TIỂU LUẬN môn PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM đề tài ĐỊNH LƯỢNG BACILLUSCEREUS

Các ổ chứa và lối sống của Bacillus cereus Bacillus cereus có mặt khắp nơi trong tự nhiên và có thể được tìm thấytrong nhiều loại đất, trầm tích, bụi và thực vật.. cereus, được phân lập

BỘ CÔNG THƯƠNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM

KHOA DINH DƯỠNG ẨM THỰC

^^Q^^ -TIỂU LUẬN MÔNPHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM

ĐỀ TÀIĐỊNH LƯỢNG BACILLUSCEREUS

GVHD: HOÀNG XUÂN THẾ

Nhóm 7:

Danh sách thành viên:

Nguyễn Như Quỳnh

Hoàng Hải Quỳnh

Nguyễn Thị Yến Nhi

Năm 2021

2005191240

20051905502005190431Nguyễn Hoàng Phương 2005191506

M C L C ỤC LỤC ỤC LỤC

1 Tình hình ô nhiễm Bacillus cereus 3

1.1 Các ổ chứa và lối sống của Bacillus cereus 3

1.2 Bacillus cereus có thể chuyển từ đất sang thực phẩm 4

2 Đặc điểm sinh học: 6

3 CƠ SỞ PHÂN TÍCH 7

3.1 TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 6404:2016 (ISO 7218:2007 WITH AMENDMENT 1:2013): VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM VÀ THỨC ĂN CHĂN NUÔI - YÊU CẦU CHUNG VÀ HƯỚNG DẪN KIỂM TRA VI SINH VẬT 7

3.2 TIÊU CHUẨN VIỆT NAM TCVN 4992 : 2005 (ISO 7932:2004): VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM VÀ THỨC ĂN CHĂN NUÔI - PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG BACILLUS CEREUS GIẢ ĐỊNH TRÊN ĐĨA THẠCH - KỸ THUẬT ĐẾM KHUẨN LẠC Ở 30oC 8

4 Quy trình phân tích 12

5 Dụng cụ, môi trường, thiết bị 14

6 Các bước tiến hành 16

7 An toàn phân tích 17

KẾT LUẬN 19

LỜI CẢM ƠN 20

NHẬN XÉT CỦA THẦY 21

TÀI LIỆU THAM KHẢO 22

1 Tình hình ô nhiễm Bacillus cereus

1.1 Các ổ chứa và lối sống của Bacillus cereus

Bacillus cereus có mặt khắp nơi trong tự nhiên và có thể được tìm thấytrong nhiều loại đất, trầm tích, bụi và thực vật Bào tử có thể lây lan một cáchthụ động và do đó cũng được tìm thấy bên ngoài môi trường sống tự nhiên.Người ta tin rằng B cereus sensu lato tồn tại trong đất dưới dạng bào tử, nảymầm và phát triển khi tiếp xúc với chất hữu cơ hoặc vật chủ là côn trùng hoặcđộng vật Sự quan tâm đến hệ sinh thái của vi khuẩn này đã thúc đẩy mộtnghiên cứu chỉ ra rằng B cereus có thể nảy mầm, phát triển và tạo bào tử trongđất, do đó thể hiện vòng đời hoại sinh Hơn nữa, một kiểu hình đa bào vớiphương thức sinh trưởng dạng sợi đã được quan sát và đề xuất là một phươngtiện chuyển vị qua đất Một phương thức phát triển đa bào, hình sợi cũng đãđược quan sát thấy trong ruột của côn trùng Ruột của côn trùng được gợi ýlàm môi trường sống cho B cereus khi vi khuẩn tạo bào tử, sau này được xácđịnh là B cereus, được phân lập từ ruột của các loài chân đốt sống trong đấtkhác nhau, nơi vi khuẩn dường như tồn tại cộng sinh với vật chủ là động vậtkhông xương sống của chúng (Margulis và cộng sự, 1998) Vai trò của cáccộng đồng vi sinh vật đường ruột côn trùng như một vị trí thích hợp tự nhiêncho một phần của vòng đời B cereus là xa hơn, và người ta cũng gợi ý rằng sựtồn tại của các chế độ hình thái khác nhau được B cereus sử dụng, chẳng hạnnhư chế độ dạng sợi, có thể là sự thích nghi với các chu kỳ sống khác nhau nhưchu kỳ sống 'bình thường' như một loài cộng sinh hoặc không thường xuyênhơn vòng đời gây bệnh với tốc độ phát triển nhanh chóng

Bacillus cereus đã được báo cáo là có trong phân của người khỏe mạnh ởcác mức độ khác nhau Sự hiện diện ở mức độ thấp phổ biến của nó trong môitrường, thức ăn và thực phẩm sẽ đảm bảo B cereus hiện diện thoáng qua trongruột động vật có vú Tuy nhiên, dữ liệu gen từ chủng loại B cereus ATCC

14579 và từ B anthracis cho thấy rằng khả năng trao đổi chất của chúng thíchnghi hơn với việc sử dụng protein làm nguồn dinh dưỡng hơn là carbohydrate,

và hơn nữa các gen để thành lập trong vật chủ là được bảo tồn Thêm một sắcthái khác vào bức tranh, một so sánh gần đây về kiểu gen và kiểu hình giữa cácchủng B cereus ATCC 14579 và ATCC 10987 cho thấy rằng chủng ATCC

14579 thực sự có khả năng chuyển hóa một số lượng lớn cacbohydrat hơn sovới những gì được tin tưởng ban đầu chỉ dựa trên phân tích bộ gen Những dữliệu này cho thấy rằng ngoài vòng đời đầy đủ trong đất, nơi nó hiện diện phongphú, B cereus cũng thích nghi với lối sống trong vật chủ, như một mầm bệnh

hoặc có thể là một phần của hệ thực vật đường ruột, cũng như để

về sự hiện diện của các bào tử B cereus và các chủng gây độc tế bào đượcphân lập từ một số con sông Điều này cho thấy khả năng nguồn cung cấpnước có thể là một phương tiện để B cereus xâm nhập vào dây chuyền chếbiến thực phẩm

1.2 Bacillus cereus có thể chuyển từ đất sang thực phẩm

Bacillus cereus có thể được phân lập từ nhiều loại thực phẩm và thành phầnthực phẩm khác nhau, bao gồm gạo, các sản phẩm từ sữa, gia vị, thực phẩmkhô và rau Sự lây nhiễm chéo có thể phân phối bào tử hoặc tế bào sang cácthực phẩm khác, chẳng hạn như các sản phẩm thịt Khi thu hoạch, tế bào hoặcbào tử B cereus có thể đi cùng nguyên liệu thực vật vào các khu vực sản xuấtthực phẩm và hình thành trên thiết bị chế biến thực phẩm Bacillus cereus làchất gây ô nhiễm phổ biến trong sữa, và nó có thể gây ra một khuyết tật đượcgọi là sữa đông ngọt trong các sản phẩm sữa Bào tử hoặc tế bào của B cereus

có thể gây ô nhiễm bầu vú của bò trong quá trình chăn thả, hoặc xâm nhập vàotrang trại bò sữa qua vật liệu lót chuồng hoặc thức ăn Trong một nghiên cứugần đây, số lượng lớn B cereus đã được tìm thấy trong các lớp trên của chăn gagối đệm trang trại bò sữa

Bào tử Bacillus cereus đại diện cho một lợi thế to lớn đối với sinh vật, chophép gắn kết, cũng như tồn tại khi xử lý nhiệt hoặc các quy trình khác để loại

bỏ các loài vi khuẩn sinh dưỡng có thể phát triển mạnh hơn B cereus Sự khácbiệt về sức căng trong các đặc điểm của bào tử, chẳng hạn như tính kỵ nước,ngăn chứa và các phần phụ, đã được chứng minh là ảnh hưởng đáng kể đến khả

năng bám của bào tử vào các bề mặt như dây chuyền chế biến thực phẩm Bào

tử Bacillus cereus không nhất thiết phải bị loại bỏ bằng cách làm sạch bề mặtthường xuyên Khả năng B cereus xâm nhập vào một lối sống khác khi hìnhthành màng sinh học rất có thể có tầm quan trọng đối với sự tồn tại của nó

trong các thiết bị công nghiệp thực phẩm, chẳng hạn như đường

từ các sản phẩm sữa và môi trường sử dụng rộng rãi việc làm mát như mộtphương tiện kiểm soát sự phát triển của vi sinh vật Ngoài các sản phẩm từsữa, các loại thực phẩm được xử lý nhiệt nhẹ với thời gian bảo quản lâu hơncũng là một môi trường mới và thuận lợi cho các loài thuộc nhóm B cereus.Xét đến sự hiện diện phổ biến của B cereus, các bào tử có khả năng phụchồi của nó và bản chất không khó tính của vi sinh vật này, không loại thựcphẩm nào có độ pH> 4,8 có thể bị loại trừ như một phương tiện có thể xảy rahoặc là một nguy cơ hư hỏng thực phẩm hoặc bệnh do thực phẩm Người tiêudùng không tuân thủ các quy tắc chuẩn bị thực phẩm cơ bản, tức là làm lạnhchậm hoặc không đủ, bảo quản ở nhiệt độ môi trường xung quanh hoặc giữnhiệt kéo dài ở <60 C, có thể cho phép B cereus phát triển và thường là mộtphần của câu chuyện trong các trường hợp nhiễm vào thực phẩm dịch bệnh

2 Đặc điểm sinh học:

Bacillus cereus là trực khuẩn Gram dương, nội bào tử, có kích thước 0,5-1,5

x 2-4 g Vi khuẩn không tạo giáp mô, không có khả năng di động

> Đăch điểm nuôi cấy:

- Trên môi trường MYP: khóm hồng xung quanh có vòng sáng

- Trên môi trường Mossel: khóm to hồng chung quanh có vòng sáng

- Trên môi trường canh NB, TSB: đục tạo váng, sau cặn lợn cợn

> Đặc điểm gây bệnh - độc tố - triệu chứng:

Vi khuẩn Bacillus cereus phân bố nhiều trong tự nhiên, nhiễm vào các loạithức ăn qua đêm hoặc trữ lạnh lâu, thường gây ngộ độc thực phẩm

Độc tố: vi khuẩn sản sinh ra 2 loại độc tố:

• Độc tố gây tiêu chảy (Type 1): Diarrhoed toxin Vi khuẩn sản sinh độc

tố trên thịt, rau quả, gia vị Bản chất là một loại protein gây phân hủyhoại biểu bì và niêm mạc ruột gây tiêu chảy có thể nguy hiểm đến tínhmạng

• Độc tố gây nôn mữa (Type 2): emetic toxin Vi khuẩn nhiễm trong gạo,com nguội, đậu các loại Bản chất độc tố là phospholipit có tính ổn địnhcao không bị phân hủy ở nhiệt độ cao và dịch dạ dày.

Ngoài ra vi khuẩn còn có enzyme hemolyzin là một loại protein gây độcmạnh có thể gây chết người Độc tố này có thể bị trung hòa bởi cholesteroltrong huyết thanh nhưng nó có thể góp phần cho sự phát triển của vi khuẩn.Bacillus Cereus có thể gây nhiễm trùng và nhiễm độc khác nhau như: nhiễmtrùng máu, viêm màng não và nhiễm trùng mắt

3 CƠ SỞ PHÂN TÍCH 3.1 TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 6404:2016 (ISO

7218:2007 WITH AMENDMENT 1:2013): VI SINH

VẬT TRONG THỰC PHẨM VÀ THỨC ĂN CHĂN

NUÔI - YÊU CẦU’ CHUNG VÀ HƯỚNG DẪN KIỂM

- Các hướng dẫn bổ sung trong lĩnh vực kiểm tra sinh học phân tử được quyđịnh trong TCVN 11134 (ISO 22174)

- Tiêu chuẩn này bao gồm việc kiểm tra vi khuẩn, nấm men và nấm mốc và cóthể được sử dụng nếu được bổ sung hướng dẫn cụ thể về prion (các phần tửlây nhiễm có protein), ký sinh trùng và virut Tiêu chuẩn này không bao gồmviệc kiểm tra các độc tố hoặc các chất chuyển hóa khác (ví dụ: các amin) từ

vi sinh vật

- Tiêu chuẩn này áp dụng cho vi sinh vật trong thực phẩm, thức ăn chăn nuôi

và môi trường sản xuất thực phẩm và môi trường sản xuất ban đầu

- Mục đích của tiêu chuẩn này là giúp đảm bảo tính hợp thức của công việckiểm tra nhằm xác định tính đồng nhất của các kỹ thuật chung sử dụng trongkiểm tra ở tất cả các phòng thử nghiệm, giúp đạt được các kết quả đồng nhấttại các phòng thử nghiệm khác nhau và bảo vệ sức khỏe của nhân viên phòngthử nghiệm bằng cách ngăn ngừa các nguy cơ truyền nhiễm

3.2 TIÊU CHUẨN VIỆT NAM TCVN 4992 : 2005 (ISO

7932:2004): VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM VÀ

THỨC ĂN CHĂN NUÔI - PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG BACILLUS CEREUS GIẢ ĐỊNH TRÊN ĐĨA THẠCH - KỸ THUẬT ĐẾM KHUẨN LẠC Ở 30oC

Phạm vi áp dụng:

Tiêu chuẩn này qui định phương pháp định lượng Bacillus cereus giả định có

khả năng mọc được trên đĩa thạch bằng kỹ thuật đếm khuẩn lạc ở 30oC Tiêuchuẩn này có thể áp dụng cho:

- Các sản phẩm dùng cho con người và thức ăn chăn nuôi

- Các mẫu môi trường trong khu vực sản xuất và xử lý thực phẩm

Thuật ngữ và định nghĩa

Bacillus cereus giả định (presumptive Bacillus cereus)

Để cho phương pháp thử mang tính thực tiễn thì giai đoạn khẳng định đã giớihạn về thử điển hình trên thạch MYP và thử hồng cầu Do đó, thuật ngữ "giảđịnh" đã được đưa vào để công nhận thực tế là giai đoạn khẳng định không thể

phân biệt được B.cereus với các loài Bacillus khác có liên quan mật thiết,

nhưng thường ít gặp phải như: B.anthracis, B.thuringiensis,

B.weithenstepanensis, B.mycoides Một phép thử tính di động bổ sung có thể

giúp để phân biệt B.cereus với B.anthracis khi nghi ngờ có mặt B.anthracis.

Vi sinh vật hình thành các khuẩn lạc điển hình trên bề mặt môi trường cấy chọnlọc và cho phản ứng khẳng định dương tính dưới các điều kiện được qui địnhtrong tiêu chuẩn này

Nguyên tắc:

Cấy một lượng mẫu thử qui định nếu sản phẩm ban đầu ở dạng lỏng, hoặc mộtlượng huyền phù ban đầu qui định nếu các sản phẩm ở dạng khác, lên bề mặtmôi trường cấy đặc chọn lọc đựng trong các đĩa Petri

Chuẩn bị các đĩa khác trong cùng một điều kiện, sử dụng các dung dịch phaloãng thập phân của mẫu thử hoặc của huyền phù ban đầu

Ủ trong các điều kiện hiếu khí các đĩa ở 30oC từ 18 h đến 48 h

Tính số lượng B.cereus trong một mililit hoặc trong một gam mẫu từ số lượng

khuẩn lạc khẳng định thu được trên các đĩa ở các độ pha loãng đã chọn sao chokết quả có ý nghĩa và được khẳng định theo phép thử qui định

Phép thử

Bacillus cereus giả

Nếu trên các đĩa, khuẩn lạc mọc quádày

và không thể chọn các khuẩn lạc phânlập tốt, thì cấy ria năm khuẩn lạc giảđịnh lên các đĩa đựng môi trườnghoàn

Hình thành khuẩn lạc màu

hồng được bao quanh bởi

phản ứng hồng cầu

Ủ ở 30oC trong 24 h ± 2 h và giảithích

Phản ứng dương tính, độrộng của vùng hồng cầu

Lase)chứa nhiều vi sinh vật lên men mannitol dẫn đến sinh axit, thìmàu

ưng của khuẩn lạc B.cereus có thể bị nhạt đi hoặc biến mất hoàn

ng B.cereus chỉ sinh ít hoặc không sinh lexitinase Các khuẩn lạc

lủng này sẽ không có vùng kết tủa bao quanh Các khuẩn lạc này

ợc thử khẳng định

GIỚI HẠN CHO PHÉP B CEREUS

Theo Quyết định 46/2007/QĐ-BYT của Bộ Y tế về việc ban hành “Quy địnhgiới hạn tối đa ô nhiễm sinh học và hoá học trong thực phẩm”

(Trong 1g hoặc 1ml sản phẩm)

Sản phẩm chế biến từ ngũ cốc, khoai 102

củ, đậu đỗ: bột, miến, mỳ sợi (có xử lý

nhiệt trước khi sử dụng)

Rau quả muối, rau quả khô 102

Thức ăn khô và thức ăn dinh dưỡng

cho trẻ em, thức ăn thay thế đặc

biệt (phải xử lý nhiệt trước khi sử

dụng)

102

Thức ăn khô và thức ăn dinh dưỡng

cho trẻ em, thức ăn thay thế đặc

biệt (dùng trực tiếp, không qua xử lý

nhiệt trước khi sử dụng)

5 Dụng cụ, môi trường, thiết bị

Bảng dụng cụ

1 Bình tam giác Chứa dung dịch hóa chất, chứa mẫu

2 Pipet Vận chuyển một lượng thể tích (huyền phù

hoặc dung dịch pha loãng) xác định

3 Đĩa petri Nuôi cấy vi sinh vật

4 Que cấy trải Trải đều dịch mẫu lên khắp bề mặt đĩa

5 Quy trải Trải mẫu vật, làm mịn bề mặt thạch

Bảng môi trường và hóa chất

Môi trường và hóa chất Mục đích

SPW (Saline Peptone Water) Pha loãng mẫu

MYP agar base (Mannitol

-Egg Yolk - Polymixin) Nuôi cấy B cereus

Polymixin B

Egg Yolk

Blood agar base Khẳng định B cereus giả định

Sheep blood Được bổ sung vào môi trường nhằm tăng khả năng

phát triển cho các loài vi sinh vật khó mọcHCl và NaOH 10% Điều chỉnh pH

6 Các bước tiến hành

Bước 1 Chuẩn bị mẫu thử và huyền phù ban đầu

Cân chính xác 10g đối với mẫu rắn hoặc đong mẫu với thể tích 10ml đối vớimẫu lỏng của phần mẫu thử đại diện với sai số cho phép ± 5%, cho vào túinhựa vô trùng (bình tam giác) Cho dung dịch pha loãng SPW 90ml (sai số chophép ± 5% ) vô trùng vào túi nhựa (bình tam giác) chứa mẫu Đồng nhất mẫu

và dịch pha loãng SPW trong máy dập mẫu trong 1 phút hoặc lắc đều bình tamgiác có mẫu và dịch pha loãng trong 2:3 phút Để vi sinh vật không bị tổnthương do thay đổi nhiệt độ đột ngột, thì nhiệt độ của dịch pha loãng trong suốtquá trình thao tác luôn phải giữ xấp xỉ bằng nhiệt độ phòng Do các bào tử lắngxuống nhanh trong pipet, nên để pipet ở tư thế nằm ngang (không để đứng) khiđược làm đầy với một thể tích của huyền phù hoặc dung dịch pha loãng thíchhợp Lắc huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng bằng máy vortex đểtránh các phần tử có vi sinh vật lắng xuống

Bước 2 Pha loãng mẫu

Dùng pipet vô trùng lấy 1ml huyền phù ban đầu với sai số ± 5% cho vào mộtống nghiệm chứa 9 ml dịch pha loãng SPW vô trùng ở nhiệt độ thích hợp Trộn

kỹ bằng máy vortex trong 5 - 10 giây để thu được dung dịch pha loãng 10-2(đối với các loại mẫu làm từ nguyên chất thì thu được dung dịch pha loãng là10-1 ) Nếu cần, lặp lại thao tác trên để có được dung dịch pha loãng 10-3, 10-

4, 10-5, cho đến khi thu được lượng vi khuẩn thích hợp

Bước 3 Cấy và ủ mẫu

Dùng pipet vô trùng chuyển 0,1ml mẫu thử dạng lỏng hoặc 0,1ml huyền phùban đầu đối với sản phẩm ở dạng khác cho vào giữa đĩa petri Lặp lại qui trìnhvới các dung dịch pha loãng thập phân tiếp theo, nếu cần Sử dụng 2 nồng độpha loãng liên tiếp, mỗi nồng độ 2 đĩa petri Dùng que cấy trải trải đều dịchmẫu lên khắp bề mặt đĩa petri, sử dụng một que trải vô trùng cho mỗi đĩa Đểcác đĩa khoảng 15 phút ở nhiệt độ phòng để chất cấy bám vào thạch Lật úp đĩa

và ủ ở 30oC trong 24 giờ

Bước 4 Đếm và chọn các khuẩn lạc để khẳng định

Đếm các đĩa có số khuẩn lạc dưới 150 sau 24 giờ nuôi cấy Khuẩn lạc B cereusgiả định là các khuẩn lạc lớn, màu hồng, được bao quanh bởi một vòng kết tủa.Đếm các khuẩn lạc B cereus giả định trên những đĩa có số đếm phù hợp Lấy 5khuẩn lạc giả định, nếu trên đĩa có ít hơn 5 khuẩn lạc thì lấy tất cả các khuẩnlạc giả định có mặt Cấy ria, cấy đâm sâu hoặc chấm các khuẩn lạc đã chọn lênmặt thạch máu cừu, ủ ở 30oC trong 24 giờ Đọc kết quả

*Kết quả