KHAO SAT QUY TRINH NHAN GIONG IN VITRO c

Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất điều hòa sinh trưởng thực vật đến khả năng tạo chồi bên cây sim.. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất điều hòa sinh trưởng

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG

NGUYỄN THỊ THANH TUYÊN

GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN Th.S PHẠM VĂN LỘC

TP Hồ Chí Minh, tháng 06 năm 2017

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG

Mã số SV: 2008130117

Lớp: 04DHSH2

TP Hồ Chí Minh, tháng 06 năm 2017

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành khóa học và đề tài này, ngoài sự nỗ lực, cố gắng của bản thân, chúng tôi đã nhận được sự quan tâm, giúp đỡ, hướng dẫn tận tình của quý Thầy (Cô), anh chị và các bạn Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, chúng tôi xin chân thành cảm ơn:

Ban Giám hiệu trường Đại học Công nghiệp Thực phẩm Thành phố Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện tốt cho chúng tôi học tập và hoàn thiện đề tài này

Quý Thầy, Cô khoa Công nghệ Sinh học và Kỹ thuật Môi trường trường Đại học Công nghiệp Thực phẩm Thành phố Hồ Chí Minh đã luôn tạo điều kiện thuận lợi, giúp

đỡ chúng tôi trong suốt những năm học vừa qua

Thầy Phạm Văn Lộc – Giáo viên hướng dẫn, người Thầy kính mến đã luôn động viên, tận tình hướng dẫn cũng như truyền đạt những kiến thức quý báu giúp đỡ chúng tôi trong suốt thời gian nghiên cứu và hoàn thiện đề tài này

Thầy Nguyễn Thành Luân và thầy Hồ Viết Thế - Cố vấn học tập, đã dẫn dắt, nhiệt tình hướng dẫn chúng tôi trong suốt những năm học vừa qua

Các anh chị khóa 03DHSH, các bạn khóa 04DHSH cùng các em khoá 14CDSH, 05DHSH đã luôn bên cạnh động viên, chia sẻ, giúp đỡ chúng tôi những lúc khó khăn trong thời gian thực hiện đề tài

Gia đình đã hậu thuẫn, động viên tiếp thêm nghị lực để giúp chúng tôi hoàn thành tốt đề tài

Do sự giới hạn về mặt thời gian và kiến thức, không thể tránh khỏi thiếu sót nên rất mong nhận được những đóng góp ý kiến của quý Thầy (Cô) để đề tài được hoàn thiện hơn

Cuối cùng xin kính chúc quý Thầy (Cô) trường Đại học Công nghiệp Thực phẩm Thành phố Hồ Chí Minh lời chúc sức khỏe và thành công trong công tác đào tạo

TP Hồ Chí Minh, tháng 6 năm 2017 Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thị Thanh Tuyên

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

DANH MỤC BẢNG BIỂU iv

DANH MỤC HÌNH ẢNH v

DANH MỤC ĐỒ THỊ vi

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vii

PHẦN MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về cây sim 3

1.1.1 Vị trí phân loại 3

1.1.2 Đặc điểm hình thái 3

1.1.3 Nguồn gốc và phân bố 3

1.1.4 Thành phần hóa học 4

1.1.5 Tác dụng dược lý 4

1.1.6 Giá trị kinh tế 5

1.1.7 Phương pháp nhân giống truyền thống 6

1.2 Tổng quan về nuôi cấy mô 6

1.2.1 Giới thiệu nuôi cấy mô 6

1.2.2 Quy trình nhân giống 7

1.2.3 Chất điều hòa sinh trưởng thực vật 8

1.3 Tình hình nghiên cứu 11

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP 12

2.1 Vật liệu 12

2.2 Phương pháp nghiên cứu 12

2.2.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất khử trùng Javel lên quá trình khử trùng mẫu hạt sim. 12

2.2.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến sự

sinh trưởng của cây sim. 13

2.2.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất điều hòa sinh trưởng thực vật đến khả năng tạo chồi bên cây sim. 13

2.2.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng tạo rễ cây sim. 15

2.3 Điều kiện thí nghiệm và xử lý số liệu 15

2.4 Địa điểm thực hiện 16

2.5 Thời gian thực hiện 16

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 17

3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất khử trùng Javel lên quá trình khử trùng mẫu hạt sim 17

3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến sự sinh trưởng của cây sim 18

3.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất điều hòa sinh trưởng thực vật đến khả năng tạo chồi bên cây sim 21

3.3.1 Thí nghiệm 3.1: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ TDZ đến khả năng tạo chồi bên cây sim. 21

3.3.2 Thí nghiệm 3.2: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng tạo chồi bên cây sim. 25

3.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng tạo rễ cây sim 28

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ 30

4.1 Kết luận 30

4.2 Kiến nghị 30

TÀI LIỆU THAM KHẢO 31

PHỤ LỤC 35

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1: Nồng độ và thời gian sử dụng một số chất diệt khuẩn xử lý mô cấy thực vật 8 Bảng 2.1: Bố trí nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất khử trùng Javel lên quá trình khử trùng mẫu hạt sim 12 Bảng 2.2: Bố trí nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến

sự sinh trưởng của cây sim 13 Bảng 2.3: Bố trí nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng của nồng độ TDZ đến khả năng tạo chồi bên cây sim 14 Bảng 2.4: Bố trí nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng tạo chồi bên cây sim 14 Bảng 2.5: Bố trí nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng tạo rễ cây sim 15 Bảng 3.1: Kết quả thí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ chất khử trùng Javel lên quá trình khử trùng mẫu hạt sim 17 Bảng 3.2: Kết quả thí nghiệm ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến sự sinh trưởng của cây sim 18 Bảng 3.3: Kết quả thí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ TDZ đến khả năng tạo chồi bên cây sim 22 Bảng 3.4: Kết quả thí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng tạo chồi bên cây sim 25 Bảng 3.5: Kết quả thí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng tạo rễ cây sim 28

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1: Hình ảnh cây sim 3

Hình 1.2: Cấu trúc của một số auxin phổ biến 9

Hình 1.3: Cấu trúc một số loại cytokinin 10

Hình 3.1: Cây sim in vitro trong các môi trường dinh dưỡng sau 5 tuần nuôi cấy 21

Hình 3.2: Chồi cây sim phát sinh trên môi trường WPM có bổ sung TDZ với các nồng độ khác nhau sau 6 tuần nuôi cấy 24

Hình 3.3: Chồi cây sim phát sinh trên môi trường WPM có bổ sung BA với các nồng độ khác nhau sau 6 tuần nuôi cấy 27

Hình 3.4: Rễ cây sim trong môi trường WPM có bổ sung NAA với các nồng độ khác nhau sau 4 tuần nuôi cấy 29

Đồ thị 3.3: Ảnh hưởng của nồng độ TDZ đến khả năng tạo chồi bên cây sim 22

Đồ thị 3.4: Ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng tạo chồi bên cây sim 26

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

PHẦN MỞ ĐẦU

Cây sim (Rhodomyrtus tomentosa (Aiton) Hassk.) là một loại cây ăn quả với

nhiều công dụng hữu ích Theo Đặng Thị Lụa và cộng sự (2015) thì cây sim từ lâu đã được xem là cây thảo dược có nhiều lợi ích Lá sim chứa chất rhodomyrtone có vai trò như một chất kháng sinh giúp chống lại sự xâm nhập của vi khuẩn, thường được dùng

để chữa đau bụng, tiêu chảy, kiết lỵ Ngoài ra, quả sim giàu các hợp chất phenol bao gồm tannin, stilbene, anthocyanin, flavonol có khả năng kháng khuẩn, kháng oxi hóa, kháng viêm và kháng ung thư Nhiều nghiên cứu ngoài nước đã khẳng định, hoạt chất chiết xuất từ lá sim có khả năng tiêu diệt nhiều loại vi khuẩn gây bệnh trong đó đã có những chủng vi khuẩn kháng lại nhiều loại kháng sinh

Mặt khác nhu cầu tiêu thụ các sản phẩm từ sim như: rượu, trà, mật, siro, tăng cao đòi hỏi nguồn nguyên liệu cung cấp cho các nhà máy chế biến cũng gia tăng Do

đó việc trồng sim trên quy mô lớn là điều tất yếu và đòi hỏi cần phải có nguồn cây giống đạt tiêu chuẩn Cây sim thường được nhân giống chủ yếu bằng hạt nhưng phương pháp này thường có hệ số nhân giống thấp, cây con không đều và chất lượng không đồng nhất Chính vì vậy mà ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào trên cây sim cho hệ số nhân giống cao, cây con đạt chất lượng đang là hướng nghiên cứu cần được quan tâm

Nhân giống in vitro là kỹ thuật nhân giống vô tính cây trồng được thực hiện

trong ống nghiệm và điều kiện ổn định Với nhiều đặc tính ưu việt, kỹ thuật này góp phần tích cực trong lĩnh vực sản xuất giống cây trồng chất lượng cao bên cạnh những

kỹ thuật nhân giống truyền giống (Nguyễn Quang Thạch và cộng sự, 2009) Chính vì

vậy đề tài “Khảo sát quy trình nhân giống in vitro cây sim (Rhodomyrtus

tomentosa (Aiton) Hassk.)” nhằm mục đích khảo sát sự ảnh hưởng của các chất điều

hòa sinh trưởng thực vật lên quá trình vi nhân giống cây sim góp phần hoàn thiện quy

trình nhân giống in vitro, đồng thời giải quyết những khó khăn trong việc nhân giống

cây sim

 Mục tiêu của đề tài

Xác định nồng độ chất điều hòa sinh trưởng thực vật phù hợp cho sự phát sinh chồi và rễ giúp hoàn thiện quy trình vi nhân giống cây sim

 Nội dung nghiên cứu

 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất khử trùng Javel lên quá trình khử trùng mẫu hạt sim

 Khảo sát ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến sự sinh trưởng của cây sim

 Khảo sát ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật lên khả năng tạo chồi cây sim

 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ NAA lên quá trình hình thành rễ cây sim

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về cây sim

Loài: Rhodomyrtus tomentosa (Aiton) Hassk

Tên thông thường: sim, hồng sim, dương lê, đào

Hoa mọc riêng lẻ hoặc 3 cái ở một kẽ lá, màu hồng tím Cuống hoa dài 1,5 – 2

cm, có lông Đài hoa có ống dính vào bầu, 3 – 5 răng, có lông mềm; tràng có 5 cánh, lúc đầu lõm lúc sau phẳng, mỏng và dễ rụng; nhị rất nhiều dính ở gốc thành một cột, chỉ nhị đều, bao phấn dính lưng; nhiều noãn

Quả mọng hình trứng ngược mang đài ở đỉnh Quả có màu xanh lúc chín chuyển sang màu đỏ đậm hoặc tím, nhiều lông mịn, có mùi thơm, chứa rất nhiều hạt Hạt hình thang, màu nâu

Mùa hoa: tháng 4 – 6, mùa quả: tháng 7 – 8

1.1.3 Nguồn gốc và phân bố

Sim là một loại cây bụi có nguồn gốc từ Đông Nam Á và thuộc họ Myrtaceae

Phân bố ở các nước: Trung Quốc, Đài Loan, Philippines, Malaysia, Indonesia

Ở Việt Nam, sim là loài cây quen thuộc mọc hoang rất nhiều tại những vùng đồi trọc khắp các tỉnh vùng trung du, núi thấp và một số hải đảo (Phú Quốc, Côn Đảo )

Hình 1.1: Hình ảnh cây sim

(WHO/WPRO, 1990)

Độ cao phân bố đôi khi đến 1000 m Cây đặc biệt ưa sáng và có khả năng chịu hạn tốt, thường mọc rải rác hay tập trung trên các đồi cây bụi, đồng cỏ tạo thành quần thể cây bụi giảm bớt quá trình rửa trôi (Đỗ Huy Bích và cộng sự, 2006)

Loại cây này ưa sáng không đòi hỏi cao về đất đai và ít bị sâu bệnh (Lai và cộng

sự, 2015) ra hoa quả hàng năm, quả chín là thức ăn của các loài chim và gặm nhấm, hạt giống từ đó phát tán khắp nơi Sim là loại cây ăn quả, mọc hoang dại và ít được coi trọng do đó các hoạt động canh tác nông nghiệp, phá rừng làm nương rẫy, nhiều người không quan tâm đến những giá trị lợi ích của cây nên hiện nay diện tích phân bố của cây sim dần dần bị thu hẹp

Một số nghiên cứu gần đây cho thấy rằng trong quả sim có chứa các chất khác như: acid amin, đường, acid hữu cơ và đặc biệt có hàm lượng sắt cao Đồng thời còn chứa 19 hợp chất phenolic đặc trưng bao gồm: ellagitannins, stilbenes, anthocyanins, ethanol, rhodomyrtone, flavonol và acid phenolic (Saising và cộng sự, 2011; Lai và cộng sự, 2015)

1.1.5 Tác dụng dược lý

Tại một vài vùng ở Việt Nam người ta dùng búp và lá sim non sắc uống điều trị đau bụng, tiêu chảy và kiết lỵ (hoặc dùng để rửa vết thương, vết loét) (Đỗ Tất Lợi, 2004)

Theo Đông Y, tất cả các bộ phận của cây sim đều có thể dùng làm thuốc Trong

đó, quả sim vị ngọt chát, tính bình, có tác dụng dưỡng huyết, cầm máu, dùng chữa các chứng huyết hư, thổ huyết, mũi chảy máu, tiểu tiện ra máu, băng huyết Lá sim vị chát, tính bình, có tác dụng giảm đau, thanh nhiệt, giải độc, dùng chữa đau đầu, ngoại thương xuất huyết, ghẻ lở, Rễ sim vị ngọt, hơi chua, tính bình, dùng chữa viêm gan, đau bụng, có tác dụng trừ phong thấp đau nhức (Đỗ Huy Bích và cộng sự, 2006) Ngoài ra, piceatannol là một stilbene có hoạt tính sinh học mạnh có tác dụng chống oxy hóa, chống ung thư, chống viêm và chống béo phì Hơn nữa, piceatannol

của quả sim cao hơn nhiều so với quả nho (200 – 2000 lần) (Lai và cộng sự, 2015) Ngoài ra hợp chất anthocyanins đã được chứng minh là có khả năng chống oxi hóa mạnh (Cui và cộng sự, 2013), đồng thời kìm hãm sự phát triển của tế bào ung thư và

ức chế hình thành khối u, bảo vệ tim mạch đồng thời còn có khả năng cải thiện thị giác một cách đáng kể (Mary Ann Lila, 2004)

Dịch chiết ethanol và rhodomyrtone từ lá đã được đánh giá về hoạt tính kháng

khuẩn có khả năng chống lại trên 47 chủng Streptococcus pyogenes (Limsuwan và

cộng sự, 2012) và một loạt các vi khuẩn gây bệnh Gram dương khác (Saising và cộng

sự, 2011) Từ đó cho thấy dịch chiết từ lá có tiềm năng để phát triển thuốc điều trị các bệnh nhiễm trùng tụ cầu thay thế cho các loại thuốc kháng sinh hiện nay

Không những vậy cây sim còn có giá trị dược liệu đối với vật nuôi như điều trị

bệnh hoại tử gan tụy cấp (AHPND) do vi khuẩn (điển hình là Vibrio spp.) gây ra trên

tôm sú và tôm thẻ chân trắng Việc sử dụng kháng sinh trong nuôi tôm đã gây ảnh hưởng xấu tới sức khỏe động vật nuôi, môi trường sinh thái và đặc biệt là tạo ra các chủng vi khuẩn kháng lại thuốc kháng sinh Trong một nghiên cứu gần đây cho thấy cả dịch chiết lá sim và dịch chiết hạt sim đều có tác dụng tiêu diệt vi khuẩn gây AHPND tốt hơn kháng sinh ampicillin (Đặng Thị Lụa và cộng sự, 2015) Do đó cây sim có tiềm năng là nguồn nguyên liệu để phát triển sản phẩm thảo dược phòng trị AHPND

1.1.6 Giá trị kinh tế

Ngoài việc được sử dụng trong y học dân gian tại nhiều nước, quả sim được sử dụng để làm thức uống lên men nổi tiếng gọi là ''Rượu sim'' tại đảo Phú Quốc (Lai và cộng sự, 2015) Việc trồng sim tại Phú Quốc mang lại nhiều lợi ích về kinh tế, tạo ra nguồn nguyên liệu phục vụ cho nghề chế biến rượu sim tăng thu nhập cho nông dân đồng thời còn cải tạo đất, môi trường sinh thái và cảnh quan

Ngoài ra cây sim còn được dùng làm nguyên liệu để chiết xuất nhiều sản phẩm như: trà, rượu, mật, sirô Người ta còn chiết xuất phần tinh chất từ thân cây sim để chế biến thành các loại mỹ phẩm như nước hoa, xà phòng

Với đặc điểm thân cây thấp và hoa có màu tím đặc trưng nên sim cũng được trồng để làm cảnh trang trí Do nhu cầu tiêu thụ tăng cao nhưng nguồn cung thì ít đã làm cho sim trở thành cây có giá trị kinh tế cao

1.1.7 Phương pháp nhân giống truyền thống

Sim vốn là cây mọc hoang nhiều ở các vùng đồi trung du, đất chua, khô cằn Đôi khi cây còn được trồng để lấy quả ăn và làm cảnh vì có bộ lá xanh tốt quanh năm, hoa đẹp, thân cành dễ tạo dáng Sim được trồng bằng hạt vào mùa xuân hoặc lấy cây con mọc tự nhiên về trồng Cách trồng sim rất đơn giản, nhưng để lấy quả cần bón phân quả mới sai, to, thơm và ngọt Cây ít bị sâu bệnh, sống khỏe, không cần chăm sóc (Đỗ Huy Bích và cộng sự, 2006)

Cây sim có nhiều giá trị về dược liệu và kinh tế nên các sản phẩm từ sim ngày càng được nhiều người tiêu thụ Với nhu cầu lớn như vậy đòi hỏi cần phải có số lượng cây nhiều để cung cấp cho những khu vực trồng quy mô lớn, cửa hàng cây giống hay những nhà thuốc Đông Y Với phương pháp nhân giống truyền thống không thể cung cấp đủ số lượng cây con cho thị trường cộng với việc khai thác quá mức như hiện nay

đã làm cho cây sim đang ngày càng trở nên quý hiếm

1.2 Tổng quan về nuôi cấy mô

1.2.1 Giới thiệu nuôi cấy mô

Nuôi cấy mô (tissue culture) là thuật ngữ dùng để chỉ quá trình nuôi cấy vô trùng

in vitro các bộ phận tách rời khác nhau của thực vật Kỹ thuật nuôi cấy mô dùng cho

cả hai mục đích nhân giống và cải thiện di truyền (Dương Công Kiên, 2002) Nuôi cấy

mô tế bào thực vật (nuôi cấy in vitro) là một lĩnh vực của công nghệ sinh học thực vật

Dựa trên tính toàn năng của tế bào, khả năng phân hóa và phản phân hóa của chúng mà người ta có thể tái sinh cây từ một tế bào hay từ một mẫu mô nào đó (Hoàng Minh Tấn

và cộng sự, 2004)

Các kỹ thuật dùng trong nuôi cấy mô:

 Nuôi cấy mô và cơ quan tách rời: Kỹ thuật nuôi cấy này yêu cầu mẫu phải ở

tình trạng sinh lý tốt và đang phát triển (những phần non của cây, phôi hợp tử trưởng thành lá mầm, phần trên lá mầm, chồi bên của lá thứ nhất hoặc thứ hai)

 Nuôi cấy mô phân sinh: Mô phân sinh thường là các mô đỉnh chồi và cành có

kích thước 0,1 mm – 1,0 cm Chúng có đặc điểm là chứa các tế bào non trẻ, phân chia mạnh, lại không bị virus xâm nhập vì vậy mô phân sinh là mô duy nhất của cây sạch virus (Vũ Văn Vụ và cộng sự, 2012)

 Nuôi cấy mô sẹo (callus): Các mô, đỉnh sinh trưởng hay nhu mô được tách ra và

nuôi cấy trên môi trường giàu auxin thì mô sẹo được hình thành Mô sẹo là khối tế bào

phát triển vô tổ chức, có hình dạng không nhất định với màu vàng, trắng hoặc hơi xanh (Vũ Văn Vụ và cộng sự, 2012) Từ mô sẹo sẽ được biệt hóa thành các mô, cơ quan hoặc tạo cây hoàn chỉnh

 Nuôi cấy phôi: Phôi vô tính có khả năng nảy mầm và phát triển như phôi hữu

tính do đó hiện nay đây được xem là kỹ thuật mang lại nhiều hiệu quả hơn trong nhân giống cây trồng mà nhân giống vô tính theo phương pháp cổ điển còn nhiều hạn chế

 Nuôi cấy bao phấn và hạt phấn: Hạt phấn nuôi cấy có thể phát triển thành cây đơn bội hoàn chỉnh trong điều kiện nuôi cấy in vitro bằng con đường tạo phôi trực tiếp

hoặc gián tiếp thông qua tạo mô sẹo và tạo cơ quan Kỹ thuật này được dùng nhằm tạo dòng thuần để nghiên cứu gen lặn và chọn các dòng đột biến

 Nuôi cấy tế bào đơn: Tế bào đơn được thu nhận bằng cách nghiền mô hoặc xử

lý với enzyme, có thể sử dụng mô sẹo cho kỹ thuật nuôi cấy này Các tế bào đơn được nuôi cấy dịch lỏng, có khuấy hoặc lắc tạo điều kiện thuận lợi cho sự trao đổi khí và tiếp xúc với các chất dinh dưỡng (Vũ Văn Vụ và cộng sự, 2012) Yêu cầu dinh dưỡng

và điều kiện nuôi cấy tế bào đơn khá phức tạp

Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật có một số ứng dụng như sau:

 Nhân giống một số loại cây trong thời gian ngắn và tạo số lượng lớn

 Tạo ra những giống cây sạch virus từ cây bệnh (phục tráng giống), cây con đồng đều về độ tuổi

 Chọn dòng tế bào cho năng suất thứ cấp cao, chủ động hơn trong việc sản xuất các chất trao đổi thứ cấp ở quy mô lớn

 Phối hợp với các kỹ thuật khác (di truyền học, hóa sinh ) phục vụ cho quá trình chuyển gen ở thực vật

 Tạo cây đơn bội hoặc cây đa bội thông qua xử lý colchicin

 Bảo quản nguồn gen thực vật

 Ngoài ra có thể sử dụng nuôi cấy mô tế bào để nghiên cứu di truyền, biến dị, nghiên cứu sinh lý, hóa sinh

1.2.2 Quy trình nhân giống

Quá trình nuôi cấy mô gồm các bước sau đây:

 Tạo vật liệu khởi đầu cho việc nuôi cấy Tùy theo từng loại cây mà chọn các bộ phận nuôi cấy thích hợp Bước tiếp theo là khử trùng mẫu, thường bằng các hóa chất

Tỷ lệ vô trùng thành công phụ thuộc thời gian, nồng độ các chất khử trùng và khả năng xâm nhập của chúng vào các kẽ lách lồi lõm trên bề mặt mẫu, khả năng đẩy hết bọt khí bám trên bề mặt mô nuôi cấy Để tăng tính linh động và khả năng xâm nhập của chất diệt khuẩn, mẫu sẽ được xử lý với cồn 70o sau đó mới xử lý với chất khử trùng

Bảng 1.1: Nồng độ và thời gian sử dụng một số chất diệt khuẩn xử lý mô cấy thực vật

STT Chất khử trùng Nồng độ Thời gian khử

trùng (phút)

Hiệu quả

bị tác nhân vô trùng làm trắng trước khi đưa vào môi trường nuôi cấy

 Bước thứ hai là nhân nhanh Đưa mẫu vào môi trường có hàm lượng cytokinin cao hơn để tái sinh thật nhiều chồi

 Bước thứ ba là tạo cây hoàn chỉnh Tách các chồi riêng ra cho vào môi trường tạo rễ có hàm lượng auxin cao hơn, mỗi chồi khi ra rễ là thành một cây hoàn chỉnh

 Cuối cùng, khi cây trong ống nghiệm đủ tiêu chuẩn ta tiến hành đưa cây ra đất trồng Trước khi đưa ra trồng ngoài đất cây cần phải trải qua giai đoạn thích nghi dần với môi trường ngoài ống nghiệm thì tỷ lệ sống sẽ cao hơn

1.2.3 Chất điều hòa sinh trưởng thực vật

Các chất điều hòa sinh trưởng, phát triển thực vật là các chất hữu cơ có bản chất hóa học khác nhau nhưng đều có tác dụng điều tiết quá trình sinh trưởng, phát triển

của cây từ khi noãn được thụ tinh phát triển thành phôi cho đến khi cây hình thành cơ quan sinh sản, cơ quan dự trữ và kết thúc chu kỳ sống của mình (Hoàng Minh Tấn và cộng sự, 2004) Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật được tạo ra ở một vị trí và có tác dụng ở một vị trí khác và chúng có hiệu ứng khác nhau trên những mô đích khác nhau (Nguyễn Đức Lượng và cộng sự, 2006)

Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật được chia thành hai nhóm:

 Nhóm các chất kích thích: auxin, gibberellin, cytokinin, các chất kiểm soát sự ra hoa

 Nhóm các chất kìm hãm: abscicis acid, ethylene, các hợp chất phenol

Trong đó auxin và cytokinin là hai nhóm chất được sử dụng phổ biến trong nuôi cấy mô

 Auxin

Auxin là phytohormon đầu tiên trong cây được phát hiện và năm 1934, đó chính

là acid β – indol acetic (IAA) Cơ quan chính tổng hợp auxin trong cây là chồi ngọn, ngoài ra các cơ quan còn non đang sinh trưởng cũng có khả năng tổng hợp một lượng nhỏ auxin như lá non, quả non, phôi hạt Chất tiền thân tổng hợp nên IAA là acid amin tryptophan (Hoàng Minh Tấn và cộng sự, 2004) Hiện nay một số auxin tổng hợp được sử dụng rộng rãi như: IBA; α – NAA, 2,4 – D; 2,4,5 – T

Hình 1.2: Cấu trúc của một số auxin phổ biến

(Nguồn: http://www.biologydiscussion.com/) Đối với nuôi cấy mô, auxin được sử dụng cho việc phân chia tế bào và phân hóa

rễ Trong số các auxin IBA và NAA chủ yếu được sử dụng cho môi trường ra rễ hoặc phối hợp với cytokinin sử dụng cho môi trường tạo chồi 2,4 – D và 2,4,5 – T có hiệu quả cho môi trường tạo và phát triển callus

Vai trò sinh lý chủ yếu của auxin là:

 Kích thích mạnh lên sự dãn của tế bào gây nên sự tăng trưởng của cơ quan và toàn cây

 Điều chỉnh tính hướng quang, hướng địa, hướng thủy của cây

 Gây ra hiện tượng ưu thế ngọn

 Kích thích sự hình thành rễ

 Điều chỉnh sự hình thành, sự sinh trưởng của quả và tạo quả không hạt

 Kìm hãm sự rụng lá tăng sự đậu quả phòng ngừa rụng nụ, quả non

 Điều chỉnh sự chín của quả

 Ảnh hưởng lên sự vận động của chất nguyên sinh, tăng tốc độ lưu động của chất nguyên sinh, ảnh hưởng lên các quá trình trao đổi chất và các hoạt động sinh lý như quang hợp, hô hấp, vận chuyển chất trong cây

 Cytokinin

Cytokinin là nhóm phytohormon thứ ba được phát hiện vào năm 1963 là nhóm chất hoạt hóa sự phân chia tế bào, thay đổi ưu thế ngọn và phân hóa chồi có vai trò quan trọng đối với nuôi cấy mô Cơ quan tổng hợp là hệ thống rễ hoặc một số cơ quan non đang sinh trưởng Cytokinin chủ yếu trong cây là zeatin, ngoài ra một số loại tổng hợp thường được sử dụng như: Benzyl adenin (BA), kinetin (Kin), thidiazuron (TDZ)

Hình 1.3: Cấu trúc một số loại cytokinin

(Nguồn: http://labs.bio.unc.edu/)

Vai trò sinh lý chủ yếu của cytokinin là:

 Kích thích sự phân chia tế bào mạnh mẽ

 Ảnh hưởng rõ rệt và đặc trưng lên sự phân hóa cơ quan của thực vật đặc biệt là phân hóa chồi

 Làm yếu hiện tượng ưu thế ngọn, làm phân cành nhiều

 Kìm hãm sự hóa già và kéo dài tuổi thọ của cây

 Tác động lên sự phân hóa giới tính cái, tăng tỷ lệ hoa cái của các cây đơn tính

 Kích thích sự nảy mầm của hạt, có tác dụng phá bỏ trạng thái ngủ như GA nhưng không đặc trưng bằng

 Cytokinin ảnh hưởng tới quá trình trao đổi chất: sinh tổng hợp acid nucleic, protein, chlorophyll do đó ảnh hưởng đến các hoạt động sinh lý của cây

và cộng sự, 2012)

Ngoài ra còn có các nghiên cứu về khả năng ức chế một số loại cầu khuẩn

dương (Saising và cộng sự, 2011), có khả năngchống lại trên 47 chủng Streptococcus (Limsuwan và cộng sự, 2012) và vi khuẩn Bacillus cereus trong thực phẩm

(Voravuthikunchai và cộng sự, 2010) Đồng thời dịch chiết lá sim và hạt sim có tác dụng diệt khuẩn đối với vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp trên tôm (Đặng Thị Lụa

và cộng sự, 2015)

Hầu như chưa có nghiên cứu nào về nhân giống in vitro kể cả trên thế giới và

Việt Nam

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu

Cây sim con (Rhodomyrtus tomentosa (Aiton) Hassk.) in vitro

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất khử trùng Javel lên quá trình khử trùng mẫu hạt sim

Mục đích: Xác định nồng độ Javel thích hợp cho quá trình khử trùng mẫu hạt Vật liệu: Hạt sim

Cách thực hiện: Hạt sim sau khi tách khỏi quả được rửa dưới vòi nước chảy để loại bỏ phần thịt quả và bụi bẩn Tiếp theo mẫu được lắc với xà phòng trong 10 phút, rửa sạch xà phòng bằng nước sạch Mẫu được ngâm và lắc với cồn 70o trong 3 phút 30 giây Sau đó ngâm mẫu trong các nồng độ dung dịch Javel trong 15 phút Rửa mẫu lại

3 lần với nước cất vô trùng và cấy vào môi trường dinh dưỡng, thao tác này được thực hiện trong tủ cấy vô trùng Mẫu được che sáng trong vòng 1 tuần sau đó được đưa ra nuôi cấy trong điều kiện ánh sáng của phòng thí nghiệm

Bảng 2.1: Bố trí nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất khử trùng Javel

lên quá trình khử trùng mẫu hạt sim

2.2.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến sự sinh trưởng của cây sim

Mục đích: Xác định môi trường dinh dưỡng phù hợp cho sự sinh trưởng của cây sim

Vật liệu: Cây con in vitro

Cách thực hiện: Cây con in vitro được cấy vào các môi trường dinh dưỡng có

chứa 30 g/l đường saccharose, 8 g/l agar, 1 g/l than hoạt tính được bố trí theo bảng 2.2

Bảng 2.2: Bố trí nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến sự

sinh trưởng của cây sim

STT Nghiệm thức Môi trường

Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ cây sống (%), đặc điểm hình thái cây sau 5 tuần nuôi cấy

2.2.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất điều hòa sinh trưởng thực vật đến khả năng tạo chồi bên cây sim

2.2.3.1 Thí nghiệm 3.1: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ TDZ đến khả năng tạo chồi bên cây sim

Mục đích: Xác định nồng độ TDZ thích hợp tạo chồi bên cây sim

Vật liệu: Cây con in vitro

Cách thực hiện: Cấy cây con in vitro vào môi trường WPM có chứa 30 g/l

đường, 8 g/l agar, 1 g/l than hoạt tính với nồng độ TDZ được bố trí theo bảng 2.3

Bảng 2.3: Bố trí nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng của nồng độ TDZ đến khả năng tạo

chồi bên cây sim

Mục đích: Xác định nồng độ BA thích hợp để tạo chồi bên cây sim

Vật liệu: Cây con in vitro

Cách thực hiện: Cấy cây con in vitro vào môi trường WPM có chứa 30 g/l

đường, 8 g/l agar, 1 g/l than hoạt tính với nồng độ BA được bố trí theo bảng 2.4

Bảng 2.4: Bố trí nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng tạo

chồi bên cây sim