KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC CHẤT HỮU CƠ ĐẾN SỰ NHÂN NHANH SINH KHỐI VÀ TÍCH LŨY SAPONIN Ở RỄ TÓC SÂM NGỌC LINH (PANAX VIENAMENSIS HA ET GRUSHV.)

ĐỖ THỊ MAI TRINH KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC CHẤT HỮU CƠ ĐẾN SỰ NHÂN NHANH SINH KHỐI VÀ TÍCH LŨY SAPONIN Ở RỄ TÓC SÂM NGỌC LINH PANAX VIENAMENSIS HA ET GRUSHV... ĐỖ THỊ MAI TRINH KHẢO S

ĐỖ THỊ MAI TRINH

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC CHẤT HỮU

CƠ ĐẾN SỰ NHÂN NHANH SINH KHỐI VÀ TÍCH LŨY SAPONIN Ở RỄ TÓC SÂM NGỌC LINH

(PANAX VIENAMENSIS HA ET GRUSHV.)

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số ngành: 60420201

TP HỒ CHÍ MINH, tháng 12 năm 2019

ĐỖ THỊ MAI TRINH

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC CHẤT HỮU

CƠ ĐẾN SỰ NHÂN NHANH SINH KHỐI VÀ TÍCH LŨY SAPONIN Ở RỄ TÓC SÂM NGỌC LINH

(PANAX VIENAMENSIS HA ET GRUSHV.)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HCM

Cán bộ hướng dẫn khoa học : TS Hà Thị Loan

(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị và chữ ký)

Luận văn Thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Công nghệ TP.HCM ngày 13 tháng 06 năm 2020

Thành phần Hội đồng đánh giá Luận văn Thạc sĩ gồm:

(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị của Hội đồng chấm bảo vệ Luận văn Thạc sĩ)

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá Luận sau khi Luận văn đã được sửa chữa (nếu có)

Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: ĐỖ THỊ MAI TRINH Giới tính: NỮ

Ngày, tháng, năm sinh: 12/05/1995 Nơi sinh: AN GIANG

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC MSHV: 1741880020

I- Tên đề tài:

Khảo sát ảnh hưởng của các chất hữu cơ đến sự nhân nhanh sinh khối và tích lũy saponin ở rễ tóc sâm ngọc linh (Panax vienamensis Ha et Grushhv.)

II- Nhiệm vụ và nội dung:

- Thứ nhất: Khảo sát ảnh hưởng của dịch chiết nấm men (Yeast extract) lên sự

tăng sinh khối và tích lũy saponin ở rễ tóc sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis

Ha et Grushv.)

- Thứ hai: Khảo sát ảnh hưởng của pepton lên sự tăng sinh khối và tích lũy

saponin ở rễ tóc sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)

- Thứ ba: Khảo sát ảnh hưởng của L-tyrosine lên sự tăng sinh khối và tích lũy

saponin ở rễ tóc sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)

- Thứ tư: Khảo sát ảnh hưởng của casein hydrolysate lên sự tăng sinh khối và

tích lũy saponin ở rễ tóc sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.).

III- Ngày giao nhiệm vụ: 31/05/2019

IV- Ngày hoàn thành nhiệm vụ: 25/11/2019

V- Cán bộ hướng dẫn: TS HÀ THỊ LOAN

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN KHOA QUẢN LÝ CHUYÊN NGÀNH

(Họ tên và chữ ký) (Họ tên và chữ ký)

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nêu trong Luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện Luận văn này

đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong Luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc

Học viên thực hiện Luận văn

(Ký và ghi rõ họ tên)

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian làm việc và học tập tại trường Đại học Công Nghệ TP.HCM và Trung tâm Công Nghệ Sinh Học TP.HCM, được sự giúp đỡ và giảng dạy tận tình của thầy cô, anh chị và bạn bè

Lời đầu tiên em xin chân thành gửi lời cám ơn đến Ban Giám Hiệu trường Đại học Công Nghệ TP.HCM , quý thầy cô giảng dạy tại Khoa Công nghệ sinh học

- Thực phẩm - Môi trường cùng tất cả các thầy cô đã truyền dạy những kiến thức khoa học vô cùng quý báu cho em trong suốt những năm học vừa qua

Em xin cảm ơn Ban Giám đốc Trung tâm Công Nghệ sinh Học TP.HCM đã tạo điều kiện cơ sở vật chất, trang thiết bị hóa chất để em hoàn thành luận văn này Đặc biệt em xin cảm ơn đến chị Hà Thị Loan Phó Giám đốc Trung tâm Công Nghệ Sinh Học TP.HCM là người hướng dẫn chính trong suốt thời gian qua đã hỗ trợ, định hướng, quan tâm, giúp đỡ em đưa ra những lời khuyên và chỉ dạy những điều tốt nhất để em hoàn thành tốt khóa luận của mình

Em xin gửi lời cám ơn đến chị Quyên, Trung và Huy phòng Thực Nghiệm cây trồng đã nhiệt tình giúp đỡ và giải quyết vấn đề khi em gặp khó khăn trong quá trình học tập và làm việc tại Trung tâm

Xin được bày tỏ lòng biết ơn đến anh Long bộ môn dược liệu trường đại học

Y dược TP.HCM đã chỉ bảo và hướng dẫn em tìm kiếm và phân tích số liệu tạo điều kiện thuận lợi giúp em hoàn thành tốt đề tài của mình

Và cuối cùng, lời cảm ơn dành cho gia đình đã luôn bên cạnh ủng hộ, động viên con trong những lúc khó khăn, là người luôn thương yêu và theo sát những bước đường con đi cũng như trong khóa luận này

Đỗ Thị Mai Trinh

TÓM TẮT

Đề tài “Khảo sát ảnh hưởng của các chất hữu cơ đến sự nhân nhanh sinh khối

và tích lũy saponin ở rễ tóc sâm Ngọc Linh (Panax vienamensis Ha et Grushv.)”

được thực hiện từ tháng 3 năm 2019 đến tháng 11 năm 2019 tại Trung tâm Công Nghệ Sinh Học TP.HCM

Trong nghiên cứu này, các cụm rễ tóc sâm Ngọc Linh được tạo thành từ việc

lây nhiễm vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes ATCC 15834 từ dạng hoang dại

vào cuống lá sâm Ngọc Linh, được sử dụng như nguồn vật liệu nhằm đánh giá ảnh hưởng của các chất hữu cơ như yeast extract, pepton, L-tyrosine và casein hydrolysate lên khả năng tăng sinh khối và tích lũy saponin - hợp chất chủ yếu quyết định đến tác dụng dược lý đặc hiệu của loài sâm này Sau 60 ngày nuôi cấy, việc bổ sung các chất hữu cơ vào môi trường nuôi cấy cho thấy kích thích sinh trưởng của rễ tóc sâm Ngọc Linh và làm gia tăng hàm lượng saponin Các cụm rễ tơ được nuôi cấy trên môi trường SH có bổ sung 60 g/L sucrose và bốn chất hữu cơ đều cho thấy sự hiện diện của G-Rg1, M-R2, V-R2, V-R1, G-Rb1, G-Rd và G-Rg2 với hàm lượng khác nhau khi phân tích bằng HPLC.Các thí nghiệm được bố trí trên dòng rễ tóc sâm Ngọc Linh (dòng rễ số 5) Thí nghiệm nuôi cấy sinh khối mỗi nghiệm thức được lặp lại 5 lần, kết quả đề tài như sau:

Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của dịch chiết nấm men (Yeast extract) lên sự tăng

sinh khối và tích lũy saponin ở rễ tóc sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et

Grushv.) Cho thấy: Dịch chiết nấm men ở nồng độ 4,0 g/L cho saponin tổng số

và hàm lượng các saponin cao hơn so với nghiệm thức đối chứng Khi bổ sung nồng

độ 4,0 g/L là thích hợp nhất cho sự tăng trưởng và tích lũy saponin ở rễ tóc sâm Ngọc Linh

Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của pepton lên sự tăng sinh khối và tích lũy saponin

ở rễ tóc sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) Kết quả cho thấy

pepton không ảnh hưởng tăng sinh khối khô nhưng có kích thích sự tổng hợp một số saponin Saponin tổng số cao nhất khi bổ sung pepton ở nồng độ 1,0 g/L

Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của L-tyrosine lên sự tăng sinh khối và tích lũy

saponin ở rễ tóc sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) Kết quả thí

nghiệm cho thấy bổ sung L-tyrosine nồng độ 30 mg/L saponin tổng số đạt cao nhất Khi bổ sung L-tyrosine trong thí nghiệm ở nồng độ 30,0 mg/L thích hợp nhất cho

sự tăng trưởng và tích lũy saponin ở rễ tóc sâm Ngọc Linh

Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của casein hydrolysate lên sự tăng sinh khối và tích

lũy saponin ở rễ tóc sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) Kết quả

cho thấy bổ sung nồng độ casein hydrolysate kích thích sự tổng hợp một số saponin, nhận thấy rằng ở nồng độ 0,5 g/L thích hợp nhất cho sự tăng trưởng và tích lũy saponin ở rễ tóc sâm Ngọc Linh

ABSTRACT

The project "Investigation of the effects of organics substances on the rapid

multiplication of biomass and and saponin accumulation of Panax vietnamensis Ha

et Grushv hairy roots” were made from March to November 2019 at HCMC of Biotechnology Center

In this research, In-vitro hairy roots of Panax vietnamensis were formed from

the infection of Agrobacterium rhizogenes ATCC 15834 from wild type into the

stem of Ngoc Linh ginseng leaves, was used as material for examining the effect of organics such as yeast extract, pepton, L-tyrosine and casein hydrolysate on the ability to grow and accumulate saponins - the most valuable chemical of this ginseng After 60 days of culture, supplementation one of these organics into culture medium can stimulate growth of hairy roots and increase the saponins content Hairy root which cultured on SH medium supplemented with 60 g/l sucrose and four organic substances show the presence of different ginsenoside include G-Rg1, M-R2, V-R2, V-R2, G-Rb1, G-Rd and G-Rg2 when tested with HPLC method Experiments were designed on hairy root lines ( hairy root line 5) Each experiment was repeated 5 times, the results were shown below:

Experiment 1: Effect of yeast extract on stimulating growth and saponin

accumulate on hairy root of Panax vietnamensis The total saponin content and

amount of ginsenoside largest when supplemented 4 g/L yeast extract The analysis showed that at concentration of yeast extract at 4,0 g/L was most suitable for

stimulate growth and saponin acumulate on hairy root of Pannax Vietnamsis

Experiment 2: Effect of pepton on stimulate growth and saponin accumulate on

hairy root of Panax vietnamensis The results showed that peptones not affect dry

biomass growth but stimulated the synthesis of some saponins supplementing pepton stimulate synthesis of many saponins Total saponin content highest at concentration 1,0 g/L pepton

Experiment 3: Effect of L-tyrosine on stimulate growth and saponin accumulate

on hairy root of Panax vietnamensis The results showed that the higher the

concentration of L-tyrosine added in culture media, the higher the amount of saponin accumulate The analysis show that at concentration of L-tyrosine at 30,0 mg/L is most suitable for stimulate growth and saponin acumulate on hairy root of

Pannax vietnamsis

Experiment 4: Effect of casein hydrolysate on stimulate growth and saponin

accumulate on hairy root of Panax vietnamensis The results showed that

supplementing casein enhances synthesis of some saponins The analysis showed that at concentration of casein hydrolysate at 0,5 g/L have the highest effect

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

TÓM TẮT iii

ABSTRACT v

MỤC LỤC vii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT x

DANH MỤC BẢNG xi

DANH MỤC HÌNH xiii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

1.1.Giới thiệu chi Panax 5

1.2.Giới thiệu về sâm Ngọc Linh 7

1.2.1.Nguồn gốc và lịch sử phát triển 7

1.2.2.Phân loại 8

1.2.3.Danh pháp khoa học 9

1.2.4.Đặc điểm hình thái 9

1.2.5.Phân bố 11

1.2.6.Thành phần hóa học 12

1.2.7.Tác dụng dược lý của sâm Ngọc Linh 18

1.2.8.Tình hình nghiên cứu sâm Ngọc Linh bằng phương pháp nuôi cấy mô trên thế giới và Việt Nam 20

1.3.Một số yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy rễ tóc sâm Ngọc Linh 23

1.3.1.Nhiệt độ 23

1.3.2.Ánh sáng 24

1.3.3.Giá thể nuôi cấy 24

1.4.Elicitor và sự kích kháng trong nuôi cấy in vitro 24

1.4.1.Khái niệm 25

1.4.2.Phân loại 25

1.4.3.Dịch chiết nấm men 26

1.4.4.Peptone 27

1.4.5.L-tyrosine 27

1.4.6.Dịch thủy phân casein (Casein hydrolysate-CH) 28

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30

2.1.Địa điểm và thời gian thực hiện đề tài nghiên cứu 30

2.2.Vật liệu nghiên cứu 30

2.2.1.Vật liệu 30

2.2.2.Hóa chất và trang thiết bị thực hiện thí nghiệm 31

2.2.3.Môi trường nuôi cấy 32

2.2.4.Điều kiện thí nghiệm 32

2.3.Phương pháp nghiên cứu 33

2.4.Nội dung nghiên cứu 34

2.4.1.Khảo sát ảnh hưởng của dịch chiết nấm men (Yeast extract) lên sự tăng sinh khối và tích lũy saponin ở rễ tóc sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 34

2.4.2.Khảo sát ảnh hưởng của pepton lên sự tăng sinh khối và tích lũy saponin ở rễ tóc sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 35

2.4.3.Khảo sát ảnh hưởng của L-tyrosine lên sự tăng sinh khối và tích lũy saponin ở rễ tóc sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 36

2.4.4.Khảo sát ảnh hưởng của casein hydrolysate lên sự tăng sinh khối và tích lũy saponin ở rễ tóc sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 37

2.5.Phương pháp định lượng saponin bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 38

2.5.1.Tách chiết mẫu 38

2.5.2.Làm sạch mẫu 38

2.5.3.Phân tích trên HPLC 41

2.5.4.Tính kết quả 42

2.6.Thống kê và xử lý số liệu 43

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 44

3.1.Ảnh hưởng của dịch chiết nấm men (Yeast extract) lên sự tăng sinh khối và tích lũy saponin trong rễ tóc sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 44

3.2.Ảnh hưởng của pepton lên sự tăng sinh khối và tích lũy saponin ở rễ tóc sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 49

3.3.Ảnh hưởng của L-tyrosine lên sự tăng sinh khối và tích lũy saponin ở rễ tóc sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 54

3.4.Ảnh hưởng của casein hydrolysate lên sự tăng sinh khối và tích lũy saponin ở rễ tóc sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 58

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 64

1. Kết luận 64

2.Kiến nghị 64

TÀI LIỆU THAM KHẢO 65

PHỤ LỤC 0

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

2,4-D : 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid

ABA : Abscisic acid

BA : 6-benzyladenine

CĐHST : Chất điều hòa sinh trưởng thực vật

GA3 : Acid gibberellic

KLK : Khối lượng khô

KLT : Khối lượng tươi

LED : Light-Emmitting Diode

MeJA : Methyl jasmonate acid

MR2 : Majonoside-R2

MS : Môi trường Murashige và Skoog – 1962

NAA : α-Naphtaleneacetic acid

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Các loài thuộc chi Panax trên thế giới 6

Bảng 1.2 Hàm lượng một số saponin chính trong sâm Ngọc Linh (đã trừ độ ẩm) 13

Bảng 1.3 Hàm lượng saponin của sâm Ngọc Linh so với các loài Panax 14

Bảng 1.4 Saponin nhóm protopanaxadiol 14

Bảng 1.5 Các saponin dẫn chất của 20(s)-protopanaxatriol 15

Bảng 1.6 Dẫn chất của acid oleanolic 16

Bảng 1.7 Các saponin có cấu trúc ocotillol 16

Bảng 1.8 Các axid béo được tìm thấy 17

Bảng 2.1 Thí nghiệm khảo sát nồng độ Yeast extract (YE) lên khả năng tăng sinh khối và tích lũy saponin ở rễ tóc sâm ngọc linh (Panax vietnamensis ha et grushv.) 34

Bảng 2.2 Thí nghiệm khảo sát nồng độ pepton lên khả năng tăng sinh khối và tích lũy saponin ở rễ tóc sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 35

Bảng 2.3 Thí nghiệm khảo sát nồng độ L-tyrosine lên khả năng tăng sinh khối và tích lũy saponin ở rễ tóc sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 36

Bảng 2.4 thí nghiệm khảo sát nồng độ casein hydrolysate lên khả năng tăng sinh khối và tích lũy saponin ở rễ tóc sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 37

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của dịch chiết nấm men (Yeast extract) lên khả năng hình thành và tăng trưởng rễ tóc sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 44

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của dịch chiết nấm men (Yeast extract) lên khả năng tích lũy saponin trong rễ tóc sâm ngọc linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 47

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của pepton lên khả năng hình thành và tăng trưởng rễ

tóc sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 49

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của pepton lên khả năng tích lũy saponin trong rễ tóc

sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 52

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của L-tyrosine lên khả năng hình thành và tăng trưởng

rễ tóc sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 54

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của L-tyrosine lên khả năng tích lũy saponin trong rễ

tóc sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 57

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của casein hydrolysate lên khả năng hình thành và tăng

trưởng rễ tóc sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 59

Bảng 3.8 Ảnh hưởng của casein hydrolysate lên khả năng tích lũy saponin

trong rễ tóc sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 62

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Panax vietnamensis Ha et Grushv 8

Hình 1.2 Các cơ quan, bộ phận của cây sâm Ngọc Linh: 10

Hình 2.1 Rễ tóc sâm Ngọc Linh sử dụng làm vật liệu thí nghiệm 30

Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 33

Hình 2.3 Dịch chiết thô của sâm Ngọc Linh sau khi chiết 3 lần với methanol 38

Hình 2.4 Dịch chiết sau khi được tinh sạch bằng cột SPE C18 39

Hình 2.5 Quy trình tách chiết và thu hồi cao sâm Ngọc Linh 40

Hình 2.6 Máy HPLC dùng để phân tích hàm lượng thành phần saponin 43

Hình 3.1 Rễ tóc sâm Ngọc Linh sau 60 ngày nuôi cấy trên môi trường SH có bổ sung dịch chiết nấm men (Yeast extract) ở các nồng độ khác nhau 44

Hình 3.2 Rễ tóc sâm Ngọc Linh sau 60 ngày nuôi cấy trên môi trường SH có bổ sung dịch chiết nấm men (Yeast extract) ở các nồng độ khác nhau 45

Hình 3.3 Rễ tóc sâm Ngọc Linh sau 60 ngày nuôi cấy trên môi trường SH có bổ sung pepton ở các nồng độ khác nhau 50

Hình 3.4 Rễ tóc sâm Ngọc Linh sau 60 ngày nuôi cấy trên môi trường SH có bổ sung pepton ở các nồng độ khác nhau 50

Hình 3.5 Rễ tóc sâm Ngọc Linh sau 60 ngày nuôi cấy trên môi trường SH có bổ sung L-tyrosine ở các nồng độ khác nhau 55

Hình 3.6 Rễ tóc sâm Ngọc Linh sau 60 ngày nuôi cấy trên môi trường SH có bổ sung L-tyrosine ở các nồng độ khác nhau 55

Hình 3.7 Rễ tóc sâm Ngọc Linh sau 60 ngày nuôi cấy trên môi trường SH có bổ sung casein hydrolysate ở các nồng độ khác nhau 59

Hình 3.8 Rễ tóc sâm Ngọc Linh sau 60 ngày nuôi cấy trên môi trường SH có bổ sung casein hydrolysate ở các nồng độ khác nhau 60

MỞ ĐẦU

a Đặt vấn đề

Cây sâm Ngọc Linh là loài thân thảo, được biết đến chính thức đầu tiên ở Việt Nam vào ngày 19/3/1973 bởi dược sỹ Đào Kim Long, Nguyễn Châu Giang và

Nguyễn Thị Lê ở độ cao 1800 m thuộc dãy Ngọc Linh và đặt tên là Panax

articulatus Kim Long Đào [1] Đến năm 1985, tiến sĩ Hà Thị Dụng và giáo sư

Grushvisky đã xác định đây là một loài nhân sâm mới và đặt tên khoa học là

Panax vietnamensis Ha et Grushv., thường được gọi là sâm Việt Nam [1] Ngoài

ra, còn có một số tên gọi khác là sâm khu năm (sâm K5), sâm trúc (sâm đốt trúc,

trúc tiết nhân sâm), củ ngải, rọm con hay cây thuốc dấu của đồng bào dân tộc sống xung quanh chân núi Ngọc Linh [2]

Không chỉ có ý nghĩa về sinh học, sâm Ngọc Linh còn được xác định là một cây thuốc quý, có giá trị sử dụng cao [1] Hơn 30 năm qua, các nhà khoa học trong và ngoài nước đã chứng minh sâm Ngọc Linh là một trong những loại sâm quý hiếm và tốt nhất trên thế giới hiện nay, bên cạnh nhân sâm, sâm Nhật và sâm

Mỹ Sâm Ngọc Linh có tác dụng như loại thuốc tăng lực, chống lão hóa, hồi dương, tăng cường sức đề kháng, chống độc tố và kích thích điều hòa cơ chế miễn dịch của cơ thể [3] Đặc biệt, sâm Ngọc Linh có những tính năng mà sâm một số nước khác không có là tính kháng khuẩn, chống trầm cảm, hiệp lực tốt với thuốc kháng sinh, thuốc điều trị ung thư [3] Loài sâm quý và có giá trị kinh tế cao này thuộc danh mục sách đỏ cần được bảo tồn, nhưng bị khai thác quá mức ngoài tự nhiên Hơn nữa, việc sử dụng các hợp chất từ sâm Ngọc Linh vào sản xuất dược phẩm vẫn còn gặp rất nhiều khó khăn vì sâm Ngọc Linh khó nuôi trồng và nhân rộng, để thu hoạch được phải cần ít nhất 6 − 7 năm

Đến nay, nuôi cấy rễ được xem là một giải pháp thay thế đầy tiềm năng để thu nhận hoạt chất thứ cấp từ loài sâm quý hiếm này, do khả năng sản xuất ổn định được một lượng lớn sinh khối sạch trong thời gian ngắn [4] Phương pháp nuôi cấy

rễ tóc với những ưu điểm vượt bậc đã được khẳng định như: sinh trưởng nhanh, không hướng đất, không phụ thuộc vào chất điều hòa sinh trưởng ngoại sinh, bền

vững về mặt di truyền và tổng hợp hoạt chất thứ cấp với hàm lượng cao hơn hoặc bằng cây mẹ, tạo sinh khối lớn [5] Chính vì vậy, trong những năm gần đây việc nuôi cấy rễ tóc để thu nhận các hợp chất mang hoạt tính sinh học nhận được nhiều quan tâm của các nhà khoa học và những nhà kinh doanh

b Tính cấp thiết của đề tài

Trong nuôi cấy rễ sâm in vitro, việc bổ sung các elicitor giúp tăng đáng kể khả

năng tích lũy các hợp chất thứ cấp trong quá trình nhân nhanh sinh khối rễ [6] Acid amin là một nguồn nitơ hữu cơ (dạng khử) được chuyển hóa rất nhanh trong tế bào thực vật, kích thích tế bào sinh trưởng và phát triển nhanh hơn [7] Vì vậy, việc bổ sung acid amin vào môi trường nuôi cấy cung cấp cho tế bào và mô một nguồn nitơ

hữu cơ phù hợp ở một mức độ nhất định Nuôi cấy rễ sâm Ngọc Linh in vitro, dù

môi trường giàu dinh dưỡng giúp rễ phát triển nhanh, nhưng hàm lượng một số saponin phân tích được thấp Hơn nữa, quá trình tích lũy một số chất không diễn ra

do thiếu một số yếu tố kích kháng, dẫn đến hàm lượng saponin nội sinh thấp hơn so

với rễ thu ngoài tự nhiên, ví du như lượng saponin thu được ở nuôi cấy rễ Panax

ginseng chỉ bằng 1/3 so với trồng ngoài tự nhiên [8] Với lợi ích to lớn của các

elicitor và các chất hữu cơ trong việc tăng cường khả năng tích lũy các hợp chất

saponin trong nuôi cấy in vitro, việc nghiên cứu ảnh hưởng của cách chất hữu cơ

vào nuôi cấy rễ sâm Ngọc Linh là rất cần thiết Tuy nhiên, các nghiên cứu sử dụng các chất hữu cơ trên đối tượng sâm Ngọc Linh còn rất hạn chế, đặc biệt trên nuôi

cấy tạo rễ tóc là chưa có

Chính vì thế, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu “Khảo sát ảnh hưởng của các chất hữu cơ đến sự nhân nhanh sinh khối và tích lũy saponin ở rễ tóc sâm

Ngọc Linh (Panax vienamensis Ha et Grushv.)”

c Mục tiêu đề tài

Mục tiêu tổng quát: Khảo sát ảnh hưởng của các chất hữu cơ đến sự nhân nhanh sinh khối và tích lũy saponin ở rễ tóc sâm Ngọc Linh

Mục tiêu cụ thể: Xác định được các loại, nồng độ của các chất khác nhau lên

quá trình nhân nhanh sinh khối và tích lũy saponin (Rg1, M-R2, V-R2, V-R1,

G-Rb1, G-Rd, G-Rg2) quan trọng có trong rễ tóc sâm Ngọc Linh in vitro thông qua các chất (Pepton, Casein Hydrolysate, L-Tyrosine, Yeast extract – YE)

d Địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào thực vật của Phòng thực nghiệm cây trồng ở Trung tâm Công Nghệ Sinh Học thành phố Hồ Chí Minh

Đề tài nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sự nhân nhanh sinh khối và tích lũy saponin ở rễ tóc sâm Ngọc Linh nhờ nguồn mẫu cấy, thành phần môi trường, các chất hữu cơ, nguồn carbohydrate, các điều kiện môi trường nuôi cấy, điều kiện chiếu sáng Đề tài cũng sử dụng kỹ thuật HPLC để phân tích hàm lượng saponin có trong rễ tóc sâm Ngọc Linh

e Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

 Ý nghĩa khoa học

Đề tài nghiên cứu đã góp phần ghi nhận một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nhân nhanh sinh khối và tăng cường tích lũy các hợp chất saponin trong nuôi cấy rễ tóc sâm Ngọc Linh và các loài cùng chi nhân sâm hay các cây tương tự Thiết lập được những phương pháp phân tích định lượng saponin có trong mẫu cấy

 Ý nghĩa thực tiễn

Đề tài nghiên cứu thiết lập được môi trường nuôi cấy, điều kiện nuôi cấy tối ưu cho rễ tóc sâm Ngọc Linh tăng sinh trong thời gian ngắn nhất Đồng thời, nâng cao được chất lượng rễ thông qua việc sử dụng các chất hữu cơ để tăng hàm lượng các saponin (G-Rg1, M-R2, V-R2, V-R1, G-Rb1, G-Rd và G-Rg2)

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu chi Panax

Chi Panax thuộc giới Thực vật (Plantae), ngành Thực vật có hoa

(Magnoliophyta), lớp Hai lá mầm (Magnoliopsida), bộ Hoa tán (Apiales), họ Cam Tùng (Araliaceae) theo hệ thống phân loại mới nhất của Jun Wen thống kê lại 11

loài và 1 thứ loài của chi Panax [9]

Ở Việt Nam, ghi nhận có sự hiện diện của 4 loài thuộc chi sâm: Panax

pseudoginseng Wall, Panax bipinnatifidus Seem, Panax stipuleanatus H.T.Tsaiet K.M.Feng và Panax vietnamensis Ha et Grushv Đây là loài thứ 11 được phát hiện

trong vòng 30 năm gần đây, là loài mới đối với khoa học và là loài đặc hữu trong hệ thực vật Việt Nam [9]

Chi sâm là cây thảo mộc, sống nhiều năm, cao 0,4 – 0,8 m Thân rễ (củ) nạc gồm nhiều đốt, phân nhánh, nằm ngang, đường kính 1,5 – 2,5 cm, phần đầu có nhiều vết sẹo do thân khi sinh tàn lụi, người ta dựa vào sẹo trên thân rễ để tính tuổi của sâm, chiều dài rễ tùy theo số năm sinh trưởng Lá kép chân vịt, gồm 2 − 3 cái, mọc vòng, lá chét thuôn, dài 10 – 14 cm, rộng 3 – 5 cm, gốc nhọn, mép khía răng cưa, cuống lá chét ngắn dưới 1 cm [9]

Cụm hoa tán, mọc ở ngọn, thường gồm 1 tán, cá biệt có tán phụ, cuống cụm hoa dài 15 – 30 cm Hoa nhỏ, màu trắng ngà, cuống hoa 1 – 1,5 cm, đài 5, hợp ở gốc, hình tam giác, 5 cánh hoa hình tam giác rộng, nhị 5, chỉ nhị mảnh, bầu 2 ô, cá biệt 1

ô, bầu nhụy có 2 – 3 lá noãn, đầu nhụy chẻ đôi [9]

Quả hình cầu hoặc hình cầu hơi dẹt, đường kính 0,6 – 1,0 cm, khi chín màu đỏ hoặc cam, có chấm đen Hạt 1 – 2, gần tròn, đường kính 2 – 3 mm, dài 3 – 4 mm, màu trắng xám [9]

Vùng phân bố của chi này ở Bắc Bán Cầu, từ Himalaya đến Đông Bắc Trung Quốc, vùng Viễn Đông nước Nga, Hàn Quốc, Nhật Bản và Việt Nam Sâm có tác dụng tốt và được nhiều người ưa dùng, cho nên một số loài như Nhân sâm đã được trồng hàng nghìn hecta tại Hàn Quốc, Trung Quốc và Bắc Mỹ [9]

Bảng 1.1 Các loài thuộc chi Panax trên thế giới

Panax bipinnatifidus Seem Nhân sâm Himalaya

Trung Quốc (Yunnan)

Trung Quốc (Yunnan), Việt Nam

(Dwarf, Peanut ginseng)

Bắc Mỹ

Panax vietnamensis Ha et

Grushv

Sâm Ngọc Linh (Vietnamese ginseng)

Trung Quốc (Yunnan)

(Nguồn: http://www.theplantlist.org/browse/A/Araliaceae/Panax)

Tác dụng: Sâm Ngọc Linh nói riêng và Nhân sâm nói chung có vai trò quan trọng trong dự phòng và điều trị các bệnh mãn tính như: bệnh tiểu đường, ung thư,

sơ vữa động mạch, huyết khối, lipid máu, cao huyết áp, thiểu năng tuần hoàn não…

do có tác dụng tăng cường thể lực và gia tăng sức đề kháng của cơ thể

1.2 Giới thiệu về sâm Ngọc Linh

Năm 1973, đoàn điều tra dược liệu Ban Dân Y khu 5 do dược sỹ Đào Kim Long

và Nguyễn Châu Giang hướng dẫn, đã phát hiện được một loài Panax mọc thành

quần thể ở độ cao 1800 m tại vùng Đắc Lây, huyện Đắc Tô, tỉnh Kon Tum và đặt

tên là “sâm Đốt trúc” với tên khoa học sơ bộ xác định là Panax articulatus L., họ

nhân sâm (Araliaceae) [10]

Đến năm 1974, với kết quả phân tích sơ bộ về thành phần hóa của rễ củ Sâm K5

so với Sâm Triều Tiên và rễ củ Tam thất, Nguyễn Thới Nhâm đã có 4 đề nghị sau đây gửi về Khu ủy khu 5 để bảo vệ cây Sâm này trong hoàn cảnh các đoàn đi B tấp nập qua vùng này, luôn tìm cây thuốc bổ, cây Sâm để dùng [10]

Ngày 14/3/1978, Bộ Y tế ra quyết định thành lập đơn vị nghiên cứu chuyên đề Sâm khu 5 đặt tại Trường Đại học Y dược Thành phố Hồ Chí Minh Nhiệm vụ được giao: Nghiên cứu toàn diện cây Sâm Khu 5 để làm thuốc [11]

Trong 3 năm từ 1978 − 1980, Bộ Y tế phối hợp với UBND tỉnh Gia Lai - Kon Tum và Quảng Nam − Đà Nẵng đã tổ chức điều tra, khảo sát ở độ cao 1700 m tại 13

xã của 3 huyện thuộc 2 tỉnh, phát hiện 108 vùng Sâm mọc tập trung Kết quả khoanh vùng bảo vệ đã đo vẽ 136 bản đồ Dựa theo địa hình đã khoanh thành 11

“chốt” để bảo vệ, khai thác và phát triển trồng [10]

Từ năm 1978 − 1979, phối hợp với Bộ môn Thực vật học của Trường Đại học tổng hợp Thành phố Hồ Chí Minh đã tiến hành cuộc điều tra sơ bộ Thực vật vùng Tây Nam núi Ngọc Linh, dưới sự hướng dẫn của Ts Lê Công Kiệt đã có sơ bộ kết luận như sau: vùng núi Ngọc Linh là điểm hội tụ của nhiều luồng di trú thực vật khác nhau từ phương Bắc xuống, từ vùng núi Himalaya và Indonesia đến, dựa trên

cơ sở sự có mặt các đại diện tiêu biểu các loại cây của các vùng trên, do đó đã tạo ra

sự đa tạp nguồn gốc các thành phần thực vật ở đây Vùng núi Ngọc Linh còn có thể được xem là 1 “lò” cây họ Nhân sâm vì đã phát hiện được tại đây 16 loài cây họ này [10]

Từ năm 1980, do khai thác quá mức và không kiểm soát dẫn đến cạn kiệt nên Sâm Ngọc Linh đứng trước nguy cơ tuyệt chủng cần được các cấp chính quyền và nhân dân tập trung bảo tồn và phát triển nguồn dược liệu quí hiếm này [10]

- Loài : Panax vietnamensis Ha et Grushv

- Tên khác : Sâm Việt Nam, Sâm Ngọc Linh,

Sâm Khu Năm, Thuốc Dấu

- Tên nước ngoài : Vietnamese ginseng

(Nguồn: http://www.nhansamngoclinh.com)

Hình 1.1 Panax vietnamensis Ha et Grushv

1.2.3 Danh pháp khoa học

Dược sĩ Đào Kim Long đã đặt tên khoa học của cây sâm Ngọc Linh này là

Panax articulates KL Dao (trong kháng chiến để giữ bí mật nên thường gọi là sâm

K5) Sau 12 năm, tên Nhân Sâm Việt Nam và tên khoa học là Panax vietnamesis Ha

et Grushv., họ Cam Tùng Araliaceae, được công bố tại Viện Thực Vật Kamarov (Liên Xô cũ) năm 1985, do Hà Thị Dụng và I V Grushvistky đặt tên Áp dụng quy tắc quốc tế về danh pháp thực vật công bố năm 1994 (ICBN – Tokyo code), điều 1, mục 3, phần C, danh pháp khoa học của sâm Ngọc Linh có thể được nối tên của người thứ hai công bố với tên người thứ nhất qua chữ ex, và khi đó tên khoa học của cây nhân sâm Ngọc Linh được viết hợp pháp theo luật quốc tế hiện nay sẽ phải

là Panax articulatus KL Dao (1973) ex Ha et Gruskv (1985) [11]

1.2.4 Đặc điểm hình thái

a Đặc điểm của thân rễ

Sâm Ngọc Linh thuộc dạng cây thân thảo, sồng nhiều năm nhờ thân rễ, cao khoảng 40 − 60 cm, đôi khi cao trên 1 m Thân rễ nạc, đường kính 1 − 3,5 cm, chiều dài tùy theo số năm sinh trưởng, màu vàng nhạt hay màu vàng đất, có nhiều đốt, mang nhiều vết sẹo, mỗi vết sẹo tương đương với 1 năm tuổi Thân rễ mang nhiều

rễ con và những vết nhăn dọc, dễ bẻ gãy, mùi thơm nhẹ, vị đắng hơi ngọt Ở cuối thân rễ có rễ củ thường ít phát triển, có dạng con quay, hình trụ, đôi khi có dạng hình người, màu vàng nhạt, mang nhiều rễ con và có vân ngang Thân rễ to nhất được phát hiện năm 1978 dài 90 cm, có 62 vết sẹo và nặng 710 g [12]

Thân mọc thẳng đứng, màu xanh hoặc hơi tím, đường kính 5 − 8 mm, thường rụng hằng năm sau mùa sinh trưởng Tuy vậy, đôi khi có 2 − 3 thân vẫn tồn tại vài năm Thân rễ có thể phát nhánh nhiều lần và hình thành một bụi sâm, nhưng rất hiếm Cây sâm thường héo chết vào mỗi mùa đông, để rồi mọc trở lại từ củ sâm vào đầu mùa xuân [12]

b Đặc điểm của lá

Lá kép hình chân vịt, mọc ở đỉnh thân Cuống lá kép dài 1 – 2 cm, mỗi lá kép thường có 5 lá chét hình trứng ngược, hình mác hoặc bầu dục, mép khía răng cưa, đầu lá nhọn, đôi khi có mũi nhọn, gốc lá hình nêm Lá chét ở giữa lớn nhất, dài 15

cm, rộng 3 – 5 cm Gân lá hình lông chim, thường có 10 cặp, gân phụ hình mạng Phiến lá màu xanh lục, mảnh, dễ rách, có nhiều lông cứng dài 1-2 mm, mặt dưới ít hơn [13]

c Đặc điểm của hoa

Hoa màu vàng nhạt, đường kính 3 – 4 mm, gồm 5 lá dài hợp thành hình chuông, trên chia thành 5 răng nhỏ, hình tam giác, dài 1 – 1,5 mm, 5 cánh hoa, 5 nhị màu trắng, dài 1,5 – 2 mm Bao phấn hình xoan, đỉnh lung, đĩa hoa hơi lồi Bầu cao 1 – 1,5 mm, có 2 lá noãn, nhưng thường chỉ có 1 lá noãn phát triển Hoa thường nở vào buổi sáng từ 9 giờ đến 11 giờ, lúc này nhiệt độ không khí khoảng18 – 20oC và độ

ẩm 85 – 90% Hoa nở dần từ ngoài vào và từ dưới lên Đài hoa rụng 1 – 2 ngày sau khi nở và tán bắt đầu kết quả Mùa hoa thay đổi tùy theo vùng nhưng thường bắt đầu từ tháng 4 đến tháng 6 [13]

d Đặc điểm của quả và hạt

Quả mọng khi chín màu đỏ tươi, có chấm đen không đều ở đỉnh Quả chủ yếu

có một hạt hình thận, một số ít quả hình cầu dẹt chứa 2 hạt và số quả trên cây bình quân khoảng 10 đến 30 quả Quả có chứa 3 hạt hay hơn đến nay chưa tìm thấy [13]

Hình 1.2 Các cơ quan, bộ phận của cây sâm Ngọc Linh:

thân và lá (a), hoa (b), quả (c), củ (d)

(Nguồn: http://www.nhansamngoclinh.com)

1.2.5 Phân bố

Trong số hơn mười loài và dưới loài đã biết của chi Nhân Sâm (Panax), ở Việt

Nam có ba loại mọc tự nhiên và một loại là cây nhập trồng Sâm Ngọc Linh được phát hiện sau cùng vào năm 1973 Đến năm 1985 nó mới được công bố là hoàn toàn mới đối với khoa học Đến nay Sâm Ngọc Linh được phát hiện ở vùng núi Ngọc Linh thuộc hai tỉnh Quảng Nam và Kon Tum [14]

Ngọc Linh là dãy núi cao thứ hai của Việt Nam Có tọa độ địa lý từ 107⁰50’ 108⁰7’ kinh Đông và từ 14⁰44’ – 15⁰13’ vĩ Bắc, đỉnh cao nhất là Ngọc Linh cao

-2598 m Những điểm vốn trước đây có sâm Ngọc Linh mọc tự nhiên từ độ cao khoảng 1500 – 2000 m, chủ yếu tập trung ở 1800 – 2000 m, thuộc địa bàn hai huyện Đăk Tô (Tỉnh Kon Tum) và Trà Vinh (tỉnh Quảng Nam) Về giới hạn cũng như phân bố của loài sâm này ở núi Ngọc Linh hiện nay đã có nhiều thay đổi, những nghiên cứu thực địa mới nhất cho thấy sâm còn mọc cả ở núi Ngọc Lum Heo thuộc xã Phước Lộc, huyện Phước Sơn, tỉnh Quảng Nam, đỉnh núi Ngọc Am thuộc Quảng Nam, Đắc Glây thuộc Kontum, núi Langbian ở Lạc Dương tỉnh Lâm Đồng cũng rất có thể có loại sâm này [1]

Sâm mọc tập trung dưới chân núi Ngọc Linh, một ngọn núi cao 2598 m với lớp đất vàng đỏ trên đá granit dày trên 50 cm, có độ mùn cao, tơi xốp và rừng nguyên sinh còn rộng, nên được gọi là sâm Ngọc Linh [14]

Sâm Ngọc Linh thường mọc dưới tán rừng ẩm, nhiều mùn, thích hợp với nhiệt

độ ban ngày từ 20⁰C – 25⁰C ban đêm 15⁰C – 18⁰C Tổng lượng mưa trung bình năm của vùng sâm là từ 2600 – 3200 mm Nhiệt độ trung bình năm dao động từ 15 – 18,5⁰C Tổng lượng bốc hơi trung bình năm từ 670 – 770 mm Độ ẩm trung bình

từ 85,5 – 87,5% Chúng mọc dày thành đám dưới tán rừng dọc theo các suối ẩm trên những mảnh đất nhiều mùn [14]

1.2.6 Thành phần hóa học

a Hợp chất saponin

Hợp chất saponin được xem là thành phần hoạt chất chủ yếu của cây sâm Ngọc Linh cũng như của các loài sâm khác trên thế giới Từ phần dưới mặt đất của sâm Ngọc Linh hoang dại đã được phân lập và xác định được cấu trúc protopanaxadiol oxid II và 52 hợp chất saponin có cấu trúc mới được đặt tên là vina-ginsenoside-R1-R24 và 20-O-Me-G.Rh1 Các saponin dammaran được xem là hoạt chất quyết định cho các tác dụng sinh học có giá trị của sâm Triều Tiên cũng chiếm một tỉ lệ rất cao

về hàm lượng và số lượng trong thành phần hợp chất saponin của sâm Ngọc Linh (50/52 saponin được phân lập) Trong đó các saponin dẫn chất của 20(S)-protopanaxadiol gồm 22 hợp chất với các đại diện chính là: ginsenoside-Rb1, -Rb3, -

Rd Các saponin dẫn chất của 20(S)-protopanaxatriol gồm 17 hợp chất với các đại diện chính là: ginsenoside-Re, -Rg1, notoginsenoside-R1 và -R2 Đặc biệt, M-R2 chiếm gần 50% hàm lượng saponin toàn phần từ dưới mặt đất của sâm Ngọc Linh

so với thành phần saponin trong các loài sâm khác trên thế giới và gấp 48 lần hiệu

suất chiết được từ Đại Diệp Tam Thất (Panax japonicum C A Mey Var major

(Bukk) C Y Wu et K M Feng) Hai saponin dẫn chất của acid oleanolic chỉ chiếm một tỉ lệ rất thấp với hemsloside –Ma3 được phát hiện đầu tiên trong một loài Panax

thuộc họ Nhân sâm Hợp chất này trước đây đã được phân lập từ Hemsleya

macrosperma C.Y.Wu họ Bầu bí (Cucurbitaceae) [15]

Sâm Ngọc Linh có 52 thành phần saponin được chia thành 4 nhóm chính:

Quốc chỉ có nhóm saponin dammaran, không có saponin olean Cả ba được xem là những loài sâm quý hiện nay Tuy nhiên chỉ có sâm Việt Nam mới có hợp chất saponin dammaran kiểu ocotillol với majonoside R2 (M-R2) chiếm hơn 50% hàm lượng saponin có trong sâm Việt Nam Thành phần này quyết định những khác biệt của sâm Việt Nam so với sâm Triều Tiên và sâm Trung Quốc trong trị liệu [16]

Bảng 1.2 Hàm lượng một số saponin chính trong sâm Ngọc Linh (đã trừ độ ẩm)

Bảng 1.3 Hàm lượng saponin của sâm Ngọc Linh so với các loài Panax [14]

(Ghi chú: 20(S)-ppd: 20(S)-protopanaxadiol; 20(S)-ppt: 20(S)-protopanaxatriol)

Panax quinquefolius

Panax vietnamensis

Bảng 1.5 Các saponin dẫn chất của 20(S)-protopanaxatriol [14]

Bảng 1.6 Dẫn chất của acid Oleanolic [14]

Bảng 1.7 Các saponin có cấu trúc ocotillol [14]

b Hợp chất polyacetylen

Có 7 hợp chất đã được phân lập, 5 hợp chất đã được xác định cấu trúc với panaxynol và heptadeca-1,8(E)-dien-4,6-diyn-3,10-diol là 2 polyacetylen chính yếu Hai hợp chất mới là 10 acetoxy-heptadeca-8(E)-en-4,6-diyn-3-ol và heptadeca- 1,8(E),10(E)-trien-4-6-diyn-3,10-diol [14]

1.2.7 Tác dụng dược lý của sâm Ngọc Linh

Sâm Ngọc Linh sở dĩ trở thành loại dược liệu quý hiếm vì thành phần dược liệu trong sâm Ngọc Linh tự nhiên có thể xếp hàng đầu trong những loại sâm đã được tìm thấy trước đó Dược tính của sâm Ngọc Linh rừng phát huy tác dụng hiệu quả trong việc chữa bệnh, cải thiện sức khỏe con người

 Tác dụng chống oxy hóa

Trên thí nghiệm in vitro dùng dịch nổi của dịch não, gan và phân đoạn vi thể

gan của mô não chuột và phân đoạn vi thể gan của chuột nhắt trắng, saponin sâm Ngọc Linh ở nồng độ 0,05 – 0,5 mg/kg có tác dụng chống oxy hóa, ức chế sự hình thành MDA (malonyl chadehyd) là sản phẩm của quá trình oxy hóa lipid màng sinh học [14]

Saponin sâm Ngọc Linh và saponin sâm Triều Tiên (nồng độ 0,05 – 0,5 mg/mL) ngăn chặn sự hình thành sản phẩm TBA-RS của quá trình oxy hóa lipid trong mô não, dịch đồng thể tế bào gan và vi thể gan Tác động này tương tự như vitamin E (nồng độ 10 – 100 M) là một chất antioxidant điển hình [17]

 Tác dụng trên hệ tim mạch và huyết áp

Sâm Ngọc Linh có tác dụng điều hòa hoạt động tim mạch, nâng cao huyết áp trong các trường hợp hạ áp do mất máu Sâm Ngọc Linh còn thể hiện tác động phòng chống xơ vữa động mạch ở liều 50 – 500 mg/kg theo cơ chế giảm cholesterol huyết, giảm lipid toàn phần và lipoprotein, tăng hàm lượng HDL (lipoprotein có nhiệm vụ vận chuyển cholesterol vào nội bào) [17]

 Tác dụng với bệnh tiểu đường

Khi sử dụng ở liều 50 mg/kg có tác dụng hạ đường huyết và hiệp lực với sulfamid hạ đường huyết (Diabinese) và Insulin [17]

 Tác dụng chống trầm cảm

Theo thống kê của bệnh viện Tâm thần TW, tỉ lệ người có biểu hiện các triệu chứng của bệnh trầm cảm chiếm khoảng 5 − 7%, trong đó phụ nữ chiếm tỉ lệ mắc bệnh cao

Sâm Ngọc Linh được chứng minh có tác dụng chống trầm cảm ở liều uống một lần 200 mg/kg và liều 50 − 100 mg/kg khi được cho uống trong thời gian 7 ngày Majonoside-R2 (3,1 – 12,5 mg/kg, liều tiêm phúc mô) cũng đã được chứng minh có tác dụng chống trầm cảm trên súc vật bình thường [17]

Stress cô lập trong thời gian 4 tuần làm gia tang mức độ trầm cảm của súc vật thử nghiệm đạt ý nghĩa thống kê so với nhóm bình thường Bột chiết sâm Ngọc Linh (liều uống 100 mg/kg) thể hiện tác dụng ức chế sự gia tăng mức độ trầm cảm

do stress cô lập của súc vật thử nghiệm đạt ý nghĩa thống kê, tương tự như Fluoxetine (Prozac, liều uống 20 mg/kg) Bột chiết sâm Triều Tiên (liều uống 100 mg/kg) chưa thể hiện tác dụng ức chế sự gia tăng mức độ trầm cảm do stress cô lập [17]

Majonoside-R2 (liều tiêm phúc mô 12,5 mg/kg) thể hiện tác dụng ức chế sự gia tăng mức độ trầm cảm gây ra do stress cô lập, tương tự như các thuốc chống trầm cảm điển hình Desipramine (thuộc nhóm tricyclic, 20 mg/kg) và Fluoxetine (thuộc nhóm ức chế thụ thể serotonin, 30 mg/kg) [17]

 Tác dụng kích thích miễn dịch

Bột chiết sâm Ngọc Linh liều uống 500 mg/kg và majonoside R2 tiêm trong

màng bụng có tác dụng làm tăng chỉ số thực bào trong thí nghiệm in vitro và in vivo

ở chuột nhắt trắng [14]

Dùng liều Escherichia coli gây chết chuột nhắt trắng Nếu kết hợp dùng sâm và

majonoside R2 với liều như trên sẽ làm tăng tỷ lệ số chuột sống sót Có lẽ do thuốc

làm tăng tác dụng thực bào với E.coli [14]

 Tác dụng chống ung thư

Hoạt chất majonoside-R2 có tác động ức chế cả giai đoạn bắt đầu và giai đoạn tiến triển của ung thư biểu mô da chuột được gây bằng nitric oxide phối hợp

với 12-O-tetredecanoylphorbol-13 acetate (TPA) hay peroxynitrite phối hợp với

TPA [16]

 Tác dụng kháng khuẩn

Sâm Ngọc Linh thể hiện tính kháng khuẩn trên các chủng vi khuẩn gram dương,

có tác dụng kháng khuẩn đặc hiệu trên các chủng vi khuẩn Staphylococcus và

Streptococcus gây viêm họng Tác dụng kháng khuẩn của sâm Ngọc Linh tương

đương với một số kháng sinh thông dụng và không gây ảnh hưởng trên hệ vi khuẩn lành tính ở ruột như kháng sinh [2]

1.2.8 Tình hình nghiên cứu sâm Ngọc Linh bằng phương pháp nuôi cấy mô trên thế giới và Việt Nam

a Trên thế giới

Trong thời gian hiện nay, phương pháp nuôi cấy mô đã trở thành một công cụ mạnh mẽ để phát triển các phương pháp vi nhân giống cho cây sâm Ngọc Linh Đối với các loài sâm, khả năng tích lũy các hợp chất saponin có ý nghĩa rất lớn trong các ngành sản xuất dược phẩm Do vậy, một nghiên cứu cũng đã xác định các loại và nồng độ auxin tối ưu lên sự hình thành cơ quan và sản xuất saponin từ nuôi

cấy rễ bất định Panax ginseng C.A Meyer Rễ và chồi phát triển trong môi trường

có chứa 2,4-D, NAA và đặc biệt là IBA có sự gia tăng hàm lượng các ginsenoside nhóm Rb hơn là nhóm Rg [19] Palazon đã tiến hành bước đầu sản xuất ginsenoside

từ nuôi cấy rễ tơ Panax ginseng trong Bioreactor cải tiến [20]

Một nghiên cứu gần đây về sự phát sinh phôi từ rễ của Panax assamicus

khoảng 4 năm tuổi Đầu tiên là nhân nhanh mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 5,0 mg/L 2,4-D Mô sẹo 8 tuần tuổi được cấy chuyển sang môi trường MS có bổ sung 5,0 mg/L 2,4-D kết hợp với 0,5 mg/L BAP để tạo mô sẹo có khả năng phát sinh phôi Sau 3 tháng nuôi cấy trên cùng một môi trường thì hình thành phôi Sự nảy mầm của phôi đạt cao nhất khi nuôi cấy trong môi trường ½ MS có bổ sung 1,5 mg/L acid gibberellic Cây con từ phôi sau 4 – 5 tháng được đưa ra vườn ươm trồng với tỷ lệ sống sót 70% [21]

Nghiên cứu sự phát sinh phôi từ thân rễ của loài Panax seudoginseng thông qua nuôi cấy lớp mỏng tế bào Các thân rễ được cắt theo chiều ngang có kích thước (0,5; 1,0 và 3,0 mm) sau đó cấy vào môi trường MS và SH có bổ sung 2,4-D ở các nồng độ khác nhau để cảm ứng tạo mô sẹo Để cảm ứng31tạo phôi soma trên hai loại môi trường (MS và ½ MS) Kết quả thu được mẫu thân rễ cắt theo chiều ngang với kích thước 0,5 mm cho khả năng tạo mô sẹo cao nhất trong môi trường MS (84,32%) còn trong môi trường SH chỉ đạt (48,24%) khi có bổ sung 2,4-D Sự hình thành phôi đạt cao nhất (56,66%) khi mẫu được nuôi cấy trong môi trường MS có

bổ sung 2,5 mg/L BAP và 2,4-D, môi trường ½ MS chỉ đạt (40%), tuy nhiên số phôi nhiều nhất (20,60) lại thu được trong môi trường ½ MS khi bổ sung 2,5 mg/L KIN

và 2,4-D Tỷ lệ phôi phát triển thành cây (28,33 ± 0,30) trên môi trường ½ MS với 1,0 mg/l GA3 Các cây con được đưa ra vườn ươm trồng trong giá thể đất đen, mùn

và rơm với tỷ lệ 2:1:1 với tỷ lệ sống sót 70% [22]

Nuôi cấy tế bào của sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) để sản

xuất sinh khối và sản phẩm trao đổi chất 26 thứ cấp ginsenoside Ở nồng độ môi trường MS với tỷ lệ 50% và 100% đường là thích hợp cho sự tích luỹ sinh khối tế bào và sự tổng hợp sản phẩm thứ cấp ginsenoside Nồng độ 30 mM nitrogen là tối

ưu cho sự sinh trưởng tế bào và sự tích luỹ sản phẩm trao đổi chất thứ cấp ginsenoside Trong nghiên cứu ảnh hưởng của các nguyên tố đa lượng trong môi trường nuôi cấy thì khi bổ sung NH4NO3 với nồng độ 0,5 g/L hà lượng ginsenoside thu được (6,54 mg/g khối lượng khô) Sinh khối tế bào và thành phần ginsenoside tăng đáng kể khi bổ sung 1,5 g/L CaCl2 vào môi trường, với sự tích lũy sản phẩm ginsenoside thu được (5,75 mg/g khối lượng khô) [23], [24]

b Tại Việt Nam

Trong những năm gần đây, sâm Ngọc Linh được biết đến bởi giá trị dược tính cao Vì thế việc khai thác, mua bán sâm Ngọc Linh ngày càng tràn lan dẫn đến nguy

cơ bị tuyệt chủng của giống sâm quí Do đó, để bảo tồn nguồn gene quý đồng thời nghiên cứu để làm sáng tỏ thêm về thành phần hoạt chất chính của chúng, các nhà khoa học đã tiến hành nghiên cứu và nhân giống sâm Ngọc Linh

“Nghiên cứu tạo rễ tóc sâm Ngọc Linh Panax vietnamensis bằng phương pháp chuyển gen rol nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes ATCC 15834 hoang dại

vào cuốn lá sâm Ngọc Linh” Kết quả thu nhận được một số dòng rễ tóc sâm ngọc

linh chuyển gen từ nguồn mẫu lây nhiễm là lá và cuống lá của cây sâm in vitro Đặc

biệt là cuống lá sau khi lây nhiễm 5 tuần cho hiệu quả chuyển gen cao hơn so với mẫu lá Những rễ này được khẳng định là đã thay đổi thông tin di truyền so với rễ không chuyển gen, bằng sự có mặt của gen rolC Những kết quả thí nghiệm thu được đã khẳng định việc chuyển gen tạo rễ tóc sâm ngọc linh thông qua vi khuẩn

trung gian là Agrobacterium rhizogenes ATCC 15834 Tác giả đã nuôi cấy thành

công rễ tóc sâm ngọc linh trên môi trường thạch và trên môi trường nuôi lỏng lắc không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật đã khẳng định hướng đi đúng đắn, nhiều tiềm năng hứa hẹn cho ứng dụng trong nhân sinh khối rễ tóc để thu nhận hoạt chất saponin trong tương lai Việc không dùng các chất điều hòa sinh trưởng trong nhân sinh khối rễ sâm giúp loại bỏ được những ảnh hưởng không mong muốn đến sức khỏe người sử dụng và tính an toàn của sản phẩm [25]

Năm 2010, Dương Tấn Nhựt và cộng sự đã nhân giống in vitro và trồng thử

nghiệm ở vườn ươm Trong giai đoạn tăng trưởng chồi, môi trường ½MS được bổ sung 1,0 mg/L BA và 0,5 mg/L NAA, 50 g/L sucrose, 2,0 g/L than hoạt tính và được đặt trong điều kiện ánh sáng đèn LED 70% đỏ và 30% xanh là tốt nhất Sau 6 tháng trồng 1000 cây sâm in vitro ngoài khu vực vườn ươm cho thấy, tốc độ sinh trưởng là nhanh hơn so với cây sâm Ngọc Linh gieo bằng hạt với tỷ lệ sống sót là 87% [26]

Nguyễn Bảo Triệu và cộng sự (2012) cũng đã tiến hành nghiên cứu nuôi cấy in

vitro sâm Ngọc Linh trên môi trường MS bổ sung 1,0 mg/L 2,4-D, 0,2 mg/L TDZ

và trên môi trường SH bổ sung 1,0 mg/L BA, 0,5 mg/L NAA [27]

Một nghiên cứu mới nhất năm 2017 về các nano kim loại được thêm vào môi trường MS không có hormone sinh trưởng để đánh giá tác động của chúng lên sự phát triển của rễ bên sâm Ngọc Linh gồm nZnO (0,5 – 2,5 mg/L), nAg (1,0 – 3,0 mg/L) và nCu (1,0 – 3,0 mg/L) Kết quả cho thấy, trong các loại nano thì nano Cu ở

nồng độ 1,5 mg/L là tối ưu nhất cho sự hình thành rễ bên sâm Ngọc Linh (với 99,3%) Ngoài ra, 2,5 mg/L nAg cũng giúp tăng đáng kể sự phát triển rễ bên sâm Ngọc Linh Khi bổ sung các nano kim loại ở nồng độ cao trên 2,5 mg/L gây ức chế

sự hình thành rễ Đặc biệt, khi bổ sung nZnO (0,5 – 2,5 mg/L) đã làm giảm đáng kể

số rễ và trên 2 mg/L nZnO giảm cả phần trăm ra rễ [28]

Một nghiên cứu mới đây về ảnh hưởng của các elicitor sinh học và phi sinh học đến sinh khối và hàm lượng saponin của rễ thứ cấp trong nuôi cấy lỏng lắc rễ bất định sâm Ngọc Linh Kết quả cho thấy, hầu hết các elicitor làm giảm đáng kể sinh khối khô rễ thứ cấp so với đối chứng (ngọai trừ bổ sung 50 – 100 mg/L dịch chiết nấm men và 50 µl/L salicylic acid) Tuy nhiên, tất cả các elicitor đều có hiệu quả lên quá trình tích lũy saponin; trong đó, elicitor phi sinh học có hiệu quả gia tăng tích lũy saponin hơn các elicitor sinh học Jasmonic acid cho kết quả tối ưu nhất so với các elicitor khác về tổng 3 loại saponin ở nồng độ 150 µl/L, Rg1 ở 100 µl/L, Rb1

ở 50 µl/L và MR2 ở 200 µl/L trong việc gia tăng đáng kể các saponin Tuy nhiên, khi đánh giá hiệu quả tích lũy saponin trên tổng khối lượng rễ thu được cho thấy

150 mg/L YE đem lại hiệu quả tích lũy tốt nhất (0,88 mg) [29]

1.3 Một số yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy rễ tóc sâm Ngọc Linh

Trong quá trình nuôi cấy rễ tóc để sản xuất hợp chất thứ cấp có rất nhiều yếu tố như nhiệt độ, ánh sáng, giá thể nuôi cấy ảnh hưởng đến sinh trưởng và tạo sản phẩm trao đổi thứ cấp Các yếu tố Ngoài ra, ảnh hưởng của các elicitor làm tăng mức trao đổi thứ cấp được coi là có tác động mạnh mẽ trong việc nuôi cấy rễ tóc sản xuất hợp chất thứ cấp

1.3.1 Nhiệt độ

Nhiệt độ cao kích thích sự biến dưỡng của tế bào, thích hợp cho sự khởi tạo sơ khởi rễ Người ta cho rằng, nếu nuôi cấy ra rễ trong điều kiện sáng thì nhiệt độ kích thích ra rễ là 30 – 35C, còn nếu nuôi trong điều kiện tối thì nhiệt độ khoảng 20 – 25ºC là thích hợp [30]

1.3.2 Ánh sáng

Ánh sáng thường được cho là tác nhân ức chế sự hình thành rễ, đặc biệt là ở giai đoạn hình thành sơ khởi rễ Ánh sáng đỏ rất quan trọng cho sự kéo dài thân, đáp ứng với phytochrome và thay đổi cấu trúc giải phẫu [31] Ánh sáng xanh không ảnh hưởng đến số lượng rễ tạo thành nhưng làm gia tăng sự kéo dài rễ Nguyên nhân là

do ánh sáng xanh thúc đẩy sự phân hủy IAA nhờ tăng cường tổng hợp các phenylalanin và một số phenol mạch đơn [30]

1.3.3 Giá thể nuôi cấy

Có thể nói sự tăng trưởng của rễ chịu ảnh hưởng bởi cấu trúc và thành phần của giá thể nuôi cấy Agar là một dẫn xuất của rong biển, là một hợp chất polysaccharide cao phân tử Agar được sử dụng như một nhân tố làm đông trong hầu hết môi trường dinh dưỡng Vì agar liên kết với nước và hấp thu các hợp chất từ môi trường nên người ta nghĩ rằng, agar hạn chế sự hấp thu các chất điều hòa tăng trưởng Agar có thể có những ảnh hưởng về vật lý như hạn chế sự kéo dài rễ, và rễ

trở nên dày hơn nhờ sự trương phồng, tỏa tròn của tế bào Ở cây Radiate pine, cây

con kéo dài rễ trong môi trường agar: rễ khô héo và hóa đen khi chuyển ra đất Khi nuôi cấy trên môi trường thạch, rễ thứ cấp có khuynh hướng phát triển hướng lên bề mặt thạch để hấp thu không khí ở bên trên [30]

Để có độ thoáng khí cao trong nuôi cấy một số nghiên cứu đã sử dụng giá thể

bông gòn, có nguồn gốc từ bông cây Gossypium herbaceum, trơ về mặt hóa học

Tuy nhiên, chưa có nhiều nghiên cứu về hiệu quả của bông gòn trong nuôi cấy mô Bông gòn cũng có thể sử dụng để nuôi cấy rễ chuyển gen sâm Ngọc Linh, nhưng hiệu quả không cao bằng agar [33]

1.4 Elicitor và sự kích kháng trong nuôi cấy in vitro

Để tăng hiệu quả sản xuất saponin, gần đây mối tương quan giữa sản xuất saponin và biểu hiện của enzyme quan trọng trong sinh tổng hợp saponin đã được

nghiên cứu trên các chi Panax ginseng thông qua tác động của các elicitor [29].