Tình hình ngộ độc, gây bệnh của Salmonela Trong nước: Tại Việt Nam, hằng năm nước ta xảy ra khoảng 168 ca ngộ độc thực phẩm nghiêm trọng, nguyên nhân phần lớn là do Salmonella Tại TP Hồ
Trang 1TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM
Phạm Thị Mỹ HuyềnNguyễn Thị Trúc LinhTrịnh Ngọc Như Huỳnh 2005181102
Hồ Trúc LinhNguyễn Võ Nhật Khanh 2005181107
TP HÔ CHÍ MINH, NĂM 2020
Trang 2STT Họ và tên Phân công nhiệm vụ Mức độ hoàn
3 Trịnh Ngọc Như Huỳnh Quy trình phâ tích và giải thích 100%
quy trình, ví dụ minh họa
4 Phạm Thị Mỹ Huyền Môi trường, dụng cụ, hóa chất 100%
thiết bị
So sánh TCVN và ISO, thuật
Bảng phân công nhiệm vụ
Trang 3MỤC LỤC
1 Cơ sở sinh học 1
2 Tình hình ngộ độc, gây bệnh của Salmonela 2
3 Nguyên tắc phân tích 5
4 Quy trình phân tích 6
5 Các bước tiến hành 7
6 Môi trường và hóa chất 15
7 Dụng cụ và thiết bị 16
9 So sánh TCVN 10780-1: 2017 và ISO 6579-1:2017 19
10 Thuật ngữ đề xuất 20
11 Kết luận 20
TÀI LIỆU THAM KHẢO 21
1
Trang 4DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 7.1 Tủ sấy 16
Hình 7.2 Tủ ấm 16
Hình 7.3 Tủ lạnh 17
Hình 7.4 Nồi cách hâp thủy 17
Hình 7.5 Que cấy vô trùng 17
Hình 7.6 Dụng cụ đo pH 18
Hình 7.7 ĐĨa petri vô trùng 18
Hình 7.8 Ống nghiệm, bình tam giác vô trùng 18
Trang 5DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
BPW: dung dịch Buffered Peptone Water
CDC: Trung tâm Kiểm soát và Phòng ngừa dịch bệnh MỹHE: Hektoen Entric Agar
LD: lysine decarboxylase
MKTTn: Mueller Kauffman Tetrathionate Novobiocin BrothRVS: Canh Rappaport - Vassiliadis Soya Pepton
TSA: Tryptone Soy Agar
TSI: Kilgler Iron Agar
VP: Voges-Proskauer
XLD: Xylose Lysine Desoxycholate
Trang 61 Cơ sở sinh học
Salmonella thuộc họ Enterobacteriaceae (vi khuẩn đường ruột) là một giống vi
khuẩn hình que, trực khuẩn gram âm, không sinh bào tử, hiếu khí và kỵ khí tùy nghi,
có khả năng di động (trừ Salmonella gallinarum và Salmonella pullorum), sinh acid
từ glucose và mannitol nhưng không lên men saccharose và lactose, không sinh indol và không phân giải ure Hầu hết các chủng đều sinh H2S (trừ Salmonella
typhi) Chúng có mặt khắp nơi trong đất, nước, nước đá, sữa, sản phẩm bơ sữa, gia
cầm, sản phẩm gia cầm, trứng, sản phẩm trứng, thịt, phân động vật, thú nuôi… sinh sống trong đường ruột, có đường kính khoảng 0,7µm đến 1,5µm, dài từ 2µm đến 5µm và có vành lông rung hình roi Salmonella có hơn 2000 kiểu huyết thanh và mỗi kiểu đều có khả năng gây bệnh chung phat triên tôt ơ nhiêṭđô ̣ 6℃ – 42℃, thichhợp nhât ơ 35℃ – 37℃, pH tư 6 – 9 va thich hợp nhât ơ pH = 7,2 Ở nhiêṭđô ̣tư
18℃ – 40℃ vi khuân co thê sông đên 15 ngay
Tại Bắc Mỹ, Salmonella typhimurium và Salmonella enteridis là hai chủng thường gặp nhất Tại Việt Nam, bệnh thương hàn do Salmonella typhi và Salmonella
paratyphi A, B, C gây ra Bệnh do Salmonella gây ra là một trong những vấn đề
quan trọng nhất liên quan đến sức khỏe cộng đồng, gây nguy hiểm và tử vong đếnngười và động vật trên thế giới Liều gây bệnh khoảng 105-6 tế bào, nhưng đối vớimột số chủng độc, thì việc ăn một lượ̣ng nhỏ tế bào cũng có thể gây bệnh
Salmonella là một trong những tác nhân gây bệnh chủ yếu trong thực phẩm Có ba
dạng bệnh do Samonela gây ra Sốt thương hàn do S typhy, nhiễm trùng máu do S
cholera-sius, rối loạn tiêu hóa do S.typhymurium và S.enterithdis.
Hầu hết các tiêu chuẩn vi sinh về an toàn thực phẩm đều không cho phép có sự
hiện diện của Salmonella trong 25g/25ml mẫu Theo phương pháp truyền thống việc phát hiện Salmonella bao gồm những bước như tiền tăng sinh, tăng sinh chọn
lọc, phân lập, phuc hồi và khẳng định
Vi khuẩn Salmonella kém chịu nhiệt, dễ bị tiêu diệt khi thức ăn đượ̣c đun nấu phù
hợ̣p Việc làm lạnh, cấp đông, đảm bảo vệ sinh có tác dụng quan trọng làm giảmthiểu nguy cơ nhiễm bệnh
Salmonella có ba loại kháng nguyên, đó là những chất khi xuất hiện trong cơ thể
thì tạo ra kích thích đáp ứng miễn dịch và kết hợ̣p đặc hiệu với những sản phẩmcủa sự kích thích đó, gồm: kháng nguyên thân O, kháng nguyên lông H và kháng
nguyên vỏ K Vi khuẩn thương hàn (S.typhi) có kháng nguyên V (Virulence) là yếu
1
Trang 7tố chống thực bào giúp cho vi khuẩn thương hàn phát triển bên trong tế bào bạch cầu.
Vi khuẩn Salmonella có thể tiết ra 2 loại độc tố: Ngoại độc tố và nội độc tố
+ Nội độc tố của Salmonella rất mạnh gồm 2 loại: Gây xung huyết và mụn loét,
độc tố ở ruột gây độc thần kinh, hôn mê, co giật
+ Ngoại độc tố chỉ phát hiện khi lấy vi khuẩn có độc tính cao cho vào túicolodion rồi đặt vào ổ bụng chuột lang để nuôi, sau 4 ngày lấy ra, rồi lại cấy truyềnnhư vậy từ 5 đến 10 lần, sau cùng đem lọc, nước lọc có khả năng gây bệnh cho độngvật thí nghiệm Ngoại độc tố chỉ hình thành trong điều kiện invivo và nuôi cấy kỵ khí.Ngoại độc tố tác động vào thần kinh và ruột
2 Tình hình ngộ độc, gây bệnh của Salmonela
Trong nước:
Tại Việt Nam, hằng năm nước ta xảy ra khoảng 168 ca ngộ độc thực phẩm nghiêm
trọng, nguyên nhân phần lớn là do Salmonella
Tại TP Hồ Chí Minh, trong đợ̣t giám sát thí điểm năm 2013, sau khi lấy 1.618 mẫu
tại chợ̣ đầu mối Bình Điên, Hóc Môn, Thủ Đức đã phát hiện Salmonella trong 30%
mẫu thịt heo và 45% trong mẫu thịt gà
Ngày 10/7/2013, tại Công ty TNHH Foremart Việt Nam (thị trấn Ân Thi, huyện
Ân Thi, tỉnh Hưng Yên) đã làm 232 công nhân bị ngộ độc thực phẩm do ăn bữatrưa tại bếp ăn đặt trong Công Ty với các món giò, ngao nấu mùng tơi, giá xàomướp, đậu sốt cà chua Đoàn công tác và đại diện các cơ quan y tế tại địa phương
đã thống nhất đánh giá nguyên nhân của vụ ngộ độc là do vi khuẩn Salmonella và
độc tố của chúng gây ra
Ngày 3/10/2013, sau bữa ăn ca trưa tại Bếp ăn tập thể Công ty TNHH MTVWONDO VINA tại ấp Tân Bình, xã Long Bình Điền, huyện Chợ̣ Gạo, tỉnh TiềnGiang, hàng loạt công nhân có biểu hiện nôi mửa, đi ngoài và phải nhập viện Tínhđến ngày 08/10/2013, tổng số bệnh nhân ghi nhận đượ̣c là 779 người phải nhậpviện điều trị Rất may mắn, các bệnh nhân đều có tiến triển tốt, không có diễn biếnbất thường Thưc ăn nghi ngơ chưa tac nhân la mon thit boc trưng chim cut kho;nguyên nhân ngộ độc nghi do vi sinh vâṭva đôc ̣ tô vi khuân nhom Gram âm và đếnnay, mẫu kiểm nghiệm đã xác định hàng loạt công nhân bị ngộ độc là do thức ăn
nhiễm khuẩn Salmonella.
2
Trang 8Tại Thành phố Đồng Hới với gần 250 người phải nhập viện từ ngày 14 tháng 10năm 2015 vì bánh mì thịt, bánh mì trứng nhiễm khuẩn.
Những ngày đầu tháng 5 năm 2018, ở bản Nà Mện, xã Nậm Ty, huyện Sông Mã,tỉnh Sơn La, sau khi ăn cỗ cưới, đã có tới hơn 300 người bị ngộ độc thực phẩm do
vi khuẩn Salmonella (vi khuẩn thương hàn) gây ra.
Ngày 14/11/2018, vi khuẩn Salmonella là nguyên nhân khiến trên 200 trẻ mầm non
tại Đông Anh (Hà Nội) bị ngộ độc thực phẩm sau khi tổ chức liên hoan Kết quả
kiểm tra cho thấy 1 mẫu bánh ngọt dương tính với vi khuẩn Salmonella Mẫu bánh
này đượ̣c cung cấp bởi Công ty Cổ phần sản xuất và thương mại Nguyên Cát cóđịa chỉ tại phường Hạp Lĩnh, tỉnh Bắc Ninh
Ngày 28/11/2018, hơn 200 người nhập viện sau khi ăn bánh mì vỉa hè ở TP Buôn
Ma Thuột Ngày 5/12, bà Lê Thị Châu - Chi cục trưởng Chi cục Vệ sinh An toànthực phẩm thuộc Sở Y tể Đắk Lắk xác nhận liên quan đến vụ 215 người bị ngộ độcthực phẩm sau khi ăn tại tiệm bánh mì ở ngã tư đường Hoàng Diệu - Phan ChuTrinh (TP Buôn Ma Thuột), đơn vị đã xác định nguyên nhân ngộ độc hàng loạt là
do nhiễm vi khuẩn Salmonella Sau khi lấy mẫu thực phẩm gồm thịt heo, giò chả,nước sốt, hành phi, bơ kiểm trathì phát hiện tất cả những mẫu trên đều nhiễm vi
khuẩn Salmonella.
Ngày 25/3/2019, hàng chục người bị ngộ độc khi ăn giỗ ở xã Hòa Hải, huyện
Hương Khê, tỉnh Hã Tĩnh do thức ăn trong đám giỗ bị nhiễm Salmonella Nguyên nhân gây nhiễm Salmonella là do không đảm bảo an toàn thực phẩm trong khâu
chế biến, mặt nước bị ô nhiễm và nước tù đọng…
Các triệu chứng ngộ độc thực phẩm do Salmonella thường xuất hiện nhanh chóng, trong vòng 8 – 72 giờ sau khi ăn thức ăn hoặc uống nước nhiễm Salmonella Các
triệu chứng điển hình như đau bụng co thắt, ớn lạnh, tiêu chảy, sốt, đau cơ, buồnnôn, nước tiểu có màu sẫm, khô miệng, phân toàn nước đôi khi có máu…
Ngoài nước:
Theo dự đoán của WHO, trên toàn thế giới có hơn 16 triệu ca bệnh thương hàn
hàng năm, hơn nửa triệu trong số đó là tử vong Salmonella có khả năng sống sót
hàng tuần bên ngoài cơ thể con người hoặc động vật Ánh sáng mặt trời (tia UV)làm tăng tốc độ chết của các tác nhân gây bệnh Trong phân khô, chúng còn có thểsống đượ̣c 2,5 năm Vi khuẩn không bị giết bằng cách đông lạnh Trong môi
trường axit, vi khuẩn Salmonella chết đi nhanh chóng và chất diệt khuẩn phổ biến
giết chết chúng trong vòng vài phút Ở̉ nhiệt độ dưới 6 °C, mức tăng trưởng của
3
Trang 9chúng chậm hơn nhiều Để ngăn ngừa nhiễm khuẩn Salmonella, thực phẩm đượ̣c
khuyến cáo là khi chế biến ít nhất nên giữ ở nhiệt độ ở 75°C trong ít nhất mườiphút (nhiệt độ trong lõi), trứng tươi cần bảo quản trong tủ lạnh
Năm 1885 Slamon và Smith (Mỹ) tìm đượ̣c Salmonella từ lợ̣n mắc bệnh dịch tả và gọi tên là Bacilus cholerasuis, hiện nay gọi là Salmonella.
Tại Hoa Kỳ, Salmonella là thủ phạm của 15% các trường hợ̣p ngộ độc thực phẩm.
Ngày 15/12/2011, tại trường học trên đảo Hokkaido phía Bắc Nhật Bản có 953 họcsinh và 48 giáo viên và nhân viên nhà trường có triệu chứng ngộ độc thực phẩmsau khi ăn trưa gồm súp miso, salad và củ cải với thịt băm Nhật Bản Các mẫu thức
ăn trên đã đượ̣c thử nghiệm và xác định nguyên nhân phát sinh vụ ngộ độc là do
thức ăn nhiễm Salmonella.
Ngày 3/7/2019, đu đủ tươi nhập khẩu từ Mexico khiến 62 người bị ngộ độc do
nhiễm khuẩn Samonella
Ngày 26/9/2020, ít nhất 41 người dân tại Mỹ đã nhiễm khuẩn Salmonella sau khi
ăn mộc nhĩ chế biến đi kèm với món mỳ ramen Trung tâm Kiểm soát và Phòngngừa dịch bệnh Mỹ (CDC) cho rằng các ca nhiễm trên đều do sử dụng món mộcnhĩ khô do công ty nhập khẩu đồ Châu Á có trụ sở ở Sante Fe Springs, Californiaphân phối
Chính quyền tỉnh Saitama ngày 2/7/2020 xác nhận 3.453 người tại các trường tiểuhọc và trung học ở Yashio - thành phố phía Bắc thủ đô Tokyo, đã bị đau bụng, đingoài sau khi ăn bữa trưa với các suất ăn do công ty TQC cung cấp vào ngày 26/6.Suất ăn bao gồm gà rán, khoai tây sốt cá ngừ, salad rong biển cùng cơm và súp đậuhũ
Salmonella đượ̣c ghi nhận là nguyên nhân phổ biến nhất của các vụ ngộ độc thựcphẩm ở EU Năm 2018, các quốc gia thành viên EU đã báo cáo 5.146 vụ ngộ độcthực phẩm ảnh hưởng đến 48.365 người, theo báo cáo của cơ quan an toàn thựcphẩm Châu Âu (EFSA) và Trung tâm phòng chống dịch bệnh Châu Âu (ECDC),
có 1.581 vụ trong số các vụ ngộ độc này là do Salmonella, 67% trong đó có nguồn
gốc từ Tây Ban Nha và Ba Lan và chủ yếu liên quan đến trứng
4
Trang 103 Nguyên tắc phân tích
Phương pháp này tham chiếu theo TCVN 10780-1:2017 dùng để phát hiện
Salmonella trong tất cả các loại thực phẩm.
Phương pháp này chỉ dùng để định tính và kết luận phát hiện hay không phát hiện
Salmonella trên lượ̣ng mẫu đã lấy.
Quy trình phát hiện Salmonella bắt buộc phải qua năm giai đoạn và phải sử dụng
chủng đối chứng trong toàn bộ quá trình phân tích
+ Tiền tăng sinh: mẫu đượ̣c tiền tăng sinh trong môi trường tăng sinh không chọn lọc (BPW) ủ ở 37℃ trong khoảng 18h
+ Tăng sinh chọn lọc: Sau giai đoạn tiền tăng sinh, dịch mẫu đượ̣c chuyển qua môi trường tăng sinh chọn lọc RVS ủ ở 41,5 ℃ và MKTTn ủ ở 37℃ trong khoảng 24h
+ Phân lập: cấy ria dịch mẫu từ môi trường tăng sinh chọn lọc sang hai môi trường rắn chọn lọc ( XLD và HE), ủ ở 37℃ trong khoảng 24h
+ Phục hồi: Cấy chuyển các khuẩn lạc nghi ngờ Salmonela trên các môi
trường phân lập sang môi trường dinh dưỡng
+ Khẳng định: Cấy chuyển sinh khối trên môi trường dinh dưỡng sang các môitrường thử nghiệm sinh hóa và thử nghiệm kháng huyết thanh lọc
5
Trang 114 Quy trình phân tích
Cân 25g mẫu rắn hoặc 25ml mẫu lỏng
Thêm 225 ml BPW
Dập mẫu trong 1 phútBao PE vô trùng chứa 25g/25ml mẫu thử
Ủ ở (37±1)oC/(18±2)h0.1ml
10ml môi trường RVS broth
Ủ ở (41±1)oC/(24±3)h
1ml10ml môi trường MKTTn broth
Không có khuẩn lạc điển hình hoặc nghi
ngờ từ mỗi môi trường phân lập
Đánh dấu 5 khuẩn lạc điển hình hoặc nghi
ngờ, cấy lên NA/TSA
Ủ ở (37±1)oC /(24±3)h
Thử một khuẩn lạc điển hình
hoặc nghi ngờ
Thử bốn khuẩn lạc cònlại đã đượ̣c đánh
broth
Ủ ở (37±1)oC/(24±3)h
6
Dương
tính Báo cáo kết quả
Trang 12Âm tính
Trang 135 Các bước tiến hành
Cân một lượ̣ng 25g mẫu rắn hoặc đong một thể tích 25ml mẫu lỏng với sai số chophép ± 5% của phần mẫu thử đại diện cho vào bao PE vô trùng (hoặc bình tamgiác), bố sung 225ml môi trường BPW và đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu(stomacher) trong 60 giây
+ Bước 1: Tiền tăng sinh (Tăng sinh sơ bộ)
Mẫu đượ̣c tiền tăng sinh trong môi trường tăng sinh không chọn lọc (BPW) ủ ở
37±1oC trong 18±2h
+ Bước 2: Tăng sinh chọn lọc
- Chuyển 0,1 ml dịch cấy tăng sinh thu đượ̣c vào ống chứa 10 ml môi trường
RSV
- Chuyển 1 ml dịch cấy thu đượ̣c vào ống có chứa 10 ml môi trường MKTTn
Ủ môi trường RVS đã cấy ở 41,5 °C trong 24 h ± 3 h
Ủ môi trường MKTTn đã cấy ở 37°C trong 24 h ± 3 h
- Sau khi ủ 24±3h, kiểm tra các đĩa về sự có mặt của các khuẩn lạc điển hình và
các khuẩn lạc không điển hình mà có thể nghi ngờ là Salmonella
F Các khuẩn lạc Salmonella điển hình phát triển trên thạch XLD có màu hồng
trong suốt, có hoặc không có tâm màu đen
F Các khuẩn lạc Salmonella điển hình phát triển trên thạch HE có màu xanh
lam, có hoặc không có tâm màu đen
+ Bước 4: Phục hồi trên môi trường dinh dưỡng NA/TSA
7
Trang 14- Đánh dấu 5 khuẩn lạc điển hình hoặc nghi ngờ từ mỗi đĩa trên môi trường phânlập XLD và HE Nếu trên mỗi đĩa có ít hơn năm khuẩn lạc điển hình hoặc khuẩnlạc nghi ngờ, thì lấy tất cả cá khuẩn các điển hình hoặc nghi ngờ đó cấy ria lên NA/TSA Ủ ở 37±1oC trong 24±3h
+ Trường hợ̣p 1: từ mỗi đĩa thử một khuẩn lạc đặc trưng, nếu cho các kết quả
thử nghiệm sinh hóa phù hợ̣p thì kết luận phát hiện Salmonella trong mẫu
+ Trường hợ̣p 2: nếu khuẩn lạc đầu tiên cho kết quả thử nghiệm sinh hóakhông phù hợ̣p thì tiến hành thử bốn khuẩn lạc còn lại đã đượ̣c đánh dấu, một trongbốn khuẩn lạc này cho kết quả thử nghiệm sinh hóa phù hợ̣p thì kết luận phát hiện
Salmonella trong mẫu và ngượ̣c lại thì kết luận không phát hiện Salmonella trong
mẫu
F Chọn khuẩn lạc để khẳng định
Đánh dấu các khuẩn lạc nghi ngờ trên mỗi đĩa Chọn ít nhất một khuẩn lạc điểnhình hoặc nghi ngờ để cấy truyền và khẳng định Nếu khuẩn lạc này âm tính thìchọn nhiều hơn bốn khuẩn lạc nghi ngờ để chắc chắn rằng các khuẩn lạc này đãđượ̣c cấy truyền trên hỗn hợ̣p các môi trường phân lập/môi trường tăng sinh chọnlọc khác nhau cho thấy các khuẩn lạc nghi ngờ phát triển
Cấy ria các khuẩn lạc đượ̣c chọn trên bề mặt môi trường thạch không chọn lọc đãđượ̣c làm khô trước, sao cho các khuẩn lạc phát triển riêng rẽ Ủ các đĩa đã cấy ởnhiệt độ từ 34°C đến 38°C trong 24± h
Cách khác, nếu có các khuẩn lạc riêng rẽ (nuôi cấy thuần) trên môi trường đĩathạch chọn lọc thì có thể thực hiện khẳng định sinh hóa trực tiếp với khuẩn lạcriêng rẽ nghi ngờ từ môi trường đĩa thạch chọn lọc Sau đó có thể thực hiện bướcnuôi cấy trên môi trường thạch không chọn lọc song song với các phép thử sinhhóa để kiểm tra độ thuần của khuẩn lạc từ môi trường thạch chọn lọc
Sử dụng các chủng cấy thuần để khẳng định bằng phép thử sinh hóa và huyếtthanh
8
Trang 15+ Bước 5: Khẳng định sinh hóa và kháng huyết thanh
- Từ các khuẩn lạc đã chọn cấy ria lên NA/TSA, dùng que cấy cấy vào các môi trường sau:
Thạch TSI
- Nguyên tắc: xác định khả năng sử dụng nguồn carbohydrate cụ thể kết hợ̣pvới môi trường tăng trưởng căn bản, có hoặc không có sinh hơi và hydrogen sulfide(H2S)
- Cách cấy mẫu: Cấy ria trên bề mặt nghiêng của thạch và cấy đâm sâu xuốngđáy Ủ ở 37±1°C trong 24±3h Diễn giải những thay đổi trong môi trường như sau:
Cấy đâm sâu
Màu đỏ hoặc không đổi màu Glucose âm tính (không sử dụng
glucose)
Bọt khí hoặc nứt thạch Sinh khí từ glucose
Phần lớn các chủng cấy Salmonella điển hình thể hiện tính kiềm (màu đỏ) trên bề
mặt nghiêng của thạch và tính axit (màu vàng) có sinh khí (bọt khí), (với khoảng90% trường hợ̣p) sinh hydro sunfua (thạch bị đen) khi cấy đâm sâu
9