Nghiên cứu biểu hiện và thu nhận protein tái tổ hợp của virus dengue typ 1 để chế tạo bộ sinh phẩm chẩn đoán sốt dengue sốt xuất huyết dengue

luận văn cao học Nguyén Thi Hi He b, Chẩn đoán nguyên nhân Có thể thể hiện mầm bệnh trong máu và huyết thanh bằng phương pháp phân lập virus, xác định kháng nguyên virus bằng các phươn

DAI HOC QUOC GIA HÀ NỘI TRUONG DAI HOC KHOA HOC TU NHIEN

KHOA SINH HOC

NGUYEN THI HAI HA be |

Am xui Yup

|

PROTEIN TAI TO HGP CUA VIRUS DENGUE TYP 1

DE CHE TAO BO SINH PHAM CHAN DOAN

SOT DENGUE/SOT XUAT HUYET DENGUE

Chuyên ngành : Di truyền học

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS.TS ĐINH DUY KHÁNG

Hà Nội - 2006

LOI CAM ON

Em xin bay tổ lòng biết ơn sâu sắc tới DG6.T6 Dinh Duy Kháng:

Dhòng Vi sinh vật học phân tử- Viện Công nghệ ổinh học- Viện Khoa học

và Công nghệ Việt Nam đã tận tình giúp đỡ và hướng dan em hoàn thành luận văn này

Trong thời gian nghiên cứu em đã nhận dược sự giúp đỡ nhiệt tình của các anh chị công tác tại phòng Vi sinh vật học phân tử, đặc biệt là sự giúp dd cla CN Pham Minh Tuan Nhân dịp này em cũng xin cảm ơn những siúp đỡ quý báu đó

Em cũng xin được gửi lời cảm ơn đến các thầy cô giáo trong bộ môn

Di truyền học, cdc thay cô giáo trong khoa Sinh hoc- Dai hoc Khoa hoe tu nhién

- Dai học Quốc gia Hà Nội đã tận tỉnh dạy dỗ trong thời gian qua

Cuối cùng xin chân thành cảm ơn gia đỉnh, bạn bẻ đã luôn ỏ bên tôi, động viên và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu

Hà Nội, ngày 27 tháng 12 năm 2OOG

Học viên

Nguyễn Thị Hải Hà

Base pair (Cap bazo )

Bovine Serum Albumin (Albumin huyét thanh bò) Deoxynucleotide

Escherichia coli Ethylen diamin tetraacetic acid Enzyme Linked Immunosorbent Assay Ethidium bromide

Dengue shock syndrome (hội chứng sốc dengue) Isopropyl- beta- D- thiogalactopyranoside

Kilo Dalton Môi trường Lauria Betanin Optical density (mật độ quang)

Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp)

Precursor membrane envelope Dengue fever (sốt dengue)

" Dengue hemorrhagic fever (sot xuat huyét dengue) Sodium Dodecyl Sulfate

Tris- Acetate- EDTA Tris- EDTA

World Health Organization (T6 chitc y tế thế giới) 5’- bromo- 4-chloro-3-indolyl- galactopyranoside

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU . «cccccvcttriz:crerrri 3

1.1 Bệnh sốt dengue/sốt xuất huyết dengue (SD/SXHD) . <<- 3

1.1.1 Tình Hình dich B@ah ssssisssssssesssaswsensevevsnsanaveavcvsaveansevsaseveseccsseiesstesssecsedecaeere 3

1.1.2 Tình hình mắc bệnh trên thế giới ¿- ¿+ 555222252 +x+zcz<zc+zcs2 4

II v0 00/1227 .ŒdAd.A.H 6

1.1.4 Triệu chứng và chẩn đoán ¿2+5 255252 Sx+x2EErxerrxvrvrerrrrvrrxee 8

1.1.5 Điều trị và phòng chống .- - - 5+ s2 ST Hy 111111111 xe 14 1.2 Virus: dene Ue ö6656655656561161651566554655405566355465166656153558564863ã8686485488548356G38888566146164938046538638 18

1.3.2 Hệ thống pE7T V€CfOT ¿-¿ - 223k + ttrtrrrrrrerrtrrrrrrrrrrree 25 Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

2.3.4 Phương pháp thiết kế vector biểu hiện trong E.coli 55+ 36

2.3.5 Phương pháp điện di trên gel agarose l?% -+-+<+<s+crereeree 37

2.3.6 Phương pháp biểu hiện gen trong #.cưÏi - -csc+ccccscvrvererrreerkee 38

2.3.7 Phương pháp điện di trên gel polyacrilamide - - -s+++++++2 38 2.3.8 Phương pháp tinh sạch protein tái tổ hợp bằng cột ái lực Ni”” 40 2.3.9 Phương pháp Western bÌÏOf 5< 1 2119 22v ng ng tre 4I

2.310 PHưƯØïiE DPHáP Hút DĐ Gsexndesanranuantrenniitiaainidratiattiisitiin0810100015150318381555E 43

2.3.11 Phương pháp EILISA - - xsS S12 2171711117111 1 re 43

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ccecrrieeerre 45

3.1 Khuyếch đại đoạn gen E3 bằng cặp mồi biểu hiện 45

3.2 Kết quả tách chiết plÌasimi(d .- -<s<5<ss s99 9 01.A.0.10008.0.00 47 3.3 Kết quả cắt kiểm tra dịng plasmid tái tổ hợp bằng enzym giới hạn

BamH I va Xho T a 33560XESEESXEENESSWISESISEEKEISSS.SE53948 49

3.4 Tỉnh sạch plasmid tái tổ hợp - ssessesseesesseee 50

3.5 Thơi gen đoạn E3 và vector pET-TRX-EuS-E3 xử lý bằng

3.10 Kiém tra mức độ phản ứng của protein tái tổ hợp bằng kỹ thuật

Western blot ÄESS35598465406856668Ä sssnssssoesasaes 56

3.11 Sử dụng protein tái tổ hợp để chẩn đoán các bệnh nhân nghỉ nhiễm virus

dengue bằng kỹ thuật Dot blot và Elisa 57

3.12 Tạo bộ sinh phẩm chẩn đoán bệnh SD/SXHD bằng Dot blot 60 3.13 Tinh chế và đóng lọ 1.000ml] kháng nguyên tái tổ hợp dengue typ 1 dùng

trong chan đoán SD/SXHD bằng MAC-ELISA hoặc GAC-ELISA 62

KẾT LUẬN YÃ ĐỂ NGHỊ, « e- 22c,2 2802810 tngDmnmenmsam 64

TAT LIBU THAM KHAO csssssssccscccssnssossesssenssssonnssssoosssescccessesssannnsnaseseneeseeseee 65

Ti6ing Viet .sssssssesssessecsssessssnsecnsconecensossssnssonessssccnsecssscsnsssnnsssnccrasecaneceanecenssssnsseseseneets 65 Tiéng amh ccssssccscsssscsssssesoeessssnsensenscnnssnsensenscnvosssssnsconcssessnessscsnssanecnsesnnesnnesnnscnacenecsecs 66

Luận văn cao học Nguyễn Thị Hải Hà

MỞ ĐẦU

Sốt dengue/Sốt xuất huyết dengue (SD/SXHD) là một bệnh truyền nhiễm cấp tính ở người do 4 typ virus dengue (typ 1, typ 2, typ 3, typ 4) gây nên Tới năm 1997 virus dengue cùng với SD/SXHD đã được lan rộng trên phạm vi toàn thế giới, bệnh lan truyền chủ yếu do muéi Aedes aegypti (mudi van, mudi dém), thit yéu 1a Aedes albopictus va một số muỗi khác Theo Tổ chức Y tế thế giới, hàng năm có khoảng 100 triệu trường hợp SD va 500.000 trường hợp SXHD, 25.000 trường hợp tử vong xảy ra trên thế giới, trong đó 90% mắc phải sốt xuất huyết là trẻ em dưới 15 tuổi [15, 18, 29, 32]

Trong 60 năm qua, sự tác động, sự phân bố và tính dữ dội của bệnh đã tăng một cách đột ngột Sự phát triển dân cư ở các nước nhiệt đới tạo ra nguồn vật chủ nhạy cảm với bệnh, bên cạnh đó sự thành thị hoá không có kế hoạch dẫn tới thiếu sự quản lý nguồn nước và nguồn chất thải đã cung cấp địa điểm cho ấu trùng muỗi phát triển đã làm bệnh SD/SXHD trở nên ngày càng trầm trọng Ở Đông Nam Á, các trường hợp SXHD có xu hướng ngày càng gia tăng Tình trạng tương tự như vậy cũng xảy ra ở các nước trung Mỹ và vùng

biển Caribe SXHD có thể gây bệnh cảnh nguy kịch, hội chứng sốc dengue (HCSD) nhanh chóng dẫn tới tử vong nếu không được chẩn đoán và điều trị

kịp thời Ở Việt Nam, các tỉnh phía Nam, đồng bằng sông Hồng mà đặc biệt là các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long đang là điểm nóng của dịch SD/SXHD

[20, 39, 48, 57]

Hiện nay vẫn chưa có vaccine đặc hiệu để chống lại cả bốn typ dengue

nên phát hiện sớm và điều trị thích hợp là quan trọng để giảm bớt tỉ lệ tử vong

do SD/SXHD Để có thể phòng chống dịch SD/SXHD có hiệu quả thì việc xác định, chẩn đoán nhanh, chính xác sự có mặt của virus dengue là hết sức cần thiết Kết quả chẩn đoán sẽ giúp cho các bác sĩ lâm sàng có hướng điều trị

Protein vỏ (E) của virus dengue là kháng nguyên cực kỳ quan trọng đối

với các đáp ứng miễn dịch Kháng nguyên này nằm trên bề mặt của virus, vì

vậy chứa đựng phần lớn các quyết định kháng nguyên quan trọng tạo ra các

kháng thể trung hoà virus dengue Chính vì vậy, chúng tôi chọn và tiến hành

biểu hiện đoạn gen mã hoá cho domain 3, tạo ra protein tái tổ hợp dùng cho

Kit chan đoán nhanh SD và SXHD bằng phương pháp Dot blot, Elisa để dần

thay thế các phương pháp chẩn đoán truyền thống kém hiệu quả, đồng thời

thay thế các kit nhập ngoại có giá thành cao [38, 49]

Nhằm phục vụ cho mục đích trên chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:

"Nghiên cứu biểu hiện và thu nhận protein tái t6 hop cua virus dengue typ 1

để chế tạo bộ sinh phẩm chẩn đoán sốt denguelsốt xuất huyết dengue”

Đề tài được thực hiện tại phòng Vi sinh vật học phân tử - Viện Công

nghệ Sinh học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Bệnh sốt dengue/sốt xuất huyết dengue (SD/SXHD)

1.1.1 Tình hình dịch bệnh

Dịch SD và SXHD được xác định và chính thức được thông báo lần đầu

tiên vào năm 1953 ở Philippines, mặc dù đã có những ghi nhận về những vụ

dịch SD kèm theo xuất huyết xảy ra ở Australia vào năm 1897, ở Hy Lạp năm

1928, ở Đài Loan năm 1931 Trong vòng 50 năm qua, với những nỗ lực phòng

chống và sự phát triển kinh tế đã làm giảm đáng kể sự đe dọa của dịch ở một

số nước Tuy vậy, những vụ dịch SD/SXHD trầm trọng van xảy ra ở nhiều

nước khu vực Đông Nam Á, Thái Bình Dương và vùng vịnh Caribe [22, 25]

Bệnh SD/SXHD trở thành một bệnh dịch lưu hành ở nước ta Bệnh

không chỉ xuất hiện ở đô thị mà cả vùng nông thôn, nơi có muỗi vectơ truyền

bệnh Dịch lớn SD/SXHD

- bùng nổ theo chu ki

A khoảng 3-5 năm Năm

1998, trên toàn quốc bùng

nổ vụ dịch lớn, số mắc bệnh và tử vong cao (mắc:

234.920 người, tử vong

—_ 377 người, theo số liệu :_ của Viện VSDT)

Tuy mới xảy ra lần

- đầu tiên năm 1954 tai

Tỉ lệ nhiễm dengue trên toàn thế giới đã gia tăng mạnh mẽ trong những

năm gần đây Không chỉ có số trường hợp mắc bệnh gia tăng mà khả năng

nhiễm nhiều typ dengue khác nhau cũng ngày càng đáng báo động (hình 1)

lệ này hiện nay giảm ở Thái Lan (95-103 trường hợp/100.000 người vào 1997),

một vài quốc gia như Việt Nam, vẫn đang mắc bệnh với tỉ lệ cao Mặc dù tỉ lệ

các trường hợp chết ở hầu hết các quốc gia ở Đông Nam Á có giảm đi và hiện

nay giảm ít hơn 1%, và tỉ lệ này ở một số thành phố vẫn vượt quá 4% [41, 60]

b, Cuba

Vụ dịch dengue đầu tiên xảy ra ở Cuba vào năm 1977, sự lây lan tiếp

diễn đến 1981 và có hơn 500.000 trường hợp nhiễm SD (typ 1) được thông

báo Vụ dịch thứ 2 xảy ra vào 1981, do virus dengue typ 2 làm cho 344.203

người mắc bệnh, trong đó có 10.312 trường hợp SXHD/HCSD và 158 người

(101 trẻ em và 57 người trưởng thành) tử vong [27]

c, Tình hình bệnh ở Châu Mỹ

Sự phân bố của dengue virus ở châu Mỹ tăng từ năm 1970, không chỉ

một mà cả 4 typ dengue đều được tìm thấy Trong thời gian đó có vài quốc gia

không thấy thông báo có dịch, ví dụ Chile Nhung đến thế kỉ 20 thì những

quốc gia ở vùng châu Mỹ đều thông báo có dịch [43]

đ, Tình hình dịch bệnh ở Việt Nam

Mới bước vào đầu mùa mưa, bệnh SXHD đã xuất hiện ở khắp các tỉnh

phía Nam, đặc biệt nó hoành hành đữ đội tại khắp 13 tỉnh thuộc khu vực đồng

bằng sông Cửu Long Tính đến ngày 15/07/2006, người ta phát hiện 23.426 ca

nhiễm bệnh, tăng 52% so với cùng kì năm ngoái, trong đó có 14 người thiệt

mạng (tăng gấp đôi)

Theo nhận định của các nhà chuyên môn thì khả năng SXHD sẽ bùng

phát thành dịch do môi trường biến động, tạo điều kiện cho muỗi và bọ có thể

phát triển nhanh Chính sự biến đổi của chủng virus làm cho sức đề kháng của

nhiều người chưa kịp thời thích ứng khiến bệnh diễn biến vô cùng phức tạp

Trong thời gian tới, SD/SXHD sẽ còn là vấn đề nóng bỏng trên thế giới

vì khả năng hiểu biết để phòng ngừa của người dân vẫn còn thấp và sự tham

gia một cách hời hợt cho có lệ của chính quyền từ trung ương đến địa phương

[8, 32]

Hình 2 Sự phân bố dengue trên thế giới giai đoạn 1961-1990 (hình trên) và dự đoán sự

phân bố dengue trên thế giới vào năm 2080 (hình dưới), sau khi nhiệt độ nóng lên

Trong đó vùng màu xanh là vùng hâu như không có sự lưu hành của virus dengue

vùng màu đỏ là vùng có sự lưu hành của virus dengue

Theo thông báo của Viện Hàn lâm Khoa học quốc gia Mỹ, nhiệt độ bề

mặt trái đất đang ấm dần lên và điều này làm cho nhiều loại côn trùng gây

bệnh xuất hiện, có nghĩa nhiều bệnh lạ xuất hiện Thêm vào đó do sự thay đổi

về khí hậu, nguồn nước, dân cư phát triển, sự thành thị hoá không có tổ chức

làm cho các bệnh truyền nhiễm tăng lên như sởi, sốt dengue Hình 2 là dự

báo về tình hình nhiễm bệnh dengue vào năm 2080 [33, 46, 56]

1.1.3 Muỗi Aedes aegypti

a Sinh ly, sinh thai A aegypti

- Mu6i A aegypti xuất phát từ châu Phi rồi sang châu Mỹ, châu Á vào

cuối thế kỉ 19 Loài muỗi này trở nên thích ứng tốt và ngày càng phân bố sâu

vào lục địa châu Á trước hết là các vùng thành thị Ở châu Á, đã xuất hiện quá

luận văn cao học Nguyễn Thị Mã; /là

trình thay thế dân muéi A albopictus

trước sự xuất hiện của A 4egypii A

aegypti phan bố chủ yếu ở các điểm dân

cư và các thành phố thuộc miền duyên hải WHO đã đưa ra những hình ảnh về

sự phân bố mở rộng của muỗi A zeøypfi

nhân SD/SXHD [5, 12, 55]

- Muỗi A zegypri gặp nhiều ở thành phố nên được gọi 1A mudi van

thành thị Muỗi còn gặp ở các thị trấn dọc theo các trục đường giao thông có

dân cư đông đúc

- Muỗi A zlbopicius về hình thể rất giống muỗi A aegypti Sinh ly và sinh

thái của mudi A albopictus tuong tu như muỗi A egypti, nhung mudi A

Ibopictus phan bé chi yéu 6 ving nông thôn, gặp ít ở ven thành phố

- Việt Nam nam trong vung phan b6 cua ca hai loai A aegypti va A

albopictus, tuy nhiên sự phân bố của chúng ở những sinh cảnh và vùng địa lý

khác nhau có khác nhau Gần đây trong báo cáo tại hội nghị quốc gia tổng kết

hoạt động phòng chống SD/SXHD cho biết muỗi A egypíi có mặt ở cả 3 miền

Bac, Trung, Nam [6, 8]

b Co ché lay truyén bénh dengue

Người nhiễm virus dengue do muỗi cái thuộc giống Aeđøs đốt Muỗi

Aedes aegypri là vector truyền bệnh chủ yếu ở hầu hết các khu vực bệnh lưu

hành Khi muỗi cái Aedes hút máu bệnh nhân nhiễm virus dengue, virus nay

sẽ ủ bệnh trong cơ thể muỗi khoảng 8- 11 ngày Trong khoảng thời gian sống

còn lại sau đó, muỗi có nguy cơ truyền bệnh cho người Khi virus vào cơ thể

người, chúng tuần hoàn trong máu từ 2- 7 ngày Trong khoảng thời gian này

nếu muỗi Aedes hút máu thì virus được truyền cho muỗi Người là ổ chứa

virus chính mặc dù một số nhà khoa học cũng đưa ra giả thuyết rằng khỉ cũng

có thể là một ổ chứa mầm bệnh cần quan tâm [3, 22]

Rừng núi Nông thôn/Bán thành thị Thành thị

(TQT: Truyền qua trứng) Hình 4 Sơ đồ truyền bệnh của virus Dengue

1.1.4 Triệu chứng và chẩn đoán

1.1.4.1 Triệu chứng

a, Đối tượng mắc bệnh

- SXHD là bệnh chủ yếu của trẻ em, nhất là ở những địa phương có dịch

lưu hành nhiều năm, người lớn ít bị hơn do đã tiếp xúc và có miễn dịch với

nhiều typ virus dengue

- Lứa tuổi thụ bệnh có xu hướng ngày càng nhỏ dần

- Khi địa phương lần đầu tiên có dịch dengue thì lứa tuổi nào cũng có

- Khởi phát: những biểu hiện lâm sàng phụ thuộc lứa tuổi

- Toàn phát: sốt cao 39- 40°C, kèm theo các triệu chứng

s Sốt xuất huyết dengue

+ Lâm sàng sốt xuất huyết dengue không sốc (SXHD)

x 8

e_ Hội chứng nhiễm trùng: sốt cao đột ngột, nhiệt độ 39- 40°C, sốt kéo

dài 2- 7 ngày, sốt kèm theo các triệu chứng như: mệt mỗi, chán ăn, đau bụng ở

thượng vị hoặc hạ sườn phải, đôi khi nôn, gan to (ở trẻ em hay gặp hơn người

lớn), đôi khi da xung huyết hoặc có phát ban

e Hội chứng thần kinh: đau người, đau cơ, đau khớp, nhức đầu, đau

quanh hố mắt, trẻ em nhỏ sốt cao, đôi khi co giật, hốt hoảng, không có biểu

hiện màng não

e_ Hội chứng xuất huyết: thường xuất hiện vào ngày thứ 2 của bệnh

Trường hợp không có xuất huyết thì có dấu hiệu dây thất dương tính

+ Sốt xuất huyết dengue có sốc: hội chứng sốc dengue (HCSD)

Khi bị SXHD cần theo dõi sốc là biến chứng nặng dễ đưa đến tử vong

Do đó phải thường xuyên theo dõi huyết áp, mạch, nhiệt độ, hematocrit, số

lượng nước tiểu

1.1.4.2 Chẩn đoán

Chẩn đoán nguyên nhân là cực kì quan trọng và cần thiết nếu xét trên phương diện sức khoẻ cộng đồng nhưng lại tỏ ra không cần thiết cho việc thiết

lập một chế độ điều trị hỗ trợ sớm cho bệnh nhân Chẩn đoán dengue thường

dựa vào các yếu tố dịch tế, biểu hiện lâm sàng như trình bày ở trên cũng như

dựa vào các xét nghiệm đơn giản: số lượng bạch cầu, số lượng tiểu cầu và

hematocrit

a Xét nghiệm (triệu chứng cận lâm sàng)

- Số lượng bạch cầu trong máu ngoại vi: SXHD thường có giảm bạch

cầu Trường hợp tăng bach cầu và tăng bạch cầu trung tính thường là cơ sở để

loại trừ SXHD

- Giảm tiểu cầu (<100.000/mmỶ): cần làm số lượng tiểu cầu ở bất kì

bệnh nhân nào nghi ngờ bị SXHD Tiểu cầu càng giảm, nguy cơ xuất huyết

càng cao

luận văn cao học Nguyén Thi Hi He

b, Chẩn đoán nguyên nhân

Có thể thể hiện mầm bệnh trong máu và huyết thanh bằng phương pháp

phân lập virus, xác định kháng nguyên virus bằng các phương pháp miễn dịch hoặc phát hiện bộ gen của virus bằng kỹ thuật khuếch đại chuỗi ADN (PCR)

[44]

s* Phân lập virus

- Virus dengue có thể phân lập từ các bệnh phẩm: huyết thanh, máu của

bệnh nhân Theo Gubler (1981) thì thời gian có nồng độ cao của virus trong máu

và đặc hiệu nhưng tiến hành khá phức tạp, đòi hỏi kỹ thuật cao, đầu tư tài

chính lớn nên khó đáp ứng và phổ biến rộng rãi trong các phòng thí nghiệm

luận văn cao học Nguyén Thi Hei He

+ Phản ứng ức chế ngưng kết hông cầu (HI Haemaglutination inhibition)

Kỹ thuật này nhạy, dễ thực hiện, trang thiết cổng kénh và cần nhiều kinh phí, nhưng đáng tin cậy cho nên đến nay vẫn là kỹ thuật tốt nhất để chẩn đoán cơ bản về huyết thanh học cho hầu hết các nhóm #/2wivirus Tuy nhiên

kỹ thuật này kém đặc hiệu do có phản ứng chéo giữa các typ virus dengue

+ Phản ứng cố định bổ thể (CF= Complememt Fixation Technique)

Là phản ứng giữa kháng nguyên và kháng thể xảy ra trong điều kiện có

mặt của bổ thể Phản ứng này có hai hệ thống tham gia: hệ thống | gồm kháng

nguyên và kháng thể Hệ thống 2 gồm hồng cầu cừu và huyết thanh kháng

hồng cầu cừu Trung gian giữa hai hệ thống là bổ thể Nếu trong huyết thanh bệnh nhân có kháng thể thì kháng thể sẽ kết hợp với kháng nguyên, bổ thể sẽ

gắn vào phức hợp kháng nguyên- kháng thể Phản ứng này kém nhạy cảm hơn

phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu hoặc phản ứng trung hoà nhưng lại tồn

tại lâu hơn mặc dù ở một số trường hợp nó có tồn tại ở nồng độ rất thấp do đó

CF chỉ dùng để chẩn đoán những bệnh nhân trong vụ dịch có tính chất dịch té

CF đặc hiệu khi nhiễm virus nguyên phát nhưng lại kém đặc hiệu khi

nhiễm virus thứ phát Kỹ thuật này khó thực hiện nên ít được sử dụng

+ Phản ứng trung hoà (NT= Neutralization Test)

Virus dengue có khả năng tạo ra những đám hoại tử trên tế bào nuôi cấy một lớp cảm thụ, khả năng này bị mất đi khi có mặt của kháng thể đặc hiệu huyết thanh bệnh nhân

Kỹ thuật này nhạy hơn 2 kỹ thuật trên nên có thể phát hiện được kháng

thể trung hoà ngay cả khi không phát hiện được kháng thể HI ở một số người trước đây đã nhiễm virus dengue

Kỹ thuật NT cũng có thể dùng để xác định kháng thể ở lần nhiễm nguyên phát và có thể phát hiện được các đáp ứng đơn typ ở các mẫu huyết

thanh lấy ở thời kì hồi phục Còn đối với các trường hợp nhiễm thứ phát thì

NT không phát hiện được các typ gây bệnh

11

cả 4 typ kháng nguyên dengue để phát hiện kháng thể

+ Kỹ thuật ELISA phát hiện lẹM (MAC-ELISA: IgM Antibody Capturre

ELISA)

Kháng thể IgM là kháng thể xuất hiện sớm nên kỹ thuật này có ý nghĩa

trong việc chẩn đoán bệnh Sự xuất hiện kháng thể IgM nhanh hay chậm thay

đổi tuỳ từng bệnh nhân nhưng ở lần nhiễm virus nào (nguyên phát hay thứ

phát) thì IzM cũng được hình thành sớm và cũng sớm mất đi

Với kỹ thuật này chỉ cần lấy máu bệnh nhân một lần vào những ngày

đầu của bệnh Kỹ thuật này nhanh, cần ít trang thiết bị vì vậy kỹ thuật này có

giá trị đặc biệt trong việc giám sát bệnh SD/SXHD/HCSD Ở các vùng mà SD

không phải là bệnh địa phương thì kỹ thuật này được dùng để giám sát, phát

hiện những trường hợp nhiễm virus ở các bệnh nhân Còn ở các vùng bệnh có

tính chất địa phương kỹ thuật này có thể dùng để điều tra sàng lọc một lượng

lớn mẫu huyết thanh

Kỹ thuật MAC-ELISA kém nhạy hơn kỹ thuật HI nhưng có ưu điểm là

chỉ cần huyết thanh đơn, thực hiện kỹ thuật nhanh, cần ít trang thiết bị Tuy

nhiên kỹ thuật MAC-ELISA không giúp chúng ta phân biệt được giữa những

trường hợp nhiễm virus dengue nguyên phát hay thứ phát [15, 28, 53]

+ Kỹ thuật ELISA phát hiện IgG (GAC-ELISA= IgG Antibody Capture

Enzymelinked Immunosorbent Assay)

Kỹ thuật này dựa trên nguyên lý: kháng thể IgG đặc hiệu của virus dengue có trong huyết thanh bệnh nhân được phát hiện bằng kỹ thuật IgG

người gắn trước vào bản nhựa, sau đó kháng thể IgG được phát hiện bằng

kháng nguyên dengue và kháng thể dengue gắn enzyme cho thêm vào sau Khi

có cơ chất, phản ứng dương tính sẽ xuất hiện màu

12

Kỹ thuật này có độ nhạy thấp, chủ yếu là do sự cạnh tranh với lgG

không đặc hiệu Tuy nhiên kỹ thuật này cũng có những ưu điểm là có thể

dùng để phân biệt giữa nhiễm dengue nguyên hay thứ phát, đồng thời lại đơn

giản, chỉ cần một lượng nhỏ huyết thanh và có thể nhận định kết quả bằng mắt

thường [8, 28, 51]

Kháng thể IgG kháng dengue xuất hiện muộn hơn và tồn tại nhiều năm hoặc suốt đời và có miễn dịch với typ dengue gây bệnh Kháng thé IgG khang

dengue xuất hiện trong nhiễm trùng tiên phát và thứ phát, nhưng trong nhiễm

trùng thứ phát hiệu giá rất cao so với nhiễm trùng tiên phát Khi bị bệnh do

một typ huyết thanh nào đó của virus dengue thì sẽ có miễn dịch suốt đời với

typ dengue đó, nhưng không có miễn dịch với các typ khác [42]

Nhưng có một điều đặc biệt là IgG và IgM ở huyết thanh người phản ứng chéo với cả 4 typ huyết thanh của virus dengue và thậm chí với

Flaviviruse khác Sự phân biệt typ huyết thanh có thể làm được chỉ nhờ kiểm

tra phản ứng miễn dịch bằng các kiểm tra trung hoà hoặc RT- PCR của typ

đặc hiệu Glycoprotein E, một kháng nguyên có tính đặc hiệu dengue virus

cao, vùng B hoặc vùng HI là đặc trưng Trình tự của nó ngắn khoảng 100

amino acid duoc biéu hién 6 E.coli cho virus viêm não Nhật Bản bởi Mason et

al và cho các virus dengue bởi Fonseca et al Bằng cách sử dụng những kháng

nguyên này, các kháng thể đặc hiệu typ được tìm thấy ở huyết thanh siêu miễn

dịch Nghiên cứu này được tiếp tục bởi Simsons et al., ông đã ứng dụng một

hỗn hợp của cả 4 tái tổ hợp vùng B của dengue virus để thiết lập một phản ứng

ELISA dac hiéu dengue virus [31]

+ Kỹ thuật Dot blot va Western blot

Ngoài những kỹ thuật trên thì gần đây nhiều phương pháp miễn dịch khác dùng cho chẩn đoán nhiễm dengue trở nên phổ biến, dễ sử dụng bao gồm

que thử, phương pháp miễn dịch enzyme, sắc kí miễn dịch và Dot blot,

Western blot Đây là những phương pháp để thử khả năng phản ứng của kháng

13

thể trong huyết thanh bệnh nhân với protein tái tổ hợp Phản ứng này có thể

quan sát bằng mắt thường, dễ thực hiện nên được sử dụng khá rộng rãi Phản

ứng này nhằm phát hiện những kháng thể IgG và IgM dựa trên hai kiểu đáp

ứng miễn dịch của cơ thể là đáp ứng miễn dịch tiên phát đối với người chưa bị

nhiễm virus dengue và một virus khác trong chi #J2wivirus hay chưa dùng

vaccine Flavivirus, IgM hiéu gid cao hon han IgG hoac 1a dap tmg miễn dịch

thứ phát đối với người có tiền sử nhiễm virus dengue hay đã ding vaccine Vi

vậy phản ứng Dot blot, ELISA rất có ý nghĩa trong việc đánh giá nhiễm trùng

hiện tại của virus [17, 19, 41]

này làm giảm tính thấm mao mạch)

- Bồi phụ nước bằng con đường uống hoặc bằng đường tĩnh mạch trong trường hợp cần thiết nhằm đề phòng và điều chỉnh mất nước

- Nếu có xuất huyết nặng và rối loạn đông máu trầm trọng, cần phải

truyền máu tươi hoặc khối tiểu cầu

- Theo dõi bệnh nhân chặt chế nhất là trong giai đoạn bắt đầu hạ sốt

[29]

1.1.5.2 Nghiên cứu chế tạo vaccine dự phòng

Ở người, mỗi typ virus đều có thể gây SD và SXHD, chưa rõ typ nào

gây bệnh mạnh hơn Tuy 4 typ rất gần nhau về phương diện kháng nguyên

14

(chung nhau khoảng 60- 74% gốc amino acid), nhưng cũng đủ khác nhau để

chỉ có một phần gây miễn dịch chéo [40] Virus dengue còn có chung một số

đặc điểm kháng nguyên với các ƑJ2vivirus khác Kháng nguyên virus dengue

đã được thấy khu trú ở đại thực bào phổi, lách, gan, tuyến ức, tế bào Kupffer,

tổ chức đại thực bào của da và bạch cầu đơn nhân to ở máu ngoại vi Virus

dengue có khả năng phát triển rất nhanh trong những bạch cầu đơn nhân to

thực bào khi có mặt phân nhóm dengue (hoặc cùng nhóm Ƒ/avivir„s) Tình

trạng này dẫn đến tăng hoạt thực bào, tăng nhiễm các tế bào, bạch cầu đơn

nhân to sẽ giải phóng ra những chất trung gian hóa học làm tăng tính thấm

huyết quản, kích hoạt bổ thể, hoạt hóa thromboplastin tổ chức (nguồn gốc của

đông máu rải rác nội mạch), từ đó bệnh nặng hơn Trong khi chưa rõ độc lực

và tính gây bệnh của các typ virus dengue có khác nhau không, đáng lưu ý là

bệnh cảnh lâm sàng SXHD rất khác nhau tùy theo vụ dịch, tùy theo vùng địa

lý [47]

Kháng thể dengue tồn tại cả đời với typ virus gây bệnh và không có cơ chế bảo vệ chéo do đó vaccine phải bao gồm cả 4 typ mà chỉ cần tiêm một lần

bảo vệ được 4 typ Thực tế việc sản xuất ra một vaccine đạt yêu cầu thực sự là

một vấn đề phải nghiên cứu, đánh giá thật chặt chẽ Nếu ta chỉ sản xuất một

vaccine đơn giá và tiêm riêng biệt thì có nhiều người lo ngại về trình tự nhiễm

các typ virus dengue Việc đề xuất một phác đồ tiêm vaccine tạo miễn dịch

chắc chắn vẫn còn là một vấn đề lớn đang được nghiên cứu Một số tác giả

cho rằng trong tự nhiên có sự phối hợp ngẫu nhiên các trình tự nhiễm 2 typ

dengue nào đó dẫn đến kết quả một số ít người mắc SD/SXHD Mặt khác, có

câu hỏi đã được đặt ra rằng liệu trong số các virus vaccine có làm cho người

đã tiêm phòng bị mẫn cảm và gây ra nhiễm trùng tăng cường khi tiếp xúc với

virus dengue hoang dại hay không? Đến nay đã có ít nhất 15 chương trình

nghiên cứu vaccine dengue đang được thực hiện ở nhiều nước trên thế giới

như Mỹ, Thái Lan, Trung Quốc song cũng có những khó khăn về kỹ thuật,

15

việc đưa vào sản xuất và sử dụng rộng rãi một vaccine như mong muốn có lẽ

sẽ chưa đạt được trong vài năm tới [5, 8, 14, 16, 24, 45]

Vaccine dengue đầu tiên được phát triển sau một thời gian ngắn khi virus dengue được phân lập đầu tiên bởi các nhà khoa học Nhật và Mỹ Mặc

dù đã cố gắng qua nhiều năm nhưng một vaccine hiệu quả mà an toàn vẫn

chưa được phát triển Với sự giúp đỡ của WHO, công trình lớn cho sự phát

triển một vaccine dành cho SD và SXHD đã được thực hiện trong những năm

gần đây Vaccine làm giảm độc lực đầy hứa hẹn đã được phát triển và được

định giá ở giai đoạn 1 và 2 được dùng thử ở Thái Lan Sự tiến triển đầy hứa

hẹn trong chiến lược phát triển vaccine khác sử dụng công nghệ phân tử mới

cũng được thực hiện trong những năm gần đây Các phương pháp gần đây bao

gồm sử dụng các vaccine có các virion bị bất hoạt, tổng hợp peptides, các

vaccine cấu trúc siêu phân tử, vector biểu hiện, các hệ thống vector tái tổ hợp

sống, và ADN trần [22, 26]

1.1.5.3 Tình hình nghiên cứu trong nước

Để có thể giám sát dịch tễ học của virus dengue nhằm phát hiện kịp thời

và có biện pháp phòng chống hiệu quả thì việc tạo ra các Kit chẩn đoán và ứng

dụng các kỹ thuật hiện đại trong chẩn đoán và phát hiện virus dengue là cực

kỳ quan trọng Tại Viện Vệ sinh Dịch tế học Trung ương, các bộ sinh phẩm

dùng trong chẩn đoán sốt xuất huyết như MAC-ELISA Đặc biệt các sinh

phẩm cao cấp như kháng thể đơn dòng cũng được sản xuất tại đây và ứng

dụng trong chẩn đoán nhanh SD Các kỹ thuật hiện đại như hiển vi điện tử,

trung hòa giảm đám hoại tử, phản ứng chuỗi polymerase phiên mã ngược (RT-

PCR) cũng đã được ứng dụng trong chẩn đoán SD Bệnh SD/SXHD là bệnh do

muỗi truyền, vì vậy phương pháp phòng chống vectơ cũng được xem là một

biện pháp cực kỳ quan trọng Việc ứng dụng thành công các chủng vi sinh vật

tái tổ hợp như E.coli và nấm men P.pasforis để sản xuất các loại protein tái tổ

hợp phục vụ sản xuất và đời sống trong đó có các kháng nguyên và vaccine tái

16

luận văn cao học Nguyễn Thị Hữi Hà

1.1.5.4 Kiểm soát vector truyền bệnh

Hiện tại, kiểm soát vector truyền bệnh được xem là phương pháp phòng

bệnh duy nhất có hiệu quả Kiểm soát các vector Aeđes có thể làm giảm đáng

kể tỉ lệ mắc bệnh dengue Trong những năm 1950-1960 Tổ chức Y tế toàn châu

My (Pan American Health Organization) đã thành công trong việc diệt sạch Aedes aegypti ở nhiều vùng thuộc Trung và Nam Mỹ và trong thời gian này, các vụ dịch dengue rất hiếm ở châu Mỹ Tuy nhiên sau khi chương trình ngimg lai thi Aedes aegypti va sau do 14 dengue lai tai xuat hién

Diệt và chống đốt đối với mudi A aegypti lai khong dé dang, rat tuy thuộc vào trình độ kinh tế xã hội của từng vùng như hệ thống cấp và thoát nước; riêng ở Việt Nam có những khó khăn đặc biệt do tỷ lệ gia đình dùng

trực tiếp nước máy còn thấp, số hộ sử dụng nước dự trữ trong thùng, bể chum,

vại còn nhiều, nhất là nông thôn; nhiều hộ ở thành phố mặc dù có ống dẫn

nước tới nhà nhưng bơm có giờ nên vẫn phải có bể chứa trong nhà, ngoài sân Tình hình này buộc công cuộc phòng chống bệnh dengue ở nước ta phải phát huy tối ưu mọi biện pháp có hiệu lực- như các biện pháp diệt muỗi chống đốt,

cải thiện vệ sinh hoàn cảnh môi trường, phát hiện và điều trị sớm bệnh nhân, mặt khác về lâu đài và cơ bản, phải cải tạo hệ thống cấp thoát nước ở các

thành phố, thị trấn, việc này đi liền với sự phát triển đời sống kinh tế xã hội và

đòi hỏi sự đầu tư của nhiều ngành ngoài y tế [20, 23]

Virus dengue hình khối cầu có đường kính khoảng 40-50nm, chứa một sợi

(+) ARN có trọng lượng phân tử là 3,8.10É, vỏ là lipoprotein được hình thành bởi

32 capsome Trọng lượng phân tử 14 4,2.10° Hat virus có hệ số lắng khoảng 175S

đến 215S Tỷ trọng xác định bằng ly tâm gradient sacarosa khoảng 1,19g/cm' Tỉ

lệ ARN/ Protein/ Lipit/Gluxit =6/66/17/9, tỉ lệ này có thể thay đổi đôi chút do kỹ

thuật tinh chế và loại tế bào mà virus đã xâm nhiễm [8, 54]

Nucleotit của virus có thành phần như sau: Adenin 31%, Guanin 26,5%, Cytidin 21% và Uracin 21,5% [2, 8]

Các kháng nguyên ngưng kết hồng cầu của các typ virus dengue có nhiều yếu tố chung nhau do đó hay có hiện tượng ngưng kết chéo giữa các typ

do đó trong phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu để định typ thường hay bị

chéo, không đặc hiệu Khi nhiễm dengue sơ cấp hiệu giá kháng thể của typ

đang gây bệnh thường cao hơn nhiều so với các typ khác pH 6.4 là pH thích

hợp cho virus ngưng kết hồng cầu

Khi bị nhiễm virus các tế bào còn sản sinh ra một loại protein không cấu trúc, TLPT là 39.000 Dal, protein này mang những quyết định kháng

nguyên đặc hiệu nhóm và đặc hiệu typ

Khi virus xâm nhiễm vào cơ thể, các kháng nguyên virus kích thích cơ

thể hình thành kháng thể đặc hiệu tương ứng, kháng nguyên và kháng thể đặc

hiệu typ có tác dụng trung hoà lẫn nhau, còn kháng thể đặc hiệu nhóm và thứ

nhóm thì không có tác dụng trung hoa [8]

- Virus dengue thuộc nhóm Favivirus (họ Flaviviridae) genome có 3

gen protein có cấu trúc (protein lõi- C, protein màng M và protein vỏ E) và 7

gen protein không cấu trúc Protein E có chức năng trung hòa và tương tác với

các thụ thể Hiện nay phân biệt được 4 typ huyết thanh virus dengue đã gây

bénh: DEN-1, DEN-2, DEN-3, DEN-4 W.M, Hammon, 1966 da phan lập từ

18

bệnh nhân sốt xuất huyết ở Thái Lan thêm 2 typ (TH36, TH Sman) đề nghị coi

là typ 5 và 6, tuy rằng chúng gần tương tự với 1 và 2; nhưng Succhinda

Udomsakdi và S.B Halstead (1966) bằng phản ứng kết hợp bổ thể nhận thấy

giống nhau về kháng nguyên giữa virus dengue typ 1 với TH Sman, giữa typ 2

với TH36 [36, 50]

1.2.2 Genome của virus dengue

A) ARN Flavivirus

5 NTf khung doc mg 3UNTR

Cap Se evi ARN don (+) ~ 1lkb |

Cac protein vo nang sink beady sre Rhine TEN) RdRp

Kháng IFN- (?) Protease Methyl-transferase

Helicase Guanylyl-transferase ARN-ưiphosphauase

ER lumen

> "“fRuria 3< = Cáctnhiệucätcủa vậtchủ

Hình 5 Cấu tạo genome của dengue virus, polyprotein và hình học màng của các protein

của virus; (a): sơ đồ genome ARN sợi đơn với các nhân tố ARN cấu trúc ở đầu 5 và đầu 3 NTRs;

(b): cấu trúc penome của dengue virus và các chức năng của các protein virus, một vài protein mà

chức năng của chúng trong chu trình sống của virus còn chưa rõ, kí hiệu là “?”; (c): các protein của

dengue ở khu vực màng và proteinase tạo thành polyprotein cắt [26, 58]

Virus dengue có hệ gen của Ƒ‡2zvivừus điển hình Genome là một sợi

RNA don, dương có chiều dài xấp xỉ 10.200 ribonucleotit Hệ gen chứa một

khung đọc mở mã hoá thành một chuỗi polyprotein duy nhất Chuỗi này sau đó

sẽ được phân cắt bởi các enzym của tế bào vật chủ và các enzym của virus thành

10 phân tử protein chức năng, bao gồm 3 protein cấu trúc và 7 protein phi cấu

19

Luận uăn cao học NguyEn hi Het Ha

tric Genome cla virus dengue c6 cau trúc phân bố của các gen theo thứ tự như

sau: 5’-C-preM-E-NS1-NS2a-NS2b-NS3-NS4a-NS4b-NSS5-3’ (hinh 5) [26]

- Dau 5’ không mã hoá dài khoảng 100 nucleotit, được methyl hoa dam

bảo sự bền vững cho vật liệu di truyền Đầu 3' (không được polyadenin hoá)

không mã hoá dài khoảng 400 nucleotit

- Khoảng một phần tư chiều dài của genome tính từ đầu 5” mã cho các

protein cấu trúc: protein lõi (C), protein màng (M), protein vo (E) Doan gen

này đã được hiểu rõ và đã được giải trình tự Đoạn này chứa nhiều vùng đặc

hiệu loài và đặc hiệu typ Người ta dựa vào các vùng đặc biệt này để phân biệt

cấu trúc gen của các virus trong nhóm và các typ virus trong loài

229 ⁄7?— c genome ma hoa cho 7 protein

phi cấu trúc thực hiện các chức

" protein này đến nay vân chưa

SS được biết đây đủ

cản nàn Khoảng 1/4 chiều đài của

Hình 6 Các thành phần cấu tạo của virus genome tính từ đầu 5° (khoảng

hơn 2.000 nucleotide) mã hoá cho các protein cấu trúc Đoạn gen này chứa

nhiều vùng quyết định kháng nguyên quan trọng góp phần đánh giá đặc hiệu

typ Tính chất đặc trưng của vùng này cho phép phân biệt cấu trúc gen của các

virus trong nhóm và trong cùng typ huyết thanh [25]

Protein cấu trúc

Bao gồm protein lõi (C), protein vỏ (E), protein màng (M)

+ Protein lõi (C): là protein có kích thước nhỏ và là thành phần cơ bản

tạo nên lõi nucleocapsit của virus

20

Luan van cao hoc Nguyễn Thị Hải Ha

+ Protein vỏ (E): có nguồn gốc từ màng tế bào chủ, được glycosyl hoá ở

pH thấp, mang các kháng nguyên trung hoà, kháng nguyên gây ngưng kết

hồng cầu và tương tác với các thụ thể gây ra các triệu chứng của SD/SXHD

+ Protein mang (M): Co hai dang phụ thuộc vào độ sinh trưởng của

virus bao gồm M có khối lượng phân tử 8 kDa và preM có khối lượng phân tử

19 - 23 kDa

Protein phi cấu trúc

Chức năng của nhóm protein này chưa được biết một cách đầy đủ Các

chức năng sinh học này xác định vòng đời của virus Cấu trúc đoạn sen này

khá giống nhau ở các typ virus dengue khác nhau, đây chính là nguyên nhân

gây nên các phản ứng chéo nhau trong chẩn đoán huyết thanh học

+ NSI là một glycoprotein, khoảng 46- 50kDal, là glycoprotein được

biểu hiện ở dạng chất tiết (sÑS1) hoặc không tiết (mNSI), có thể liên quan

đến vai trò trong quá trình sao chép [59]

+ NS2 có thành phần là các enzym quan trong trong việc sao chép

RNA, helicase và RNA triphotphatase tạo thành cấu trúc đầu 5”, protease dé

phân cắt polyprotein và liên kết với màng

+ NS5 thành phân là các enzym polymerase phụ thuộc RNA có chức

năng phiên mã ADN và enzym methyltransferase metyl hoá đầu 5"

+ Ngoài ra còn có các vị trí của NS2A, NS2B, NS1A, NS4H Các

protein này cùng phối hợp thực hiện các chức năng sinh học trong vòng đời

cua virus

1.2.3 Chu trình nhân lên và cơ chế gây bệnh của virus dengue

Lúc đầu virus gắn vào bề mặt tế bào nhờ một thụ thể đặc hiệu của màng

tế bào Sau đó dưới tác động giữa protein vỏ capsit của virus và enzym của tế

bào sẽ phá huỷ vỏ capsit, phân tử ARN của virus được thâm nhập vào bào

tương tế bào vật chủ Tiếp theo là quá trình nhân lên của virus với tế bào Giai

đoạn đầu này được gọi là giai đoạn hấp thụ và giải phóng vật liệu di truyền

21

—

virus vào tế bào chủ Sau đó ARN của virus và các protein vỏ capsit dần xuất

hiện, rồi đến các virion hoàn chỉnh đó là các giai đoạn tổng hợp ARN, vỏ capsit virus và hình thành virus mới Cuối cùng là giai đoạn hoàn chỉnh virus

mới trong toàn bộ chu kì nhân lên của virus dengue [29, 30]

1 Nối 2 Thực ẩm bào nhờ thụ quan trung gian >

\ 6 Su tao hinh

© 7 Giải phóng virus Sự thay đổi màng ở các tế bào Huh7 được

kích thích trong suốt quá trình nhiễm DV

Molecular Virology University cf Haideiderg

Hình 7 Quá trình nhân lên của virus dengue

Chu trình nhân lên của virus trong tế bào gồm các bước sau:

1 Sự hấp thụ (hút bám)

2 Thực ẩm bào nhờ thụ quan trung gian

3 Dung hop trong lysosome ở pH thấp

Luan van cao hoc Nguyén Thi Hai Ha

virus vào tế bào chủ Sau đó ARN của virus và các protein vỏ capsit dần xuất

hiện, rồi đến các virion hoàn chỉnh đó là các giai đoạn tổng hợp ARN, vỏ

capsit virus và hình thành virus mới Cuối cùng là giai đoạn hoàn chỉnh virus

mới trong toàn bộ chu kì nhân lên của virus dengue [29, 30]

(*)ssRNA ———————®—~=

(Cie protein cha virus

1 N6i 2 Thực ẩm bào nhờ thụ quan trung gian

6 Sự tạo hình ua (@) Sự thay đổi màng ở các tế bào Huh7 được is Tee: AB SY

kích thích trong suốt quá trình nhiễm DV

@ 7 Giai phéng virus Molecular Virology University of Hoidelberg

Hình 7 Quá trình nhân lên của virus dengue

Chu trình nhân lên của virus trong tế bào gồm các bước sau:

1 Sự hấp thụ (hút bám)

2 Thực ẩm bào nhờ thụ quan trung gian

3 Dung hợp trong lysosome ở pH thấp

Luan van cao học NguyEn Thi Hei Ha

Sau khi xâm nhập vào cơ thể, virus dengue tăng sinh trong các đại thực

bào Khi cơ thể bị nhiễm virus dengue typ khác thì những kháng thể có sẵn

trong cơ thể không có khả năng phản ứng đặc hiệu với kháng nguyên nên

không trung hoà được kháng nguyên của virus Virus xâm nhập vào bạch cầu

đơn nhân, số lượng bạch cầu đơn nhân to tăng lên Hoạt hoá các CD4, CD8,

lympho déc té bao Cac lympho T hoat hod giải phóng ra nhiều cytokinin, các

bạch cầu don nhân to nhiễm virus bị phân giải qua trung gian tế bào Xuất

hiện thoát huyết tương và xuất huyết

1.2.4 Đặc điểm kháng nguyên

Virus dengue mang các kháng nguyên trung hoà, kháng nguyên gây

ngưng kết hồng cầu, kháng nguyên kết hợp bổ thể trên protein màng (E) [6,

21] Virus dengue có nhiều kháng nguyên, trong đó có kháng nguyên đặc hiệu

typ, kháng nguyên chung của phân nhóm và của nhóm, dựa vào sự khác biệt

giữa các đặc điểm quyết định kháng nguyên người ta phân chia virus dengue

thành 4 typ khác nhau Khi xâm nhập vào cơ thể các kháng nguyên của virus

là kháng nguyên trung hoà, kháng nguyên ngưng kết hồng cầu và kháng

nguyên kết hợp bổ thể sẽ kích thích cơ thể hình thành các kháng thể đặc hiệu

tương ứng [2, 9, 25]

1.3 Biểu hiện protein tái tổ hợp trong E.coli

1.3.1 Chủng E.col biểu hiện protein tái tổ hợp

E.coli dễ biến nạp, sinh trưởng nhanh trong môi trường đơn giản và các

thiết bị nuôi cấy, giữ chủng không đắt tiền Ngoài ra, tế bao E.coli dé dang bi

phá vỡ để thu sản phẩm protein tạo ra trong té bao Nhung E.coli lai không cắt

trình tự không mã hoá (intron) và không có các biến đổi sau dịch mã ở tế bào

sinh vật nhân chuẩn như glycosyl hoá, phosphorin hoá hoặc hình thành cầu

disulfua [21]

23

Luận văn cao họe Nguyễn Thị lái Hà

Sau khi các plasmid đã được đưa vào trong một vật chủ không biểu hiện

hầu hết chúng thường được chuyển vào một vật chủ mang gen T7 ARN

polymerase (thể tiềm tan ADE3) cho sự biểu hiện của các protein đích Hình 8

mô tả ở dạng sơ đồ vật chủ và các yếu tố vector có thể dùng để điểu khiển các

mức T7 ARN polymerase và sự phiên mã tiếp theo của một gen đích trong

một vector pET Và để điều khiển nghiêm ngặt hơn nếu có các tế bào vật chủ

mang pLysS hoặc pLysE Các plasmid pLys mã hoá lysozym 'T7 là một chat

ức chế tự nhiên T7 ARN polymerase và vì vậy làm giảm khả năng phiên mã

gen đích trong các tế bào không cảm ứng Các vật chủ pLysS tạo ra lượng T7

lysozyme thấp trong khi các vật chủ pLysE sản xuất ra enzym nhiều hơn và vì

vậy hay được dùng hơn [35]

le E coli genome HOST CELL s)

Hinh 8 Hé théng T7 biéu hién protein 6 E.coli

Cảm ứng bằng IPTG dẫn đến:

e©_ Giải ức chế của gen T7 ARN polymerase ở NŠT vật chủ

e_ Giải ức chế gen đích dưới sự điều hoà của lac O

e Gen dich phién ma nho T7 ARN pol

Hình 9 Giải ức chế cia gen T7 ARN polymerase bang IPTG

24

Luan van cao hoe Nguyễn Thị Hai Ha

1.3.2 Hệ thống pET vector

Hệ thống pET là hệ thống mạnh nhất dùng cho nhân dòng và biểu hiện

các protein tái tổ hợp trong E.coli Gen dich dugc nhan dòng trong các

plasmid pET dưới sự điều khiển của các tín hiệu phiên mã và dịch mã của T7

bacteriophage T7 ARN polymerase cé tinh chon loc va linh hoat dén néi hau

hết tất cả các nguồn tế bào được chuyển vào gen đích đều được biểu hiện

Các vector pET được xây dựng ban đầu bởi Studier và cộng sự (Sfudier

& Moffatt 1986; Rosenberg et al., 1987; Studier et al 1990) Cac vector pET

mới hiện nay do Novagen cải tiến có vị trí gan ribosome hiệu quả cao từ

protein capsit chính của thực khuẩn thể T7, được dùng để biểu hiện gen đích

mà không cần vị trí gắn ribosome của gen đó, cùng với đặc điểm mạnh để

tách dòng, phát hiện và tinh sạch protein tái tổ hợp dễ dàng hơn

Hệ thống pET có những nhân tố quan trọng sau:

° Dấu chuẩn chọn lọc (kháng

kháng sinh)

Vùng khởi đầu sao chép ColEl

° Vùng khởi đầu sao chép f1

e — Vùng 3 điều khiển lac của T7

promoter

° Vị trí đa tách dòng (vùng nối) liền

Hình 10 Cấu trúc vector pET

luận văn cao học Nguyễn Thị Hải Hà

Dé tinh sạch protein tái tổ hợp dùng S- tag, T7- tag hoặc HSV- tag để đễ

dàng xác định trên Western blot Những peptide này (các đoạn dung hợp) có kích thước nhỏ và các thuốc thử xác định chúng là có tính đặc hiệu và độ nhạy cao Các đoạn S- fag và T7- tag cũng được sử dụng cho quá trình tinh sạch ái lực nhờ các gốc tương ứng và các kit buffer Trình tự His- tag là rất có ích như một phần cua protein dung hop Gen quan tâm đã được nhân dòng như một protein dung hợp với 6- 10 géc histidine liên tiếp được gọi là một “đuôi” và vị trí của tag thường là đầu tận cùng amino hoặc carboxyl của protein để tránh phá vỡ chức năng protein, nhưng có thể nằm giữa protein nếu vùng đó không cần thiết cho chức năng protein Tỉnh sạch protein dễ dàng dựa vào các gốc histidine liên tiếp

có khả năng liên kết mạnh với những cation có hoá trị 2 như nickel

Hệ thống này là phổ biến vì nó có thể được thực hiện dưới những điều kiện khác nhau Ta có thể gắn hoặc giải phóng một protein từ cột dưới những điều kiện nhẹ nhàng mà vẫn duy trì được cấu trúc và chức năng của protein hoặc ta chọn lọc dưới những điều kiện biến tính và hơn nữa sử dụng tag không cần trở chức năng thông thường của protein tái tổ hợp [18, 34, 35]

26

đòng- TA cloning của hãng Invitrogen, Kit xác định trình tự- BigDye

Terminator v3.1 của hãng Applied Biosystem, Vector biểu hiện pET-TRX-

FUS do hãng Novagen cung cấp, Kit tinh sach plasmid - S.N.A.P.TM của

hang Invitrogen, Kit thôi gen - S.N.A.P free UV của hãng Invitrogen

2.2.2 Hoá chất

Các hóa chất tinh khiết được sử dụng trong nghiên cứu sinh học phân tử của hãng Sigma, Merk, Invitrogen, Bio-Rad bao gồm IPTG, ethanol, acetat

natri, cao nấm men, trypton, chloroform, EDTA, agarose, natriclorua, agar-

bacter, tris-HCI, SDS, MgCl;, acrylamide, bis-acrylamide

Máy khuấy từ (RotoLab, OSD

Máy ly tâm (Sorvall)

27

luận văn cao học Neguyén Thi Har He

Máy khuấy trộn Vortex (RotoLab, OSI) Máy hút chân khong (Speed VAC Se 110A-Savant)

Máy quang phổ (Hewlett Packard, M¥)

May soi chup anh gel (Pharmacia) Máy ly tam lanh (Sorvall)

May khuéch dai gen 9700 (Applied Biosystem)

Máy xác định trình tự ADN tu dong (ABI 3100) Cân phan tich 10“g (Mettler Toledo)

Cân điện 101g (Ohaus)

Nồi khử trùng (Nhật Bản)

Ta lanh sau - 20°C, va - 80°C (Sanyo, Nhat Ban)

Tu cay vô tring (Sanyo) Pipetteman cac loai (Gilson)

1% NaCl

pH = 7.4 (chỉnh bằng NaOH 5N)

Đối với môi trường thạch, cần bổ sung 2% agar bacter

2.2.4.2 Các loại dung dịch

- _ Dung dịch dùng trong tách chiết ADN plasmit từ vi khuẩn:

Dung dich Sol I: Tris-HCl 50mM, EDTA 10mM Dung dich Sol II: NaOH 200mM, SDS 1%

Dung dich Sol I: CH,COOK 3M, pH 5.5

Dung dich chloroform: isomylalcohol (24:1) Dung dich CH,COONa (Natri acetat) 3M, pH 5.2 Dung dich TE (10 mM Tris-HCl pH 8.0; 1 mM EDTA pH 8.0) Dung dich TE-RNase: 100 yl RNase 10mg/ml trong 10 ml dung

H/O khử ion vừa đủ : 20 ml

- Dung dich dùng cho điện di protein:

+ Dung dich dém SDS-PAGE 10X:

Tris base :15.14g Glycine : 72.1 g

Khuấy tan rồi bổ sung 25 ml SDS 20% Sau đó rồi bổ sung nước khử

ion vừa đủ 500 ml

29

Ludn vén cao hoe Nguyén thi Hei He

H;O khử ion vừa đủ : 4 ml

+ Dung dịch nhuộm Coomassie brilliant blue (CBB) 0.25%: Can 0.25 g CBB (Merck) hoa tan trong 100 ml dung dich tay mau

- Dung dich ding cho Western blot:

+ Dém chuyén protein sang mang bloting buffer 10X:

30

- Dung dich hién mau:

5 ml metanol để trên đá + 15 mg chất hiện màu (4-chloronaphtol)

25 ml TBS 1X + 15 pl H,O, 30%

Trộn 2 thành phần vào với nhau trước khi hiện màu

- Dung dịch dùng cho ELISA:

Dung dịch rửa : 100ml

31

Luận văn cao hoc Neguyén Thi Hei He

2.3.1 Phương pháp khuyếch đại gen bằng PCR

PCR hay là kỹ thuật nhân ADN đặc hiệu được Kary Mullis hoàn thiện vào giữa những năm 80 và đã đưa lại một cuộc cách mạng trong đi truyền học phân tử Thực chất đây là một phương pháp tạo dong in vitro, khong can su hiện diện của tế bào

Các giai đoạn cơ bản trong một chu kỳ của phản ứng PCR gồm:

+ Biến tính ADN: Giai đoạn hình thành đoạn ADN sợi đơn đóng vai trò làm khuôn, giai đoạn này cần nhiệt độ từ 94°C đến 95°C, thời gian kéo dài từ

30 giây đến 1 phút

+ Bắt cặp: Giai đoạn để mồi bắt cặp với khuôn, cần nhiệt độ từ 40-70°C,

phụ thuộc vào độ dài và tỷ lệ G+C của mỗi mồi, thời gian kéo dài từ 30 giây

đến vài phút

+ Tổng hợp: Giai đoạn ADN polymerase (Taq polymerase) tổng hợp sợi

ADN mới trên khuôn, thời gian kéo dài từ 30 giây đến vài phút

Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau (thường từ 25 - 45 chu kỳ) để tạo được lượng sản phẩm cần thiết [1, 4]

2.3.2 Phương pháp tao dong

Sản phẩm PCR được gắn trực tiếp vào vector tách dòng TA Topo trong

bộ Kit TA cloning, sau đó được biến nap vao té bao E.coli ching DHSaT’

32