Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm gây bệnh của vi sinh vật nội sinh từ cây neem (azadirachta indica a juss) nghiên cứu khoa học

Kết quả định tính khả năng kháng khuẩn gây bệnh với nấm nội sinh phân lập từ cây neem Azadirachta indica A.. Kết quả xác định khả năng kháng khuẩn gây bệnh của các chủng vi nấm nội sinh

NỘI SINH TỪ CÂY NEEM

(Azadirachta indica A.Juss)

Mã số đề tài

Thuộc nhóm ngành khoa học: Công nghệ sinh học y dƣợc

Tp Hồ Chí Minh, tháng 03 năm 2015

NỘI SINH TỪ CÂY NEEM

(Azadirachta indica A.Juss)

Mã số đề tài

Thuộc nhóm ngành khoa học: Công nghệ sinh học y dược

Sinh viên thực hiện: NGUYỄN TRUNG HIẾU Nam

Dân tộc: Kinh

Lớp, khoa: DH11SH02 – Công nghệ sinh học Năm thứ: 4 /Số năm đào tạo: 4

Ngành học: Vi sinh – Sinh học phân tử

Người hướng dẫn: ThS DƯƠNG NHẬT LINH

Tp Hồ Chí Minh, tháng 03 năm 2015

Lời cảm ơn

Để hoàn thành đề tài này, chúng em xin gửi lời cảm ơn đến các thầy, cô khoa Công Nghệ Sinh Học, trường Đại học Mở thành phố Hồ Chí Minh đã giảng dạy và truyền đạt kiến thức cơ bản để giúp chúng em làm cơ sở cho đề tài nghiên cứu này

Chúng em xin chân thành cảm ơn cô Dương Nhật Linh và thầy Nguyễn Văn

Minh đã tận tình hướng dẫn, động viên, truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm

quý báu, tạo mọi điều kiện thuận lợi để chúng em hoàn thành tốt đề tài này

Chúng em xin cảm ơn chị Nguyễn Thị Mỹ Linh đã luôn quan tâm, giúp đỡ

chúng em thực hiện tốt đề tài Bên cạnh đó,chúng tôi xin cảm ơn các bạn và các em trong phòng thí nghiệm Vi sinh luôn ủng hộ, giúp đỡ chúng tôi trong quá trình thực hiện suốt đề tài

Đề tài nghiên cứu kết thúc với những kỷ niệm đẹp và chúng tôi đã học hỏi thêm được nhiều kinh nghiệm cũng như áp dụng những kiến thức đã học trong nghiên cứu

Chúng em xin gửi lời chúc sức khỏe đến tất cả người thầy, người cô đáng kính khoa Công nghệ sinh học, Trường Đại Học Mở TP Hồ Chí Minh, xin chúc thầy cô ngày càng gặt hái được nhiều thành công Chúng tôi xin chúc các bạn của chúng tôi sẽ hoàn thành tốt công việc học tập của mình tại trường và thành công trong cuộc sống Xin chân thành cảm ơn

Sinh viên thực hiện Nguyễn Trung Hiếu Tháng 03/2015

MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG I DANH MỤC BIỂU ĐỒ II DANH MỤC HÌNH ẢNH II

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 4

1.1.GIỚITHIỆUCHUNGVỀCÂYNEEM(A ZADIRACHTA INDICA A.JUSS) 5

1.1.1 Đặc điểm thực vật học 5

1.1.2 Nguồn gốc và phân bố 5

1.1.3 Đặc điểm hình thái 6

1.1.4 Công dụng 7

1.1.5 Dược tính 8

1.2.SƠLƯỢCVỀVISINHVẬTNỘISINH 9

1.3.TỔNGQUANVỀMỘTSỐVIKHUẨNGÂYBỆNHCHONGƯỜI 11

1.3.1 Staphylococcus aureus 11

1.3.2 Escherichia coli 12

1.3.3 Salmonella typhi 13

1.3.4 Pseudomonas aeruginosa 14

1.3.5 Klebsiella spp 15

1.3.6 Acinetobacter spp 16

1.4.TỔNGQUANVỀMỘTSỐNẤMGÂYBỆNHTRÊNNGƯỜI 16

1.4.1 Trichophyton spp 17

1.4.2 Microsporum spp 18

1.4.3 Bệnh do dermatophytes gây ra 19

1.5.TÌNHHÌNHNGHIÊNCỨU 22

1.5.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước 22

1.5.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 23

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 24

2.1.VẬTLIỆU 25

2.1.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 25

2.1.2 Đối tượng nghiên cứu 25

2.1.3 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất và môi trường 25

2.2.PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU 26

2.2.1 Bố trí thí nghiệm 26

2.2.2 Tái phân lập 27

2.2.3 Định tính khả năng kháng khuẩn, kháng nấm của vi khuẩn nội sinh từ cây neem (Azadirachta indica A Juss) 28

2.2.4 Định lượng khả năng kháng khuẩn, kháng nấm của dịch lọc vi khuẩn nội sinh từ cây neem (Azadirachta indica A Juss) 30

2.2.5 Khảo sát khả năng kháng khuẩn của vi nấm nội sinh từ cây neem (Azadirachta indica A Juss) 33

2.2.6 Khảo sát khả năng kháng nấm của vi nấm nội sinh từ cây neem (Azadirachta indica A Juss) 34

2.2.7 Định danh các chủng vi nấm và vi khuẩn có hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm cao theo phương pháp truyền thống 36

2.2.8 hương pháp thống k số liệu 38

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 40

3.1.KẾTQUẢTÁIPHÂNLẬP 41

3.1.1 Vi khuẩn nội sinh từ cây neem (Azadirachta indica A Juss) 41

3.1.2 Vi nấm nội sinh từ cây neem (Azadirachta indica A Juss) 41

3.2.KẾTQUẢ KHẢOSÁTKHẢNĂNG KHÁNGKHUẨN CỦAVIKHUẨNNỘI SINHTỪCÂYNEEM(A ZADIRACHTA INDICA A.JUSS) 42

3.2.1 Kết quả định tính khả năng kháng khuẩn của vi sinh vật nội sinh từ cây neem (Azadirachta indica A Juss) 42

3.2.2 Kết quả định lượng khả năng kháng khuẩn của dịch lọc vi khuẩn nội sinh từ cây neem (Azadirachta indica A Juss) 44

3.3 KẾT QUẢ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG NẤM CỦA VI KHUẨN NỘI

SINHTỪCÂYNEEM(A ZADIRACHTA INDICA A.JUSS) 48

3.3.1 Kết quả định tính khả năng kháng nấm của vi khuẩn nội sinh từ cây neem (Azadirachta indica A Juss) 48

3.3.2 Kết quả định lượng khả năng kháng nấm của vi khuẩn nội sinh từ cây neem (Azadirachta indica A Juss) 49

3.4 KẾT QUẢ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA VI NẤM NỘI SINHPHÂNLẬPTỪCÂYNEEM(A ZADIRACHTA INDICA A.JUSS) 51

3.5.KẾTQUẢKHẢO SÁTKHẢNĂNG KHÁNGNẤMCỦAVINẤMNỘISINH PHÂNLẬPTỪCÂYNEEM(A ZADIRACHTA INDICA A.JUSS) 53

3.6 ĐỊNH DANH CHỦNG VI SINH VẬT CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN, KHÁNG NẤMCAO NHẤTPHÂNLẬP TỪCÂY NEEM(A ZADIRACHTA INDICA A JUSS) 58

3.6.1 Định danh chủng vi khuẩn có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm cao nhất được phân lập từ cây neem (Azadirachta indica A Juss) 58

3.6.2 Định danh chủng vi nấm có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm cao nhất được phân lập từ cây neem (Azadirachta indica A Juss) 60

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 64

4.1.KẾTLUẬN 65

4.2.ĐỀNGHỊ 66

TÀI LIỆU THAM KHẢO 67

PHỤ LỤC 72

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Một số công dụng dƣợc liệu trong các bộ phận của cây neem 8

Bảng 2.1 Biểu hiện các mức phát triển của khóm nấm 38

Bảng 3.1 Đặc điểm đại thể và vi thể của vi khuẩn nội sinh từ cây neem 41

Bảng 3.2 Đặc điểm đại thể và vi thể của vi nấm nội sinh từ cây neem 42

Bảng 3.3 Kết quả định tính khả năng kháng khuẩn của vi sinh vật nội sinh từ cây neem (Azadirachta indica A Juss) 43

Bảng 3.4 Kết quả định lƣợng khả năng kháng khuẩn của vi khuẩn nội sinh từ cây neem (Azadirachta indica A Juss) (mm) 44

Bảng 3.5 Kết quả định tính khả năng kháng nấm của vi khuẩn nội sinh 49

Bảng 3.6 Kết quả định lƣợng khả năng kháng nấm của vi khuẩn nội sinh 49

Bảng 3.7 Kết quả định tính khả năng kháng khuẩn gây bệnh với nấm nội sinh phân lập từ cây neem (Azadirachta indica A Juss) 51

Bảng 3.8 Kết quả xác định khả năng kháng khuẩn gây bệnh của các chủng vi nấm nội sinh phân lập từ cây neem (Azadirachta indica A Juss) (mm) 52

Bảng 3.9 Kết quả định tính khả năng kháng khuẩn gây bệnh với nấm nội sinh phân lập từ cây neem (Azadirachta indica A Juss) 53

Bảng 3.10 Kết quả phần trăm ức chế khả năng kháng T rubrum với nấm nội sinh thử nghiệm từ cây neem (Azadirachta indica A Juss) 54

Bảng 3.12 Kết quả phần trăm ức chế khả năng kháng nấm T mentagrophytes với nấm nội sinh thử nghiệm phân lập từ cây neem (Azadirachta indica A Juss) 55

Bảng 3.13 Kết quả phần trăm ức chế khả năng kháng nấm M gypseurm với nấm nội sinh thử nghiệm phân lập từ cây neem (Azadirachta indica A Juss) 56

Bảng 3.14 Kết quả định danh sinh hóa chủng KT1, KT2 và KT3 60

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3.1 So sánh khả năng kháng khuẩn của dịch lọc vi khuẩn nội sinh 45

Biểu đồ 3.2 So sánh khả năng kháng T rubrum của vi khuẩn nội sinh từ cây neem 50

DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Cấu trúc vi thể của nấm da 17

Hình 1.2 Cấu trúc hình thể của nấm da dưới kính hiển vi 17

Hình 2.1 Kết quả vòng kháng khuẩn, kháng nấm gây bệnh 30

Hình 2.2 Kết quả vòng kháng khuẩn, kháng nấm gây bệnh 32

Hình 2.3 Kết quả vòng kháng khuẩn gây bệnh 34

Hình 2.4 Bố trí thí nghiệm 35

Hình 3.1 Kết quả quan sát đại thể và vi thể của vi khuẩn KT2 nội sinh 41

Hình 3.2 Ảnh đại thể vi nấm NT2 nội sinh từ cây neem 42

Hình 3.3 Kết quả định lượng 48

Hình 3.4 Kết quả kháng nấm T.rubrum của các chủng vi khuẩn nội sinh 51

Hình 3.5 Kết quả khảo sát khả năng vi nấm nội sinh kháng P aeruginosa 53

Hình 3.6 Nấm T.rubrum đối chứng 55

Hình 3.7 Chủng NT1 kháng nấm T rubrum 55

Hình 3.8 Nấm T.mentagrophytes đối chứng 56

Hình 3.9 Chủng NL1 kháng T.mentagrophytes 56

Hình 3.10 Nấm M gypseurm đối chứng 57

Hình 3.11 Chủng NT2 kháng M gypseurm 58

Hình 3.12 Kết quả nhuộm Gram và hình thái khuẩn lạc trên môi trường NA của chủng

KT1 59

Hình 3.13 Kết quả nhuộm Gram và hình thái khuẩn lạc trên môi trường NA của chủng KT2 59

Hình 3.14 Kết quả nhuộm Gram và hình thái khuẩn lạc trên môi trường NA của chủng KT3 60

Hình 3.15 Quan sát hình thái nấm NT2 trên môi trường PDA 61

Hình 3.16 Bào tử chủng NT2 dưới kính hiển vi 61

Hình 3.17 Quan sát hình thái nấm NL1 trên môi trường PDA 62

Hình 3 18 Bào tử chủng NL1 dưới kính hiển vi 62

DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1 Bố trí thí nghiệm 27

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

CFU Colony Forming Unit – Đơn vị hình thành khuẩn lạc

E Coli Escherichia coli

M canis Microsporum canis

M gypseum Microsporum gypseum

P aeruginosa Pseudomonas aeruginosa

S aureus Staphylococcus aureus

S typhi Samonella typhi

T mentagrophytes Trichophyton mentagrophytes

T rubrum Trichophyton rubrum

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM

THÔNG TIN VỀ SINH VIÊN CHỊU TRÁCH NHIỆM CHÍNH THỰC HIỆN ĐỀ TÀI

I SƠ LƯỢC VỀ SINH VIÊN

Họ và tên: NGUYỄN TRUNG HIẾU

Sinh ngày: 23 tháng 03 năm 1993

Nơi sinh: Tp Hồ Chí Minh

Lớp: DH11SH02 Khóa: 2011 - 2015

Khoa: Công Nghệ Sinh Học

Địa chỉ liên hệ: 90 Bình Thuận – Bình Khánh – Cần Giờ - TPHCM

Điện thoại: 01692041434 Email: hieunguyencnsh@gmail.com

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM

THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI

1 Thông tin chung

 Tên đề tài: “KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN, KHÁNGNẤM CỦA

VI SINH VẬT NỘI SINH TỪ CÂY NEEM

(Azadirachta indica A.Juss)”

THỨ

SỐ NĂM ĐÀO TẠO

1 NGUYỄN TRUNG HIẾU DH11SH02 CNSH 4 4

Khảo sát khả năng kháng khuẩn, kháng nấm của một số chủng vi sinh vật nội

sinh từ cây neem (Azadirachta indica A Juss)

3 Tính mới và sáng tạo

Hiện nay ở Việt Nam đã có nhiều nghiên cứu công bố về vi sinh vật nội sinh trên một số cây dược liệu nhưng chưa có công trình nghiên cứu nào về vi sinh vật từ cây neem mà đa số tập trung vào cao chiết của loài cây neem Trong khi trên thế giới, các đã có một số nghiên cứu về vi sinh vật nội sinh từ cây neem như Chandrashekhara

và cs.(2007), Verma và cs (2009) nhƣng chƣa chuyên sâu Vì vậy, chúng tôi tiến hành thực hiện khảo sát hoạt tính khả năng kháng khuẩn, kháng nấm gây bệnh của vi sinh

vật nội sinh từ cây neem (Azadirachta indica A Juss) Đó chính là tính mới trong đề

tài

4 Kết quả nghiên cứu

Sau thời gian thực hiện đề tài chúng tôi đã hoàn thành mục tiêu khảo sát hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của các chủng vi sinh vật nội sinh từ cây neem khi tiến hành

thử nghiệm khả năng kháng 11 chủng vi khuẩn S aureus, E coli, S typhi, P

aeruginosa, E Coli 4a (A), E Coli 70a (A, E), Klebsiella spp 153b (A, E), Klebsiella

spp 81b (A), Klebsiella spp 26b (E), Acinetobacter 2d (C), P aeruginosa 86c (C) và 4 chủng vi nấm T rubrum, T mentagrophytes, M gypseum, M canis và kết quả thu

đƣợc nhƣ sau:

 Kháng khuẩn của vi khuẩn nội sinh từ cây neem:

 KT1 có khả năng kháng E Coli, E Coli 4a (A), E.Coli 70a (A, E), Klebsiella spp 153b (A, E), Klebsiella spp 81b (A), Klebsiella spp 26b (E), Acinetobacter spp 2d (C) mạnh nhất lần lƣợt là 27 ± 2,08 mm, 22,33 ± 0,88 mm, 29 ± 0,58

mm, 30,67 ± 0,33 mm, 31,67 ± 0,88 mm, 28 ± 0,58 mm và 23,67 ± 0,33 mm

 KT2 có khả năng kháng P aeruginosa, Salmonella typhi, P aeruginosa 86c (C)

mạnh nhất lần lƣợt là 17 ± 0,58 mm, 13.33 ± 0,33 mm và 22,67 ± 1,67 mm

 KT3 có khả năng kháng Staphylococcus aureus mạnh nhất là 22,33 ± 0,58 mm

 Kháng nấm của vi khuẩn nội sinh từ cây neem

 Chủng NT1 có khả năng kháng T rubrum cao nhất là 10,34 ± 0,98%

 Chủng NT2 có khả năng kháng M gypseurm cao nhất là 48,76 ± 0,63%

 Chủng NL1 có khả năng kháng T mentagrophytes, M gypseurm cao nhất đều là

100 ± 0,00%

Kết quả định danh sơ bộ cho thấy, nghi ngờ cả 3 chủng KT1, KT2 và KT3 đều

thuộc chi Bacillus

Quan sát hình thái đặc điểm vi nấm nội sinh trên môi trường PDA và quan sát vi

thể dưới kính hiển vi, nghi ngờ chủng NT2 và NL1 tương đồng với chi Aspergillus

5 Đóng góp về mặt kinh tế - xã hội, giáo dục và đào tạo, an ninh, quốc phòng và khả năng áp dụng của đề tài

Thành công của đề tài là tiền đề cho việc đánh giá khả năng kháng khuẩn và

kháng nấm của chủng vi sinh vật nội sinh phân lập từ cây neem (Azadirachta indica A

Juss) Bên cạnh đó, từ kết quả nghiên cứu về khả năng kháng các chủng vi khuẩn kháng thuốc của những vi khuẩn nội sinh từ cây neem giúp mở ra một hướng nghiên cứu mới về vi khuẩn nội sinh từ cây dược liệu có khả năng kháng lại một số chủng vi

khuẩn kháng thuốc Qua đó thu nhận, xác định bản chất của các hợp chất có hoạt tính

kháng khuẩn và kháng nấm cao Tiến hành khảo sát các yếu tố có ảnh hưởng đến hoạt

tính của các hợp chất, sau đó thử nghiệm trên mô hình thử nghiệm ex vivo, in vivo

6 Công bố khoa học của sinh viên từ kết quả nghiên cứu của đề tài (ghi rõ

tên tạp chí nếu có) hoặc nhận xét, đánh giá của cơ sở đã áp dụng các kết quả nghiên cứu (nếu có)

Nhận xét của người hướng dẫn về những đóng góp khoa học của sinh viên

thực hiện đề tài (phần này do người hướng dẫn ghi):

Ngày 19 tháng 03 năm 2015

Xác nhận của đơn vị Người hướng dẫn

ThS DƯƠNG NHẬT LINH

ĐẶT VẤN ĐỀ

Việt Nam là một nước nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới ẩm gió mùa nên hầu hết mọi người luôn làm việc trong môi trường có độ ẩm cao, kéo dài Đây chính là điều kiện thuận lợi để các loài vi khuẩn, vi nấm phát triển mạnh Các bệnh về da và niêm mạc do nấm, nhiễm trùng do vi khuẩn gây ra ngày càng phổ biến và nghiêm trọng (Nguyễn Thị Sinh, 1983; Al-Alawi và cs., 2005)

Các loại nấm mốc đã được định danh có khả năng gây một số bệnh ngoài da ở người như nấm chân hay hắc lào cho đến những bệnh nguy hiểm có thể gây chết người

như viêm màng não (Cryptococcus neoformans) (Gendelman H.E và cs., 2005) Bào

tử nấm có thể gây ra những chứng như hen suyễn, viêm mũi dị ứng, các bệnh nấm dị ứng phế quản phổi và viêm phổi quá mẫn (Briner W và cs., 2006; Lockey R.F và cs.,

2004) Ngoài ra còn có các bệnh do vi khuẩn như vi khuẩn P aeruginosa (hay còn gọi

là trực khuẩn mủ xanh) là một vi khuẩn phổ biến gây bệnh ở động vật và con người, gây ra viêm nhiễm và nhiễm trùng huyết Nếu vi khuẩn xâm nhập vào các cơ quan thiết yếu của cơ thể như phổi, đường tiết niệu và thận sẽ gây ra những hậu quả chết người (Balcht và cs., 1994)

Một trong những hướng nghiên cứu tác nhân kháng nấm, kháng khuẩn mới là tìm các hợp chất có nguồn gốc từ thực vật Hiện nay cùng với sự phát triển của y học, các bài thuốc từ thực vật được sử dụng để chữa bệnh ngày càng nhiều Các loài thực vật này có trong tự nhiên, dễ kiếm lại ít có những tác dụng phụ cho con người, do đó

đã thu hút sự quan tâm của các nhà nghiên cứu hóa sinh và y dược học trong nước cũng như trên thế giới (Võ Thị Mai Hương, 2009) Bên cạnh đó, một số nghiên cứu trước đây đã cho thấy rằng, vi khuẩn nội sinh thực vật có khả năng sinh ra các chất có khả năng ứng dụng để sản xuất kháng sinh, đó là nguồn chất kháng khuẩn, kháng nấm có

tiềm năng quan trọng dùng cho việc phòng trị các loại vi nấm và vi khuẩn gây bệnh (Ryan và cs., 2008)

Trong rất nhiều hợp chất có nguồn gốc từ thực vật thì các hợp chất chiết xuất từ

cây neem (Azadirachta indica A.Juss), một loại thảo dược từ cổ xưa có nguồn gốc ở

Ấn Độ đã và đang được quan tâm bởi những công dụng to lớn của nó đối với sức khỏe

và đời sống con người Tại Việt Nam, cây neem mọc hoang và trồng nhiều ở các tỉnh miền Nam Trung Bộ như Bình Thuận, Ninh Thuận

Cây neem có các hợp chất chống viêm, chống ung thư, chống khối u, kháng virus, kháng khuẩn, kháng nấm và kháng kí sinh trùng, giúp ngăn chặn sự hình thành các tế bào bất thường, loại trừ bệnh nhiễm trùng và đẩy nhanh sự chữa lành trong rất nhiều vấn đề sức khỏe như nimbin, nimbinon, margocin, azadirachtin, (Võ Quang Yến, 1996; Conrick, 2001) Năm 2012, Hashmat và cộng sự đã khảo sát cao chiết cây

neem bằng methanol có khả năng ức chế Bacillus subtilis với đường kính kháng 28

mm Năm 2007, Chandrashekhara và cs đã phân lập được 7 chủng vi khuẩn nội sinh được phân lập từ cây neem tại Ấn Độ cho thấy 2 chủng Gram (+) và 5 chủng Gram () Năm 2008, Rajasekaran đã nghiên cứu cao chiết lá neem bằng dung môi nước, ethanol

và dichloromethane đều cho thấy hoạt tính kháng 10 chủng vi khuẩn gây bệnh Năm

2009, Verma và cs đã phân lập được 55 chủng xạ khuẩn nội sinh từ cây neem có khả năng ức chế được 54,4 % hoạt động của vi khuẩn và nấm bệnh

Với những công dụng to lớn như trên nhưng tại Việt Nam cây neem vẫn chưa được nghiên cứu sâu và rộng rãi Để tận dụng và phát triển nguồn nguyên liệu sẵn có trong nước, nhằm đem đến nhiều lựa chọn hơn cho vấn đề sức khỏe của con người và động

vật chúng tôi tiến hành đề tài: “Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của

các chủng vi sinh vật nội sinh phân lập từ cây neem (Azadirachta indica A Juss)”

 Mục tiêu

Khảo sát khả năng kháng khuẩn, kháng nấm của một số chủng vi sinh vật nội sinh

từ cây neem (Azadirachta indica A Juss)

 Nội dung thực hiện bao gồm

 Tái phân lập các chủng vi sinh vật nội sinh từ cây neem (Azadirachta indica A

Juss)

 Định tính khả năng kháng khuẩn, kháng nấm của một số chủng vi sinh vật nội

sinh từ cây neem (Azadirachta indica A Juss)

 Định lượng khả năng kháng khuẩn, kháng nấm của một số chủng vi sinh vật nội

sinh từ cây neem (Azadirachta indica A Juss)

 Định danh các chủng vi sinh vật nội sinh từ cây neem có hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm cao nhất bằng phương pháp truyền thống

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY NEEM (Azadirachta indica A

Năm 1830, cây neem được nhà khoa học Andriew Henri Laurent de Jussieu mô tả

và định danh là Azadirachta indica, thuộc hệ thống phân loại như sau (Biswas và cs.,

Loài : Azadirachta indica A Juss (Biswas và cs., 2002)

Có ba cây tương tự với cây Azadirachta indica A Juss đó là: Melia azadirachta L.,

Melia indica và Antelaca azadirachta Người ta thường hay lẫn lộn giữa cây neem và

cây Melia azadirachta L nhiều nhất bởi hình dáng bên ngoài của chúng hơi giống

nhau Nhưng thực ra chúng dễ dàng được phân biệt dựa vào đặc điểm của lá:

Azadirachta indica A Juss có lá kép lông chim một lần, trong khi đó Melia azadirachta L có lá kép lông chim hai lần (Biswas và cs., 2002)

1.1.2 Nguồn gốc và phân bố

Neem là loại cây đặc trưng tại vùng biển lục địa Indo – Pakistan Ngày nay nó được tìm thấy ở Nam Á như Ấn Độ, Bangladesh, thượng Burma và tại các vùng hoang mạc

ở Sri Lanka, Thái Lan, Nam Malaysia Ngoài ra nó còn được tìm thấy ở Phillipines, đảo Fiji, đảo Mauritius và trải rộng tới các đảo khác ở nam Thái Bình Dương Ở Trung Đông nó được tìm thấy ở YeMen và Saudi Arabia Tại Châu Phi cây neem tồn tại ở Ghana, Nigieria, Sudan và các nước Đông Phi Ở Châu Mỹ nó được tìm thấy ở các đảo vùng Caribe và vùng Trung Mỹ (Schmutterer, 1990)

Cây neem được di thực vào Việt Nam năm 1981 do giáo sư Lâm Công Định, nhà lâm học Việt Nam, nhân dịp tham dự hội thảo lâm nghiệp quốc tế về “Vai trò của rừng trong sự phát triển cộng đồng nông thôn” tại Senegal Châu Phi Ông đã đem hạt giống cây neem về trồng tại Phan Thiết, sau đó trồng rộng ra ở Ninh Thuận, Bình Thuận Ông

là người đặt tên cho loài cây này là xoan chịu hạn để phân biệt với xoan địa phương

(Melia azadirachta) được trồng phổ biến tại Việt Nam (Lâm Công Định, 1991)

Cây neem thích hợp ở những vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Đặc biệt cây sinh trưởng tốt ở những vùng đất xấu, khô nóng, độ cao khoảng 1000 m, tính từ mực nước biển, vùng gần xích đạo Rễ cái mọc sâu, có thể dài gấp hai lần chiều cao của cây (Lâm Công Định, 1991)

Trái hình bầu dục, màu oliu, vỏ mỏng, thịt đắng màu vàng nhạt, dày khoảng 0,3 – 0,5 cm, dài khoảng 2 cm

Rễ gồm rễ cọc ngắn và nhiều rễ bên mọc khá dài Cây bắt đầu ra hoa, quả sau 3 – 5 năm trồng Tuổi thọ trung bình của một cây neem khoảng 200 năm (Hashmat và cs., 2012)

1.1.4 Công dụng

Neem được người Ấn Độ sử dụng đầu tiên để hỗ trợ sức khỏe từ 4500 năm trước đây Neem là một thảo dược có thể giúp tăng cường sức khỏe một cách tổng thể, sử dụng neem không có bất cứ tác dụng phụ nào (Conrick, 2001)

Cây neem có vị đắng, nồng, có tính mát, có thể chữa trị được giun, chống nôn ói, ung nhọt ở trẻ em Cây neem cũng có tác dụng chữa trị sung viêm, sốt, rụng tóc,

Lá dùng chế cồn thuốc được dùng như cồn long não, xoa lên chỗ bong gân, làm tan viêm Lá còn dùng chế dầu thuốc (thêm với dầu dừa) dùng xoa chóng đau khớp hay dùng để băng trị vết chàm Lá còn được dùng để trị táo bón, ung nhọt, giun,

Dịch nước của lá có tính kháng virus, có tính lợi niệu nhẹ, làm giảm nhịp tim, có tính chống khối u Đối với nhiều loại côn trùng, dịch trích từ lá cây này có tính xua đuổi hay ức chế sự tăng trưởng của côn trùng

Bột lá neem được sử dụng để chữa trị nhiều bệnh khác nhau của con người như hỗ trợ miễn dịch, chống oxy hóa, hỗ trợ chức năng gan, tăng tiết mật khơi thông dòng chảy của mật, giúp tiêu hóa tốt, lọc máu, thải độc cơ thể giúp duy trì ổn định và giảm mức độ đường trong máu Neem còn giúp cơ thể có làn da sáng, đẹp và khỏe mạnh Nhánh non có tác dụng trị giun, hen suyễn và đầy bụng

Hoa có tính kích thích, bổ và dễ tiêu hóa Ngoài ra còn có thể dùng để trị đờm ở cổ, tẩy giun

Trái có thể làm lành vết thương, chữa lao phổi, bệnh vàng da, sốt rét,

Vỏ thân cây còn trị đƣợc bệnh lậu và bệnh đái tháo, trị viêm họng, suy nhƣợc, chứng vàng da, giun đũa, làm giảm sốt Ngoài ra, vỏ có thể đƣợc dùng làm thuốc ngừa thai (Thanh Huế, 2000; Võ Quang Yến, 1996)

Một số công dụng chữa bệnh của các bộ phận khác nhau của neem đƣợc đề cập trong bảng 1.1 (Biwas và cs., 2002)

Bảng 1.1 Một số công dụng dƣợc liệu trong các bộ phận của cây neem

Lá Trị phong, vấn đề về mắt, chảy máu cam, diệt sâu bọ,

chán ăn, loét da

Vỏ cây Giảm đau, chữa sốt

Hoa Ức chế sự tiết mật, loại bỏ đờm, diệt sâu bọ

Tinh dầu Chữa phong và giun trong ruột

Năm 2002, Biwas và cs đã có nghiên cứu về hoạt tính sinh học của cây neem cho thấy dịch chiết bằng chloroform của vỏ thân cây có tác dụng chống carrageenin gây ra phù nề chân ở chuột và viêm tai chuột, chiết xuất từ methanol của lá có tác dụng hữu

hạ sốt ở thỏ đực Bên cạnh đó, một chiết xuất bằng nước của vỏ thân cây đã được chứng minh để tăng cường đáp ứng miễn dịch của những con chuột Balbc Ngoài ra, chiết xuất bằng nước của lá neem có tác dụng chống loét hiệu quả ở chuột

Hợp chất nimbidin được trích từ hạt neem có tác dụng chống viêm loét bao tử, trị

phong thấp Nimbidin có ức chế nấm da, nấm tóc Tinea rubrum Dung dịch nimbidin

Khảo sát dược lý học của Luscombe cho thấy lá cây neem có tác dụng kháng virus,

có tính lợi niệu nhẹ ở dịch trích của lá trong nước và lá non có khả năng làm giảm đường huyết ở thỏ (Luscombe và cs., 1974)

Trong số các triterpenoid chiết xuất từ cây neem thì azadirone và các dẫn xuất của

nó, nimbin, salannin, meliantriol, nimbidin giữ vai trò chủ lực trong việc thể hiện hoạt tính sinh học Mỗi chất có phương thức và hiệu quả tác động khác nhau Vì vậy các dịch chiết từ cây neem có phổ tác động rộng Cho đến nay các hoạt chất từ cây neem được báo cáo là có khả năng kiểm soát trên 400 loài sinh vật như: côn trùng, vi sinh vật (vi nấm, vi khuẩn, virus) gây bệnh thực vật, người và động vật Các hoạt chất từ cây neem được xác định là không độc đối với động vật có xương sống và vô hại đối với nhiều loài thiên địch và tác nhân thụ phấn trong tự nhiên Đây là cơ sở cho việc ứng dụng các dịch chiết từ cây neem để sản xuất thuốc trừ sâu và dược phẩm (Biwas và cs., 2002)

1.2 SƠ LƯỢC VỀ VI SINH VẬT NỘI SINH

Vi sinh vật nội sinh (Endophyte) là thuật ngữ chỉ các sinh vật trong toàn bộ hoặc một phần chu kỳ sống của nó có giai đoạn xâm nhập vào các mô của thực vật gây nhiễm trùng không có biểu hiện thành triệu chứng De Bary (1866) lần đầu tiên giới thiệu thuật ngữ “epiphytes” cho các loại nấm sống trên bề mặt vật chủ của chúng và thuật ngữ “endophytes” cho những loài nấm sống bên trong các tế bào thực vật Ban đầu, thuật ngữ vi sinh vật nội sinh đã được sử dụng rộng rãi bao gồm các tác nhân gây bệnh nguy hiểm trên lá, rễ thực vật Nhưng sau đó, các vi nấm xâm nhập vào mô thực vật tạo thành các triệu chứng của bệnh cây được loại trừ khỏi danh mục vi sinh vật nội sinh, mặc dù tất cả các nấm gây bệnh đều xâm nhập và tồn tại bên trong mô thực vật,

và những vi nấm xâm nhập nhưng không tạo các triệu chứng biểu hiện trong các mô của thực vật được gọi là vi sinh vật nội sinh Tuy nhiên, một số nghiên cứu còn bao gồm nấm sinh sống ở các bộ phận của thực vật trong toàn bộ hay một phần chu kỳ sống của chúng mà không gây hại đến thực vật, cũng như không là các tác nhân gây bệnh tiềm ẩn cho thực vật được đưa vào danh mục vi sinh vật nội sinh Hiện nay, thuật ngữ vi sinh vật nội sinh bao gồm tất cả các sinh vật có toàn bộ hoặc một phần thời gian của chu kỳ sống của chúng sống bên trong mô thực vật mà không tạo ra bất kỳ triệu chứng nào (Khan, 2007)

Các nhóm khác nhau của các sinh vật như nấm, vi khuẩn, xạ khuẩn và mycoplasma được báo cáo như là vi sinh vật nội sinh Trong đó, nấm và vi khuẩn là hai loại được phân lập nhiều nhất Trong thế kỷ trước, nghiên cứu về các loại nấm nội sinh được thực

hiện ở một quần thể sinh học, giới hạn cho ba họ thực vật: Coniferaeceae, Ericaceae

và Gramineae Gần đây, các kiến thức về đa dạng sinh học vi sinh vật nội sinh đang trở

nên rõ ràng hơn, từ một vài cho đến hàng trăm loài vi sinh vật nội sinh được phân lập

từ một loại thực vật Người ta tin rằng, môi trường có vai trò quan trọng trên đa dạng sinh học của vi sinh vật nội sinh và đa dạng loài là phụ thuộc vào bản chất của cây chủ

và địa điểm sinh thái của chúng Ví dụ, nấm nội sinh cây thân gỗ rất phong phú và đa dạng, đặc biệt là ở các vùng nhiệt đới (Khan, 2007; Strobel và Daisy, 2003)

Vi sinh vật nội sinh đã nhận được sự chú ý đáng kể sau khi phát hiện được chúng

có khả năng bảo vệ thực vật chống lại côn trùng, sâu bệnh, mầm bệnh và thậm chí cả động vật ăn thực vật Hầu như tất cả các loài thực vật (khoảng 400.000) chứa một hoặc nhiều vi sinh vật nội sinh (Khan, 2007) Chúng sinh sống ở phần lớn các cây khỏe mạnh, trong các mô khác nhau, hạt, rễ, thân, cành và lá Thực vật ký chủ đem lại lợi ích rộng rãi bằng cách nuôi dưỡng những vi sinh vật nội sinh này, và các vi sinh vật nội sinh này giúp thúc đẩy tăng trưởng, nâng cao đề kháng các tác nhân gây bệnh khác nhau bằng cách sản xuất kháng sinh cho thực vật ký chủ Vi sinh vật nội sinh cũng sản xuất các chất chuyển hóa thứ cấp có tầm quan trọng trong y học hiện đại, nông nghiệp

và công nghiệp Người ta cho rằng hoạt động hỗ sinh của thực vật có sự hiện diện của

vi sinh vật nội sinh như một chất “kích hoạt sinh học” (biological trigger) để kích hoạt các hệ thống phản ứng một cách nhanh hơn và mạnh mẽ hơn so với thực vật không được hỗ sinh (Bandara và cs., 2006; Strobel và Daisy, 2003)

1.3 TỔNG QUAN VỀ MỘT SỐ VI KHUẨN GÂY BỆNH CHO NGƯỜI

Loài: Staphylococcus aureus (Buchanan và Gibbons, 1994)

S aureus là vi khuẩn Gram (+), hình cầu đường kính 0,5 – 1,5 µm, có thể đứng

riêng lẻ, từng đôi, từng chuỗi ngắn, hoặc từng chùm không đều giống như chùm nho Đây là loại vi khuẩn không di động và không sinh bào tử, thường cư trú trên da và

màng nhầy của người và động vật máu nóng Trên môi trường Baird Parker, khuẩn lạc

có vòng sáng rộng 2 – 5 mm

 Khả năng gây bệnh của S aureus:

S aureus gây ra hai loại hội chứng nhiễm độc và nhiễm trùng:

- Nhiễm độc có thể do hoạt tính của một hoặc một vài sản phẩm của S aureus

(độc tố) mà không cần có sự hiện diện của vi khuẩn Như hội chứng sốc nhiễm độc, hội chứng phỏng ngoài da, hội chứng ngộ độc thức ăn

- Nhiễm trùng là do S aureus xâm nhập vào cơ quan bảo vệ của vật chủ khi bị

tổn thương hay giảm chức năng Như nhiễm trùng da và mô mềm, nhiễm trùng hệ hô hấp, nhiễm trùng hệ thần kinh trung ương, nhiễm trùng huyết, nhiễm trùng tiểu, nhiễm trùng nội mạch, nhiễm trùng xương…

S aureus gây ra nhiều bệnh nhiễm trùng, tạo mủ và gây độc ở người Thường xảy

ra ở những chỗ xây xước trên bề mặt da như nhọt, gây ra nhiều bệnh truyền nhiễm nghiêm trọng như viêm phổi, viêm tĩnh mạch, viêm màng não, nhiễm trùng tiểu và những bệnh nguy hiểm khác như viêm xương tủy, viêm màng trong tim (Nguyễn Thanh Bảo, 2008)

Loài: Escherichia coli (Buchanan và Gibbons, 1994)

E coli là trực khuẩn Gram (), kích thước trung bình từ 2 – 3 µm x 0,5 µm; trong những điều kiện không thích hợp (ví dụ như trong môi trường có kháng sinh) vi khuẩn

có thể rất dài như sợi chỉ Rất ít chủng E coli có vỏ, nhưng hầu hết có lông và có khả

năng di động

E coli phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường, hiếu khí tùy

nghi, nhiệt độ từ 5 – 40oC Trong điều kiện thích hợp E coli phát triển rất nhanh, thời

gian thế hệ chỉ khoảng 20 đến 30 phút

 Khả năng gây bệnh của E.coli:

E coli là vi khuẩn thường trú ở đường tiêu hóa của người, có thể được tìm thấy ở

đường hô hấp trên hay đường sinh dục E coli đứng đầu trong các vi khuẩn gây bệnh

tiêu chảy, viêm đường tiết niệu, viêm đường mật, căn nguyên gây nhiễm khuẩn huyết

E coli có khả năng gây bệnh khi xâm nhập vào những vị trí trong cơ thể mà bình

thường chúng không hiện diện

E coli hội sinh có trong phân người khỏe mạnh chỉ gây bệnh khi có dị vật hay hệ

thống miễn dịch của ký chủ bị suy yếu

E coli gây bệnh đường ruột Tác nhân gây bệnh qua đường tiêu hóa bất cứ khi

nào ký chủ nuốt vào đủ số lượng vi khuẩn Truyền bệnh chủ yếu qua thức ăn hay nước uống bị nhiễm vi khuẩn hay truyền từ người này qua người khác (Buchanan và Gibbons, 1994)

Loài: Salmonella typhi (Buchanan và Gibbons, 1994)

S typhi là trực khuẩn Gram (), có lông xung quanh thân Vì vậy có khả năng di động, không sinh nha bào Kích thước khoảng 0,4  0,6 x 2  3 μm S typhi là vi

khuẩn hiếu khí tùy nghi, phát triển được trên các môi trường nuôi cấy thông thường Trong môi trường thích hợp sau 24 giờ khuẩn lạc có kích thước trung bình 2 – 4 mm

 Khả năng gây bệnh của S typhi:

S typhi chỉ gây bệnh cho người, chủ yếu gây bệnh thương hàn

Bệnh thương hàn có thể gây biến chứng chủ yếu là xuất huyết tiêu hóa và thủng ruột Một số biến chứng ít gặp hơn như viêm màng não, viêm tủy xương, viêm khớp, viêm thận (Nguyễn Thanh Bảo, 2008; Lê Văn Phủng, 2012)

Loài: Pseudomonas aeruginosa (Buchanan và Gibbons, 1994)

P aeruginosa là trực khuẩn mủ xanh, thẳng hoặc hơi cong nhưng không xoắn,

hai đầu tròn, dài 1 5 µm, rộng 0,5  1 µm, ít khi có vỏ có một ít lông ở một đầu, di động, không sinh nha bào, bắt màu Gram () Chúng mọc ở biên độ nhiệt rộng (10 –

44oC), nhưng tối ưu ở 35oC Trong môi trường đặc, có thể gặp hai loại khuẩn lạc: một loại to, nhẵn, bờ trải dẹt, giữa lồi lên; một loại khác thì xù xì (Nguyễn Thanh Bảo, 2008; Lê Văn Phủng, 2012)

 Khả năng gây bệnh của P aeruginosa:

Trực khuẩn mủ xanh là loại vi khuẩn gây bệnh có điều kiện như: khi cơ thể bị suy giảm miễn dịch, bị bệnh ác tính hay mãn tính, khi dùng corticoid lâu dài, việc sử dụng kháng sinh tùy tiện… Chúng gây nhiễm trùng da, mắt như viêm nang lông, viêm da

chảy nước ở các vùng kẽ hoặc viêm tai ngoài, viêm loét giác mạc, Ngoài ra P

aeruginosa là căn nguyên gây nhiễm trùng vết bỏng, vết thương, xương khớp, huyết,

dịch não tủy, tiết niệu và hô hấp (Nguyễn Thanh Bảo, 2008; Lê Văn Phủng, 2012) Trực khuẩn gây viêm mủ (mủ có màu xanh) Khi có điều kiện thuận lợi chúng gây bệnh toàn thân như nhiễm khuẩn huyết hoặc viêm phế quản, viêm màng não, viêm tai giữa, viêm xương tủy (Nguyễn Thanh Bảo, 2008; Lê Văn Phủng, 2012)

Chi: Klebsiella (Dworkin M., 2006)

Klebsiella spp là trực khuẩn Gram (), không di động, có vỏ polysacharide đặc trưng Lớp áo này giúp vi khuẩn tránh được hàng rào phòng vệ của tế bào chủ

(Podschun và cs, 1998) Klebsiella spp có kích thước 0,3  1,5 µm × 0,6  6,0 µm, hình que, thường đứng thành từng đôi, không sinh bào tử (Buchanan R E., 1994)

 Khả năng gây bệnh của Klebsiella spp.:

Klebsiella tác nhân đứng thứ hai sau E.coli gây nhiễm khuẩn bệnh viện và cộng

đồng Klebsiella spp có thể gây tổn thương ở hầu hết các cơ quan của cơ thể: viêm

xoang, viêm họng, viêm màng não, viêm phúc mạc,… đáng chú ý là trẻ con có thể bị viêm ruột do loài vi khuẩn này Nó là căn nguyên quan trọng gây nhiễm khuẩn hô hấp, nhiễm khuẩn tiết niệu, nhiễm khuẩn huyết và nhiễm khuẩn mô mềm ở nhiễm khuẩn

bệnh viện Klebsiella spp lan rộng và nhanh trong môi trường bệnh viện qua tay nhân

viên y tế và đường tiêu hóa Yếu tố nguy cơ để nhiễm các chủng này ở bệnh viện là do bệnh nhân nằm viện thời gian dài, hệ miễn dịch suy yếu, nằm chung giường với người nhiễm bệnh hay thực hiện những thủ thuật xâm lấn như đặt ống thông tiểu, đặt nội khí

quản,…Tuy nhiên, nhiễm khuẩn bệnh viện do Klebsiella tăng cao chủ yếu do việc sử

dụng kháng sinh không hợp lý nên làm gia tăng những chủng kháng thuốc (Buchanan

Chi: Acinetobacter (Buchanan và Gibbons, 1994)

Acinetobacter spp là những vi khuẩn Gram (), đa hình (cầu khuẩn hoặc cầu trực khuẩn), kích thước khoảng 1,0 µm x 0,7 µm, rất dễ nhầm lẫn với vi khuẩn thuộc giống

Neisseria Các chủng Acinetobacter kháng với penicilin trong khi các chủng của họ Neisseria lại nhạy cảm với kháng sinh này Acinetobacter spp trên môi trường thạch

máu sau 24 giờ, khuẩn lạc có kích thước 0,5 – 2 mm, màu sáng đều đến đục, lồi , nguyên vẹn, đặc biệt không tạo sắc tố (Nguyễn Thanh Bảo, 2008)

 Khả năng gây bệnh của Acinetobacter spp.:

Vi khuẩn Acinetobacter spp hiện diện ở khắp nơi, đặc biệt nơi ẩm ướt như đất,

nước và môi trường bệnh viện Vi khuẩn thường trú trên da người với tỉ lệ cao (25%), màng nhầy, dịch tiết Vi khuẩn có thể gây nhiễm khuẩn bệnh viện với bệnh nặng như viêm màng não, viêm nội tâm mạc, viêm phổi và nhiễm khuẩn huyết Vi khuẩn thường xâm nhập vào cơ thể rõ rệt là đường hô hấp và da (Nguyễn Thanh Bảo, 2008)

1.4 TỔNG QUAN VỀ MỘT SỐ NẤM GÂY BỆNH TRÊN NGƯỜI

Dermatophytes là một nhóm nấm ưa keratin gây bệnh ở da, tóc và móng thuộc họ

Gymnoascaceae Bệnh do nhóm nấm này gây ra được gọi chung là bệnh nấm da Có

khoảng 40 loài nấm da đã biết, thuộc 3 chi: Trichophyton, Microsporum và

Epidermophyton Chu kỳ sinh sản của nấm da gồm hai giai đoạn, vì vậy một số loài đã

biết với hai tên riêng biệt nhau, một tên để chỉ giai đoạn sinh sản vô tính (anaphorm) và một tên để chỉ giai đoạn sinh sản hữu tính (teleomorph) Chỉ có một số loài nấm da có giai đoạn sinh sản hữu tính bằng bào tử tiếp hợp Tên gọi cho giai đoạn sinh sản hữu

tính của Microsporum là Nannizzia và của Trichophyton là Arthroderma sống ở đất

Bệnh nấm da rất phổ biến, có ít nhất 10% dân số thế giới bị nhiễm nấm da Bệnh lây nhiễm chủ yếu qua tiếp xúc trực tiếp với người bệnh, thú bệnh hay đất; hoặc gián tiếp qua thảm, sàn nhà, kệ tủ đựng quần áo, hồ tắm, giày dép mang vảy da hay tóc bệnh Ở môi trường thích hợp, vi nấm có thể sống ngoài cơ thể ký chủ ít nhất một năm

Do vi nấm có ở khắp nơi, rất khó xác định được nguồn lây nhiễm, nhất là ở các vi nấm

ưa người như T.rubrum và T.mentagrophytes.Các loại nấm gây bệnh cho người thay

đổi theo vị trí gây bệnh và theo vùng địa lý, tuy nhiên trên phạm vi toàn thế giới có hai

loài nấm da thường được ly trích từ bệnh nấm da là T rubrum và T mentagrophytes

(chiếm 80 – 90% trong tổng số ca bệnh nấm da) (Nguyễn Đinh Nga, 2009)

Hình 1.1 Cấu trúc vi thể của nấm da Hình 1.2 Cấu trúc hình thể của nấm da dưới kính hiển vi

1.4.1 Trichophyton spp

Phân loại như sau:

Giới: Nấm

Ngành: Ascomycota Lớp: Eurotiomycetes Bộ: Onygenales Họ: Arthrodermataceae

Chi: Trichophyton

Trichophyton spp có bào tử đính lớn, khi trưởng thành, có dạng phẳng, thường có

từ 1 đến 12 vách ngăn mỏng Chúng được tạo ra đơn lẻ hoặc thành các chùm, và có thể được kéo dài ở dạng chùm , hình chuỳ, hình thoi, hình trụ Kích thước dao động trong khoảng chiều dài từ 8 đến 86 µm, chiều rộng 4 đến 14 µm Bào tử đính nhỏ, thường nhiều hơn hơn bào tử đính lớn, chúng có thể là hình cầu, hình quả lê hoặc hình chùm, không cuống hoặc có cuống, và được tạo ra đơn lẻ dọc theo hai bên sợi nấm hoặc thành cụm giống như chùm nho (Weitzman I và Summerbell R.C., 1995)

1.4.2 Microsporum spp

Phân loại như sau:

Giới: Nấm Ngành: Ascomycota Lớp: Eurotiomycetes Bộ: Onygenales Họ: Arthrodermataceae

Chi: Microsporum

Microsporum spp bào tử đính lớn có đặc điểm là có những vách ngăn thô ráp do

có nhiều điểm nhỏ, gai nhỏ, hoặc nhiều mụn cơm Ban đầu, bào tử đính lớn được mô tả bởi Chester Emmons (1934), chúng như hình con quay hoặc hình thoi, nhưng khi phát hiện ra loài mới đã giúp mở rộng phạm vi hình dạng của chúng từ hình trứng ở

Microsporum nanum cho đến hình trụ nhọn 2 đầu ở Microsporum vanbreuseghemii

Bào tử đính lớn có thể có vách mỏng, hơi dày cho đến dày, có từ 1 đến 15 vách ngăn

và kích thước nằm trong khoảng chiều dài 6  160 µm, chiều rộng 6  25 µm Bào tử

đính nhỏ không có cuống hoặc có cuống và có dạng hình chùm, thường được bố trí đơn

lẻ dọc theo sợi nấm hoặc có dạng chùm như ở Microsporum racemosum, một tác nhân

gây bệnh hiếm có (Weitzman I và Summerbell R.C., 1995)

1.4.3 Bệnh do dermatophytes gây ra

Thông thường, các bệnh nhiễm trùng gây ra bởi dermatophytes (nấm ngoài da) được đặt tên theo vị trí giải phẫu học có liên quan đến bằng cách gắn thêm thuật ngữ Latin chỉ định các vị trí cơ thể sau chữ tinea, ví dụ như tinea capitis (nấm da đầu) Các biểu hiện lâm sàng thường gặp như sau: (i) tinea barbae (nấm ở vùng có râu), (ii) tinea capitis (nấm da đầu, lông mày, và lông mi), (iii) tinea corporis (nấm ở vùng da nhẵn ); (iv) tinea cruris (nấm bẹn), (v) tinea favosa (nấm da mãn tính), (vi) tinea imbricata

(nấm da gây ra bởi T Concentricum), (vii) tinea manuum (nấm ở tay), (viii) tinea pedis

(nấm ở chân), và (ix) tinea unguium (nấm móng) Một số vị trí giải phẫu học có thể bị nhiễm bởi một loài nấm da duy nhất, và những loài khác nhau có thể tạo ra các tổn thương lâm sàng giống hệt nhau Các tác nhân gây bệnh có thể phổ biến toàn cầu, ví dụ

như T rubrum, trong khi đó sự phân bố của một số tác nhân gây bệnh khác có thể khác

nhau về mặt địa lý (Weitzman I và Summerbell R.C., 1995)

+ Nấm ở vùng có râu (Tinea barbae)

Một nhiễm trùng ở vùng có râu, có thể nhẹ và xảy ra trên bề mặt hoặc viêm nang lông có mụn mủ nghiêm trọng, dạng thứ hai thì thường gây ra bởi nhóm dermatophytes

ưa động vật như Trichophyton verrucosum, T mentagrophytes var mentagrophytes và

T mentagrophytes var Erinacei (Weitzman I và Summerbell R.C., 1995)

+ Nấm da đầu (Tinea capitis)

Một nhiễm trùng liên quan đến da đầu, thường được gây ra bởi các thành viên của

chi Microsporum và Trichophyton Nhiễm trùng có thể diễn biến từ nhẹ như là không

ngứa hoặc ngứa nhẹ, gần như chưa có biểu hiện lâm sàng, hoặc với ban đỏ nhẹ và một vài mảng trụi tóc lớn với chân tóc màu xám nhạt, hình thành các mảng lớn của sẹo và rụng tóc, vảy ở da đầu, cho đến nặng như hiện tượng bị viêm nang lông có mụn mủ rất

nghiêm trọng, các mụn mủ này lan rộng dần ra và tạo thành một mảng lớn hình tròn hay bầu dục Các mụn mủ dần dần ăn sâu xuống tạo thành các apxe Bề mặt thương tổn đóng vảy tiết, tóc trong đám thương tổn rụng hết Nếu cạy hết vảy tiết bề mặt sẽ lõm lỗ chỗ như tổ ong nên có tên mới là Kerion de celse, đôi khi đi kèm với mệt mỏi, sốt và nổi hạch Cả bề mặt da và tóc bị ảnh hưởng Nhiễm trùng của tóc có thể được mô tả như ectothrix (vỏ bọc của bào tử đính có phân đốt, hình thành ở bên ngoài của sợi tóc) hoặc endothrix (vỏ bọc của bào tử đính có phân đốt, hình thành trong sợi tóc) Nguyên nhân chủ yếu hiện tại của tinea capitis ở hầu hết các khu vực Bắc, Trung và Nam Mỹ là

T tonsurans (endothrix) thay thế M audouinii (ectothrix) (Weitzman I và Summerbell

+ Nấm bẹn (Tinea cruris)

Nhiễm trùng ở vùng bẹn, quanh hậu môn, và vùng xương mu, và đôi khi phía trên

bắp đùi, thường được tìm thấy ở nam giới trưởng thành T rubrum và E floccosum là

các tác nhân gây bệnh thường gặp nhất Biểu hiện khi bị nhiễm trùng là tổn thương da, mảng da lớn hình tròn hay đa cung có giới hạn rõ, trung tâm có màu nâu nhạt, ngã sang màu đỏ có vảy nhẹ, ngoài rìa có mụn nước và vảy Từ một bên nấm có thể lan sang bên đối xứng, lên xương mu, xuống đùi, sau kẽ mông, quanh thắt lưng (Weitzman I và Summerbell R.C., 1995)

+ Nấm da mãn tính (Tinea Favosa)

Nấm da do Trichophyton schoenleinii gây ra rất nghiêm trọng và mãn tính, nó đặc

trưng bởi sự xuất hiện trên da đầu và da nhẵn những chấm đỏ phủ vảy tiết vàng, ở giữa

lõm xuống, các chấm có thể liên kết thành mảng lớn, trong đó bao gồm các mảnh vỡ biểu mô và dày đặc Tóc thường không rụng,vẫn mọc dài nhưng khô và không bóng Nếu có rụng tóc thì trụi vĩnh viễn Nhiễm trùng này phổ biến nhất ở đại lục Á – Âu và Châu Phi (Weitzman I và Summerbell R.C., 1995)

+ Nấm da gây ra bởi T concentricum (Tinea Imbricata)

Tinea Imbricata, một nhiễm trùng mãn tính với sự biểu hiện đặc trưng của Tinea corporis, được xác định bởi các vòng tròn đồng tâm của các mảng bong vảy chồng lên nhau rải rác khắp cơ thể Nhiễm trùng này chỉ xảy ra ở những hòn đảo trên biển Thái

Bình Dương, khu vực Đông Nam Á, Mexico, và Trung và Nam Mỹ T concentricum,

một loại nấm da thuộc nhóm ưa con người, là tác nhân duy nhất gây ra nhiễm trùng nói trên (Weitzman I và Summerbell R.C., 1995)

+ Nấm ở tay (Tinea Manuum)

Khi bị nấm ở tay, các khu vực lòng bàn tay và phía trong ngón tay là nơi thường

bị ảnh hưởng nhất, dấu hiệu thường thấy nhất là sự phân bố dày sừng lan tỏa ở lòng

bàn tay sau đó ra mu tay, rìa ngón tay Hầu hết các nhiễm trùng được gây ra bởi T

rubrum (Weitzman I và Summerbell R.C., 1995)

+ Nấm ở chân (Tinea Pedis)

Bàn chân, đặc biệt là lòng bàn chân và kẽ ngón chân, là khu vực thường bị nhiễm nấm chân nhất Các biểu hiện lâm sàng thường gặp nhất là bong tróc vảy da khô, và đường nứt giữa kẻ da, xung quanh kẻ ẩm ướt, chảy nước, thường tăng tiết mồ hôi, đôi khi có đau, xảy ra chủ yếu vào các khe giữa các ngón chân thứ tư và thứ năm Một biểu hiện mãn tính phổ biến khác là dày vảy, sừng: đỏ da, dày da, giới hạn rõ, bong vảy trắng mịn, có ít mụn nước ở rìa thương tổn, vị trí thường gặp: gót chân, lòng bàn chân, rìa bàn chân, mu bàn chân Thường bắt đầu một bên sau lan ra hai bên Trường hợp vị viêm cấp tính, được đặc trưng bởi sự hình thành của mụn nước hoặc bọng nước chứa dịch trong, có mủ khi nhiễm tụ cầu vàng hoặc liên cầu nhóm A thứ phát Sau đó vỡ để lại vết chợt có bờ tròn lởm chởm Vị trí thường gặp là lòng bàn chân, mu bàn chân,

thường do T mentagrophytes gây ra Có nhiều tác nhân gây tổn thương mãn tính ở chân như là T rubrum, T mentagrophytes var interdigitale và E Floccosum

(Weitzman I và Summerbell R.C., 1995)

+ Nấm móng (Tinea Unguium)

Tổn thương móng do dermatophytes gây ra được gọi là Tinea Unguium , tổn

thương móng do nấm không thuộc nhóm dermatophytes được gọi là nấm móng Từ thứ hai thường được sử dụng như một thuật ngữ chung cho một tổn thương ở móng Nấm thường bắt đầu từ bờ tự do hay hai cạnh bên của móng ăn vào, móng mất vẻ bóng, dòn, dày lên có màu trắng bẩn Trên mặt móng bị lỗ chỗ hoặc có những đường rãnh Dưới móng có tích tụ ít bột vụn Ít khi có viêm quanh móng, về sau móng dần dần bị lẹm, phần còn lại xù xì màu vàng đục Bệnh lan từ móng này sang móng kia, tiến triển qua

hàng tháng hàng năm T rubrum và T mentagrophytes là hai tác nhân phổ biến nhất

thuộc nhóm nấm dermatophytes gây ra nhiễm trùng này (Weitzman I và Summerbell R.C., 1995)

1.5 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU

1.5.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Trên thế giới, có nhiều công trình nghiên cứu về vi sinh vật nội sinh phân lập từ cây dược liệu nói chung và cây neem nói riêng đã được công bố và ứng dụng vào thực tiễn Năm 2003, Kennedia nigriscan, một loại cây leo ở Úc dân gian thường sử dụng sáp nhựa để điều trị vết thương, sát trùng, đã được Strobel và cộng sự phân lập được

chủng Streptomyces sp NRRL 30562 mới ứng dụng sản xuất kháng sinh Năm 2007,

Chandrashekhara và cộng sự đã phân lập được 7 chủng vi khuẩn nội sinh từ cây neem tại Ấn Độ trong đó có 2 chủng Gram (+) và 5 chủng Gram () Năm 2009, Verma và cộng sự đã phân lập được 55 chủng xạ khuẩn nội sinh từ cây neem có khả năng ức chế được 54,4 % hoạt động của vi khuẩn và nấm bệnh Năm 2011, Kafur và cộng sự đã phân lập được 38 chủng xạ khuẩn nội sinh trong cây dừa cạn có khả năng ức chế

hợp chất tiết ra từ 4 chủng vi khuẩn nội sinh dừa cạn kháng được vi khuẩn, vi nấm gây bệnh.Năm 2012, Pavithra đã nghiên cứu 40 chủng nấm nội sinh trong cây húng quế có hoạt tính kháng được 77,5% nấm bệnh Năm 2013, Idris nghiên cứu hoạt tính kháng

khuẩn từ nấm nội sinh phân lập từ cây thuốc Kigelia africana có khả năng kháng lại

Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Escherichia coli

1.5.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Tại Việt Nam, đã có nhiều nghiên cứu về vi sinh vật nội sinh trong các loài cây nhưng chưa có công trình nghiên cứu về vi sinh vật nội sinh trên cây neem Nhưng bên cạnh đó đã có công trình nghiên cứu về vi sinh vật nội sinh trên cây dược liệu khác: Lương Thị Hồng Hiệp và Cao Ngọc Điệp (2011) đã phân lập và nhận diện vi khuẩn nội sinh trong cây Cúc Xuyến Chi

Nhóm tác giả Nguyễn Văn Minh, Mai Hữu Phúc, Võ Ngọc Yến Nhi, Dương Nhật Linh, Nguyễn Anh Nghĩa (2013) đã sàng lọc vi sinh vật nội sinh cây cao su có khả

năng kiểm soát sinh học vi nấm Corynespora cassiicolalà bệnh rụng lá trên cây cao su Nghiên cứu vi sinh vật nội sinh và các hợp chất hóa học có hoạt tính kháng nấm gây bệnh ở các dòng Keo tai tượng khảo nghiệm tại Thừa Thiên Huế (Phạm Quang Thu 2012)

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP