Nghiên cứu tạo dòng vi khuẩn photobacterium damselae nhược độc bằng phương pháp sử dụng tia uv nhằm phục vụ chế tạo vắc xin phòng bệnh tụ huyết trùng trên một số loại cá nuôi

Một trong những bước quan trọng để nghiên cứu ra vắc-xin là phải tạo được chủng vi khuẩn nhược độc, làm cơ sở ban đầu hướng đến việc sản xuất vắc-xin bệnh tụ huyết trùng ở cá biển.. Xuất

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH -& -

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Người thực hiện: NguyễnTrọng Hiếu

Người hướng dẫn: Th.S Lê Minh Hải

PGS TS Phạm Thị Tâm

Vinh, 5/2016

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian thực tập và thực hiện đề tài tốt nghiệp này, ngoài sự nỗ lực của bản thân tôi đã nhận được sự giúp đỡ nhiệt tình từ các thầy cô giáo trong khoa Nông Lâm Ngư, trường Đại Học Vinh, những người đã tận tình dìu dắt tôi trong suốt thời gian ngồi trên ghế nhà trường

Đặc biệt tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất tới thầy giáo Lê Minh Hải, người

đã hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôi hoàn thành tốt luận văn này

Xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các anh chị và các bạn khoa Công Nghệ Sinh Học, Viện Đại học Mở - Hà Nội, đặc biệt là cô giáo Phạm Thị Tâm đã

hỗ trợ tạo mọi điều kiện về trang thiết bị, cơ sở vật chất để tôi có thể hoàn thành đề tài tại cơ sở thực tập

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến gia đình và những người bạn đã động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học cũng như trong cuộc sống

Một lần nữa, tôi xin chân thành cảm ơn !

Sinh viên

Nguyễn Trọng Hiếu

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

Chương 1.TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 3

1.1 Tổng quan về vi khuẩn Photobacterium damselae 3

1.1.1 Phân loại 3

1.1.2 Đặc điểm hình thái 3

1.1.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hoá 4

1.1.4 Đặc điểm gây bệnh của vi khuẩn Photobacterium damselae 5

1.1.5.Dịch tễ học 6

1.1.6.Phòng trị bệnh 9

1.2 Lịch sử phát hiện bệnh do vi khuẩn Photobacterium damselae 10

1.2.1 Lịch sử phát hiện bệnh trên thế giới 10

1.2.2 Lịch sử phát hiện bệnh ở Việt Nam 11

1.3 Tổng quan về tạo chủng vi khuẩn nhược độc 11

1.3.1 Tình hình nghiên cứu tạo chủng vi khuẩn nhược độc 11

1.3.2 Các phương pháp làm giảm độc lực vi khuẩn 14

1.3.3 Các tác nhân tạo chủng nhược độc 16

1.4 Đặc điểm hệ miễn dịch ở cá xương 22

1.4.1 Miễn dịch đặc hiệu 22

1.4.2 Miễn dịch tự nhiên 22

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1 Đối tượng nghiên cứu 24

2.2 Vật liệu nghiên cứu 24

2.2.2.Hóa chất 24

2.2.3 Môi trường và dung dich nuôi cấy 24

2.2.4 Thiết bị 26

2.3 Nội dung nghiên cứu 27

2.4 Phương pháp nghiên cứu 27

2.4.1 Phương pháp vi sinh 29

2.4.2 Phương pháp gây đột biến bằng tia cực tím 29

2.4.3 Phương pháp gây nhiễm động vật thí nghiệm 30

2.5 Phương pháp xử lý số liệu 32

2.6 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 32

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33

3.1 Kết quả tạo các dòng vi khuẩn Photobacterium damselae nhược độc bằng tia UV 33

3.2 Kết quả đánh giá mức độ giảm độc lực của các dòng vi khuẩn Photobacterium damselae nhược độc đột biến 36

3.2.1 Kết quả thử khả năng dung huyết 36

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44

TÀI LIỆU THAM KHẢO 45

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1.A Hình thái của vi khuẩn P damselae 4

Hình 1.1.B Hình thái khuẩn lạc trên môi trường thạch máu 4

Hình 1.2 Tác động của tia tử ngoại tạo các dimer thymine 17

Hình 1.3 Tác động tia UV làm cho DNA có một chỗ phình trong cấu trúc 18

Hình 1.4: Cấu trúc RNA polymerase (RNAP) 20

Hình 1.5 Vùng kháng Rif của tiểu đơn vị β RNAP [13] 21

Hình 1.6 Đột biến kháng Rif ở vùng I của gen rpoB 21

Hình 2.1 Sơ đồ khối nghiên cứu 28

Hình 2.2 Minh họa thí nghiệm chiếu tia UV 30

Hình 2.3.Sơ đồ bố trí thí nghiệm gây nhiễm trên cá 31

Hình 3.2 Số khuẩn lạc sống sót sau khi chiếu UV 36

Hình 3.3 Khả năng dung huyết của chủng T4.3 và Dòng 8 38

Hình 3.4 Cá trước và sau khi gây nhiễm các chủng đột biến 41

Hình 3.6.Cá thí nghiệm sau 15 ngày đánh giá kháng thể bảo hộ 43

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Môi trường TCBS (Thiosulfate Citrate Bile Salts) 25

Bảng 2.2 Môi trường thạch máu 25

Bảng 2.3.Môi trường Brain Heart Infusion ( BHI) Broth 26

Bảng 2.4 Các thiết bị chính dùng trong nghiên cứu 26

Bảng 3.1 Số khuẩn lạc sống sót sau xử lý UV 34

Bảng 3.2 Kết quả phản ứng thử khả năng dung huyết 37

Bảng 3.3 Kết quả gây nhiễm cá sau 15 ngày tiêm 39

Bảng 3.4 Kết quả đánh giá khả năng sinh kháng thể bảo hộ 42

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Hiện nay, đối tượng nuôi và mô hình nuôi thủy sản ở Việt Nam khá phong phú.Trong đó, mô hình nuôi cá lồng đang ngày càng khẳng định được vị trí của mình Đây là mô hình được áp dụng cho nhiều loài cá có giá trị kinh tế cao Các loại

cá biển như: Cá Mú (Epinephelus spp), cá Giò (Rachycentron canadum), cá Chẽm (Lates calcarifer), cá Hồng (Lutjanus spp)… có giá trị kinh tế rất cao do hàm lượng

dinh dưỡng giàu axit béo không no nên được thị trường trong và ngoài nước ưa chuộng Tuy nhiên, khi nghề nuôi cá biển phát triển thì người nuôi cũng gặp không

ít khó khăn trong đó có dịch bệnh xảy ra trên cá Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng những tác nhân gây bệnh chủ yếu trên cá biển nuôi lồng thường là virus, nấm và vi

khuẩn, trong đó nguy hiểm nhất là vi khuẩn Photobacterium damselae gây ra bệnh

tụ huyết trùng do.Vi khuẩn có thể tấn công và gây bệnh trên cá biển nuôi ở tất cả các giai đoạn phát triển của cá từ giai đoạn ấu trùng, cá giống đến cá nuôi thương phẩm Khi bị bệnh, cá có biểu hiện ở dạng mãn tính và cấp tính Biểu hiện của bệnh

tụ huyết trùng bao gồm: gây loét trên da, xuất hiện các nốt kem trắng hoặc u hạt màu trắng ở một số cơ quan nội tạng, gây hoại tử trong nội tạng, hoại tử tập trung ở thận và lá lách, gây nhiễm trùng và hoại tử rộng rãi (Evelyn năm 1996; Romalde 2002; Barnes và các cộng sự, 2005) Dấu hiệu lâm sàng của bệnh bao gồm: cá kém

ăn, da tối màu, mang hoại tử Cá bệnh có thể chết sau 5 - 10 ngày với tỷ lệ chết cao

từ 80 - 100% và đã gây ra thiệt hại kinh tế lớn ở một số nước như: Nhật, Mỹ, Pháp, Tây Ban Nha, Hy Lạp, Thổ Nhỹ Kỳ,Bỉ…Ở Việt Nam, bệnh phân bố ở hầu hết các vùng nuôi trên cả nước

Thực tế trong nuôi trồng thủy sản, người dân thường sử dụng nhiều hóa chất

và kháng sinh để khống chế vi khuẩn này, song việc sử dụng kháng sinh có thể gây hiện tượng nhờn thuốc và không mang lại hiệu quả cao Vi khuẩn này có khả năng tạo ra màng bảo vệ trước thuốc diệt khuẩn và kháng sinh Chính vì thế, dịch bệnh thường bùng phát trở lại rất nhanh sau khi thuốc hết tác dụng Mặt khác, dư lượng

kháng sinh trong sản phẩm từ cá biển có thể gây ảnh hưởng xấu đến chất lượng thịt

cá và sức khỏe của con người

Phương pháp phòng bệnh hiệu quả nhất hiện nay là sử dụng vắc-xin Việc nghiên cứu ra một loại vắc-xin phòng bệnh là tương đối cần thiết Một trong những bước quan trọng để nghiên cứu ra vắc-xin là phải tạo được chủng vi khuẩn nhược độc, làm cơ sở ban đầu hướng đến việc sản xuất vắc-xin bệnh tụ huyết trùng ở cá biển

Xuất phát từ lý luận và tình hình thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành đề tài:

“Nghiên cứu tạo dòng vi khuẩn Photobacterium damselae nhược độc bằng phương pháp sử dụng tia UV nhằm phục vụ chế tạo vắc-xin phòng bệnh tụ huyết trùng trên một số loại cá nuôi ” làm cơ sở ban đầu hướng đến việc sản xuất vắc-

xin bệnh tụ huyết trùng ở cá biển

2 Mục tiêu của đề tài

2.2.1 Mục tiêu chung

Tạo được chủng vi khuẩn Photobacterium damselae nhược độc có khả năng

tạo kháng thể bảo hộ ở cá

2.2.2 Mục tiêu cụ thể

 Tạo được dòng vi khuẩn Photobacterium damselae nhược độc kỹ thuật đột

biến sử dụng tia UV

 Đánh giá đặc tính của chủng đột biến:

- Đánh giá lại khả năng dung huyết

- Đánh giá lại mức độ gây bệnh qua lây nhiễm trên cá

 Đánh giá khả năng tạo kháng thể bảo hộ cho cá sử dụng vi khuẩn nhược độc

Chương 1.TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

1.1 Tổng quan về vi khuẩn Photobacterium damselae

nhận là một tác nhân gây bệnh cơ hội có khả năng gây bệnh ở cá và động vật có vũ

McDonell và Colwell (1985) đã phân loại lại như một thành viên của chi Listonella

dựa trên việc nghiên cứu các mối quan hệ phát sinh loài bằng cách phân tích chuỗi 5S rRNA Sau đó, Smith et al (1991) dựa trên đặc điểm kiểu hình đã chuyển các

loài này đến chi Photobacterium Trong một nghiên cứu của Gauthier et al (1995)

về tác nhân gây bệnh tụ huyết trùng ở một số loài cá, đã chứng minh và xác định

chủng vi khuẩn này là một thành viên của Photobacterium damselae bằng phương

pháp phân tích trình tự 16S rDNA và DNA [30]

1.1.2 Đặc điểm hình thái

Vi khuẩn Photobacterium damselae là trực khuẩn, gram âm, kích thước

khoảng 0.5 – 0.8 µm x 0.7 – 2.6 µm, lưỡng cực Không có roi và không di động (Austin et al, 1997) [19]

A B

Hình 1.1.A Hình thái của vi khuẩn P damselae

Hình 1.1.B Hình thái khuẩn lạc trên môi trường thạch máu

1.1.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hoá

Điều kiện nuôi cấy: Vi khuẩn P damselae phát triển tốt trên môi trường có

nồng độ NaCl từ 0,5% - 4% Phát triển tốt nhất ở nồng độ NaCl từ 1,0% - 2,5% Không phát triển trong môi trường có nồng độ NaCl 0%, 8%, 10%, 12% và không thể phát triển nếu thiếu Na+ Nhiệt độ nuôi cấy từ 15ºC – 32,5ºC Môi trường nuôi cấy cấp một tốt nhất là môi trường BHI Agar, TCBS, Marine Agar hoặc môi trường thạch máu (2% máu cừu) không bổ sung thêm muối Khuẩn lạc trên môi trường thạch máu có màu xám, đục, đường kính khoảng 1mm, viền trơn, gây dung huyết β

và quan sát được rõ ràng sau 48h ở 28ºC (Austin et al, 1997 và Fouz et al, 1997) [19]

Vi khuẩn P damselae bắt màu Gram âm, nhuộm lưỡng cực, khi nhuộm

thường thấy vi khuẩn bắt màu sẫm ở hai đầu, ở giữa nhạt hơn do hiện tượng nguyên sinh chất bị dung giải về hai đầu của vi khuẩn

Là vi khuẩn hiếu khí, kỵ khí tùy tiện Phản ứng tích cực với Metyl đỏ (1%NaCl), Arginene (1%NaCl), khử Nitrat thành Nitrit Sinh acid nhưng không sinh khí gas từ các loại đường glucose, mannose, maltose, fructose, và galactose Sinh khí từ D-glucose, lipase, esculin Dương tính với oxidase, catalase, methyl red

Âm tính với indol, nitrate, citrate, H2S (Austin et al,1997 và Fouz et al, 1997) [19]

1.1.4 Đặc điểm gây bệnh của vi khuẩn Photobacterium damselae

- Gây bệnh trên cá:

Rất nhiều báo cáo khoa học đề cập đến bệnh do P damselae trên cá biển nuôi

công nghiệp tại nhiều quốc gia trên thế giới Các loài cá tự nhiên (cá Trinh nữ, cá da trơn, cá Mập, cá Đuối gai độc…), cũng như các loài cá có tầm quan trọng kinh tế trong nuôi trồng thủy sản (cá Mú, cá Giò, cá Tráp, cá Bống bớp, cá Vược) chịu rất

nhiều thiệt hại do P damselae gây bệnh (Romalde & Magarinos, 1997)

Tác nhân gây bệnh có thể lây nhiễm sang các loài cá mới thông qua nước, và

sự lây lan của căn bệnh này phụ thuộc phần lớn vào nhiệt độ nước và độ mặn (Fouz

et al, 2000) [19] Bệnh thường xảy ra với tỷ lệ chết rất cao vào các tháng mùa hè, sự bùng phát bệnh phụ thuộc vào nhiệt độ và thường xảy ra khi nhiệt độ nước tăng lên trên 18oC Tại các thời điểm khác trong năm cá chết rải rác, ở nhiệt độ thấp cá ở

tình trạng ủ bệnh Phát hiện này cho thấy P damselae đã xuất hiện ít nhiều trong cá

khỏe mạnh nuôi cùng khu vực bị nhiễm, và số lượng cá bị nhiễm tăng khi nhiệt độ lên cao, nâng cao khả năng nhiễm trùng cùng với Vibrio spp khác Sự lây lan giữa

cá bệnh sang cá khỏe mạnh đang ngày càng rộng hơn, vì có nhiều cá nhiễm P damselae trong cơ thể mà không thể hiện triệu chứng bên ngoài nên người nuôi

không biết để phòng trị

Dấu hiệu điển hình ở cá bị nhiễm bệnh là xuất hiện vùng xuất huyết và vết loét trên bề mặt cơ thể Cá bệnh hầu hết có triệu chứng chung khá điển hình trên nhiều loài: xuất hiện vết loét trên da, cá kém ăn hoặc bỏ ăn, da sẫm màu, bơi dữ dội Giải phẫu bên trong cơ thể tuyến thận bị sưng, xuất hiện các đốm trắng dạng hạt trong mô thận, gan tuỵ, mang và nội tạng xuất huyết, hoại tử trong nội tạng, hoại tử tập trung ở thận và lá lách, gây nhiễm trùng Bệnh cấp tính cá chết sau 5 - 10 ngày với tỉ lệ cao, có thể từ 80 - 100% Trong cá trinh nữ, vết loét thường xảy ra trong khu vực của các vây ngực và cuống đuôi có thể đạt 5 - 20 mm Trong khi ở cá bơn các triệu chứng đáng chú ý nhất là xuất huyết sâu rộng trong mắt, miệng, và hàm (Fouz et al, 1995) Trong cá ngừ, các u hạt bao quanh mô hoại tử và vi khuẩn thường xuất hiện nhiều trong lá lách, thận và gan của cá nhiễm (Robohm 1983) [41]

- Gây bệnh ở người

Hầu hết những người nhiễm P damselae đều có tiền sử tiếp xúc với cá biển

bị nhiễm P damselae và nước nuôi cá bệnh hoặc các dụng cụ xử lý (Morris et al,

1982) Trường hợp bất thường là nhiễm trùng sau khi ăn hải sản (Kim et al, 2009)

và thông qua đường tiết niệu do tiếp xúc với nước biển (Alvarez và cộng sự, 2006) [17] Phần lớn các trường hợp xảy ra ở khu vực ven biển của Hoa Kỳ, Úc và Nhật

Bản Trường hợp nhiễm bệnh đầu tiên được xác định bệnh nhân bị nhiễm P damselae phát triển suy đa cơ quan trong vòng vài giờ sau khi có triệu chứng ban

đầu, mặc dù được điều trị hóa trị chuyên sâu và điều trị phẫu thuật Một bệnh nhân

tử vong trong năm 1984 với dấu hiệu bị chấn thương ở tay trong khi xử lý một con

cá da trơn, vết thương gây phù nề qua cẳng tay trong vòng chưa đầy 24 giờ cũng

được chẩn đoán do nhiễm P damselae (Clarridge, 1985) [22]

Mặc dù con người đã bị bệnh từ việc xử lý cá, điều quan trọng cần lưu ý là những người trong nhóm này đều có sức khoẻ bình thường Ngoài ra, phần lớn những người bị bệnh này chỉ khi có vết thương hở hoặc vết cắt ở tay khi tiếp xúc với mầm bệnh Các dữ liệu và quan sát cho thấy rằng nguy cơ gây hại cho sức khỏe con người lây nhiễm từ cá bệnh là dường như rất cao Những người suy giảm miễn dịch có nguy cơ lây nhiễm lớn hơn đặc biệt là nếu họ bị các vết cắt hoặc vết thương trong khi chế biến xử lý cá, và do đó các cá nhân nên thực hiện theo biện pháp phòng ngừa thích hợp, chẳng hạn như đeo găng tay và sử dụng xà phòng kháng

khuẩn [22] Điều quan trọng là phải nhận thức được nguy cơ tiềm ẩn gây ra bởi P damselae cho con người, thông tin cho đến nay cho thấy rằng rủi ro mắc bệnh

nhiễm khuẩn này là rất cao với người tiếp xúc trực tiếp với mầm bệnh

Hiện nay, trên thế giới đã xuất hiện rất nhiều trường hợp bệnh nhân bị nhiễm

P damselae với tỷ lệ tử vong cao Căn bệnh này lây lan nhanh thông qua tiếp xúc trực tiếp với vi khuẩn P damselae và là một mối đe dọa lớn đối với con người [22]

1.1.5 Dịch tễ học

Vi khuẩn P damselae tồn tại trong môi trường nước mặn, nước lợ và bắt

buộc phải có Na+ cho sự sống và không phát triển trên môi trường không có muối, chúng được tìm thấy quanh năm Số lượng vi khuẩn tăng lên tương quan với nhiệt

độ nước, vào mùa đông lượng vi khuẩn ít hơn và phân bố nhiều vào mùa ấm Có thể

phân lập khi sử dụng môi trường tăng sinh chọn lọc Vi khuẩn P damselae cũng

được phân lập từ lớp dịch nhầy, chất bẩn tích tụ trong lồng nuôi, hoặc từ mẫu nước

nuôi cá bị bệnh [22] Cá sống sót sau dịch bệnh có thể là nguồn mang mầm bệnh P damselae trong nước

Cá có thể được gây nhiễm bằng cách tiêm, ngâm, cho ăn thức ăn chứa vi khuẩn, nuôi chung cá khoẻ với cá bệnh

- Gen độc tố và các yếu tố gây bệnh:

P damselae (trước đây là Vibrio damselea) là một tác nhân gây bệnh của

một loạt các động vật biển như cá, động vật giáp xác, động vật thân mềm, các loài thú biển và con người (Kreger, 1984; Kothary & Kreger,1985; Cutter Kreger, 1990) [23] đã chứng minh rằng phospholipase-D dly (damselysin) và các chất độc tạo thành HlyApl và HlyAch đóng một vai trò chính trong độc lực cho homeotherms và poikilotherms Việc tìm ra các plasmid độc lực pPHDD1 mã hóa DLY và HlyApl đã có khả năng tạo cơ sở chính cho sự phát triển của một dòng gây dung huyết trong phân loài Các chủng tự nhiên thiếu pPHDD1 cũng có khả năng gây bệnh mạnh mẽ cho nhiều loài cá, cho thấy sự tồn tại của các yếu tố độc lực có

khả năng gây bệnh rất lớn Phân tích sâu hơn về trình tự bộ gen hoàn chỉnh của P damselae chắc chắn sẽ cung cấp một kết quả rõ ràng hơn về các yếu tố độc lực của

loại vi khuẩn gây bệnh này ở các phạm vi khác nhau [23]

Thành phần chính trong các sản phẩm ngoại bào có liên quan đến độc lực bao gồm các protease, hemolysins (Norqvist et al, 1990; Toranzo & Barja,1993) Những cơ chế này có thể gây phá hủy mô tế bào và gây xuất huyết, đóng một vai trò quan trọng trong sự xâm nhập của các vi khuẩn gây bệnh trong cơ thể cá (Finkelstein et al, 1992; Silva et al, 2003) Tuy nhiên, Osorio et al (2000a) đã chứng minh rằng sự có mặt của các sản phẩm ngoại bào này không phải là điều kiện quyết định cho khả năng phát sinh độc lực gây bệnh của chủng vi khuẩn này Một số protease trong sản phẩm ngoại bào của vi khuẩn, được coi là yếu tố độc lực ở nhiều

vi khuẩn gây bệnh (Ishihara et al, 2002; Miyoshi et al, 2002; Farto et al, 2006)

Protrease hạn chế sự hoạt động của enzym đã được phát hiện ở P damselae bao

gồm cả phosphatases, esteraza, amylase và glycosidases [34]

Nghiên cứu ban đầu đã chứng minh rằng ảnh hưởng lớn nhất của hoạt động

tiêu huyết của P damselae gây nguy hiểm cho chuột Các nghiên cứu khác đã báo

cáo rằng các chủng thiếu gen DLY vẫn cho thấy tính độc hại cho chuột và cá, điều

đó cho thấy DLY không phải là một điều kiện tiên quyết cho độc lực vi khuẩn này [25] Ngoài ra, các sản phẩm ngoại bào của chủng độc lực bất kể sự hiện diện của gen DLY cũng gây chết cho cá và chuột, cũng như gây độc cho người, cho thấy rằng các yếu tố độc lực không phải là gen DLY cũng có thể đóng một vai trò quan trọng trong yếu tố gây bệnh của vi khuẩn này, nhưng bản chất của chúng vẫn chưa được biết Các gen độc tố DLY, được nhân bản vô tính và trình tự của nó đã được xác định Tuy nhiên, bối cảnh của bộ gen dly vẫn khó nắm bắt, các quan sát ban đầu thấy rằng chủng cao huyết tán mang lại đột biến tự phát và giảm đáng kể hoạt động tán huyết khi đã bị mất gen DLY [34]

- Khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn P damselae

Theo nghiên cứu của Pasqualina Lagana và cộng sự (2011) [38], thử nghiệm

tính mẫn cảm của các chủng P damselae phân lập ở một số trang trại nuôi trồng thủy sản ở Ý cho thấy các chủng P damselae phân lập có khả năng kháng một số

loại kháng sinh bao gồm: Ampicillin, Carbenicillin, Kanamycin, Cefalothin; trong khi đó lại mẫn cảm với các loại kháng sinh gồm: Chloramphenicol, Nitrofurantoin

và Tobramycin

Theo nghiên cứu của (Toranzo et al., 1991; Bakopoulos et al., 1995; Sano, 1998) , các kháng sinh được sử dụng rộng rãi nhất để điều trị tụ huyết trùng bao gồm Amoxicillin, Chloramphenicol, Erythromycin, florfenicol, Flumequine, Acid oxolinic, Oxytetracycline, Nitrofurazone, trimethoprim sulfadiazine- và Tetracycline

Tuy nhiên, Thyssen và Ollevier (2001) đã nghiên cứu tính nhạy cảm với một

số kháng sinh của P damselae phân lập từ các khu vực địa lý khác nhau Cho

thấy, phần lớn (93%) các chủng kháng với Erythromycin, và một tỷ lệ thấp (dưới 10%) kháng với Amoxicillin, Ampicillin, Florfenicol và trimethoprim-

sulfamethoxazole Phần lớn các chủng vi khuẩn này rất nhạy cảm với Kanamycin, Florfenicol và Trimetho- prim-sulfamethoxazole

Nghiên cứu khả năng kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn gây bệnh là

cơ sở quan trọng để đưa ra các biện pháp phòng và điều trị bệnh trên cá nuôi biển Hiện nay, chưa có một công trình nghiên cứu nào trong nước công bố về khả năng

kháng kháng sinh của vi khuẩn P damselae phân lập tại Việt Nam

- Sự phân bố và lan truyền của bệnh:

Dịch bệnh thường xảy ra khi cá nuôi stress, nhiệt độ nước tăng, môi trường nước ô nhiễm, lượng oxy trong nước thấp dưới mức cho phép hoặc cá bị nuôi ở mật độ cao trong thời gian dài [12]

Về mặt lý thuyết thì bệnh lây nhiễm cho cá ở mọi lứa tuổi, kích cỡ từ giai đoạn ấu trùng, cá giống, đến cá nuôi thương phẩm

Bệnh ở giai đoạn cấp tính với đỉnh điểm tử vong trong khoảng từ 5 - 10 ngày khi nhiệt độ nước cao Tuy nhiên bệnh cũng có thể ở giai đoạn mãn tính khi nhiệt

Giảm nhiệt độ của nước: Khi nhiệt độ nước cao dễ tạo căng thẳng cho cá và

là điều kiện thuận lợi để vi khuẩn phát triển Vì vậy việc hạ thấp nhiệt độ nước có thể được thực hiện trong hệ thống nuôi nước tuần hoàn nơi mà nhiệt độ nước được kiểm soát Đối với những ao nuôi có kích thước nhỏ có thể dùng lưới che nắng để giảm bớt nhiệt độ nước Sử dụng máy quạt nước vào ban đêm cũng là cách làm

giảm nhiệt độ nước và tăng lượng oxy [12]

Điều trị bằng kháng sinh: Kháng sinh chỉ có thể điều trị bệnh ở giai đoạn sớm của bệnh Tuy nhiên trong hầu hết các trường hợp cho cá ăn kháng sinh không hiệu quả bởi cá bị nhiễm bệnh sẽ chán ăn, giảm ăn Hơn nữa những người nuôi cá cho biết thuốc kháng sinh chỉ có thể làm giảm tỷ lệ tử vong trong thời gian sử dụng

và khi thuốc kháng sinh đã hết thì tỷ lệ chết lại tăng trở lại Tuy nhiên việc sử dụng kháng sinh cần được chú ý vì sử dụng kháng sinh liên tục với liều lượng cao dần sẽ gây ra hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn và ảnh hưởng đến dư lượng kháng sinh

tồn dư trong thịt cá [12]

Thường dùng các loại kháng sinh diệt khuẩn phổ rộng hay diệt khuẩn gram

âm với tác dụng toàn thân có hiệu quả điều trị tốt Amoxicillin, Chloramphenicol, Erythromycin , Florfenicol, Flumequine, Acid oxolinic, Oxytetracycline,

Nitrofurazone, Trimethoprim sulfadiazine- và Tetracycline [22]

Rất nhiều nghiên cứu Vacxin phòng bệnh do P damselae đã được công

bố nhưng cho đến hiện nay vẫn chưa có Vacxin thương mại

1.2 Lịch sử phát hiện bệnh do vi khuẩn Photobacterium damselae

1.2.1 Lịch sử phát hiện bệnh trên thế giới

Bệnh tụ huyết trùng (Pseudotuberculosi) hay còn được gọi là xuất huyết

nhiễm trùng, gây ra bởi vi khuẩn ưa mặn Photobacterium damselae (P.damselae)

Nó lần đầu tiên được phân lập từ các quần thể cá rô trắng (Morone americanus) hoang dã và cá vược (M saxatilis) vào năm 1963 ở vịnh Chesapeake, Hoa Kỳ, hiện

là tác nhân gây bệnh của nhiều loại cá biển Căn bệnh này có ảnh hưởng lớn về kinh

tế cả ở Nhật Bản, và ở khu vực Địa Trung Hải, do nó gây ra thiệt hại trong các trang trại cá tráp và cá chẽm [40] Từ năm 1969, căn bệnh này đã là một trong những bệnh nguy hiểm tại Nhật Bản (Kusuda & Yamaoka, 1972) Từ năm 1990 nó đã gây

ra thiệt hại về kinh tế ở các nước châu Âu khác nhau trong đó có Pháp, Ý, Tây Ban

Nha, Hy Lạp, Thổ Nhĩ Kỳ, Bồ Đào Nha và Malta [37]

Bệnh lý bùng phát phụ thuộc vào nhiệt độ và thường xảy ra khi nhiệt độ nước tăng lên trên 18-20 C Dưới nhiệt độ này, cá ở tình trạng ủ bệnh (Romalde, 2002)

Vi khuẩn P.damselae có khả năng tuân thủ và xâm nhập vào tế bào biểu mô

cá Khả năng xâm nhập này đã được chứng minh trước đây bởi Magariños et al (1996) và Yoshida et al (1997) Tuy nhiên, đây là nghiên cứu đầu tiên của động

học và độ đặc hiệu của quá trình này Hình ảnh bằng chứng của giai đoạn trong

tế bào của P.damselae bên trong tế bào biểu mô cá được cung cấp bởi các quan

sát bằng kính hiển vi điện tử và kỹ thuật huỳnh quang hiển vi ánh sáng Với đặc tính chọn lọc diệt vi khuẩn ngoại bào, kháng sinh Gentamycin được sử dụng trong các xét nghiệm Gentamycin để xác nhận sự xâm nhập vào biểu mô cá của

P.damselae [31]

1.2.2 Lịch sử phát hiện bệnh ở Việt Nam

Ở Việt Nam, một số loài cá thuộc họ các mú, cá giò, cá vược cũng đã phát

hiện sự hiện diện của P.damselae Trong đó có các loài E.coioides, E.fuscogutatus, E.tauvina, E.lanceolatus, E.malabaricus ở Khánh Hoà; loài E.coioides ở Cát Bà

(Hải Phòng) và Cửa Hội (Nghệ An) Bệnh tụ huyết trùng trên cá biển tại Việt Nam

được báo cáo lần đầu tiên vào năm 2002 trên cá mú (Epinephelus spp) nuôi lồng

trên vịnh Hạ Long Kết quả điều tra ở huyện Vân Đồn, Quảng Ninh (2002) có số lồng bị bệnh Bệnh xuất hiện từ tháng 5 đến tháng 10, nhiệt độ thích hợp bệnh phát triển 25-300

Biểu hiện bệnh lý bên ngoài cho thấy khi mắc bệnh, cá thường bỏ ăn, màu sậm

đi, mang và nội tạng xuất huyết Bệnh cấp tính cá chết sau 3-5 ngày với tỉ lệ cao, có thể từ 80-100%

1.3 Tổng quan về tạo chủng vi khuẩn nhược độc

1.3.1 Tình hình nghiên cứu tạo chủng vi khuẩn nhược độc

1.3.1.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Ở các nước có nghề nuôi cá biển phát triển như Na Uy, Mỹ, Nhật Bản, việc nghiên cứu và sử dụng vắc-xin cho cá được đầu tư nghiên cứu từ rất sớm và đạt

được nhiều thành công Thử nghiệm vắc-xin vi khuẩn để phòng bệnh cho cá được công bố đầu tiên bởi Duff (1942).Trong nghiên cứu này, cá hồi sau khi ăn vi khuẩn

Aeromonas salmonicida bất hoạt bằng chloroform đã có khả năng kháng bệnh lở

loét Furunculosis Năm 1970, vắc-xin thương mại đầu tiên được sản xuất từ vi khuẩn Vibrio bất hoạt bằng formalin phòng bệnh lở miệng (ERM) và Vibriosis đã thành công tại Mỹ và đã làm giảm đáng kể lượng kháng sinh sử dụng cho nghề nuôi

cá hồi tại đây Tiếp đó, nhằm nâng cao hiệu quả bảo hộ cho cá nuôi, vắc-xin tiêm có

bổ sung chất bổ trợ (adjuvant) ra đời trong những năm đầu 1990 Ngoài vai trò như một chất kích thích miễn dịch không đặc hiệu, các chất bổ trợ còn giữ cho kháng nguyên được phóng thích từ từ trong cơ thể vật chủ, kéo dài thời gian tiếp xúc của vật chủ với kháng nguyên, xác lập tính nhớ và kích thích sinh kháng thể đặc hiệu trong thời gian dài Sau đó, nhiều loại vắc-xin vi khuẩn cho cá với các phương thức chế tạo khác nhau đã được nghiên cứu như vắc-xin bất hoạt kết hợp đa kháng nguyên, vắc-xin sống nhược độc, vắc-xin có bổ sung các loại chất bổ trợ khác nhau… Việc sử dụng vắc-xin phòng bệnh đã đem lại những thành công vượt bậc cho nghề nuôi cá ở nhiều nước

Trong vài năm trở lại đây, các nghiên cứu vắc-xin phòng bệnh cho cá mú bắt đầu được chú ý, tập trung tại các nước Châu Á như Hàn Quốc, Nhật Bản, Trung

Quốc, Đài Loan, Thái Lan Vắc-xin vi khuẩn V harveyi bất hoạt đã làm giảm tỷ lệ chết ở nhóm cá mú E bruneus tiêm vắc-xin (35 %) so với nhóm đối chứng (90 %) Vắc-xin tổ hợp từ 2 loài vi khuẩn V harveyi và V parahaemolyticus bất hoạt

formalin đã được thử nghiệm trên cá mú chấm cam tại Thái Lan, kết quả cho thấy hiệu quả bảo hộ đạt đến 77,6 % Tuy nhiên, vắc-xin từ vi khuẩn bất hoạt thường cho hiệu quả bảo hộ trong thời gian ngắn

Nhìn chung, trên thế giới, nhiều loại vắc-xin phòng bệnh cho cá nuôi đã được nghiên cứu và sản xuất, từ loại vắc-xin đơn giản như vắc-xin bất hoạt (inactivated), đến vắc-xin có công nghệ sản xuất phức tạp như vắc-xin nhược độc (live attenuated), vắc-xin đa giá (multivalent), vắc-xin tiểu phần (sub-unit vắc-xin) Mỗi loại vắc-xin có qui trình sản xuất, cách sử dụng cũng như công hiệu khác nhau

trên các loài cá Tuy nhiên, có rất ít những loại vắc-xin được thương mại hóa ra thị trường hiện nay

1.3.1.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Ở Việt Nam, tình hình nghiên cứu về miễn dịch và vắc-xin cho cá vẫn còn khá mới mẻ Vài công trình nghiên cứu miễn dịch trên cá chỉ mới bắt đầu thực hiện trong những năm gần đây, chủ yếu tập trung trên các đối tượng cá nước ngọt như cá

trắm cỏ, cá tra…Liên quan đến bệnh gan thận mủ do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây ra trên cá tra Pangasianodon hypophthalmus ở đồng bằng sông Cửu Long, Vũ Thị Thanh Hương và công sự (2011) thông báo đã tạo được chủng vi khuẩn E ictaluri nhược độc thành công bằng phương pháp sử dụng kháng sinh Rifampicin

gây đột biến gen purA Mặt khác, hai loại protein ngoại mạc của vi khuẩn này là OmpA và OmpN được chứng minh là có khả năng gây kích thích miễn dịch ở cá và khuyến nghị sử dụng làm nguyên liệu cho sản xuất vắc-xin tiểu phần phòng bệnh gan thận mủ ở cá tra Qua nhiều năm nghiên cứu, vắc-xin Alphaject Panga-1 phòng bệnh gan thận mủ cho cá tra đã ra đời và thử nghiệm thành công trên cá tra tại 3 tỉnh Đồng Tháp, An Giang và Bến Tre Kết quả thử nghiệm đã chứng minh vắc-xin này

là an toàn cho cá, giúp cá tạo kháng thể đặc hiệu chống lại vi khuẩn với hệ số bảo

hộ từ 50– 64,7%

Tại An Giang, Trương Ngọc Thùy Liên, Vũ Thị Thanh Hương, Trần Thanh

Tiếng, Nguyễn Quốc Bình (2014), Tạo thành công chủng aeromonas hydrophila đột biến nhược độc Bằng phương pháp knock-out gen aroa, bệnh nhiễm trùng huyết

do aeromonas hydrophila Chủng M25 A hydrophila đột biến bất hoạt gen aroA có

độc lực thấp hơn nhiều (>1.000 lần) so với chủng hoang dã ban đầu được kiểm tra lại bằng cách gây nhiễm lại trên cá hồi

Nhìn chung, gần đây những nghiên cứu miễn dịch cá và vắc-xin vi khuẩn phòng bệnh cho cá ở Việt Nam đã được quan tâm nhiều hơn Tuy nhiên, số lượng công trình nghiên cứu còn rất hạn chế, các nghiên cứu cơ bản về miễn dịch trên các đối tượng cá biển có giá trị kinh tế vẫn chưa được thực quan tâm đúng mức, có rất ít sản phẩm vắc-xin thương mại phòng bệnh cho cá xuất hiện trên thị trường

1.3.2 Các phương pháp làm giảm độc vi khuẩn

Vi sinh vật giảm độc lực là những vi sinh vật đã được làm giảm độc lực không còn khả năng gây bệnh nhưng có khả năng tạo đáp ứng miễn dịch mạnh, thời gian duy trì đáp ứng miễn dịch dài

- Giảm độc bằng nhiệt độ Vi sinh vật gây bệnh thường mẫn cảm với yếu tố

nhiệt độ, nếu nuôi cấy chúng ở nhiệt độ không phù hợp, vi sinh vật sẽ giảm độc lực nhưng vẫn giữ được tính kháng nguyên

Vắc-xin nhiệt thán: Nuôi vi khuẩn nhiệt thán ở nhiệt độ 42,5- 43ºC từ 15-20 ngày, vi khuẩn mất khả năng hình thành giáp mô, độc lực giảm, sử dụng làm giống gốc sản xuất vắc-xin

Vắc-xin Sabin dạng uống chống bại liệt: Chọn các chủng virus bại liệt đã đột biến, cho nhân lên nhiều lần trong tế bào thận khỉ, nuôi cấy ở nhiệt độ thấp Virus có thể nhân lên trong tuyến nước bọt đường tiêu hóa nhưng không xâm nhập được vào

mô thần kinh do đó không gây chứng bại liệt nữa

- Giảm độc bằng yếu tố hóa học

Vắc-xin BCG (Bacillus Calmette Guerin) là chủng trực khuẩn lao bò

Mycobacterium tuberculosis bovis có độc lực cao, nuôi cấy trong môi trường có mật

bò trong 13 năm sau 231 lần cấy chuyển, vi khuẩn đã không còn độc, được sử dụng

để sản xuất vắc-xin BCG phòng bệnh lao cho con người

Vắc-xin nhiệt thán nhược độc giáp mô được chế bằng cách: Vi khuẩn nhiệt thán nuôi cấy trong môi trường CO2, vi khuẩn không có khả năng hình thành giáp

mô Nếu đem vi khuẩn đó nuôi cấy tiếp ở môi trường có đủ O2 thì vi khuẩn lại hình thành giáp mô, nhưng độc lực yếu không có khả năng gây bệnh được sử dụng làm vắc-xin

- Giảm độc bằng phương pháp sinh vật học

Đây là phương pháp giảm độc vi sinh vật cổ điển, phần lớn vắc-xin virus sử dụng cho người, động vật được sản xuất theo phương pháp này Vi sinh vật gây bệnh được cấy chuyển nhiều đời qua môi trường ít mẫn (động vật thí nghiệm hoặc môi trường nuôi tế bào hoặc phôi gia cầm) Vi sinh vật không đủ điều kiện để thực

hiện đầy đủ chu kỳ sống nên thay đổi hệ gen để thích nghi với điều kiện sống mới,

do đó vi sinh vật thay đổi về độc lực và khả năng gây bệnh

- Giảm độc bằng kỹ thuật gen

Tái tổ hợp hệ gen (genome)

Virus tái tổ hợp hệ gen được tạo ra bởi kỹ thuật gây nhiễm đồng thời hai chủng virus khác nhau vào cùng một cơ thể vật chủ, virus mới tạo thành sẽ có bộ gen chứa cả gen của hai chủng virus bố mẹ Ví dụ chủng Rotaviruses tái tổ hợp sử dụng làm vắc-xin tiêm phòng cho con người được tạo thành từ sự trao đổi gen của các chủng gây bệnh trên động vật, hoặc virus cúm tái tổ hợp được tạo ra từ một chủng virus cúm cung cấp các gen mã hóa các glycoprotein bề mặt miễn dịch (hemagglutinin và neuraminidase) và một chủng nhược độc Tuy nhiên, vắc-xin Rotavirus tái tổ hợp theo phương pháp này có khả năng gây hội chứng lồng ruột với

tỷ lệ cao (1/10.000) ở người được tiêm phòng, vì vậy, vắc-xin này đã bị ngừng cấp phép sản xuất Tác dụng không mong muốn này cho thấy an toàn là một thách thức lớn trong quy trình sản xuất vắc-xin sống

Xóa hoặc cắt gen độc

Chủng nhược độc tái tổ hợp được tạo ra bằng cách sửa đổi hoặc xóa bỏ các gen độc tố vì vậy khó có khả năng tái trở lại tính độc Đây là giải pháp khắc phục được nhược điểm của vi sinh vật được gây nhược độc bằng phương pháp truyền thống Các kỹ thuật tạo chủng vi khuẩn nhược độc tái tổ hợp phức tạp hơn so với

virus do kích thước lớn hơn của hệ gen vi khuẩn

Tạo vector tái tổ hợp

Vector tái tổ hợp được tạo ra trên nguyên lý sử dụng một chủng virus làm vector để gắn đoạn gen mã hóa polypeptid từ các tác nhân gây bệnh khác Polypeptid tái tổ hợp được biểu hiện trong các tế bào bị nhiễm virus và được vận chuyển đến bề mặt tế bào để kích thích sản xuất kháng thể dịch thể hoặc bị phá vỡ thành các mảnh peptid để trình diện cho tế bào lympho T độc Mục đích của việc tạo

ra vector là để trình diện kháng nguyên với hệ thống miễn dịch thông qua việc gây nhiễm với một vi sinh vật tái tổ hợp sống, từ đó kích thích hệ thống miễn dịch tạo ra đáp ứng mạnh hơn, bao gồm cả miễn dịch dịch thể và tế bào

Nguyên mẫu của vector virus là virus đậu bò, virus này được cắt các gen gây độc để không có khả năng gây bệnh cho người Hàng chục các kháng nguyên tái tổ hợp khác nhau được biểu hiện bằng virus này, ví dụ kháng nguyên của vi khuẩn

Brucella abortus, Listeria monocytogenes, thậm chí là các kháng nguyên khối u

Bên cạnh đó, một số loài virus khác cũng được sử dụng để làm vector tái tổ hợp biểu

hiện kháng nguyên như Adenovirus, Alphaviruses Adenovirus được sử dụng để thiết

kế các vector tái tổ hợp phục vụ sản xuất vắc-xin phòng các bệnh hô hấp cấp tính

Vi khuẩn gây bệnh cũng có thể được thiết kế thành vector sống tái tổ hợp để biểu hiện các kháng nguyên có bản chất polypeptid Các loài vi khuẩn được sử dụng

làm vector là Salmonella typhimurium, V cholerae và S flexneri chủ yếu để sản

xuất các vắc-xin đường uống Vắc-xin tái tổ hợp nhược độc được sản xuất theo công nghệ này đòi hỏi phải có hai đặc tính: 1) giữ được khả năng lây nhiễm trong đường ruột và 2) biểu hiện ở mức thích hợp các polypeptid kháng nguyên để kích thích tạo

ra đáp ứng miễn dịch bảo hộ vật chủ Bên cạnh đó, một số các loài vi khuẩn nội bào cũng đang được nghiên cứu để thiết kế thành vector tái tổ hợp, tạo đáp ứng miễn dịch tế bào

Tia cực tím (hay tia tử ngoại, tia UV), (tiếng Anh là Ultraviolet) Là sóng

điện từ có bước sóng ngắn hơn ánh sáng nhìn thấy nhưng dài hơn tia X Phổ tia cực tím có thể chia ra thành tử ngoại gần (có bước sóng từ 380 đến 200 nm) và tử ngoại

xạ hay tử ngoại chân không (có bước sóng từ 200 đến 10 nm) [49]

Tia cực tím có thể khử khuẩn vì tác dụng rất mạnh trên Nucleo Protein của vi khuẩn, nó có thể làm biến dạng hoặc giết chết vi khuẩn Hiệu lực tiệt khuẩn của tia cực tím không những tuỳ thuộc mật độ, thời gian chiếu tia, điều kiện môi trường mà

còn tùy thuộc vào sức chịu đựng của vi khuẩn Ngoài ra do tác dụng của tia cực tím, không khí c1ó thể sinh ra Ozon cũng có khả năng tiêu diệt vi khuẩn

Trong tế bào, các chất hữu cơ có mạch vòng chủ yếu như purin và pyrimidin hấp thu trực tiếp tia tử ngoại Mối liên quan chặt chẽ giữa tia tử ngoại và các cấu phần của ADN đã được chứng minh ADN hấp thu tia tử ngoại mạnh nhất ở bước sóng 2537Ǻ (~254nm), đây chính là bước sóng làm tăng tần số đột biến [49]

Tia UV gây ra sự biến đổi quang oxy hóa các gốc purin và pirimidin Tác động của tia UV làm cho adenine (A) bị biến thành hypoxantin, dẫn đến những thay đổi hóa học của DNA Tia UV làm cho các base thymin gần nhau trên phân tử DNA liên kết với nhau tạo dimer thymin, gây méo mó phân tử DNA Nếu phân tử DNA

có nhiều dimer thynin có thể làm mất khả năng tái bản của DNA

Hình 1.2 Tác động của tia tử ngoại tạo các dimer thymine

Dưới tác động của tia tử ngoại, cytosin gắn thêm phân tử nước vào liên kết

C= C của mạch vòng (Hình 1.2) và thymine bị đứt liên kết C = C mạch vòng nối 2

phân tử thành thymine dimer

Ston và các cộng sự đã nhận thấy tần số đột biến tăng lên ở Staphylococcus aureus khi môi trường nuôi chúng được chiếu tia UV trong thời gian ngắn trước khi

cấy vào Đây là tác động gián tiếp của tia tử ngoại

Có thể khi hiện diện oxy, tia tử ngoại tạo ra nhiều hơn các gốc peroxit:

Hình 1.3 Tác động tia UV làm cho DNA có một chỗ phình trong cấu trúc

Tia cực tím gây hại cho DNA của sinh vật Một trong những cách phổ biến nhất tác động liên kết bất thường giữa 2 đơn phân kế cận thay vì giữa các đơn phân

bổ sung trên 2 mạch đối nhau (tạo bậc thang) Kết quả là DNA có một chỗ phình trong cấu trúc và nó không còn có thể thực hiện những chức năng bình thường nữa [49]

Trong các tế bào sống một số enzyme có khả năng làm đứt mạch trùng phân của dimer thymin khôi phục chức năng của DNA Do đó khi tia UV tác động thường ít làm chết mà tạo nên các đột biến

Độ sống sót của các tế bào vi sinh vật phụ thuộc vào liều lượng hấp thụ tia

UV Độ đậm đặc của dịch huyền phù được chiếu tia UV ảnh hưởng rõ rệt đến tần số đột biến Dịch huyền phù quá đậm đặc ( lớn hơn 1.108

tế bào/ml ) tia UV bị các tế

bào che lấp lẫn nhau hiệu quả hấp thụ tia UV không cao, ngược lại dịch huyền phù quá loãng dễ gây chết các tế bào khi chiếu Tác động gây chết tế bào và gây đột biến của tia UV còn phụ thuộc nhiều vào trạng thái sinh lý của các tế bào, tuổi giống, loài sinh vật…

1.3.3.2 Tác nhân hóa học

Tác nhân hóa học axit nitrơ (HNO2) Các hợp chất gây ankyl hoá Các chất nhóm acridin Các chất đồng đẳng của base nitơ [24]

Rifampicin

Rifampicin lần đầu tiên được phân lập năm 1957 từ quá trình lên men của

Streptomyces mediterranei tại phòng thí nghiệm của Gruppo Lepetit SpA tại Milan

bởi hai nhà khoa học đặt tên là Piero Sensi và Maria Teresa Timbal, làm việc với các nhà khoa học Israel Pinhas Margalith

Rifampicin (Rif) là một trong các kháng sinh có phổ kháng khuẩn rộng, tiềm năng trong việc chống lại các tác nhân gây bệnh, được sử dụng lần đầu tiên làm thuốc chữa bệnh lao và có tác dụng rút ngắn thời gian điều trị bệnh lao bằng liệu pháp hóa học [24], Rif là kháng sinh bán tổng hợp từ kháng sinh tự nhiên Rif B lấy

từ môi trường nuôi cấy Streptomyces mediterian, có hoạt tính kháng sinh, có tác

dụng diệt khuẩn

Rif có khả năng khuếch tán tự do trong mô, tế bào sống và vi khuẩn làm cho

Rif có hiệu quả cao trong việc chống lại các chất độc nội bào như Mycobacterium tuberculosis Dựa vào đặc điểm này, Rif được sử dụng khá phổ biến trong việc gây nhược độc vi khuẩn Escherichia coli, Flavobacterium psychrophilum, E ictaluri,…[21], [24] Và điều này đã được chứng minh bởi sản phẩm Edwardsiella ictaluri kháng Rif (RE–33) đã được đăng ký bản quyền (US patent No 6019981) và

sử dụng là vaccine sống nhược độc ở dạng thương mại với tên gọi AQUAVAC – ESC™ Bên cạnh đó nhóm tác giả Benjamin R Lafrentz, Scott E Lapatra, Douglas R.Call và Kenneth D Cain (2008) qua nghiên cứu của mình về “Phân lập

chủng Flavobacterium psychrophilum kháng Rifampicin và hiệu lực của vaccine sống nhược độc” đã chứng minh chủng Flavobacterium psychrophilum 259-93B.17

kháng Rifampicin có thể đáp ứng như một vaccine sống nhược độc cho việc ngăn

chặn việc nhiễm Flavobacterium psychrophilum gây bệnh Vi khuẩn nước lạnh

Hoạt tính diệt vi khuẩn của Rif dựa vào ái lực liên kết và ức chế DNA vi khuẩn – phụ thuộc vào hoạt tính RNAP thông qua khả năng ức chế giai đoạn đầu

của quá trình sinh tổng hợp RNA ở E.coli [24], [33], RNAP của vi khuẩn được cấu

thành bởi các tiểu đơn vị α2, β, β’, ω có khối lượng phân tử khoảng 400 kDa và được bảo tồn qua các thế hệ sinh vật [29]

Hình 1.4: Cấu trúc RNA polymerase (RNAP)

Các đột biến liên quan đến kháng Rif chỉ xảy ra đối với đoạn gen rpoB – mã hóa cho tiểu đơn vị β của phân tử RNAP Đột biến kháng rifampicin xảy ra ở 4 vùng của gen rpoB: vùng N, vùng I, vùng II, vùng III, tuy nhiên những vị trí đột biến chính, xảy ra ở vùng I [33]

Hình 1.5 Vùng kháng Rif của tiểu đơn vị β RNAP [13]

Những đột biến kháng Rif được chỉ ra cho E coli và M tuberculosis như

sau: ∆ là vị trí mất amino acid, Ω là vị trí chèn amino acid và những chấm màu là vị trí amino acid được thay thế Màu vàng: gốc tương tác trực tiếp với Rif, màu xanh lá: gốc tương tác xa với Rif, màu tím: 3 vị trí này được thay thế với tần suất cao

ở M tuberculosis kháng Rif

Hình 1.6 Đột biến kháng Rif ở vùng I của gen rpoB

Những vị trí thay thế amino acid xảy ra ở B anthracis (màu đỏ), B

cereus (màu xanh), B subtilis (màu xanh lá cây), E coli (màu tím), và M

tuberculosis (xanh lợt), những vị trí mất amino acid là những khung được khoanh lại (ví dụ amino acid V được thay thế cho những vị trí amino acid bị mất ở E coli),