Phân tích chỉ tiêu Aspergillus trong sản xuất nước tương

Aspergillus thuộc nhóm vi nấm, không có chất diệp lục do vậy chúng không thể tự tổng hợp được các chất dinh dưỡng cho bản thân mà phải lấy từ các chất hữu cơ có sẵn trong môi trường để s

LỜI MỞ ĐẦU

Ngày nay, gia vị được sử dụng nhiều trong chế biến thực phẩm và bữa ăn hàng ngày của người Việt Trong đó có rất nhiều sản phẩm gia vị được làm từ các phương pháp lên men truyền thống như nước mắm, nước tương,… Nước chấm từ thực vật ngoài vai trò cung cấp mùi vị, nó còn cung cấp cho cơ thể người một lượng protein nhất định và một số khoáng chất cần thiết cho cơ thể Nước tương lên men là một loại nước chấm giàu chất dinh dưỡng, có hương vị thơm ngon Từ xưa con người đã biết cách sản xuất nước tương bằng cách lên men truyền thống từ đậu nành Tuy nhiên phương pháp này cho năng suất thấp, thời gian lên men kéo dài và chất lượng không

ổn định, đôi lúc còn nhiễm loại nấm mốc Aspergillus flavus sinh độc tố Aflatoxin gây

ung thư (Nguyễn Đức Lượng, 2002) Mặt khác phổ biến trên thị trường hiện nay là nước chấm được sản xuất bằng phương pháp hóa giải, hàm lượng dinh dưỡng thấp, chứa chất bảo quản và chứa hàm lượng cao chất 3-MCPD, 1.3-DCP, độc tố Aflatoxin… là các chất gây ung thư Để khắc phục những nhược điểm trên người ta đã

tìm ra chủng Aspergillus oryzae có hoạt tính cao về các enzyme Amylase và Proteinase rất thích hợp cho việc làm tương Mặc dù, nấm sợi Aspergillus orysae có hình thái, màu sắc gần giống với nấm sợi Aspergillus flavus, nhưng Aspergillus oryzae không sản sinh độc tố gây ung thư như nấm sợi Aspergillus flavus (Nguyễn Lân Dũng, 2007) Loài nấm mốc Aspergillus oryzae này đã tạo nên một hướng mới cho công nghệ làm

tương trong tương lai

MỤC LỤC

Chương I: Tổng quan 5

I.1 Giới thiệu về Aspergillus oryzae 5

I.2 Lịch sử phát hiện 5

I.3 Phân loại 6

I.4 Đặc điểm 7

Chương II: Quy trình phân tích chỉ tiêu vi sinh 9

II.1 Sơ đồ quy trình phân tích 9

II.2 Thuyết minh quy trình phân tích 10

II.2.1 Nguồn mẫu 10

II.2.2 Phân lập 10

II.2.3 Xác định vi sinh vật 11

II.2.4 Khảo sát các đặc tính có lợi của Aspergillus oryzae 14

II.2.5 Định danh Aspergillus oryzae bằng kỹ thuật sinh học phân tử 15

Chương III: Ứng dụng Aspergillus oryzae trong sản xuất nước tương 16

Chương IV: Kết luận và đề nghị 20

Tài liệu tham khảo 21

Chương I: Tổng quan

I.1 Giới thiệu về Aspergillus oryzae

Giống nấm Aspergillus có thể lên đến 200 loài, trong đó có khoảng 20 loài gây hại cho con người Aspergillus thuộc nhóm vi nấm, không có chất diệp lục do vậy

chúng không thể tự tổng hợp được các chất dinh dưỡng cho bản thân mà phải lấy từ các chất hữu cơ có sẵn trong môi trường để sinh trưởng và phát triển Một số giống

Aspergillus được sử dụng trong công nghệ lên men, sản xuất enzyme (amylase,

protease, pectinase,…) và các acid hữu cơ (acid citric, acid glucomic,…) trong đó có

Aspergillus oryzae.

Chủng Aspergillus oryzae là loại nấm sợi quan trọng trong công nghiệp, cách

đây hàng trăm năm nó được dùng để lên men rượu sake, pate đậu phộng, nước tương

ở Nhật Người ta nhận ra rằng A.oryzae lên men tương ngon hơn so với một số chủng

khác vì chúng có khả năng biến đổi tinh bột của gạo nếp thành đường làm tương có vị

ngọt Hiện nay, A.oryzae đang được ứng dụng rộng rãi trong công nghệ lên men

truyền thống ở nhiều nước châu Á như Trung Quốc, Nhật Bản, Philippin, Indonesia

và Việt Nam Cho đến thời điểm này thì chủng nấm mốc A.oryzae đã được sử dụng

rộng rãi trong công nghiệp sản xuất enzyme (α-amylase, glucoamylase) trong các ngành chế biến thực phẩm

I.2 Lịch sử phát hiện:

Năm 1729, Pier Antonio Micheli nhà thực vật học người Ý đã khai sinh ra nấm học qua tài liệu công bố “giống cây lạ” theo Nguyễn Văn Bá (2009)

Từ năm 1794-1874, Elias Fries là người có công nghiên cứu sâu về nấm mốc theo Nguyễn Văn Bá (2009)

Elizabeth Tootyll cho rằng nấm mốc có khoảng 5100 giống và 50000 loài được

mô tả, tuy nhiên ước tính có trên 100000 đến 250000 loài nấm hiện diện trên trái đất theo Nguyễn Văn Bá (2009)

Aspergillus đã trở thành một trong những chi nổi tiếng nhất và được nghiên cứu

nhiều nhất theo Nguyễn Thị Thanh Kiều (2011)

Năm 1950, A.oryzae được phân lập lần đầu bởi Jokichi Takamine một nhà khoa

học Nhật Bản và được gọi là RIB40 hoặc ATCC 42149 theo wikipedia (2014)

Năm 2001, bộ gen di truyền của A.oryzae đã được phân tích và giải mã Hệ gen gồm 8 nhiễm sắc thể với 12 ngàn gene và 37 triệu cặp base theo Machida et al (2005).

Đến nay, loài A.oryzae đang được ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực ở các quốc

gia khác nhau, đặc biệt là các nước châu Á

I.3 Phân loại:

Loài Aspergillus oryzae thuộc:

Hình 1: Bộ gen di truyền của A.oryzae

Ngoài A.oryzae thì trong chi Aspergillus còn có một số loài đặc trưng như: A.flavus, A.parasiticus, A.niger, A fumigatus, A.versicolor.

I.4 Đặc điểm:

I.4.1 Đặc điểm hình thái

A.oryzae là nấm mốc hay còn gọi là nấm sợi, có bào tử, là vi sinh vật hoàn toàn

hiếu khí, không có khả năng di động, không thể tổng hợp chất hữu cơ từ CO2 mà phải

sử dụng trực tiếp các chất hữu cơ có sẵn trong môi trường để phát triển và đảm bảo hoạt động bình thường

Hình 2: Hình thái khuẩn lạc của một số loài thuộc chi Aspergillus

Cơ thể sinh trưởng của A.oryzae là một hệ bao gồm những sợi mỏng chiều

ngang 5-7µm, phân nhánh rất nhiều, có vách ngang và sợi hình thành nhiều bao tế bào

(nấm đa bào) A.oryzae sinh sản bằng bào tử đính (conidia) đây là hình thức sinh sản

vô tính Bào tử đính phát triển từ thành tế bào rất dày, bên trong hệ sợi nấm gọi là tế bào chân đế Nó tạo thành sợi cuống dài và kết thúc là một cấu trúc phồng hình củ hành gọi là bọng (túi) Xung quanh bọng là một hay hai bộ cuống để đính bào tử gọi

là cuống đính bào tử hay thể bình Từ bộ cuống ngoài cùng, những bào tử được sinh ra

đính vào nhau, nên gọi là bào tử đính Đính bào tử của A.oryzae có màu vàng lục hay

màu vàng hoa cau, đây chính là màu đặc trưng ở nấm mốc (Nguyễn Đức Lượng et al., 2003)

Chú thích hình:

I.4.2 Đặc điểm sinh lý

Hình 3: Hình thái học Aspergillus oryzae

Nấm Aspergillus oryzae có những đặc điểm sinh lý sau:

Độ ẩm môi trường tối ưu cho sự hình thành bào tử: 45%

Nhiệt độ thích hợp cho sự hình thành và phát triển bào tử: 27-32oC

Độ ẩm môi trường tối ưu cho sự hình thành enzyme: 55-58%

Độ ẩm không khí: 85-95%

pH môi trường: pH 5.5-6.5

I.4.3 Đặc điểm sinh hóa

A.oryzae có các enzyme thủy phân nội bào và ngoại bào như amylase,

glucoamylase, protease, pectinasa, xylanase, hemycenlulase, Trong đó hệ enzyme

amylase tổng hợp từ A.oryzae có hoạt lực cao hơn so với một số chủng nấm mốc và vi khuẩn khác Ngoài ra A.oryzae có khả năng tổng hợp cả ba loại enzyme protease (acid,

kiềm và trung tính) Các protease acid, trung tính được ứng dụng để sản xuất bia và công nghiệp bánh kẹo Protease kiềm được ứng dụng trong công nghệ thuộc da

Bào tử của A.oryzae có màu vàng hoa cau, không chứa độc tố aflatoxin A.oryzae tiết ra môi trường các enzyme thủy phân như cellulase, pectinase, xylanase

và hemicellulase khi sống trên môi trường có nguồn cơ chất cảm ứng như cellulose,

pectin, xilan và hemicellulose Vì thế, A.oryzae được ứng dụng rộng rãi trong sản

xuất, chế biến thực phẩm và trong công nghiệp sản xuất enzyme

Chương II: Quy trình phân tích chỉ tiêu vi sinh

II.1 Sơ đồ quy trình phân tích

II.2 Thuyết minh quy trình phân tích

II.2.1 Nguồn mẫu

Nguồn mẫu: lấy 50g mẫu đậu phộng giữ lâu trong kho  cho vào túi nylon vô trùng  bỏ vào thùng đá chuyển về phòng thí nghiệm, giữ lạnh ở 4oC Các mẫu cần phân lập ngay không giữ quá 24 giờ

Lý do thu mẫu: mẫu đậu phộng để lâu ngày dễ sản sinh một số loại nấm Bên cạnh đó, nó còn là một nguồn giàu enzyme amylase là nguồn mẫu thích hợp cho việc

phân lập các chủng nấm mốc, đặc biệt là Aspergillus.

II.2.2 Phân lập

a) Chuẩn bị mẫu:

Cân chính xác 10g mẫu đậu phộng cho vào bao PE vô trùng, sau đó cho 90ml nước cất

để pha loãng mẫu Tiến hành đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu (stomacher) Tất cả các thao tác trên phải thực hiện trong điều kiện vô trùng Khi đó, ta sẽ được dung dịch

có nồng độ pha loãng 10-1 Dịch pha loãng sẽ được pha loãng theo dãy thập phân bằng

Cấy chuyển nhiều lần cho đến khi mẫu chỉ còn các dòng khuẩn lạc hoàn

toàn thuần chủng Cấy các khuẩn lạc khác nhau vào các đĩa petri chứa môi trường Czapek

Khuẩn lạc đặc trưng của A.oryzae trên môi trường Czapek: có màu vàng

lục, dạng bột rời, tâm lồi, rìa thấp dần, ngoài là lớp tơ trắng

Ủ ở nhiệt độ 25oC trong 7 ngày

Kiểm tra khả năng sinh độc tố aflatoxin

Tiếp tục pha loãng cho đến nồng độ pha loãng thích hợp

Hút 0.1ml mẫu cấy trang vào môi trường PGA

Ủ ở nhiệt độ 32oC từ 5-7 ngày

Quan sát sự phát triển của nấm mốc cấy chuyển tiếp những khuẩn lạc

khác nhau về hình thái vào các đĩa môi trường PGA

Ủ ở nhiệt độ 27-32oC trong 7 ngày Lấy 10g mẫu cho vào 90ml nước cất vô trùng, sau đó đồng nhất mẫu, ta

được nồng độ pha loãng 10-1

cách dùng micropipette vô trùng, hút 1ml dung dịch 10-1 cho vào 9ml nước cất vô trùng  đồng nhất, ta sẽ có được nồng độ pha loãng 10-2 Tiếp tục thực hiện đến khi đạt được độ pha loãng cần thiết

b) Cấy mẫu:

Dùng micropipette hút 0.1 ml dung dịch mẫu đã pha loãng cho vào môi trường PGA Dùng que cấy tam giác trang đều trên bề mặt cho tới khi khô Ủ ở nhiệt độ phòng (30oC) trong vòng từ 5-7 ngày

c) Phân lập và làm thuần:

Quan sát sự phát triển của nấm mốc (hình dạng khuẩn lạc) Cấy chuyển những khuẩn lạc khác nhau về hình thái vào các đĩa môi trường PGA khác nhau Ủ ở nhiệt độ

27-32oC trong 7 ngày Cấy chuyển tiếp nhiều lần cho đến khi thu được ở mỗi đĩa petri là một dòng khuẩn lạc hoàn toàn thuần chủng

Cấy các dòng khuẩn lạc từ các đĩa petri khác nhau vào các đĩa petri khác có chứa môi trường Czapek, ủ ở 25oC trong 7 ngày Nhiệt độ thích hợp cho sự hình thành và phát

triển A.oryzae là 27-32oC

Khi cấy vào môi trường Czapek thì nhiệt độ do nấm mốc tỏa ra có thể lên tới 40oC Vì thế cần hạ nhiệt độ xuống 25oC để giữ được nhiệt độ thích hợp cho nấm mốc A.oryzae

phát triển

d) Quan sát:

Quan sát các khuẩn lạc thuần từ các đĩa chứa môi trường Czapek Tìm ra khuẩn lạc

đặc trưng của A.oryzae trên môi trường Czapek.

II.2.3 Xác định vi sinh vật

a) Quan sát khuẩn lạc (đại thể):

Kích thước: khuẩn lạc có kích thước khoảng 5-6cm

Hình dạng: khuẩn lạc tâm lồi, dạng bột rời, rìa thấp dần, ngoài là lớp tơ

Màu sắc: khuẩn lạc ban đầu có màu vàng lục, sợi tơ có màu trắng Sau thời gian khuẩn

lạc chuyển thành màu vàng lục nâu, sợi tơ hình thành bào tử có màu nâu

b) Quan sát bào tử (vi thể):

Các bước tiến hành làm tiêu bản:

Cách 1: Làm tiêu bản nấm mốc không nhuộm màu:

 Nhỏ 1 giọt lactophenol lên lame

 Dùng que cấy lấy khuẩn lạc nấm mốc và dàn mỏng

 Đậy lamelle và quan sát ở vật kính X10 và X40

Cách 2: Làm tiêu bàn nấm mốc nhuộm màu:

 Nhò 1 giọt dung dịch xanh cotton lên lame

 Lấy 1 ít sợi nấm dàn đều trên lame

 Đậy lamelle và quan sát ở vật kính X40

Hình dạng sợi nấm quan sát dưới kính hiển vi:

Đầu: Lúc đầu có dạng hình cầu, sau một thời gian sẽ bị tách thành

những chuỗi bào tử rất dài

Cuống Bề mặt cuống có gai mịn

Thể bình Có thể bình một tầng và thể bình hai tầng

Thể bình một tầng: có dạng hình chai.

Thể bình hai tầng: lớp 1: dạng hình trụ; lớp 2: dạng hình chai.

Hình 4: Khuẩn lạc Aspergillus oryzae có màu vàng lục (a) sau 3 ngày

Màu vàng lục nâu (b) sau 7 ngày nuôi cấy trên môi trường Czapek

Bào tử Dạng hình cầu, bề mặt có gai mịn, có kích thước lớn, màu vàng

nâu, sau một thời gian nuôi gai trở nên xù xì, vách dày

c) Thử nghiệm sinh độc tố aflatoxin:

Có thể xác định độc tố aflatoxin bằng 2 phương pháp: phương pháp sắc ký và phương pháp hóa miễn dịch:

Các phương pháp sắc ký dùng trong phân tích aflatoxin gồm: TLC, HPLC,

GC-MS, LC, LC-MS Và hiện nay có rất nhiều kỹ thuật mới được phát triển từ những phương pháp này như LC/APCI-MS/MS, HPLC-FLD, LC/APPI-MS,

Có 3 phương pháp hóa miễn dịch để xác định aflatoxin là thử nghiệm miễn dịch phóng xạ (RIA), thử nghiệm hấp thu miễn dịch liên kết enzyme (ELISA) và thử nghiệm cột ái lực miễn dịch

Phát hiện độc tố bằng phương pháp sắc kí cột (sắc kí cột mini)

Hình 6: Cấu tạo bông lớn với thể bình

hai tầng và bọng có hình cầu

Hình 7: Cấu tạo bông nhỏ với thể bình một tầng

Hình 5: A.oryzae lúc đầu có bông hình cầu (a), sau một thời gian

bị tách thành những chuỗi bào tử rất dài (b).

b) a)

Phương pháp sắc kí cột mini của Romes (1975) về sau được Davis et al., (1980), Holaday và Lansden (1975) cải tiến nhằm phát hiện nhanh aflatoxin trong mẫu

Mục đích: xem vi sinh vật có khả năng sản sinh độc tố aflatoxin hay không

Cách tiến hành: Lấy một ít sinh khối từ môi trường Czapek hòa vào một lượng nhỏ benzen được một hỗn hợp dịch Cho hỗn hợp trên vào cột Pha tĩnh sử dụng cột sắc kí chứa bột nhôm trung tính, florisil ở đáy cột, canxi sunfat ở đầu và đáy cột và silicagel làm chất hấp thụ Sau đó cho hỗn hợp thôi cột (pha động) chloform và aceton (9:1) để giữ aflatoxin và thôi các chất khác ra khỏi cột Quan sát dưới ánh sáng UV (365nm) để xác định màu huỳnh quang xanh, kết luận dương tính với aflatoxin

Đối với Aspergillus oryzae : không sản sinh độc tố aflatoxin nên không phát huỳnh

quang  âm tính (-)

III.2.4 Khảo sát các đặc tính có lợi của Aspergillus oryzae

Chủng nấm mốc Aspergillus oryzae có khả năng thủy phân liên kết β-glucoside,

endo-β-1.4- glucanase được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực:

_ Trong công nghệ sản xuất giấy và bột giấy: các loại enzyme được bổ sung trong

khâu nghiền bột, tẩy trắng và xeo giấy có vai trò rất quan trọng, gỗ được xử lý với các endoglucanase và hỗn hợp các enzyme hemicellulase, pectinase sẽ làm tăng khả năng khuếch tán hóa chất vào phía trong gỗ và hiệu quả khử lignin Trong công nghệ tái chế giấy, endoglucanase và hemicellulase được dùng để tấy trắng mực in trên giấy Kỹ thuật này mở ra triển vọng đầy hứa hẹn trong ngành công nghiệp giấy và bột giấy

(Đặng Thị Thu et al., 2004).

_ Trong công nghiệp chế biến thực phẩm: enzyme glucanase và pectinase sẽ phá

hủy hoàn toàn màng tế bào, làm giảm độ nhớt và tăng độ đồng thể của các loại nước quả có thịt tốt hơn

_ Trong công nghệ sản xuất bia: các chế phẩm enzyme amylase, protease và

glucanase được sử dụng để ngăn chặn sự tạo thành các diacetyl, giúp rút ngắn thời gian để ủ bia

_ Trong sản xuất cà phê ở Việt Nam: sử dụng kết hợp phức hệ enzyme cellulase và

pectinase để xử lý bóc vỏ cà phê và tăng khả năng ly trích dịch quả trong công nghệ sản xuất cà phê

_ Trong công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi: bổ sung enzyme β-glucanase trực

tiếp vào thức ăn sẽ cho phép tăng hấp thu và chuyển hóa thức ăn của động vật

_ Trong công nghiệp sản xuất dung môi hữu cơ: bổ sung enzyme phá hủy thành tế

bào như cellulase, hemicellulase giúp tăng lượng đường tạo ra dẫn tới tăng hiệu suất

thu hồi rượu lên 1.5% (Đặng Thị Thu et al., 2004).

_ Trong công nghệ sử lý nước thải và sản xuất phân bón vi sinh: sản xuất enzyme

cellulase thủy phân cellulose trong rác thải Vì vậy, nước thải của các nhà máy giấy, các cơ sở chế biến gỗ, các xưởng mộc khi bổ sung chế phẩm chứa phức hệ cellulase đem lại hiệu quả cao (Trần Đình Toại và Trần Thị Hồng, 2007)

III.2.5 Định danh Aspergillus oryzae bằng kỹ thuật sinh học phân tử

Để định danh chủng nấm mốc mà ta đã nuôi cấy bằng kỹ thuật sinh học phân tử người ta thường dựa trên đoạn gene 28S rRNA của mẫu nấm, được thực hiện theo các giai đoạn sau:

_ Đầu tiên, lấy DNA của mẫu nấm mốc được tách chiết trên nền đệm TENS đem kết tủa bằng iso-propanol Tủa DNA được pha với đệm TE rồi cho chạy điện di trên gel agarose 0.8% cho thấy DNA tinh sạch và đủ để tiến hành đọc trình tự Vệt nucleic acid được nhuộm bằng ethydium bromide cho vệt màu đỏ da cam khi chiếu UV (260nm) Sau khi điện di một vạch có kích thước khoảng 614 bp xuất hiện (hình 8)

Hình 8: phân tách DNA bằng điện di trên agarose