ĐỒ án CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM (22)

Trong đề tài này, chúng tôi tiến hành khảo sát lại các yếu tố có thể ảnh hưởng đến việc xác định Zn phù hợp với quy mô, thiết bị của phòng thí nghiệm Hoá Phân tích: xác định kẽm trực tiế

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN



Nguyễn Thanh Sơn

PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ HẤP THU NGUYÊN TỬ XÁC ĐNNH HÀM LƯỢNG KẼM

TRONG MÁU TIỂU LUẬN TỐT NGHIỆP

Giảng viên hướng dẫn: T.S Nguyễn Văn Đông

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - 2008

Mục lục

Mục lục ……… 2

Lời nói đầu ……… 4

Phần tổng quan ……… 5

1 Giới thiệu tổng quan về nguyên tố kẽm ……… 5

1.1 Đặc điểm ……… 5

1.2 Vai trò của kẽm trong cơ thể ……… 5

1.3 Nhu cầu kẽm hàng ngày ……… 6

1.4 Các bệnh lý và triệu chứng do thiếu hay thừa kẽm gây ra: ……… 7

1.4.1 Do thiếu kẽm ……… 7

1.4.2 Do thừa kẽm ……… 8

1.5 Những ai dễ bị thiếu kẽm? ……… 8

1.6 Dạng tồn tại của kẽm trong máu và trong huyết tương ……… 9

1.6.1 Trong máu ……… 9

1.6.2 Trong huyết tương ……… 9

1.7 Định lượng kẽm trong cơ thể ……… 10

2 Cơ chế của hiện tượng đông máu và biện pháp chống đông máu ………… 10

2.1 Cơ chế của hiện tương đông máu ……… 10

2.2 Các biện pháp chống đông máu ……… 10

3 Phương pháp quang phổ nguyên tử hấp thu ngọn lửa ……… 12

3.1 Nguyên lý cơ bản của quang phổ hấp thụ nguyên tử ……… 12

3.1.1 Nguyên lý ……… 13

3.1.2 Điều kiện thu được quang phổ hấp thu nguyên tử ……… 13

3.2 Hệ thống đo quang phổ hấp thu nguyên tử ……… 14

3.3 Phổ nguyên tử của kẽm ……… 14

3.3.1 Các kỹ thuật nguyên tử hoá ……… 15

Tiến hành thực nghiệm ……… 17

1 ChuNn bị hoá chất và dụng cụ ……… 17

1.1 Hóa chất ……… 17

1.2 Dụng cụ ……… 17

2 Tối ưu hoá điều kiện thực nghiệm và xây dựng đường chuNn ……… 19

2.1 Điều kiện đo phổ nguyên tử ……… 19

2.2 Khoảng tuyến tính và khoảng làm việc ……… 19

2.3 Xây dựng đường chuNn ……… 21

3 Nghiên cứu pha chất chống đông máu ……… 22

3.1 Dung dịch bảo quản mua ngoài thị trường ……… 22

3.2 Nghiên cứu pha dung dịch bảo quản ……… 22

4 Nghiên cứu xử lý mẫu ……… 24

4.1 Khảo sát nhiễu sắt ……… 24

4.2 Ly tâm thu huyết tương ……… 25

4.3 Xử lý mẫu bằng acid nitric kết hợp với hydrogen peroxide ………… 25

4.4 Xử lý mẫu bằng acid sulfurickết hợp với hydrogen peroxide ………… 26

4.5 Xử lý mẫu bằng acid nitric kết hợp acid perchloric ………… 26

5 Lấy và bảo quản mẫu ……… 27

6.1 Xử lý mẫu máu ……… 29

6.2 Mẫu huyết tương ……… 30

6.2.1 Ly tâm thu huyết tương ……… 30

6.2.2 Xử lý mẫu huyết tương ……… 30

7 Kết quả ……… 31

7.1 Phương pháp đường chuNn ……… 31

7.2 Phương pháp thêm chuNn ……… 33

7.3 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng ……… 36

7.4 Hiệu suất thu hồi ……… 39

8 Đối chứng bằng phương pháp xử lý mẫu với HClO và HNO ………… 41

8.1 Vùng tuyến tính và vùng làm việc ……… 41

8.2 Xây dựng đường chuNn ……… 42

8.3 Xử lý mẫu ……… 43

8.3.1 Xử lý mẫu máu ……… 43

8.3.2 Xử lý mẫu huyết tương ……… 43

8.4 Kết quả ……… 43

9 Phương pháp xử lý mẫu với acid nitric và hydroxygen peroxide ………… 43

9.1 Xử lý mẫu ……… 44

9.1.1 Xử lý mẫu máu ……… 45

9.1.2 Xử lý mẫu huyết tương ……… 46

9.2 Kết quả ……… 46

10 Bảng so sánh kết quả giữa các mẫu và các phương pháp xử lý mẫu ………… 47

10.1 Xử lý mẫu bằng acid sulfuric và hydroxygen peroxide ……… 47

10.2 So sánh giữa hai phương pháp xử lý mẫu ……… 47

11 Nhận xét và thảo luận ……… 47

Kết luận ……… 49

1 Những ưu điểm và thiếu sót của đề tài ……… 49

2 Hướng nghiên cứu mở ……… 49

Các phụ lục ……… 51

Phụ lục 1: Biểu diễn kết quả theo đơn vị quy ước của bệnh viện 51 Phụ lục 2: Các công thức tính toán ……… 52

Phụ lục 3: Quy trình ly tâm thu mẫu huyết tương hợp chuNn ……… 58

Phụ lục 4: Đĩa CD ……… 59

Tài liệu tham khảo ……… 60

Lời nói đầu

Chúng ta biết kẽm là một trong nhưng nguyên tố vi lượng đóng vai trò rất quan trọng trong cơ thể người cũng như động vật Đối với con người nếu thiếu kẽm hay thừa kẽm đều sẽ ảnh hưởng lớn đến sức khoẻ Đã có nhiều công trình nghiên cứu khoa học, nhiều chỉ tiêu được đặt ra để xác định hàm lượng kẽm trong cơ thể, phổ biến nhất là xác định kẽm trong huyết thanh, huyết tương Tuy nhiên việc xác định Zn trong máu thường gặp một số khó khăn nhất là trong quá trình xử lý mẫu Trong đề tài này, chúng tôi tiến hành khảo sát lại các yếu tố có thể ảnh hưởng đến việc xác định Zn phù hợp với quy mô, thiết bị của phòng thí nghiệm Hoá Phân tích: xác định kẽm trực tiếp trong máu bằng phương pháp quang phổ hấp thu nguyên tử ngọn lửa F – AAS Mẫu máu được chọn nghiên cứu là mẫu máu lợn

Kẽm nóng chảy ở 419.50C và hoá hơi ở 9080C

1.2 Vai trò của kẽm trong cơ thể: [2,3]

- Kẽm tham gia vào thành phần cấu trúc và đặc biệt là tác động đến hầu hết các quá trình sinh học trong cơ thể Theo Gronek I., Kolomaznik M thì kẽm có trong thành phần của hơn 80 loại enzyme khác nhau, đặc biệt có trong hệ thống enzyme vận chuyển (transferase), thủy phân (hydrolase), đồng phân hóa (isomerase), xúc tác phản ứng gắn kết các chuỗi trong phân tử ADN (ligase), xúc tác phản ứng oxy hóa cung cấp năng lượng (oxydore-ductase) Ngoài ra, kẽm còn là đồng yếu tố (co - factor) trong hơn 30 enzym khác nhau như collagenase, dehydrogenase, carbonic anhydrase…., kẽm còn hoạt hóa nhiều enzyme khác nhau như amylase, pencrea-tinase Ðặc biệt kẽm có vai trò sinh học rất quan trọng là tác động chọn lọc lên quá trình tổng hợp, phân giải acid nucleic và protein - những thành phần quan trọng nhất của sự sống Vì vậy các cơ quan như hệ thần kinh trung ương, da và niêm mạc, hệ tiêu hóa, tuần hoàn rất nhạy cảm với sự thiếu hụt kẽm Do đó trong dinh dưỡng học, việc nghiên cứu làm sao để đảm bảo nhu cầu kẽm cho cơ thể có ý nghĩa rất quan trọng

- Một vai trò cũng rất quan trọng khác của kẽm là vừa có cấu trúc vừa tham gia vào duy trì chức năng của hàng loạt cơ quan quan trọng Gần đây, người ta phát hiện kẽm có độ tập trung cao trong não, đặc biệt là vùng hải mã (hippocampus), vỏ não, các bó sợi rêu Kẽm có trong cấu trúc và làm ổn định hình thái các cơ quan này Ngoài ra nó còn có vai trò ức chế các peptide, các thụ cảm hệ thần kinh

(neuroreceptor) như opioid, muscarinic, acetylcholinic, GABAic và điều hòa các chất dẫn truyền thần kinh (neurotransmistters) Theo Adams C.E., vai trò của kẽm

đối với hoạt động của hệ limbic, đặc biệt là vùng hải mã là không thể thiếu được Nếu thiếu kẽm ở các cấu trúc thần kinh này, có thể dẫn đến nhiều loại rối loạn thần kinh và có thể là yếu tố góp phần phát sinh bệnh tâm thần phân liệt

- Vai trò hết sức quan trọng nữa của kẽm là nó tham gia điều hòa chức năng của hệ thống nội tiết và có trong thành phần các hormone (tuyến yên, tuyến thượng thận, tuyến sinh dục ) Hệ thống này có vai trò quan trọng trong việc phối hợp với hệ thần kinh trung ương, điều hòa hoạt động sống trong và ngoài cơ thể, phản ứng với các kích thích từ môi trường và xã hội, làm cho con người phát triển và thích nghi với từng giai đoạn và các tình huống phong phú của cuộc sống Vì thế thiếu kẽm có thể ảnh hưởng tới quá trình thích nghi và phát triển của con người

- Hệ thống miễn dịch phụ thuộc vào kẽm vì nhiều lý do: các tế bào của hệ thống miễn dịch sẽ không thực hiện đủ chức năng khi thiếu kẽm, kẽm giúp cơ thể chống lại mầm bệnh vi trùng chẳng hạn như virut cúm, ho

- Kẽm được thu hút bởi nhóm thiols hay gốc lưu huỳnh của các acid amin, và bảo vệ, chúng chống lại sự tấn công của các gốc tự do Kẽm là một chất bảo vệ chống ôxy hóa

- Ngoài ra, các công trình nghiên cứu còn cho thấy kẽm có vai trò làm giảm độc tính của các kim loại độc như nhôm (Al), asen (As), candimi (Cad) Góp phần vào quá trình giảm lão hóa, thông qua việc ức chế sự oxy hóa và ổn định màng tế bào Khả năng miễn dịch của cơ thể được tăng cường nhờ kẽm, bởi nó hoạt hóa hệ thống này thông qua cơ chế kích thích các đại thực bào, tăng các limpho T Vì vậy, khi thiếu kẽm, nguy cơ nhiễm trùng ở bệnh nhân sẽ tăng lên

- Cũng cần nói thêm rằng, kẽm không chỉ quan trọng trong hoạt động sống với vai trò độc lập, mà còn quan trọng hơn khi sự có mặt của nó sẽ giúp cho quá trình hấp thu và chuyển hóa các nguyên tố khác cần thiết cho sự sống như đồng (Cu),

mangan (Mn), magnesium (Mg)

1.3 Nhu cầu kẽm hằng ngày: [2,3]

Chu kỳ chuyển hóa kẽm trong cơ thể được đo bằng phương pháp đồng vị phóng xạ, khoảng 6mg/ngày ở người trưởng thành Các nghiên cứu cho thấy chế độ ăn chứa 12.5mg kẽm mỗi ngày là cần thiết để duy trì một sự cân bằng dương tính trong cơ thể Lượng mất mỗi ngày ước chừng 2.5mg Sự hấp thu trung bình khoảng 30 - 40% nhưng

có khoảng 20% là do chế độ ăn có chất xơ cao Nam trưởng thành cần 15mg/ngày; nữ cần 12mg/ngày (do trọng lượng cơ thể thấp hơn)

Nhu cầu kẽm hằng ngày cho các đối tượng khác nhau được giới thiệu trong bảng sau:

Đối tượng Nhu cầu kẽm (mg/ngày)

Bảng 1: nhu cầu kẽm hằng ngày cho các đối tượng khác nhau [2]

1.4 Các bệnh lý và triệu chứng do thiếu hay thừa kẽm gây ra: [2,3]

1.4.1 Do thiếu kẽm:

- Rất dễ nhận thấy: Móng dễ gãy, hoặc chậm mọc và có những vết trắng Da khô (biến đổi chuyển hóa acid béo) là một dấu hiệu gián tiếp Những dấu hiệu bên ngoài thường được biểu hiện là gia tăng tính tổn thương với nhiễm trùng, ở trẻ em thì chậm phát triển, đàn ông giảm khả năng sinh sản, ở phụ nữ có thai gia tăng biến chứng của thai nghén

- Phụ nữ có thai, thiếu kẽm có nguy cơ sinh non tăng gấp 3 lần Sắt được cung cấp một cách hệ thống trong lúc có thai sẽ ngăn cản sự hấp thu kẽm và có thể làm mức

độ thiếu kẽm nặng thêm Ngoài ra, bổ sung kẽm còn làm giảm nguy cơ biến chứng lúc đẻ

- Một khía cạnh quan trọng hơn nữa của kẽm là sự phát triển của trẻ em Thiếu kẽm

ở bà mẹ trong lúc có thai sẽ đi kèm với nguy cơ thiếu cân lúc sinh, tăng nguy cơ biến dạng của hệ thần kinh hoặc kém phát triển tinh thần vận động của trẻ

- Trong những điều kiện này ngày nay người ta vẫn không hiểu rõ rằng tiếp tục bổ sung không hoàn toàn sắt sẽ tạo ra tác dụng âm tính, trong khi đó kẽm và một số yếu tố khác như magesi, calci, vitamin B9 và B6 có một tầm quan trọng ở thời kỳ mang thai, cho bà mẹ lẫn em bé

- Đối với người già, thiếu kẽm góp phần gây mất cân bằng đồng hóa với các tác nhân của lão hóa như gốc tự do và chất độc Về lâu dài thiếu kẽm góp phần làm giảm độ dày của da, cũng như tan khối cơ và loãng xương

Những dấu hiệu thiếu kẽm khác là: giảm sự ngon miệng, giảm vị giác, chậm liền sẹo, chậm mọc tóc và móng, hay dễ rụng tóc

Tình trạng thiếu kẽm ở trẻ còn gây ra những rối loạn sau:

- Tiêu hóa: Ăn không biết ngon, giảm ăn, giảm bú, buồn nôn, nôn kéo dài, lưỡi bNn, miệng hôi, không ăn hoặc chán ăn, đau bụng kéo dài…

- Tâm - thần kinh: Rối loạn giấc ngủ, trằn trọc khó ngủ, thức giấc nhiều lần trong đêm, khóc đêm, mộng du, nghiến răng; rối loạn nhận thức (học kém, khó tiếp thu),

dễ co giật khi sốt cao…

- Giác quan: Sợ ánh sáng, viêm mí mắt, rối loạn vị giác và khứu giác

- Da: Có tổn thương da ở mặt ngoài hai chi dưới, có mụn bỏng, mụn mủ, vết thương chậm lành…

- Miễn dịch: Nhiễm trùng đường hô hấp, tiêu chảy, nhiễm trùng da và niêm mạc tái diễn

1.4.2 Do thừa kẽm: Tuy nhiên, cần lưu ý rằng kẽm cũng như một số nguyên tố vi

lượng khác, chỉ phát huy vai trò, tác dụng đối với sức khỏe khi lượng của các chất này ở ngưỡng sinh học

Nếu lạm dụng, hoặc bị nhiễm độc kẽm cũng gây nên nhiều trạng thái bệnh lý khác nhau (rối loạn hoạt động hệ thần kinh, sốt, thiếu máu, giảm miễn dịch, viêm loét da, hệ thống tiêu hóa )

1.5 Những ai dễ bị thiếu kẽm? [2,3]

- Trong quần thể người lành, 80% trẻ em và người lớn không nhận đủ từ thực phNm hàng ngày nhu cầu của cơ thể Tại Pháp, gần toàn bộ phụ nữ trong tuổi sinh đẻ bị thiếu kẽm, hơn 70% trong số họ không nhận được 2/3 nhu cầu đề nghị

- Kẽm không chỉ giữ vai trò quan trọng trong hoạt động phần lớn các cơ quan và mô,

mà nó còn có tầm quan trọng ở phụ nữ khi có thai, đặc biệt ảnh hưởng đến bà mẹ

và trẻ em Người ăn chay có nhu cầu cung cấp kẽm thấp hơn những người khác, người già hấp thu kẽm kém

- Trẻ em đang phát triển, phụ nữ có thai hay cho con bú, người bị phẫu thuật, bị chấn thương, bị đái tháo đường, uống rượu nhiều, người dùng sắt hay aspirin Có nhu cầu tăng cao, đơn giản ở đàn ông sẽ mất 1mg kẽm cho một lần phóng tinh

- Người hút thuốc, tiếp xúc với cadimi, cũng có nhu cầu tăng lên Người ta phát hiện rằng thiếu kẽm thường xảy ra ở người chán ăn, bao gồm tinh thần, những bệnh nhân bị bệnh crohn, và phần lớn các bệnh đường ruột khác, sẽ đưa đến các rối loạn hấp thu, vảy nến, loét, bỏng

1.6 Dạng tồn tại của kẽm trong máu và trong huyết tương: [4]

Cơ thể người có từ 1.4 đến 2.3g Kẽm

Phần lớn kẽm trong cơ thể tồn tại trong các enzyme chứa kẽm, gồm: carbonic

anhydrase, carboxypeptidases A and B, alcohol dehydrogenase, glutamic

dehydrogenase, malate and glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenases, alkaline phosphatase, RNA và DTA polymerase, và reverse transcriptase, phần nhỏ tồn tại trong máu Tuy nhiên, sự thay đổi hàm lượng kẽm trong máu không xảy ra tới khi hàm

lựơng kẽm trong mô bị thay đổi

1.6.1 Trong máu: [4]

Trong máu, khoảng 75% kẽm nằm trong hồng cầu 22% trong huyết tương và 3% trong

bạch cầu.Trong hồng cầu, 60% kẽm trong hemoglobin và 20% trong enzyme

Carbonic anhydrate

1.6.2 Trong huyết tương: [4]

Chúng ta cần làm rõ khái niệm huyết tương và huyết thanh:

- Huyết thanh: là phần dung dịch trong thu được khi ly tâm phần máu không đông (không có chất bảo quản) sau khi đã loại bỏ cục máu đông

- Huyết tương: dung dịch màu vàng nhạt thu được sau khi ly tâm phần máu đã có thêm chất bảo quản

Trong huyết tương, kẽm liên kết bền vững với các Protein họ Albumin và Globulin chiếm thành phần như bảng sau:

1.7 Định lượng kẽm trong cơ thể: [3]

- Một số bệnh lý có thể liên quan đến hàm lượng kẽm cao hay thấp bất thường

- Định lượng kẽm để đề ra chế độ dinh dưỡng, chữa trị các bệnh lý do thiếu kẽm gây ra cũng là một ứng dụng quan trọng trong dinh dưỡng học

Thường dùng phương pháp cực phổ hoặc phương pháp phổ nguyên tử Người ta hay định lượng kẽm trong huyết thanh hay huyết tương

Hiển nhiên, mỗi phương pháp phân tích sẽ cho kết quả khác nhau cũng như mỗi dung dịch bảo quản cũng cho kết quả khác nhau

Mỗi phương pháp đều có ưu và nhược điểm nhất định:

- Định lượng trong huyết thanh: phải tiến hành phân tích ngay Gần như không cần xử lý mẫu Kết quả phụ thuộc vào thiết bị ly tâm, kỹ thuật của người làm thí nghiệm, phương pháp phân tích Tuy nhiên độ tin cậy của kết quả cao hơn định lượng trong huyết tương do không có chất bảo quản

- Định lượng trong huyết tương: có thể bảo quản mẫu máu để tiến hành phân tích sau (do đã có chất bảo quản) Gần như không cần xử lý mẫu Kết quả phụ thuộc vào chất bảo quản, thiết bị ly tâm, kỹ thuật của người làm thí nghiệm, phương pháp phân tích

Với máy ly tâm của chúng ta thì không thể ly tâm thu được mẫu huyết tương hay huyết thanh hợp cách được do không thể đạt tốc độ chuNn để ly tâm thu huyết tương là từ

2800 đến 3200 vòng phút-1 Như vậy để khắc phục nhược điểm trên chúng tôi đề ra một hướng nghiên cứu khác: xác định trực tiếp kẽm trong máu

2 Cơ chế của sự đông máu và các biện pháp chống đông máu: [5,6]

2.1 Cơ chế của sự đông máu: [5,6]

Đông máu là một hiện tượng tự nhiên của cơ thể nhằm tránh cho chúng ta chảy hết máu và chết khi bị thương Yếu tố chính yếu của hiện tượng đông máu là nguyên tố Calcium (Ca) và fibrinogen xuất hiện trong các yếu tố gây ra sự đông máu

(coagulation factor)

Có 13 yếu tố đông máu khác nhau ký hiệu từ coagulation factor I đến coagulation factor XIII Và Calcium hiện diện trong 3 yếu tố (V; VII; VIII) 13 yếu tố này kết hợp chặt chẽ với nhau theo cơ chế sinh học phức tạp gây ra hiện tượng đông máu

Cơ chế hiện tượng đông máu được giới thiệu rõ trong hình dưới đây

2.2 Các biện pháp chống đông máu: [5]

Nghiên cứu sơ đồ cơ chế đông máu ta thấy nguyên tố Calcium và fibrinogen đóng vai trò rất quan trọng trong hiện tượng đông máu Như vậy để chống đông máu ta cần tìm cách che ion Calcium hay fibrinogen

Các chất chống đông máu thường được sử dụng và liều lượng cần thiết cho 1 mL máu được liệt kê trong bảng dưới đây:

Chất chống đông Tác dụng Liều lượng Tác dụng phụ

EDTA Kết hợp với Ion Calcium 1 mg Giảm Calcium, tăng

Glycine Không cho thrombin tác

dụng lên fibrinogen thông qua việc thành lập

antithrombin

Không rõ Thay đổi dạng tồn tại

của Zn trong huyết tương

Heparine Không cho thrombin tác

dụng lên fibrinogen thông qua việc thành lập

antithrombin

50 – 70 đơn vị

Thay đổi dạng tồn tại của Zn trong huyết tương

Bảng 3: Các chất chống đông máu thường gặp [4,5]

Hình 1:Cơ chế hiện tượng đông máu [6]

3 Phương pháp quang phổ hấp thu nguyên tử ngọn lửa: [7]

3.1 Nguyên lý cơ bản của phổ hấp thụ nguyên tử: [8]

3.1.1 Nguyên lý: [8]

Khi chiếu vào plasma một chùm bức xạ phát ra từ 1 nguồn bức xạ đặt bên ngoài thì các nguyên tử rời rạc sẽ hấp thụ những bước sóng nào của nguồn trùng khớp với vạch phát xạ nguyên tử tự phát bởi vì sự hấp xạ và sự phát xạ nguyên tử tuân theo cùng qui tắc chuyển dời quang học

Phương pháp phổ hấp thu nguyên tử đo sự suy giảm cường độ bức xạ tại một buớc sóng đặc trưng bị hấp thu bởi một đám hơi nguyên tử tự do

Hình 2: Nguyên lý hấp thu nguyên tử của một nguyên tố bất kỳ [8]

Khi dùng một nguồn bức xạ đặc biệt cung cấp một bức xạ ở một bước sóng đặc trưng của nguyên tố cần phân tích ta sẽ định lượng chọn lọc một nguyên tố khi có mặt các nguyên tố khác

Trong phương pháp phổ nguyên tử ta chỉ quan tâm đến các vạch hấp thu cộng hưởng đặc trưng cho nguyên tố Vạch cộng hưởng là vạch khi nguyên tử hoặc ion đơn nguyên

tử từ mức cơ bản chuyển lên mức kích thích nhờ hấp thu bức xạ phát ra từ đèn

Cathode rỗng hay đèn phóng điện không cực của nguyên tố cần khào sát

Độ hấp thu tính như sau:

A = -logT = -logPT

P0 = log

A: độ hấp thụ

P0: cường độ bức xạ của nguồn

PT: cường độ bức xạ truyền qua hệ thống cấu tử

Ngoài ra ta cũng có :

A = KlC

l : quãng đuờng bức xạ tiếp xúc với cấu tử hấp thu

C : nồng độ cấu tử

K : hệ số tỉ lệ, hằng số đặc trưng cho cấu tử hấp thu tại một buớc sóng nhất định

A chỉ tuyến tính với C trong khoảng nồng độ nhất định (định luật Lambert – Beer)

3.1.2 Điều kiện thu được quang phổ hấp thụ nguyên tử: [8]

Để thu được phổ hấp thụ nguyên tử của một nguyên tố hóa học, ta cần phải chuyển hóa một phần nguyên tố này sang trạng thái “hơi nguyên tử rời rạc” trong đó các hạt nguyên tử không tham gia vào bất cứ loại liên kết hóa học nào

Các nguyên tố nhóm VIII đã tồn tại sẵn ở trạng thái “hơi nguyên tử rời rạc” trong điều kiện thông thường nên không cần dùng lò nguyên tử hóa mà chỉ cần đun nóng chúng Với các nguyên tố còn lại, ta phải đưa chúng vào lò nguyên tử hóa để đạt được trạng thái “hơi nguyên tử rời rạc” Lò nguyên tử hóa tạo ra trạng thái plasma bằng phương pháp đun nóng trực tiếp (ngọn lửa) hoặc bằng phương pháp phóng điện khí

3.2 Hệ thống đo quang phổ hấp thu nguyên tử: [8]

Một hệ thống đo phổ nguyên tử gồm 4 phần cơ bản sau:

- Nguồn bức xạ: Bao gồm đèn cathode rỗng hay đèn phóng điện phi cực và khe hẹp sẽ cung cấp một bức xạ ở bước sóng đặc trưng của nguyên tố cần phân tích

- Hệ thống xử lý kết quả: căn cứ trên tín hiệu từ Detector, thiết bị điện tử sẽ tính toán và cho ra kết quả trên màn hình của máy phổ nguyên tử hay màn hình vi tính nếu có kết nối với máy vi tính

Hình 3: Sơ đồ hệ thống đo phổ hấp thu nguyên tử hai chùm tia [8]

3.3 Phổ nguyên tử của kẽm:

Tại bước sóng λ = 213.9 nm có xác suất chuyển dời tự phát là A = 7.14 x 10s , mức chuyển dời năng lượng từ 4s lên mức 4s4p là 46745.404 cm  với mức kích thích lúc đó là 1P0 có J = 1

Khi tiến hành đo quang phổ hấp thu nguyên tử tại bước sóng λ = 213.9 nm thì với nồng độ 0.018 ppm thu được tín hiệu độ hấp thu 0.0044, tại bước sóng λ = 307.6 nm thì với nồng độ 79.0 ppm thu được tín hiệu độ hấp thu 0.0044

3.3.1 Các kỹ thuật nguyên tử hoá kẽm: [8]

Nguyên tử hoá ngọn lửa, nguyên tử hoá không ngọn lửa (lò Graphite - Graphite

furnace) Mỗi kỹ thuật đều có ưu và nhược điểm nhất định

 Ngọn lửa: Sử dụng đầu đốt Mẫu sau khi hút vào sẽ được đưa vào buồng phun bằng dòng khí mang áp suất cao phun lên đầu đốt Do va chạm giữa mẫu và buồng phun sẽ tạo ra các hạt sol khí Các hạt sol khí sẽ được trộn lẫn với nguồn khí nhiên liệu rồi phun lên đầu đốt Nhiệt độ nguyên tử hoá sẽ phụ thuộc vào hỗn hợp khí cháy (loại nhiên liệu và tỉ lệ các loại khí trong hỗn hợp)

Hình 6: Cấu tạo đầu đốt [7]

Như vậy tuỳ thuộc vào nhiệt độ nguyên tử hoá của nguyên tố cần phân tích mà ta sẽ chọn hỗn hợp khí cháy phù hợp theo bảng sau:

Nhiên liệu Chất Oxy hoá Nhiệt độ ngọn lửa (0C)

Acetylene Nitrous Oxide (N2O) 2600 – 2800

Bảng 4: Nhiệt độ ngọn lửa của hỗn hợp khí cháy [7]

Ngọn lửa NO – acetylene làm giảm độ nhạy của phương pháp xuống gần 5 lần: sử dụng ngọn lửa không khí – acetilene cần hàm lượng kẽm 0.018ppm để thu được độ hấp thu 0.0044 trong khi cần đến 0.084ppm hàm lượng kẽm mới cho tín hiệu hấp thu 0.0044 khi dùng ngọn lửa NO – acetylene Tuy nhiên ngọn lửa này lại được dùng trong phổ phát xạ kẽm.[9]

 Không ngọn lửa: là quá trình nguyên tử hoá tức khắc nhờ năng lượng của dòng điện công suất lớn hay dòng Plasma trong môi trường khí trơ Phương pháp nguyên tử hoá này cho độ nhạy cao hơn (mức ppb), tiêu tốn ít mẫu hơn (20 – 50 µL), tuy nhiên

phương pháp này chịu ảnh hưởng của phổ nền rất lớn Do đó cần thêm hệ thống bổ chính nền vào máy Tuy nhiên, rất hiếm khi ứng dụng phương pháp này khi xác định hàm lượng kẽm Lý do là thường rất ít khi hàm lượng kẽm thấp đến cấp độ ppb, trừ phi trong các hợp kim cực kỳ tinh khiết không được phép có mặt kẽm

Tiến hành thực nghiệm

1 Chu1n bị hoá chất và dụng cụ:

1.1 Hoá chất: tất cả các hoá chất phải đảm bảo tinh khiết dùng để phân tích và

được bảo quản cNn thận đảm bảo không nhiễm bNn

- Acid sulfuric đậm đặc 98%

- Dung dịch acid sulfuric 1%: hút 10.20 mL acid sulfuric 98% cho vào ống đong

1000 mL đã có sẵn ít nhất 300 mL nước cất Khuấy đều và chờ cho dung dịch trong ống nguội lại rồi thêm nước cất đến vạch 1L

Zn có nồng độ 1000.1787 ppm

- Dung dịch chuNn Zn 100 ppm: cân 9.9830g dung dịch chuNn Zn 1000 ppm

ở trên trong chai nhựa 100 mL Thêm nước cất đến 99.8562g thu được dung dịch chuNn Zn nồng độ 99.9916 ppm

- Sắt (III) sulfate

- Acid nitric đậm đặc 67%

- Acid Perchlroic đậm đặc 70%

- Acid citric monohydrate

- Trisodium citrate dihydrate

1.2 Dụng cụ: tất cả các dụng cụ thí nghiệm bằng thuỷ tinh có tiếp xúc với mẫu

đều phải tráng rửa cNn thận nhiều lần bằng nước xà phòng, siêu âm 10 phút rồi rửa lại bằng nước cất Sau đó ngâm trong acid nitric 1% ít nhất 3 giờ mới được dùng trở lại Tất cả các dụng cụ cũng phải dùng riêng

- Beaker 100 mL, 250 mL

- Pipet vạch 5, 10mL

- Bình mức 250 mL, 1litre

- Ống ly tâm

- Phễu lọc nhỏ và giấy lọc băng xanh

- Đũa khuấy lớn

- Chai nhựa 100 mL

- Chai nhựa HDPE (High-Density PolyEthylene) 300 mL

- Cuộn PVC (Poly Vinyl Choloride) dùng để bọc bảo quản thực phNm

- Máy siêu âm, tủ lạnh

- Máy quang phổ nguyên tử và đèn Cathode rỗng Kẽm

Hình 7: Chai HDPE 300 mL dùng để lấy mẫu

Hình 8: Trang bị khi làm thực nghiệm

2 Tối ưu hoá điều kiện thực nghiệm và xây dựng đường chu1n:

2.1 Điều kiện đo phổ nguyên tử: tất cả các lần thí nghiệm đều được đo trong

cùng điều kiện sau đây:

- Bước sóng: λ = 228.3 nm (do máy lệch)

- Cường độ dòng I = 8 mA, Energy = 51

- Tỉ lệ dòng khí Acetilene / Air: 20/60 (ngọn lửa xanh – lean)

- Chiều cao đầu đốt h = 5.5 mm, chiều sâu đầu đốt 7 cm

- Chiều rộng khe: 0.7 nm

- Thời gian đọc tín hiệu: 2 giây

Ta có thể so sánh điều kiện thực tế và điều kiện lý thuyết như sau:

Yếu tố Điều kiện thực tế Điều kiện lý thuyết

Bảng 5: So sánh điều kiện thực tế và điều kiện lý thuyết trong thực nghiệm[9]

Thực nghiệm tối ưu điều kiện thí nghiệm: gắn đèn Cathode vào máy (đã mở các

valve khí và máy hút, máy cấp khí) Khi tắt ngọn lửa, điều chỉnh chiều cao và chiều sâu đầu đốt sao cho nguồn bức xạ không rọi trúng đầu đốt mà vẫn đạt tín hiệu cực đại.Bật ngọn lửa và do phổ nguyên tử bằng dung dịch Zn 1ppm Do máy bị lệch nên ta tiến hành quét sóng lại, ngừng tại bước sóng tín hiệu cực đại Tắt lửa, điều chỉnh vị trí đèn sao cho thu được Energy lớn hơn 50 và tín hiệu lớn hơn 50 ở cường độ dòng lý thuyết Vẫn sử dụng dung dịch Zn 1ppm ở trên, ta bật ngọn lửa Điều chỉnh tốc độ 2 dòng khí trên máy cấp khí sao cho thu được ngọn lửa đều, mạnh và tín hiệu cực đại

Do đèn cathode rỗng và đèn phóng điện phi cực cho độ nhạy như nhau đối với nguyên

tố kẽm nên ta sử dụng đèn cathode rỗng [9]

2.2 Khoảng tuyến tính và khoảng làm việc: [13]

Tiến hành pha các dung dịch chuNn Zn có nồng độ xác định từ dung dịch chuNn

Zn 100 ppm ở trên bằng phương pháp cân để giảm thiểu sai số dụng cụ và đo độ hấp thu ta được kết quả theo bảng sau:

m Zn chu1n (g) m dung dịch (g) C Zn (ppm) Abs

Bảng 6: Tương quan giữa độ hấp thu và nồng độ

Đồ thị biểu diễn tương quan giữa độ hấp thu và nồng độ kẽm trong các dung dịch chuNn:

Đồ thị 1: Tương quan giữa độ hấp thu và nồng độ các dung dịch +,- chu1n

Ta tính hệ số tương quan và so sánh t/0 với t01cho từng khoảng nồng độ:

Khoảng nồng độ (ppm) Hệ số tương quan r 234 245

Vậy khoảng tuân theo định luật Lambert – Beer là từ 0.10 đến 1.80 ppm và trong khoảng này t01 > t/0 Vậy khoảng tuyến tính phù hợp thực nghiệm

Căn cứ theo nhu cầu làm việc cũng như để cho hệ số tương quan đạt được tối ưu ta chọn vùng làm việc từ 0.10 đến 1.00 ppm tại đó t01 = 86.59 > t/0= t.77, = 4.60 như vậy phương trình hồi quy cũng phù hợp với thực nghiệm

2.3 Xây dựng đường chu1n: đường chuNn được xây dựng dựa trên vùng làm

việc đã chọn: từ 0.10 đến 1.00 ppm

Khi đó ta được đồ thị sau:

Đồ thị 2: Đường chu1n định lượng nguyên tố Zn bằng phương pháp phổ nguyên tử

Xây dựng phương trình đường chuNn:

3 Nghiên cứu pha chất chống đông máu: Mục tiêu là nghiên cứu pha chất

chống đông sao cho thu được mẫu máu có chất lượng tương đương với mẫu máu sử dụng chất bảo quản mua ngoài thị trường Dung dịch bảo quản được tôi chọn sử dụng là dung dịch citrate do áp dụng kinh nghiệm dân gian để chống đông máu: nặn chanh vào máu

3.1 Dung dịch bảo quản mua ngoài thị trường:

Dung dịch bảo quản mua ngoài thị trường là dung dịch CPDA – 1 (Anticoagulant

Citrate Phosphate Dextrose Adenine Solution) hiệu Teruflex của hãng Terumo (Tokyo

- Nhật Bản) dùng để lấy máu người chứa trong túi bảo quản tuyệt đối vô trùng Mỗi hộp túi bảo quản có 10 túi, hạn dùng đến tháng 9 năm 2010

Mỗi túi CPDA -1 có chứa 35 mL dung dịch bảo quản với thành phần như sau:

Monobasic Sodium Phosphate dihydrate 87.9

Bảng 8: Thành phần dung dịch bảo quản trong túi CPDA – 1

Mỗi túi bảo quản này lấy được 250mL máu và nếu giữ trong điều kiện tối ưu (vô trùng, trong điều kiện nhiệt độ từ 1C đến 6C) thì giữ được 6 tháng

Hình 9: Túi bảo quản máu CPDA -1

3.2 Nghiên cứu pha dung dịch bảo quản:

Dễ dàng nhận thấy hàm lượng citrate trong túi CPDA – 1 trên không đạt mức

5mg/1mL máu nhưng nhờ tác dụng của ba chất còn lại mà giữ được máu không đông Như vậy, cần nghiên cứu pha các dung dịch Citrate với các tỉ lệ hàm lượng từ 5 mg đến 8 mg cho 1 mL máu theo các cách sau:

- Chỉ sử dụng sodium citrate

- Có thêm acid citric theo các tỷ lệ 1/9; 2/8 …

- Thay đổi thể tích dung dịch bảo quản

Các dung dịch bảo quản được cho vào chai nhựa 100 mL, dán nhãn rồi niêm kín bằng cuộn PVC trong khoảng từ 17 giờ đến 20 giờ mỗi ngày thí nghiệm (hiển nhiên vạch mức 100 mL máu + V mL chất chống đông đã được đánh dấu bên ngoài chai) Vào lúc 1h sáng ngày thí nghiệm, mang các chai nhựa cùng với ca nhựa, thùng xốp (đã có nước đá đập nhỏ) đến địa điểm lấy mẫu Việc lấy mẫu tiến hành vào khoảng 1 giờ 15 đến 1 giờ 30 mỗi ngày Lúc này, ta không quan tâm đến tính đồng nhất của mẫu do mục tiêu là pha chất bảo quản nên chỉ cần lấy máu cho vào chai nhựa đến vạch Chai nhựa lại được niêm kín bằng cuộn PVC rồi cho vào thùng đá sao cho nước đá ngập cả chai (không ngập nút chai) Sau cùng mang thùng xốp về và cất giữ Sau 5 giờ, 12 giờ

kể từ lúc lấy mẫu, lần lượt mở niêm các chai máu, đổ ra một ít để xem xét:

- Mẫu máu nào đã bị đông hay bị đổi màu: loại, đổ bỏ

- Mẫu máu nào không đông, giữ nguyên được màu sắc: niêm lại chờ đến sau

12 giờ kiểm tra lại

Một mẫu chất bảo quản máu được cho là hợp cách khi thoả cả hai điều kiện sau:

- Máu không đông sau 12 giờ

- Màu máu được giữ nguyên như khi vừa lấy ra sau 12 giờ

Hình 10: Mẫu máu hợp cách

Hình 11: Mẫu máu không đạt

Như vậy, mẫu chất bảo quản nào có hàm lượng citrate (cho 1 mL máu) thấp nhất và tỉ

lệ acid citric / citrate thấp nhất đạt được chỉ tiêu này sẽ được nghiên cứu để pha dung dịch bảo quản cho 250 mL máu như quy cách của túi CPDA – 1

Sau mười hai giờ nhận thấy như sau:

Hàm lượng citrate Tỉ lệ citric/citrate Thể tích dung dịch Kết quả

Bảng 9: Kết quả nghiên cứu pha chất chống đông máu

Như vậy chọn được dung dịch có hàm lượng 7mg và tỉ lệ citric/citrate là 1/9 để nghiên cứu tiếp

Tiếp tục làm như trên với chai HDPE 300 mL nhận thấy sử dụng 36 mL dung dịch có thành phần như trên sẽ bảo quản được 250 mL máu

Như vậy dung dịch chống đông tự chế có thành phần như sau:

- 7 mg citrate cho 1mL máu

chen lấn vạch phổ kẽm của nguyên tố sắt (Fe) làm tăng tín hiệu phổ

Thực nghiệm như sau: cố định hàm lượng kẽm ở mức 0.6 ppm, pha thêm vào các dung dịch kẽm chuNn dung dịch chuNn Fe 100ppm để tạo ra các dung dịch có hàm lượng

sắt lần lượt là 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175 và 200 ppm, pha các dung dịch sắt chuNn

có nồng độ như trên để đối chứng Đo các dung dịch này ở điều kiện như trên

Ta thu được kết quả như bảng sau:

Bảng 10: Kết quả khảo sát nhiễu sắt

Như vậy ta thấy ở mức nồng độ 100 ppm sắt mới xuất hiện tín hiệu 0.001 ở dung dịch sắt và sự gia tăng tín hiệu 0.001 ở dung dịch có kẽm lẫn sắt (sai số độ hấp thu ±0.001)

Mà hàm lượng sắt trong máu tối đa chỉ đạt 70 đến 80 ppm, như vậy không cần xử lý nhiễu sắt Ngoài ra lại thấy ở các mức nồng độ sắt khác nhau thu được mức nhiễu như nhau cho dung dịch kẽm có sắt và dung dịch chỉ có sắt, do đó nhiễu sắt là cản nhiễu quang phổ và là nhiễu dương (gia tăng tín hiệu)

4.2 Ly tâm thu huyết tương: [5,14]

Sau khi ly tâm trực tiếp mẫu máu mà không thu được mẫu huyết tương hợp cách do máy ly tâm yếu, tôi thêm HCl 1:1 để cắt mạch polypeptit tạo điều kiện dễ dàng hơn cho việc ly tâm

Sau khi thử các tỷ lệ mẫu và HCl 1:1 khác nhau, căn cứ trên thể tích dung dịch mẫu thu được sau ly tâm cũng như màu sắc của dung dịch mẫu sau lọc chọn được tỷ lệ mẫu/HCl 1:1 là 2/1 về khối lượng

4.3 Xử lý mẫu bằng acid nitric kết hợp với hydrogen peroxide:

Do mẫu có lượng lớn hợp chất hữu cơ nên trước tiên thử dùng hỗn hợp HNO và HO

để vô cơ hoá mẫu Khi cho acid nitric vào mẫu máu hay mẫu huyết tương đều thu được dung dịch màu vàng chanh, đun nóng và dùng hydrogen peroxide thì thấy màu vàng chanh nhạt dần (mẫu máu) và mất hẳn màu vàng chanh (mẫu huyết tương) Tuy nhiên khi kết thúc quá trình vô cơ hoá thì dưới đáy beaker lại thu được chất rắn màu

đen, hoà tan lại chất rắn này bằng HNO thu được dung dịch có màu vàng đậm và kết hợp HO thì không tNy màu được nữa Như vậy ta thấy quá trình vô cơ hoá không triệt để, nguyên nhân được giải thích như sau:

- Khi cho HNO vào mẫu và đun nóng thì ngoài phản ứng oxy hoá còn có phản ứng nitroso hoá Hợp chất nitroso tạo màu vàng chanh cho dung dịch Nhóm - NO rất khó bị oxy hoá

- Phản ứng nitroso hoá xảy ra cho cả hợp chất mạch thẳng lẫn mạch vòng có bao gồm phản ứng cắt mạch carbon Khi đun nóng triệt để dung dịch thì ta làm cho nồng độ HNO gia tăng, phản ứng nitroso hoá cắt mạch mạnh hơn nữa do đó sinh ra nhiều hợp chất nitro hơn

- Phản ứng xảy ra tương tự cho hợp chất mạch vòng, hợp chất mạch thẳng sẽ

bị cắt mạch cho đến khi tạo thành CH - NO

4.4 Xử lý mẫu bằng acid sulfurickết hợp với hydrogen peroxide:

Tiếp đến chuyển sang sử dụng HSO kết hợp với HO Bấy giờ sẽ thu được dung dịch có màu đen khi thêm HSO vào mẫu Thực hiện tương tự như phần trên thì cả mẫu máu lẫn mẫu huyết tương đều mất màu, kết thúc quá trình vô cơ hoá không xuất hiện hợp chất có màu nào Điều đó do các nguyên nhân sau:

- HSO đậm đặc là chất rất háo nước, khi cho acid sulfuric đậm đặc vào mẫu thì trước tiên HSO sẽ chiếm lấy nước trong các hợp chất hữu cơ trước

- Sử dụng HSO vẫn có phản ứng phụ là phản ứng sulfon hoá tương tự như phản ứng nitroso hoá Tuy nhiên phản ứng này chỉ xảy ra với các hợp chất mạch vòng có nối đôi (aren) và hợp chất sulfonic khi đun nóng trong môi trường acid sẽ hoàn nguyên cho trở lại aren Do đó phản ứng phụ xem như không đáng kể

Để tối ưu thể tích HSO cho từng mẫu nghiên cứu như sau: Cho lượng tối thiểu

HSO là 1mL vào mẫu Thực nghiệm như trên, đến khi kết thúc quá trình vô cơ hoá

mà thu được chất rắn có màu là do acid chưa đủ Khi đó phải tăng lượng acid Sau cùng tối ưu được thể tích HSO cho một mẫu máu là 3 mL, cho một mẫu huyết tương

là 1 mL

4.5 Xử lý mẫu bằng acid nitric kết hợp acid perchloric:

Do ước đoán có thể acid sulfuric kết hợp với hydrogen peroxide không oxy hoá được hết các aren bền nên tiếp theo sử dụng HNO kết hợp với HClO để đối chứng

Khi đó thêm vào mẫu hỗn hợp HNO và HClO rồi đun trên bếp Khói trắng sẽ bốc mạnh lên, ta đun đến khi hết khói trắng khi đó mẫu đã được vô cơ hoá hoàn toàn

Để tối ưu thể tích HClO cho từng mẫu nghiên cứu như sau: Cho lượng tối thiểu HClO là 1mL vào mẫu Thực nghiệm như trên, đến khi kết thúc quá trình vô cơ hoá

mà thu được chất rắn có màu là do acid chưa đủ Khi đó phải tăng lượng acid Sau cùng tối ưu được thể tích HNO cho một mẫu máu là 6 mL, cho một mẫu huyết tương

là 3 mL và thể tích HClO cho một mẫu máu là 3 mL, cho một mẫu huyết tương là 1

mL

5 Lấy và bảo quản mẫu: mẫu được lấy vào ngày 19/11/2008 tại cửa hàng thực

phNm Bình Đông (địa chỉ: số 213 đường Bến Bình Đông phường 11 quận 8

Thành phố Hồ Chí Minh)

Trước khi lấy mẫu hai ngày, toàn bộ dụng cụ cũng như vật chứa đựng đã được vệ sinh sạch và để khô tự nhiên Xô nhựa đã được đánh dấu ở mức 3,5 litres Trước khi lấy

mẫu một ngày, toàn bộ dụng cụ sẽ được kiểm tra rồi niêm kín bằng cuộn PVC

Pha chất bảo quản:

- Dung dịch citrate: cân 21.2732 g trisodium citrate (dihydrate) và 2.3703g acid citric (monohydrate) trong 2 beaker riêng biệt, hoà tan bằng nước cất kèm siêu

âm cho beaker chứa dung dịch trisodium citrate Chuyển định lượng 2 dung dịch vào bình mức 500 mL Chờ dung dịch trong bình mức nguội lại rồi định mức đến vạch bằng nước cất Sau cùng niêm kín bình mức

- Dung dịch CPDA – 1: 14 túi máu CPDA – 1 được mang đến địa điểm lấy mẫu Vào lúc 0 giờ ngày 19/11/2008 bắt đầu tiến hành chuNn bị và mang các dụng cụ đến địa điểm lấy mẫu Túi máu CPDA – 1 và bình mức chứa dung dịch citrate được mang đến sau cùng Trước khi lấy mẫu 10 phút mới mở niêm hai xô chứa, mở vỏ bọc kim túi máu CPDA – 1 đồng thời cắt góc ở đáy túi cho dung dịch chảy hết vào xô Sau khi kết thúc đậy kín nắp xô rồi mở niêm bình mức chế dung dịch citrate vào xô còn lại, đậy kín xô

Thời gian lấy mẫu từ 1giờ 15 đến 1 giờ 30 sáng ngày 19/11/2008 Lấy mẫu bằng ca lớn rồi ước lượng khoảng phân nửa cho vào 2 xô, khuấy đều Tiếp tục lấy mẫu cho đến khi thể tích máu trong xô đến vạch mức, khuấy đều rồi đậy nắp

Đem mẫu ra xa khu vực giết mổ, bắt đầu dùng ca nhỏ chuyển máu vào các chai HDPE

300 mL đã được dán nhãn phân biệt chất bảo quản đến hết, vặn nắp vừa phải Dùng cuộn PVC niêm kín các chai rồi cho vào thùng xốp sao cho đá ngập chai (không ngập nút chai) Mang thùng xốp về cất giữ

8 giờ 30 sáng ngày 19/11/2008 toàn bộ các chai máu đã được cho vào tủ lạnh bảo quản

Hình 12:Chai HDPE chứa máu đã được niêm kín

Hình 13: Các chai HDPE chứa máu trong thùng bảo quản

Hình 14: Các chai máu trong tủ lạnh

6 Xử lý mẫu:

6.1 Xử lý mẫu máu:

Lấy chai máu ra khỏi tủ lạnh, để rã đông tự nhiên ở nhiệt độ phòng Sau khi rã đông hoàn toàn bỏ lớp niêm cũ, cho máu từ trong chai vào beaker 100 mL rồi niêm chai lại bằng cuộn PVC cho trở vào tủ lạnh

Beaker chứa máu được niêm kín và chờ cho đạt nhiệt độ phòng thì tiến hành thí nghiệm Làm tương tự cho mẫu trắng Beaker chứa mẫu sẽ được dùng cho các thí nghiệm sau, đến khi hết hay đã dùng quá nhiều lần (khoảng 4 lần) mới đổ bỏ, lấy chai máu ra rã đông lại Một chai máu rã đông khoảng 4 đến 5 lần (tuỳ điều kiện thời tiết) cũng phải đổ bỏ

Đối với mẫu sinh học (cụ thể là mẫu máu) rã đông rồi cho đông lại sau đó tiếp tục rã đông là không tốt do rã đông quá nhiều lần sẽ xuất hiện các cục máu đông, làm cho mẫu không đồng nhất nữa

Để thu được kết quả tin cậy thì phải sử dụng chai máu chưa từng rã đông lần nào khi lấy kết quả chính thức

Cân chính xác 1.00g mẫu máu trong beaker sạch khô, cho 3 mL HSO đậm đặc sẽ được dung dịch màu đen Đun nóng beaker trên bếp điện có lưới amiane ở mức nhiệt

độ trung bình trong tủ hút đến khi khói trắng bốc lên và có hiện tượng dung dịch “leo” lên thành beaker thì lấy beaker khỏi bếp (để lên tấm gỗ), chờ cho dung dịch hết khói trắng và giảm nhiệt độ thì cho thêm khoảng 2 mL HO 30% vào dung dịch Bấy giờ

dung dịch sủi bọt rất mạnh đồng thời màu đen nhạt dần, ta cho trở lên bếp đun tiếp Lặp lại quy trình trên đến khi thấy dung dịch gần cạn mà vẫn trong suốt, không màu hoặc có màu rất nhạt Bấy giờ vặn bếp lên tối đa đun đến khi hết khói trắng khi đó đã gần hết HSO dư Ta thu được lớp chất rắn mỏng ở dưới đáy beaker Mẫu sẽ được pha loãng bằng dung dịch HSO1% hay thêm chuNn rồi mới pha loãng, siêu âm 5 phút rồi cho vào chai nhựa 100 mL Làm tương tự cho mẫu trắng

Hình 15: Mẫu máu chưa xử lý

6.2 Mẫu huyết tương: mẫu máu để rã đông tự nhiên như phần 5.1 trên sẽ được

dùng để ly tâm thu huyết tương

6.2.1 Ly tâm thu huyết tương: Cân chính xác 20 g mẫu máu trong ống ly tâm

Thêm HCl 1:1 đến vạch 30 mL Siêu âm 30 phút rồi ly tâm trong 1giờ Sau khi ly tâm, lọc dung dịch vào bình mức 50 mL bằng giấy lọc băng xanh (rửa tủa 2 lần bằng 2 mL HCl 1:1 mỗi lần) Định mức bằng HCl 1:1 đến vạch

Mẫu có giá trị phân tích trong 4 giờ ở nhiệt độ phòng hoặc 24 giờ khi giữ lạnh ở 00C Làm tương tự cho mẫu trắng

6.2.2 Xử lý mẫu huyết tương:

Cân chính xác 5.00g mẫu huyết tương trong beaker sạch khô, cho 1 mL HSO đậm đặc sẽ được dung dịch màu đen Đun nóng beaker trên bếp điện có lưới amiane ở mức nhiệt độ trung bình trong tủ hút đến khi khói trắng bốc lên và có hiện tượng dung dịch

“leo” lên thành beaker thì lấy beaker khỏi bếp (để lên tấm gỗ) chờ cho dung dịch hết khói trắng và giảm nhiệt độ thì cho thêm khoảng 2 mL HO 30% vào dung dịch Bấy giờ dung dịch sủi bọt rất mạnh đồng thời màu đen nhạt dần, ta cho trở lên bếp đun tiếp Lặp lại quy trình trên đến khi thấy dung dịch gần cạn mà vẫn trong suốt, không màu hoặc có màu rất nhạt Bấy giờ vặn bếp lên tối đa đun đến khi hết khói trắng khi đó đã gần cạn đuổi hết H SO dư Ta thu được lớp chất rắn mỏng ở dưới đáy beaker Mẫu