Nhược điểm của phương pháp: Phương pháp này sử dụng thành công ở nhiều cây hai là mầm, nhưng chưa hiệu quả chuyển gen ở cây 1 là mầm còn thấp trong khi nhiều cầy 1 là mầm là cây lương thực quan trọng như cây lúa, ngô, lúa mì…

Như vậy, nhờ công nghệ chuyển gen, người ta có thể tạo ra các giống cây đem lại nhiều lợi ích cơ bản và lâu dài, đặc biệt là hạn chế tối đa việc sử dụng phân bón hóa học trong ngành trồng trọt và giảm thiểu sự ô nhiễm môi trường Ngoài ra, có thể sản xuất các loại thuốc quý, chữa các bệnh cho người và tạo ra những polyme sinh học dùng trong bao gói, vận chuyển và thuận tiện tiêu hủy, tạo lợi nhuận đáng kể cho nông dân và người tiêu dùng, làm sạch môi trường, bảo vệ môi trường và hệ sinh thái bền vững

IV Tài liệu tham khảo.

2 Trung tâm kiến thức toàn cầu về cây trồng CNSH Tài liệu phổ biến kiến thức dạng bỏ túi - Pocket K No

4 ViệtNamNet-Xử lý tin: Trọng An