TIỂU LUẬN XÁC ĐỊNH PROTEIN TRONG SỮA VÀ GLUTEN TRONG BỘT MÌ

việc phân tích hàm lượng protein trong thực phẩm có vai trò quan trọng trong việcxác định hàm lượng dinh dưỡng, định giá thực phẩm dựa trên hàm lượng protein, khảosát tính chất của sản p

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT TP.HCM KHOA CÔNG NGHỆ HOÁ HỌC VÀ THỰC PHẨM

—ӂӂ—

TIỂU LUẬN MÔN PHÂN TÍCH THỰC PHẨM

ĐỀ TÀI:

XÁC ĐỊNH PROTEIN TRONG SỮA

VÀ GLUTEN TRONG BỘT MÌ

GVHD: ThS Lê Hoàng Du Sinh viên thực hiện:

1/ Trần Thị Thuý An MSSV: 14116001 2/ Trần Thị Ngọc Linh MSSV: 14116085 3/ Phan Như Ngọc MSSV: 14116100 4/ Hoàng Thị Hạnh Nhân MSSV: 14116104 5/ Lâm Thị Thanh Trúc MSSV: 14116182

TPHCM, 2016

MỤC LỤC

LỜI NÓI ĐẦU 1

1 TỔNG QUAN VỀ PROTEIN 2

1.1 Phân loại và những nghiên cứu chung 2

1.2 Vấn đề phân tích protein trong thực phẩm 2

2 PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH PROTEIN TRONG SỮA 2

2.1 Các loại protein có trong sữa 2

2.1.1 Casein 2

2.1.2 Whey protein 3

2.1.3 Protein thiểu số 3

2.2 Các phương pháp xác định protein trong sữa 3

2.3 Định lượng protein trong sữa bằng phương pháp Lowry 3

2.3.1 Nguyên tắc 3

2.3.2 Cách tiến hành 3

2.3.2.1 Dụng cụ và thiết bị 3

2.3.2.2 Chuẩn bị mẫu và hóa chất 3

2.3.2.3 Quy trình thực hiện 4

2.3.2.4 Tính kết quả 5

2.3.3 Ưu điểm và nhược điểm 5

2.4 Định lượng protein trong sữa bằng phương pháp Bradford (1976) 5

2.4.1 Nguyên tắc 5

2.4.2 Cách tiến hành 6

2.4.2.1 Dụng cụ và thiết bị 6

2.4.2.2 Chuẩn bị mẫu và hóa chất 6

2.4.2.3 Quy trình thực hiện 6

2.4.2.4 Tính kết quả 6

2.4.3 Ưu điểm và nhược điểm 7

3 PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH GLUTEN TRONG BỘT MÌ 7

3.1 Khái quát về gluten 7

3.1.1 Định nghĩa 7

3.1.2 Thành phần 8

3.1.2.1 Gliadin 8

3.1.2.2 Glutenin 8

3.2 Các phương pháp xác định gluten trong bột mì 8

3.3 Xác định hàm lượng gluten bằng phương pháp thủ công 8

3.3.1 Nguyên tắc 8

3.3.2 Chuẩn bị 9

3.3.3 Tiến hành 9

3.3.4 Ưu điểm và nhược điểm 10

3.4 Xác định hàm lượng gluten bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography) 11

3.4.1 Giới thiệu về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao 11

3.4.1.1 Khái niệm 11

3.4.1.2 Cấu tạo máy sắc ký lỏng hiệu năng cao 11

3.4.1.3 Nguyên tắc hoạt động của hệ thống SE – HPLC 12

3.4.2 Chuẩn bị 12

3.4.3 Tiến hành 13

3.4.4 Kết quả 14

3.4.5 Ưu điểm và nhược điểm 15

TÀI LIỆU THAM KHẢO 16

MỤC LỤC HÌNH Hình 1: Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao 12

Hình 2: Kết quả SE-HPLC của protein trong bột mì 15

MỤC LỤC BẢNG Bảng 1: Lập đồ thị nồng độ protein 5 Bảng 2: Kết quả khảo sát hàm lượng gluten trong bột mì số 8, 11 và 13 10

LỜI MỞ ĐẦU

Protein là một trong những thành phần quan trọng của thực phẩm cung cấp cáctiền chất cần thiết cho quá trình sinh tổng hợp trong cơ thể Ngoài ra, protein còn trực tiếptham gia vào việc tạo nên hương vị của thực phẩm hay tham gia vào các phản ứng nhiệt

và enzyme để tạo nên các chất màu, chất mùi trong quá trình chế biến và bảo quản.Protein cũng đóng vai trò quan trọng trong việc tạo nên các tính chất vật lý của thựcphẩm qua khả năng tạo và ổn định các hệ gel, bọt, nhũ tương và cấu trúc sợi [1] Mỗi loạithực phẩm khác nhau chứa hàm lượng protein khác nhau đặc trưng cho từng loại thựcphẩm việc phân tích hàm lượng protein trong thực phẩm có vai trò quan trọng trong việcxác định hàm lượng dinh dưỡng, định giá thực phẩm dựa trên hàm lượng protein, khảosát tính chất của sản phẩm thực phẩm, xác định một số tính năng sinh học,… [2] Ở bàibáo cáo này, chúng tôi xin được trình bày 2 phương pháp xác định hàm lượng protein cótrong sữa và hàm lượng gluten có trong bột mì

1.

1 TỔNG QUAN VỀ PROTEIN [2] [3]

1.1 Phân loại và những nghiên cứu chung:

Protein là thành phần phong phú và không thể thiếu được của tất cả các cơ thểsống Protein là nền tảng về cấu trúc và chức năng của cơ thể sinh vật Protein trong thựcphẩm rất phức tạp, nhưng nó lại là một chỉ tiêu hết sức quan trọng để xác định giá trị dinhdưỡng của thực phẩm Chỉ trên nền tảng protein cao thì tính chất sinh học của các cấu tưkhác mới thể hiện đầy đủ Các protein có khối lượng phân tư lớn và khác nhau, từ khoảng

5000 đến hơn 100000000 Dalton Chúng bao gồm các nguyên tố gồm C, H, O, N Một sốcòn có chứa một lượng nhỏ S Chủ yếu bao gồm các -amino acid liên kết với nhau bằngcác liên kết peptide

Protein có thể được phân loại dựa vào hình dạng, thành phần, cấu trúc hoặc chứcnăng sinh học, khả năng hòa tan của chúng Trong thực phẩm, protein có nhiều cấu trúckhác nhau như dạng sợi, xoắn hay dạng cầu (hình hạt, hình bầu dục) Dựa vào thành phầnhóa học mà các protein hình cầu được phân thành hai nhóm lớn là Protein đơn giản vàProtein phức tạp

1.2 Vấn đề phân tích protein:

Việc phân tích protein trong thực phẩm rất phức tạp vì thực tế có một số thànhphần thực phẩm có tính chất hóa lý gần như tương tự với protein Các chất không phảiprotein nhưng có chứa nitrogen có thể là các amino acid tự do, các peptide nhỏ, nucleicacids, phospholipids hoặc một số vitamin, v.v… gây khó khăn cho việc phân tích Rấtnhiều phương pháp khác nhau đã được nghiên cứu và phát triển nhằm đo lường hàmlượng protein trong thực phẩm Những nguyên tắc cơ bản của các phương pháp này baogồm việc xác định Nitro, liên kết peptide, sự hấp phụ tia cực tím của protein, v.v… Việclựa chọn sư dụng phương pháp nào phải dựa vào độ nhạy, độ chính xác, tốc độ và chi phíphân tích, ngoài ra còn phải xét đến những ứng dụng cụ thể để lựa chọn phương pháp saocho phù hợp

2. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH PROTEIN TRONG SỮA

2.1 Các loại protein có trong sữa [4]

Sữa có chứa hàng trăm loại protein nhưng hầu hết trong số này chỉ chiếm mộtlượng rất nhỏ Protein có thể được phân loại theo nhiều cách dựa vào tính chất hóa họchay vật lý, và chức năng sinh học của chúng Thông thường, người ta phân loại proteinsữa thành casein, whey protein và các protein thiểu số

2.1.1 Casein

Casein là tên của một nhóm protein chủ yếu trong sữa Casein có mặt trong tất cảsữa động vật, bao gồm cả sữa người Trong sữa bò, casein chiếm 75-85% tổng số protein.Các dạng casein: αs-casein (47-57%), β- casein (25-35%) và κ-casein (8-15%) Casein tồntại dưới dạng các micelle casein

2.1.2 Whey protein

Whey protein (protein hòa tan) là thuật ngữ thường được dùng như là một từ

đồng nghĩa với protein huyết thanh của sữa, nhưng nên dùng nó để chỉ protein trongwhey từ quá trình sản xuất pho mát Ngoài protein huyết thanh của sữa, whey protein cònchữa những đoạn của phân tư casein bị tách rời trong quá trình đông tụ men dich vị củasữa Một số protein huyết thanh sữa tồn tại với nồng độ thấp hơn trong sữa gốc Điều này

là do biến tính nhiệt trong quá trình thanh trùng sữa trước khi làm phomat

2.1.3 Protein thiểu số

Protein thiểu số bao gồm màng các hạt cầu béo (membrane protein) và enzyme.Một số protein thiểu số phổ biến: protein màng, lactoperoxidase, phosphate, lipase…

2.2 Các phương pháp xác định protein trong sữa

Có nhiều phương pháp để phân tích protein trong sữa, ví dụ như định lượngprotein theo phương pháp Kjeldahl, Bradford, Lowry, quang phổ, v.v… Trong phần này,chúng tôi sẽ giới thiệu về hai quy trình xác định protein trong sữa theo phương pháp củaBradford và phương pháp Lowry

2.3 Xác định protein trong sữa bằng phương pháp Lowry

2.3.1 Nguyên tắc [5] [6]

Phương pháp Lowry kết hợp phản ứng biuret và phản ứng với thuốc thư Folin–Ciocalteau phenol (acid phosphomolybdic-phosphotungstic) lên gốc tyrosine vàtryptophan có trong protein (Hình 1) Phức màu xanh được tạo thành có độ hấp thu cựcđại ở bước sóng 750 nm (độ nhạy cao cho nồng độ protein thấp) hoặc 500 nm (độ nhạythấp cho nồng độ protein cao) Có thể tính hàm lượng protein của sữa dựa vào đườngchuẩn của protein và dựa vào phản ứng màu của protein với thuốc thư Folin Cường độmàu tỉ lệ với nồng độ protein

2.3.2 Cách tiến hành [5] [6]

2.3.2.1 Dụng cụ và thiết bị

Dung dịch protein chuẩn có 10 - 100 g protein/1ml

Dung dịch chuẩn: Albumin 0.1, thường là huyết thanh bò (BSA - bovine serumalbumin).

Bình định mức 25 ml

Pipet 5 ml và 0.5 ml

Ống nghiệm

Thiết bị: máy so màu quang điện

2.3.2.2 Chuẩn bị mẫu và hóa chất

Dung dịch nghiên cứu (sữa) được pha loãng đến phạm vi thích hợp (10 - 100g/1ml)

Dung dịch A: Na2CO3 2 hòa tan trong NaOH 0.1N

Dung dịch B: CuSO4.5H2O pha trong dung dịch natri citrat 1

Dung dịch C: hỗn hợp dung dịch A và dung dịch B với tỉ lệ 49:1

Dung dịch Folin có nồng độ 1N

Cách pha dung dịch Folin: pha trong bình cầu có thể tích là 2L Cân 100 g natritungstat (natri wonfamat (Na2WO4.2H2O) và 25 g natri molypdat (Na2MoO4.2H2O) vàcho vào bình cầu đáy tròn nút nhám Thêm vào đó 700 ml nước cất và 500 ml acid orthophosphoric 85 (H3PO4), khuấy tan và thêm vào đó 100 ml HCl tinh kiết và đậm đặc rồitiếp tục khuấy Đun sôi hỗn hợp trong bình cầu đáy tròn dung tích 2 lít có ống sinh hànlàm lạnh hồi lưu trong 10 giờ Sau khi đun hồi lưu thêm vào đó 150 g lithium sulfat(Li2SO4.H2O) tinh khiết Khuấy cho đến khi tan hoàn toàn rồi cho vào đó 5 - 10 ml nướcBrom khuấy đều và đun sôi ở tủ hotte 15 phút (không có ống làm lạnh hồi lưu) để đuổilượng brom thừa Chú ý dung dịch phải có màu vàng, nếu dung dịch có màu xanh thì phải

xư lý với Brom lần thứ hai sau khi làm nguội dung dịch ở nhiệt độ thường Để vào bìnhđịnh mức 1 lít và định mức đến vạch (có thể lọc nếu dung dịch không trong) Đựng trongchai thủy tinh nút nhám có màu nâu, cất giữ ở nơi lạnh, sau 2 - 3 tháng, dung dịch chuyểnsang màu xanh thì thêm vài giọt Brom và đun sôi 15 phút sao cho dung dịch có màu vàngtrở lại Trước khi dùng phải pha loãng thuốc thư bằng nước cất đến nồng độ 0.5N

2.3.2.3 Quy trình thực hiện

a) Chuẩn bị mẫu thí nghiệm nghiên cứu

Cho vào ống nghiệm 1 ml dung dịch mẫu (sữa), thêm vào ống nghiệm 4 ml dungdịch C, lắc đều, để yên trong 10 phút ở nhiệt độ phòng Sau đó thêm 0.5 ml thuốc thư

Folin, lắc đều và để yên trong 30 - 90 phút, lúc này dung dịch sẽ chuyển từ màu vàngsang màu xanh Tiếp theo sẽ đem đo độ hấp thu ở bước sóng 750 nm và ghi nhận mật độquang học của dung dịch nghiên cứu.

Thực hiện tương tự với một ống đối chứng bằng cách thay 1 ml dung dịch mẫubằng 1 ml nước cất

Nồng độ protein (mg/ml)

Dung dịch C (ml)

Thuốc thử Folin (ml)

Bảng 1: Lập đồ thị nồng độ protein

Trình tự và thao tác tương tự như phần dung dịch thí nghiệm Sau đó đem đo độhấp thu của các ống ở bước sóng 750 nm Từ đó xây dụng đồ thị chuẩn

2.3.2.4 Tính kết quả

Dựa vào bảng 1, khi lập đồ thị ta lấy trị số mật độ quang các ống từ 2 - 6 trừ đi mật

độ quang của ống 1 Kết quả thu được chính là độ hấp thu thực sự của dung dịch proteinchuẩn, từ đó ta lập đồ thị biểu diễn sự biến thiên của mật độ quang theo nồng độ proteinchuẩn, với trục hoành là nồng độ protein và trục tung là mật độ quang

Tương tự độ hấp thu thực sự của protein có trong ống thí nghiệm là trị số mật độquang của ống thí nghiệm trừ đi ống đối chứng Sau đó đối chiếu vào đường cong mẫu vàsuy ra lượng protein có trong mẫu sữa đem đi thí nghiệm

2.3.3 Ưu điểm và nhược điểm [2]

Ưu điểm: Phương pháp Lowry có độ nhạy tương đối cao ít bị ảnh hưởng bởi độ

đục của mẫu, cụ thể hơn nhiều so với một số phương pháp khác và tương đối đơn giản,

có thể hoàn thành trong vòng 1 - 1.5 giờ

Nhược điểm: Màu sắc không thật sự tỷ lệ chặt chẽ với nồng độ protein.

2.4 Định lượng protein trong sữa bằng phương pháp Bradford (1976) 2.4.1 Nguyên tắc [6]

Khi Coomassie Brilliant Blue G-250 liên kết với protein, thuốc nhuộm thay đổimàu sắc từ màu đỏ đến xanh nhạt, và sự hấp thụ tối đa của thuốc nhuộm là từ 465-595

nm Sự thay đổi độ hấp thụ ở 595 nm tỷ lệ thuận với nồng độ protein của mẫu Giống vớinhững phương pháp nhuộm bắt buộc khác, Bradford dựa trên tính chất lưỡng tính củaprotein Khi dung dịch mang protein được acid hóa đến một pH nhỏ hơn điểm đẳng điệncủa protein đang phân tích, thuốc nhuộm sẽ tạo liên kết tĩnh điện Hiệu quả liên kết sẽđược tăng cường bởi sự tương tác kỵ nước của thuốc nhuộm phân tư với các polypeptideliền kề trục dư lượng tích điện dương trong protein Trong phương pháp Bradford, thuốcnhuộm kết hợp với protein có một sự thay đổi trong quang phổ hấp thụ tương đối so vớithuốc nhuộm không liên kết

2.4.2 Cách tiến hành

2.4.2.1 Dụng cụ và thiết bị [7]

Cuvett bằng nhựa

Micropipet

Máy đo quang phổ Shimadzu UV - 200s

2.4.2.2 Chuẩn bị mẫu và hóa chất [7]

Các mẫu protein

Dung dịch màu:

- 40mg coomassie blue G (sevra No 35050)

- 20ml ethanol (EtOH) (absolute)

- 40ml H3PO4 85%

- 40ml H2O

Dung dịch BSA (Bovine Serum Albumin) 100mg/ml

2.4.2.3 Quy trình thực hiện [7]

a) Xây dựng đường cong chuẩn biểu diễn nồng độ protein chuẩn (BSA)

1,8ml dung dịch protein chuẩn có chứa từ 5-40mg BSA trong nước cất được đưavào cóng đo nhựa

Thêm 0,6ml dung dịch màu, lắc đều để 5 phút cho phản ứng xảy ra ở nhiệt độphòng

Đo độ hấp phụ ở bước sóng 595nm sau 2 phút

Dung dịch mẫu trắng (Blank) được chuẩn bị từ 1.8ml nước cất và 0,6ml chất thưmàu

Dựng đồ thị biểu diễn hàm lượng BSA tương ứng với giá trị OD 595nm Đườngcong tiêu chuẩn này được sư dụng để xác định hàm lượng protein trong các mẫu chưabiết, cũng được xây dựng tương tự theo phương pháp Lowry

b) Định lượng protein của mẫu

Các mẫu có chứa từ 1-10mg protein trong 1,8ml H2O được đưa vào cóng nhựa.Thêm vào 0,6ml dung dịch màu lắc đều

Đo độ hấp phụ quang học (OD) ở bước sóng 595nm

2.4.2.4 Tính kết quả

Dựa vào đồ thị chuẩn xác định hàm lượng protein trong mẫu theo công thức sau:

X (mg) = Trong đó:

- X: số mg protein có trong mẫu

Nhanh chóng; phản ứng có thể được hoàn thành trong 2 phút

Nhạy cảm gấp nhiều lần phương pháp Lowry

Không có sự can thiệp của ammonium sulfate, polyphenol, carbohydrate nhưsucrose, hoặc cation như K+, Na+ và Mg2+

Đo được protein hay peptide có khối lượng phân tư xấp xỉ hoặc lớn hơn 4000 Da

Nhược điểm:

Bị cản trở bởi cả thuốc tẩy mang ion và không ion như là Triton X-100 và sodiumdodecyl sulfate Tuy nhiên, với sai số nhỏ khoảng 0,1%, các chất tẩy rưa có thể đượcdùng với sự kiểm soát một cách thích hợp

Phức hợp protein-thuốc nhuộm có thể liên kết với cuvette thạch anh Vì vậy cácnhà phân tích phải sư dụng cuvette thủy tinh hoặc nhựa

Màu sắc đa dạng tuỳ theo loại protein Các protein tiêu chuẩn phải được lựa chọncẩn thận

3. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH GLUTEN TRONG BỘT MÌ

3.1. Khái quát về gluten

3.1.1. Định nghĩa [8]

Gluten có thể được định nghĩa như là một loại protein có tính “cố kết, nhớt đànhồi” Về mặt sinh học, gluten được định nghĩa như một loại protein dự trữ trong hạtlúa mì

Một cách khái quát, gluten là tên gọi chung của một loại protein có trong một

số loại ngũ cốc, là thành phần protein chính trong lúa mì, giúp tạo nên tính đàn hồi đặctrưng của bột Hàm lượng protein trong bột mì càng cao, chất lượng và độ bền củagluten càng cao

Gluten là một trong những yếu tố để phân biệt công dụng của các loại bột khácnhau

Là các chuỗi đơn polypeptide chứa các liên kết disulfide nội phân tư

Khối lượng phân tư: 30000 - 50000 Da

Gồm bốn loại: -, -, -, và -gliadin

Phát triển mạng lưới gluten bằng cách hình thành các liên kết hydro, liên kết kỵnước giữa các mạch nhánh chứa acid amin không phân cực và chuyển đổi thiol-disulfide, tương tác với lipid (lipid của bột hoặc lipid bổ sung vào)