TỔNG QUAN
Tăng acid uric máu
1.1.1 Sinh tổng hợp và chuyển hóa acid uric
Acid uric là sản phẩm cuối cùng của quá trình chuyển hóa purin, bao gồm cả purin ngoại sinh và nội sinh Chế độ ăn uống đóng vai trò quan trọng trong việc sản xuất acid uric, điều này đã được các nhà nghiên cứu châu Âu ghi nhận từ kinh nghiệm trong hai cuộc chiến tranh thế giới Sự gia tăng bệnh gout ở Nhật Bản từ sau Thế chiến thứ II, với lượng protein đầu người tăng gấp đôi, minh chứng cho mối liên hệ này Sản xuất acid uric nội sinh chủ yếu diễn ra tại gan, ruột và các mô khác như cơ bắp, thận và nội mô mạch máu.
Acid uric ở người bình thường chủ yếu được bài tiết qua thận, chiếm khoảng 2/3 tổng lượng acid uric sản sinh mỗi ngày Một phần nhỏ nhưng đáng kể của acid uric cũng được bài tiết qua dịch tiêu hóa vào ruột, trong khi lượng acid uric bài tiết qua mồ hôi chỉ chiếm dưới 1% tổng lượng.
Acid uric là một hợp chất hữu cơ dị vòng có công thức C 5 H 4 N 4 O 3 (7,9- dihydro-1H-purine-2,6,8 (3H) -trione), trọng lượng phân tử 168 Dalton
Several enzymes are involved in the conversion of the purine nucleic acids adenine and guanine into uric acid, including deaminase, nucleotidase (NT), purine nucleoside phosphorylase (PNP), xanthine oxidase (XO), and hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase (HGPRT).
Hình 1 2: Quá trình hình thành acid uric trong cơ thể [33]
Tăng acid uric máu xảy ra khi nồng độ acid uric vượt quá giới hạn hòa tan của urat trong dung dịch natri, cụ thể là trên 7,0 mg/dl (420 μmol/l) đối với nam giới và trên 6,0 mg/dl (360 μmol/l) đối với nữ giới.
Tại Mỹ, tỷ lệ tăng acid uric máu (> 0,40 mmol/l hoặc 6,8 mg/dl) là 14,6% dân số, tương đương khoảng 32,5 triệu người, với sự phổ biến cao hơn ở nam giới (24,7%) so với nữ giới (5,2%) Ngoài ra, tình trạng tăng acid uric máu cũng ít phổ biến hơn ở người Mỹ gốc Mexico so với người da trắng và người Mỹ gốc Phi.
▪ Tại Trung Quốc, tỷ lệ tăng acid uric máu chiếm 18,1% dân số, trong đó, 16,0% đối với nam giới và 19,4% đối với nữ giới Tỷ lệ tăng acid uric máu
5 của người Hán thấp hơn một chút so với các nhóm dân tộc khác (18,0% so với 19,5%) [41]
Nghiên cứu Yamagata (2016) tại Nhật Bản cho thấy nồng độ acid uric huyết thanh tăng cao, với tỷ lệ 17,4% ở nam giới và 2,2% ở nữ giới, liên quan đến tỷ lệ tử vong trong dân số Nhật Bản.
Nghiên cứu tại Việt Nam cho thấy mối liên hệ giữa tăng acid uric máu và bệnh tiểu đường type 2, chỉ ra rằng nồng độ acid uric cao hơn đáng kể ở những người bị rối loạn đường huyết lúc đói, rối loạn dung nạp glucose, và tiểu đường, so với nhóm có dung nạp glucose bình thường Tuy nhiên, không có sự khác biệt rõ rệt về nồng độ acid uric giữa nhóm dung nạp glucose bình thường và nhóm dung nạp glucose kém Đặc biệt, nam giới có tỷ lệ tăng acid uric máu cao hơn nữ giới trong cả ba nhóm này.
Tăng acid uric có sự khác biệt giữa các quốc gia và tộc người, cũng như giữa người khỏe mạnh và những người có bệnh lý kèm theo Đặc biệt, tỷ lệ tăng acid uric thường cao hơn ở nam giới so với nữ giới.
1.1.2.3 Nguyên nhân tăng acid uric máu
Nguyên nhân gây tăng acid uric máu là do tăng sản xuất acid uric, thận giảm bài tiết acid uric hoặc kết hợp cả hai nguyên nhân trên [42, 74]
Tăng tổng hợp acid uric dưới 5% có thể do nhiều nguyên nhân, bao gồm khiếm khuyết enzym, hoạt động quá mức của phosphoribosilpyrophosphate synthetase, và giảm hoạt động của hypoxanthine phosphoribosiltransferase Ngoài ra, các bệnh lưu trữ glycogen loại I, III, V, VII cũng góp phần vào tình trạng này, cùng với các bệnh lý dẫn đến sản xuất purine quá mức như rối loạn tủy, bệnh ác tính, tan máu và bệnh vẩy nến Các yếu tố khác như tăng dị hóa hoặc giảm tổng hợp ATP, nghiện rượu, thiếu oxy mô, tập thể dục cơ bắp quá mức, cũng như thói quen ăn uống và tác động của thuốc có thể làm tăng tổng hợp acid uric.
B12, fructose, tiêu thụ purine quá mức
Giảm bài tiết acid uric ở thận có thể lên đến hơn 95% và thường liên quan đến các yếu tố như khiếm khuyết di truyền trong chức năng ống thận, các tình trạng bệnh lý như suy thận, mất nước, nhiễm toan, bệnh cường cận giáp, suy giáp, hội chứng Bartter, và sản giật Ngoài ra, thói quen ăn uống không lành mạnh, việc sử dụng thuốc lợi tiểu, ethanol, pyrazinamid, lạm dụng thuốc nhuận tràng, và salicylat ở liều thấp cũng có thể góp phần làm giảm bài tiết acid uric.
Tăng tổng hợp và giảm đào thải acid uric bao gồm: nghiện rượu, thiếu men
Glucose-6-phosphatase, thiếu men Fructose-1-phosphate-aldolase
1.1.2.4 Hậu quả tăng acid uric máu
▪ Tăng acid uric máu và bệnh gout
Khi nồng độ acid uric trong máu vượt quá 7 mg/dl, urat sẽ kết tủa thành các vi tinh thể mono sodium urat, gây ra tổn thương tại nhiều vị trí khác nhau Các vi tinh thể này lắng đọng tại mô mềm và tạo thành hạt tophi, dẫn đến cơn gout cấp khi các hạt này vỡ ra tại sụn khớp Sự lắng đọng vi tinh thể cạnh khớp và trong mô sụn, mô xương có thể gây ra bệnh xương khớp mạn tính do gout Cuối cùng, viêm thận kẽ, hay bệnh thận do gout, xảy ra do tinh thể urat lắng đọng tại tổ chức kẽ của thận.
▪ Tăng acid uric máu và các bệnh khác liên quan
Nghiên cứu dịch tễ học cho thấy rằng mức acid uric máu cao có liên quan đến nhiều bệnh lý như đái tháo đường, rối loạn lipid máu, béo phì, tăng huyết áp, bệnh tim mạch và hội chứng chuyển hóa.
Như vậy, hạ acid uric máu là một mục tiêu điều trị trong bệnh gout và các bệnh lý khác liên quan đến tăng acid uric máu
1.1.3 Vai trò enzym xanthine oxidase trong quá trình tổng hợp acid uric
Vào năm 1902, Schardinger và các cộng sự đã phát hiện ra một chất chưa xác định trong sữa tươi nguyên chất, có khả năng làm mất màu xanh metylen khi thêm formaldehyd Gần 20 năm sau, chất này cũng được phát hiện trong sữa bò.
Gan, thận, lá lách và phổi của chuột có khả năng chuyển đổi hypoxanthin thành xanthin và sau đó thành urate trong cả điều kiện hiếu khí và kỵ khí Phát hiện này đã thu hút sự chú ý lớn từ các nhà nghiên cứu enzym và sinh hóa, dẫn đến việc phân lập, tinh chế và nghiên cứu enzyme xanthin oxyoreductase (XOR).
Enzym XO được phát hiện ở nhiều loài động vật có vú, chim, bò sát và vi khuẩn Trong số các động vật có vú đã được nghiên cứu, enzym này tồn tại trong gan, ruột, thận, phổi, cơ tim, não, huyết tương và hồng cầu Đặc biệt, gan và ruột cho thấy hoạt động XOR cao nhất.
Enzym xanthine oxidase
1.2.1 Cấu trúc, đặc điểm lý hóa
Xanthine oxidase là một protein có khối lượng khoảng 300 kDa, bao gồm hai tiểu đơn vị Mỗi tiểu đơn vị chứa bốn trung tâm oxy hóa khử, bao gồm một phần phụ molybden (Mo-co), một FAD và hai trung tâm Fe/S (Fe 2 S 2) Phần phụ molybden gồm một dẫn xuất pterin hữu cơ liên kết cộng hóa trị với hai nguyên tử lưu huỳnh của molybdopterin, hai nguyên tử oxy và một nguyên tử lưu huỳnh khác.
Hình 1 3: Cấu trúc không gian xanthine oxidase FAD (màu đỏ), Fe2S2 (màu cam), phần phụ molypden (màu vàng)
Enzym XO xúc tác hydroxyl hóa hypoxanthin thành xanthin và xanthin thành acid uric tại trung tâm Mo-co Trong quá trình oxy hóa, proton từ nhóm Mo-OH tấn công cơ chất, chuyển hai electron từ Mo VI sang Mo IV Electron được vận chuyển nhanh chóng đến FAD qua hai trung tâm Fe/S, tạo ra Mo V Cuối cùng, Mo V được tái sinh bởi hydroxyd từ dung môi khi phản ứng kết thúc.
Hình 1 4: Cơ chế hoạt động của xanthine oxidase [20]
1.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của enzym xanthine oxidase
Khi nồng độ cơ chất xanthin tăng, tốc độ phản ứng cũng tăng theo, dẫn đến lượng acid uric được tạo ra nhiều hơn Tuy nhiên, khi enzym đã bão hòa cơ chất, tốc độ phản ứng sẽ không còn tăng thêm nữa.
Nồng độ enzym ảnh hưởng trực tiếp đến tốc độ phản ứng; khi nồng độ enzym tăng, tốc độ phản ứng cũng tăng theo Tuy nhiên, khi đạt đến một ngưỡng nhất định, sự gia tăng sản phẩm sẽ tác động vào trung tâm dị lập thể của enzym, dẫn đến hiện tượng bão hòa và tốc độ phản ứng sẽ không còn tăng nữa.
Nhiệt độ ảnh hưởng lớn đến hoạt động của enzym, với việc tăng 10°C có thể làm tăng tốc độ phản ứng gấp 2-3 lần Tuy nhiên, nếu nhiệt độ quá cao, enzym sẽ bị biến tính Để bảo quản enzym hiệu quả, cần giữ ở nhiệt độ từ 2-8°C.
10 pH: pH ảnh hưởng đến hoạt động của enzym Với XO, pH thích hợp từ 7,5-
1.2.3 Allopurinol và ức chế enzym xanthine oxidase
Allopurinol (1,5-dihydro-4H-pyrazolo [3,4-d] pyrimidin-4-one) được tổng hợp lần đầu bởi Falco vào giữa những năm 50 với mục tiêu phát triển các chất chống ung thư mới, nhưng sau đó được phát hiện có khả năng ức chế xanthine oxidase, giúp giảm nồng độ acid uric trong huyết thanh và nước tiểu Năm 1963, Rundles và các đồng nghiệp đã thực hiện thành công thử nghiệm lâm sàng đầu tiên về việc sử dụng allopurinol trong điều trị bệnh gout, và thuốc đã được FDA phê duyệt vào năm 1966.
Allopurinol và oxypurinol, chất chuyển hóa chính của nó, đều có tác dụng ức chế enzym xanthine oxidase, giúp giảm sinh tổng hợp acid uric Điều này dẫn đến giảm nồng độ acid uric trong máu, thúc đẩy thanh thải hypoxanthin và xanthin qua nước tiểu, từ đó giảm nguy cơ hình thành sỏi thận và các cơn đau thận.
Allopurinol được sử dụng trong lâm sàng để điều trị bệnh gout và các tình trạng tăng acid uric thứ phát, như do tác dụng của thuốc chống ung thư hoặc thuốc lợi tiểu thiazid.
Sử dụng thuốc có thể gây ra tác dụng phụ như kích ứng tiêu hóa, độc gan, dị ứng da, và có thể dẫn đến cơn gout cấp trong giai đoạn đầu điều trị Để khắc phục tình trạng này, có thể kết hợp thuốc với colchicin hoặc các loại thuốc chống viêm khác.
1.2.4 Phương pháp xác định hoạt độ của enzym xanthine oxidase in vitro
Các phương pháp xác định hoạt độ enzyme XO in vitro chủ yếu đo lường lượng sản phẩm chuyển hóa từ hypoxanthine thành xanthine và từ xanthine thành axit uric, cùng với việc sản xuất các gốc superoxide, hydro peroxide hoặc NADH.
Phương pháp đo quang dựa trên định lượng acid uric
Phương pháp đo quang dựa trên lượng acid uric tạo thành từ quá trình oxy hóa xanthin dưới tác dụng xúc tác của XO theo phản ứng:
Xanthin + H 2 O + O 2 Acid uric + H 2 O 2 Lượng acid uric được xác định bằng phương pháp đo quang ở bước sóng 290 nm, lượng acid uric tạo thành tỷ lệ thuận với hoạt độ enzym [60]
Phương pháp này thường được dùng trong thử nghiệm in vitro do tính thuận tiện, nhạy đối với enzym tinh khiết
Phương pháp hóa phát quang phát hiện O 2- gây ra bởi XO
Luminol là một hợp chất phát quang hóa học, trong đó lucigenin (LDCL) là một chất phát quang phổ biến, thường được sử dụng để phát hiện O2- trong môi trường in vitro, được sản xuất bởi hệ thống enzyme hoặc tế bào nguyên vẹn.
Phương pháp xác định O 2 - bằng thử nghiệm Cytochrom c
Việc sản xuất O2 - có thể được phát hiện trong các tế bào nguyên vẹn nhờ dạng sắt có trong cytochrom c:
Các tế bào được ủ với Fe 3+ -Cyt c và độ hấp thụ là đo ở 550 nm [19]
1.3 Quá trình oxy hóa trong cơ thể và chất chống oxy hóa
Chất chống oxy hóa là những hợp chất có khả năng ngăn chặn quá trình oxy hóa do các tác nhân bên ngoài gây ra Chúng đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ các thành phần tế bào bằng cách trung hòa các gốc tự do, sản phẩm tự nhiên của quá trình chuyển hóa tế bào, được hình thành khi oxy được chuyển hóa.
Các gốc tự do trong cơ thể có electron chưa ghép cặp, khiến chúng có khả năng phản ứng cao với protein, lipid, carbohydrate và DNA Chúng tấn công các phân tử ổn định gần nhất để “đánh cắp” electron, từ đó trở thành gốc tự do mới Quá trình này tạo ra phản ứng dây chuyền, dẫn đến việc phá hủy tế bào.
Các gốc tự do, bao gồm các dẫn xuất oxy (ROS) và nitơ (RNS), đóng vai trò quan trọng trong nhiều quá trình sinh học Các phân tử gốc tự do có nguồn gốc oxy có thể gây ra tổn thương tế bào, ảnh hưởng đến sức khỏe và quá trình lão hóa.
Free radicals include superoxide (O2), hydroxyl (HO), hydroperoxyl (HO2), peroxyl (ROO), alkoxyl (RO), and hydrogen peroxide (H2O2) The primary nitrogen species involved in reactions are nitric oxide (NO), peroxy nitrate (ONOO), nitrogen dioxide (NO2), and dinitrogen trioxide (N2O3).
Cây lá gai (Boehmeria nivea L Gaudich)
Cây lá gai (Boehmeria nivea) là loài thực vật thuộc họ Urticaceae, được biết đến với nhiều tên gọi như Gai tuyết, Trữ ma và Tầm Ma Loài cây này được trồng phổ biến ở các nước Đông Á như Hàn Quốc, Ấn Độ và Trung Quốc, và tại Việt Nam, nó mọc rải rác ở nhiều tỉnh miền Bắc, miền Trung và Trung Nam bộ Trong y học dân gian, lá gai đã được sử dụng từ lâu như một loại thuốc lợi tiểu và cầm máu, đồng thời được cho là có tác dụng bảo vệ gan, chống oxy hóa và chống viêm.
Plantae Magnoliophyta Magnoliopsida Urticales Urticaceae Boehmeria
Gai tuyết, Trữ ma, Tầm ma, Co pán (Thái), Bẩu pán (Tày), Chiểu đủ
Cây nhỏ cao từ 1,5-2m, có gốc hoá gỗ và rễ dạng củ, hình trụ, cong queo, màu vàng chứa nhiều nhựa gôm Cành cây màu nâu nhạt và có lông Lá cây lớn, mọc so le, hình trái xoan với kích thước dài từ 5-16 cm và rộng từ 9,5-14 cm, mép lá khía răng, mặt trên màu xanh, mặt dưới màu trắng bạc phủ lông mềm mịn Lá kèm hình dải nhọn thường rụng, cuống lá màu đỏ Hoa của cây là đơn tính cùng gốc, với hoa đực có 4 lá đài và 4 nhị, trong khi hoa cái có đài hợp chia thành 3 răng Quả bế mang đài tồn tại, mùa hoa nở từ tháng 5 đến tháng 8 và mùa quả từ tháng 8 đến tháng 11.
Hình 1 5: Cây lá gai (Boehmeria nivea L Gaudich)
Cây có nguồn gốc từ khu vực nhiệt đới châu Á, phân bố rộng rãi ở các nước như Bhutan, Campuchia, Trung Quốc, Ấn Độ, Indonesia, Nhật Bản, Hàn Quốc, Lào, Nepal, Sikkim, Đài Loan, Thái Lan và Việt Nam Tại Việt Nam, cây thường mọc rải rác ở các rìa rừng, bụi cây, những nơi ẩm ướt dọc theo suối và ven đường, đồng thời được trồng ở một số tỉnh miền Bắc, miền Trung và Trung Nam bộ.
Rễ củ-Radix Boehmeriae thường gọi là Trữ ma căn và lá-Folium Boehmeriae
Rễ của cây có thể được thu hái quanh năm, nhưng thời điểm tốt nhất là vào mùa hè hoặc mùa thu Sau khi đào rễ, cần rửa sạch đất cát, loại bỏ rễ con, thái mỏng hoặc để nguyên và sau đó phơi hoặc sấy khô; đôi khi có thể sử dụng tươi Lá cũng có thể thu hái quanh năm.
Kết quả định tính từ dịch chiết lá B nivea cho thấy sự hiện diện của các thành phần hóa học như anthraquinon, phenol, tinh dầu, steroid, terpen, acid amin, polysaccharid, acid hữu cơ, lacton và coumarin Theo nghiên cứu của Yongsheng Chen và các cộng sự (2014), lá Gai chứa các hợp chất có khả năng chống oxy hóa, kháng khuẩn, kháng nấm và tác dụng chống ung thư đối với ung thư phổi và gan, bao gồm các phenolic và flavonoid.
Nghiên cứu tại Hàn Quốc sử dụng HPLC đã xác định lá gai B nivea chứa nhiều hợp chất phenolic có tác dụng dược lý, bao gồm các hợp chất polyphenolic và flavonoid như epicatechin, epicatechin gallate, rutin và acid chlorogenic, nổi bật với các đặc tính chống oxy hóa, chống viêm, chống khối u, chống vi khuẩn, chống vi rút và chống dị ứng Ngoài ra, các tác giả Mi-Ran Park, Ah-Ra Kim và Sunghun Cho cũng chỉ ra rằng lá gai chứa nhiều amino acid, acid béo, acid hữu cơ, carbohydrat, vitamin và khoáng chất.
Trong đó, các phenolic bao gồm: chlorogenic acid, caffeic acid, 4-coumaric acid, ferulic acid, benzoic acid
Các flavonoid bao gồm: epicatechin, rutin, isoquercetin, hyperoside
Các carbohydrate bao gồm: sucrose, glucose, fructose, galactose, mannitol Các amino acid bao gồm: threonine, glutamic acid, proline, methionine, tyrosine, phenylalanine, histidine, lysine, arginine
Các acid béo bao gồm: palmitic acid, margaric acid, oleic acid, linoleic acid, linolenic acid, arachidic acid, behenic acid, tricosylic acid, lignoceric acid
Các acid hữu cơ bao gồm: oxalic acid, citric acid, succinic acid
Các vitamin bao gồm: vitamin A (retinol), vitamin E (α- tocopherol), vitamin C
Các khoáng chất bao gồm: Ca, Fe, K, Mg, Mn, Zn, Na
Hình 1.6: Cấu trúc một số hợp chất của B Nivea [22]
Trong y học cổ truyền ở Cộng hòa Dân chủ Congo, cây được nghiền nát và ngâm trong nước để tạo ra thuốc bôi điều trị bệnh thấp khớp, phong, bệnh ngoài da và vết thương Ngoài ra, thuốc còn được thấm vào mắt để chữa bệnh về mắt, thấm vào mũi để chống viêm mũi, và ngâm rượu để điều trị tiêu chảy và giun sán Tại Malaysia, lá gai được sử dụng để đắp lên mụn nhọt và chống đầy bụng.
Rễ và lá của cây 18 hơi được sử dụng làm thuốc bổ trong trường hợp kiết lỵ và hỗ trợ điều trị vết loét Tại Ấn Độ, chúng được coi là có tác dụng làm mát, lợi tiểu và được áp dụng cho các rối loạn như rối loạn tiểu tiện, viêm niệu sinh dục và sa tử cung Ở Trung Quốc và Đài Loan, cây này được dùng với mục đích lợi tiểu, hạ sốt và bảo vệ gan.
Một số bài thuốc sử dụng lá gai:
1 Lá gai dùng riêng hoặc giã đắp với cây cứt lợn có tác dụng cầm máu, làm lành vết thương; lá gai phối hợp với lá vông, lạc tiên, rau má, nấu thành cao, pha đường uống, làm thuốc an thần, gây ngủ [11]
2 Rễ và lá gai còn là thuốc lợi tiểu, chữa đi tiểu ra máu với liều dùng trung bình 10 – 30g mỗi ngày, sắc nước uống [11]
1 Dịch chiết bằng cồn từ cây gai trên ống nghiệm có tác dụng thúc đẩy quá trình đông máu, trên thí nghiệm cắt đuôi chuột nhắt để xác định thời gian chảy máu, thuốc có tác dụng cầm máu Trong thí nghiệm lấy máu từ tĩnh mạch sau hố mắt trên chuột nhắt trắng, dạng thuốc trên với liều 0,3ml bằng đường tiêm phúc mạc hoặc với liều 0,5ml bằng đường uống có tác dụng rút ngắn thời gian đông máu Trên những chó thí nghiệm gây xuất huyết dưới da bằng cách dùng chất cobalt để chiếu xạ thì dạng chế phẩm trên của gai có tác dụng làm giảm hiện tượng xuất huyết một cách rõ rệt [11]
2 Acid chlorogenic có trong dược liệu là một chất ít độc, có tác dụng tăng cường hiệu lực của adrenalin, thông tiểu tiện, kích thích sự bài tiết mật và có khả năng ức chế tác dụng của pepsin và trypsin Acid chlorogenic còn có tác dụng diệt nấm và kháng khuẩn [11]
3 Muối ammonium của acid cafeic được phân giải từ acid chlorogenic, trên thỏ thí nghiệm tĩnh mạch với liều lượng 7mg/kg có tác dụng rút ngắn thời gian đông máu 58%, rút ngắn thời gian chảy máu 52% Trên chuột nhắt trắng đã dùng cobalt để chiếu xạ, dùng acid cafeic tiêm xoang bụng với liều lượng 14mg/kg, tiêm liên tục trong 2 tuần lễ thì số lượng bạch cầu tăng
76,4% và số lượng tiểu cầu tăng 45,6% Với nồng độ pha loãng 1: 128 trên ống nghiệm, thuốc có tác dụng ức chế tụ cầu khuẩn vàng [11]
4 Về độc tính cấp trên chuột nhắt trắng bằng tiêm phúc mạc, thuốc có
𝐿𝐷 50 83 mg/kg, về độc tính bán mãn trên thỏ thí nghiệm với liều 14mg/kg tiêm liên tục trong 10 ngày qua kiểm tra thấy các cơ quan tim, gan, thận về mặt công năng và tổ chức học không có biểu hiện gì về biến đổi bệnh lý [11]
1.4.2.10 Một số nghiên cứu về tác dụng của lá gai trên thế giới liên quan đến tác dụng chống oxy hóa và bệnh gout
Nghiên cứu của Mi Jeong Sung và cộng sự (2013) đã chỉ ra rằng chiết xuất ethanol 70% từ lá gai có tác dụng chống viêm thông qua việc ức chế sự bài tiết của oxit nitric (NO), yếu tố hoại tử khối u alpha (TNF-α) và interleukin 6 (IL-6) trong các đại thực bào RAW264.7 Cụ thể, lá gai ức chế các phân tử tín hiệu p38 và JNK, đóng vai trò quan trọng trong sản xuất các cytokine gây viêm, cho thấy tiềm năng của lá gai như một thành phần chống viêm hiệu quả.
Nghiên cứu của Jin Woo Nho và cộng sự (2010) đã chứng minh tác dụng chống oxy hóa của lá gai thông qua phương pháp đo DPPH, với giá trị IC 50 đạt 97 µg/ml.
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Vào tháng 7 năm 2019, lá cây Gai được thu hái tại Hà Nội, sau đó được rửa sạch và phơi trong bóng râm cho đến khi đạt khối lượng không đổi, rồi được bảo quản trong túi nilon.
Mẫu nghiên cứu về Boehmeria nivea (L.) Gaudich, thuộc họ Urticaceae, được thực hiện bởi Bộ môn Dược liệu & Dược học cổ truyền, Khoa Y Dược Mẫu tiêu bản hiện đang được lưu giữ tại Bộ môn Dược liệu & Dược học cổ truyền, Khoa Y Dược, Đại học Quốc Gia Hà Nội.
Hình 2 1: Cây lá gai tại Mê Linh, Hà Nội
2.1.2 Chuẩn bị các mẫu nghiên cứu
Chuẩn bị dịch chiết toàn phần ethanol
Lá Gai khô (300 g) được chiết xuất bằng dung môi ethanol 50% với thể tích 3 lít, thực hiện 3 lần, sử dụng thiết bị siêu âm ở nhiệt độ 40°C trong 90 phút Sau khi gộp các dịch chiết ethanol, tiến hành lọc qua giấy lọc và cất loại dung môi.
22 áp suất giảm bằng máy cô quay chân không thu được cao chiết toàn phần ethanol
Hình 2 2: Cao toàn phần ethanol lá Gai
Chuẩn bị các phân đoạn dịch chiết
Cao chiết được phân tán vào nước cất với tỷ lệ 1:1 và chiết phân bố bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần như n-hexan, ethyl acetat và n-Butanol, mỗi dung môi được sử dụng ba lần với thể tích 300 mL Sau khi cất loại dung môi dưới áp suất giảm, các phân đoạn tương ứng thu được là n-hexan, EtOAc và n-BuOH.
Quy trình chiết xuất dược liệu được thể hiện ở hình 2.3:
Hình 2 3: Quy trình chiết xuất dược liệu
Bảng 2.1: Các thuốc và hóa chất cần thiết
STT Nguyên liệu, hóa chất Nguồn gốc, xuất xứ
3 Enzym Xanthine oxidase Sigma Aldrich,
4 1,1 – diphenyl – 2 – picrylhydrazyl Ấn Độ TCNSX
6 Acid ascorbic Trung Quốc TCNSX
7 HCl đậm đặc 37%, NaOH Trung Quốc TCNSX
8 Dung môi: n-hexan, ethylacetat (EtOAc), n-butanol
(n-BuOH), DMSO, ethanol, methanol, nước cất
2.1.4 Máy móc, thiết bị, dụng cụ
- Máy đo quang UV Aligent technologies cary 60 UV-Vis, Mỹ
- Máy đo pH Metteler Toledo (Thụy Sỹ)
- Cân phân tích AY 220 (Shimadzu, Nhật Bản)
- Máy siêu âm Ultrasonic Cleaners AC-150H, MRC, Isareal
- Máy cô quay chân không Rovapor R-210 (Buchi- Đức)
- Máy khuấy từ (Shimadzu, Nhật Bản)
- Máy ly tâm (Shimadzu, Nhật Bản)
- Micro pipet đa kờnh 10-200àL, 100-1000àL
- Các dụng cụ khác sử dụng trong thực nghiệm: ống nghiệm, đầu côn, pipet, bình thủy tinh, cốc có mỏ, đũa thủy tinh
2.2 Nội dung nghiên cứu Để đạt được những mục tiêu nghiên cứu đã đặt ra, đề tài nghiên cứu được thiết kế với các nội dung sau:
Nội dung 1: Đánh giá tác dụng chống oxy hóa của các phân đoạn dịch chiết từ lá cây gai theo phương pháp DPPH
Nội dung 2: Đánh giá tác dụng ức chế enzym XO in vitro của các phân đoạn dịch chiết từ lá cây gai
2.3.1 Đánh giá tác dụng chống oxy hóa các phân đoạn dịch chiết từ lá cây gai theo phương pháp DPPH
Phương pháp đánh giá khả năng quét gốc tự do 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) là một trong những kỹ thuật phổ biến nhất để đo lường hoạt động chống oxy hóa Phương pháp này được ưa chuộng nhờ tính đơn giản và nhanh chóng, chỉ cần sử dụng máy quang phổ UV-VIS để thực hiện.
DDPH có khả năng tạo ra gốc tự do bền trong dung dịch MeOH bão hòa, với dung dịch có màu tím đậm và độ hấp thụ tối đa ở 517nm Khi có mặt chất chống oxy hóa, màu tím này sẽ chuyển sang màu vàng Việc thêm các chất thử vào dung dịch DDPH sẽ làm giảm cường độ hấp thụ ánh sáng nếu chất đó có khả năng quét gốc tự do.
Chuẩn bị hóa chất cần thiết
- Dung môi MeOH đạt tiêu chuẩn phân tích
- Chất chuẩn dương acid ascorbic (Trung quốc) được hòa tan trong MeOH bóo hũa với nồng độ 50 àg/ml; 25 àg/ml; 20 àg/ml; 10àg/ml; 5 àg/ml; 2,5 àg/ml
- 1,1- diphenyl – 2 –picrylhydrazyl (DDPH, Ấn Độ) pha trong MeOH được nồng độ 4,0 mg/ml
- Mẫu thử: dược liệu được hòa tan trong MeOH bão hòa với các nồng độ
500 g/ml; 250 g/ml; 125 g/ml; 62,5 g/ml; 31,25 g/ml; 15,625 g/ml dùng cho thí nghiệm
Mẫu thử được pha trong dung môi MeOH thành các nồng độ khác nhau Hỗn hợp phản ứng gồm: 630μL dung dịch DPPH (4,0 mg/ml trong methanol); 100
Các mẫu dịch chiết với nồng độ khác nhau được pha trộn với 270 μL MeOH, sau đó ủ trong bóng tối ở nhiệt độ 25 °C trong 15 phút Độ hấp thụ của hỗn hợp được đo bằng máy quang phổ ở bước sóng 517 nm.
Tiến hành đo mẫu chứng với cùng điều kiện và thành phần gồm: 630μL dung dịch DPPH ; 370μL MeOH
Thí nghiệm được lặp lại 3 lần
Cách đánh giá kết quả
Hoạt tính quét gốc tự do DPPH được đánh giá thông qua giá trị phần trăm ức chế (I%) theo công thức:
𝐴𝑐−𝐴𝑜𝑥100 Trong đó: I%: phần trăm ức chế
Ac: độ hấp thụ của mẫu chứng
At: độ hấp thụ của mẫu thử
A 0 : độ hấp thụ của mẫu trắng (sử dụng methanol)
Dịch chiết được đánh giá về tác dụng chống oxy hóa bằng cách so sánh với acid ascorbic, chất chuẩn dương Giá trị IC 50 của mẫu được xác định thông qua đồ thị thể hiện mối quan hệ giữa nồng độ mẫu thử (C) và phần trăm ức chế (I%).
2.3.2 Đánh giá tác dụng ức chế enzym xanthine oxidase in vitro các phân đoạn dịch chiết từ lá cây gai
Phương pháp này dựa trên quá trình tạo thành acid uric từ xanthin nhờ xúc tác của enzym XO Thí nghiệm được thực hiện theo phương pháp của M Umamaheswari và Đái Thị Xuân Trang, với các điều chỉnh phù hợp cho điều kiện phòng thí nghiệm Nguyên tắc định lượng của phương pháp dựa trên phản ứng cụ thể giữa các thành phần.
Hoạt độ XO được xác định bằng lượng acid uric tạo thành, được đo ở bước sóng 295nm tại nhiệt độ 37ºC và pH 7,5 hoặc 8,0 Một đơn vị enzym được định nghĩa là lượng enzym sản xuất ra 1 µmol acid uric trong mỗi phút ở nhiệt độ 37ºC.
Chuẩn bị hóa chất cần thiết
- Cơ chất: dung dịch xanthin 150àM trong đệm phosphat
- Hóa chất dừng phản ứng: dung dịch HCl 0,5M
- Chất chuẩn dương Allopurinol được hòa tan trong đệm phosphat với nồng độ
50 àg/ml; 25 àg/ml; 12,5 àg/ml; 10àg/ml; 5 àg/ml; 2,5 àg/ml
Mẫu thử cao dược liệu được hòa tan trong DMSO và pha với đệm để tạo ra các nồng độ 25 µg/mL, 50 µg/mL, 100 µg/mL, 200 µg/mL và 400 µg/mL cho thí nghiệm.
Thử nghiệm đánh giá tác dụng ức chế enzym xanthine oxidase (XO) in vitro của các phân đoạn dịch chiết từ lá cây gai đã được thực hiện tại Bộ môn Dược lý – Dược lâm sàng, Khoa.
Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội
Bảng 2 2: Bố trí thí nghiệm đánh giá tác dụng ức chế enzym XO in vitro của các mẫu thử Mẫu chứng (àl) Mẫu đối chiếu (àl) Mẫu thử (àl)
Chuẩn bị mẫu thử bằng cách pha các cao phân đoạn từ lá gai trong DMSO để tạo dung dịch gốc có nồng độ 1 mg/mL Sau đó, dung dịch gốc này được pha loãng với dung dịch đệm phosphat để đạt các nồng độ 25 àg/mL, 50 àg/mL, 100 àg/mL, 200 àg/mL và 400 àg/mL.
Hỗn hợp phản ứng bao gồm 100 µL dung dịch mẫu thử, 400 µL dung dịch đệm phosphat 50 mM pH = 7.5 và 100 µL dung dịch enzym XO 0,2 U/mL Hỗn hợp này được ủ ở 37°C trong 15 phút, sau đó thêm 200 µL xanthin (0,15 mM) và ủ tiếp trong 30 phút Phản ứng được dừng lại bằng cách thêm 200 µL HCl 0,5M, sau đó đo độ hấp thụ bằng máy đo quang phổ ở bước sóng 295 nm Mẫu chứng được thực hiện tương tự nhưng thay dung dịch thử bằng dung dịch đệm, và thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
Quy trình thí nghiệm được mô tả ở hình 2.4:
Hình 2 4: Sơ đồ quy trình thí nghiệm
Cách đánh giá kết quả
Tính I% (phần trăm ức chế) theo công thức:
Trong đó: OD: Độ hấp thụ quang
Allopurinol được sử dụng để xác định giá trị IC50, thông qua việc phân tích đồ thị và phương trình thể hiện mối quan hệ giữa nồng độ (C) và phần trăm ức chế enzym.
2.3.3 Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu được lưu trữ bằng phần mềm Microsoft Excel 2013 và phần mềm SigmaPlot 12.0
Số liệu được biểu diễn dưới dạng X ± SD (X: giá trị trung bình; SD: độ lệch chuẩn)
KẾT QUẢ
Sau khi chiết xuất 300g dược liệu lá gai khô bằng EtOH 50%, thu được 27g cao khô, tương ứng với hiệu suất 9,00% Tiếp theo, chiết phân đoạn cao EtOH cho kết quả các phân đoạn n-Hexan, EtOAc, n-BuOH lần lượt là 0,93g, 1,00g và 2,53g, với hiệu suất chiết phân đoạn tương ứng là 3,44%, 3,70% và 9,37%.
3.2 Kết quả đánh giá tác dụng chống oxy hóa các phân đoạn dịch chiết từ lá cây gai theo phương pháp DPPH
Kết quả đánh giá khả năng quét gốc tự do DPPH của cao toàn phần ethanol lá gai và các phân đoạn n-hexan, ethylacetat, n-butanol cùng acid ascorbic được thể hiện trong bảng 3.1.
Bảng 3 1: Khả năng chống oxy hóa của các mẫu thử
Từ bảng kết quả, ta vẽ đường đồ thị và phương trình biểu diễn khả năng chống oxy hóa của các mẫu thử:
Hình 3 1: Đồ thị biểu diễn khả năng chống oxy hóa của các mẫu thử
Hình 3 2: Đồ thị biểu diễn khả năng chống oxy hóa của Acid ascorbic
Từ phương trình biểu diễn giữa nồng độ (C) và giá trị phần trăm ức chế (%I) của các mẫu thử ta tính được giá trị IC50 như sau:
Bảng 3.2: Bảng giá trị IC50 tác dụng chống oxy hóa của các mẫu thử
Mẫu thử Cao EtOH Cao n-hexan Cao EtOAc Cao n-BuOH
Kết quả phần trăm ức chế (I%) của cao chiết phân đoạn lá Gai và acid ascorbic được trình bày trong bảng 3.1, cho thấy giá trị IC50 của các phân đoạn lá Gai dao động từ 81,58 ± 3,76 g/ml đến 240,19 ± 3,56 g/ml Phân đoạn n-BuOH có tác dụng chống oxy hóa cao nhất với IC50 là 81,58 ± 3,76 g/ml, tiếp theo là cao chiết toàn phần EtOH và phân đoạn EtOAc với IC50 lần lượt là 112,98 ± 2,21 g/ml và 187,86 ± 2,48 g/ml Trong khi đó, phân đoạn n-Hexan thể hiện khả năng chống oxy hóa thấp nhất.
Kết quả nghiên cứu cho thấy giá trị IC50 của mẫu thử là 240,19 ± 3,56 µg/ml, trong khi mẫu chứng dương Acid ascorbic có IC50 là 19,56 ± 2,89 µg/ml, cho thấy khả năng chống oxy hóa của Acid ascorbic cao hơn đáng kể so với các mẫu thử.
3.3 Kết quả đánh giá tác dụng ức chế enzym xanthine oxidase in vitro của cao chiết phân đoạn lá Gai
Giá trị phần trăm ức chế I (%) của các phân đoạn lá gai ở các nồng độ khác nhau và Allopurinol được trình bày ở bảng 3.2
Bảng 3.3: Tác dụng ức chế enzym XO của các mẫu thử
Từ bảng kết quả, ta vẽ được đồ thị biểu diễn khả năng ức chế enzym xanthine oxidase của các mẫu thử
Hình 3 3: Đồ thị biểu diễn tác dụng ức chế enzym XO của các mẫu thử
Hình 3.4: Đồ thị biểu diễn tác dụng ức chế enzym XO của Allopurinol
Từ phương trình biểu diễn giữa nồng độ và giá trị phần trăm ức chế của các mẫu thử, ta tính được giá trị IC50 như sau:
N ồn g độ ( g /m l) N ồn g độ ( g /m l) N ồn g độ ( g /m l)
Bảng 3.4: Bảng giá trị IC50 tác dụng ức chế XO của các mẫu thử
Mẫu thử Cao EtOH Cao n-hexan Cao EtOAc Cao n-BuOH allopurinol
Giá trị phần trăm ức chế enzym XO (%) của cao chiết từ lá Gai và allopurinol được thể hiện trong bảng 3.2 Kết quả cho thấy, khi nồng độ cao chiết tăng từ 25 đến 400 µg/ml, phần trăm ức chế enzym XO cũng tăng theo Điều này chứng tỏ rằng tác dụng ức chế enzym XO của cao toàn phần và các phân đoạn lá Gai tỷ lệ thuận với nồng độ cao chiết Trong số các phân đoạn, phân đoạn n-BuOH có giá trị IC50 thấp nhất là 162,81 ± 6,87 µg/ml, cho thấy tác dụng ức chế enzym XO mạnh nhất, tiếp theo là phân đoạn EtOH với IC50 là 261,9 ± 7,82 µg/ml.
IC 50 : 279,83 ± 8,65 g/mL) và thấp nhất là phân đoạn n-hexan (IC 50 : 455,53 ± 9,32 g/mL) Thứ tự tác dụng ức chế enzym XO của các phân đoạn tăng lần lượt như sau: n- Hexan < EtOAc< EtOH < n-BuOH Song song với các mẫu thử, tiến hành tương tự với mẫu chứng dương Allopurinol cho kết quả IC50 là 7,38 ± 1,25 àg/ml, thể hiện tỏc dụng ức chế enzym XO cao hơn cỏc mẫu thử
BÀN LUẬN
Kết quả chiết xuất dược liệu lá gai tại huyện Mê Linh, Hà Nội cho thấy hiệu suất chiết trong dung môi EtOH 50% đạt cao với các phân đoạn n-Hexan, EtOAc, n-BuOH lần lượt là 9,00%, 3,44%, 3,70%, 9,37% Kết quả này tương đồng với nghiên cứu của Phạm Ngọc Khôi (2019) ở Khánh Hòa (9%) nhưng thấp hơn so với Chikwang Kim (2015) tại Hàn Quốc (17,68%) Sự khác biệt này có thể do địa điểm thu hái, giống dược liệu, điều kiện sinh sống và quy trình chiết xuất khác nhau, dẫn đến sự biến đổi về hoạt chất trong dược liệu.
4.2 Về kết quả đánh giá tác dụng chống oxy hóa các phân đoạn dịch chiết từ lá cây gai theo phương pháp DPPH
Nghiên cứu đã chỉ ra rằng các cao phân đoạn từ lá cây gai có khả năng kháng oxy hóa thông qua phương pháp bắt gốc tự do DPPH Trong số đó, phân đoạn n-BuOH thể hiện hoạt tính kháng oxy hóa mạnh nhất với giá trị IC50 là 81,58 ± 3,76 (μg/ml), mặc dù vẫn còn thấp hơn so với một số phân đoạn khác.
Cao dược liệu này cho thấy tác dụng chống oxy hóa tốt hơn gấp 4 lần so với vitamin C, với IC 50 đạt 19,56 ± 2,89 g/ml Điều này có thể được giải thích bởi sự hiện diện của nhiều hợp chất khác nhau trong mẫu cao chiết, trong khi vitamin C chỉ là một hợp chất đơn lẻ.
Các cao phân đoạn lá gai cho thấy hoạt tính chống oxy hóa khác nhau với giá trị IC 50 của EtOH, EtOAc và n-Hexan lần lượt là 112,98 ± 2,21; 187,86 ± 2,48; và 240,19 ± 3,56 (μg/ml), cho thấy n-BuOH là phân đoạn chứa nhiều hoạt chất oxy hóa chính Nghiên cứu của Yongsheng Chen và cộng sự (2014), Mi-Ran Park và cộng sự (2010), Ah-Ra Kim và cộng sự (2014), và Sunghun Cho và cộng sự (2017) đã chỉ ra rằng lá gai chứa các hợp chất phenolic, flavonoid, vitamin A, C, E, trong đó bao gồm các acid phenolic như acid 4-coumaric, acid caffeic, acid ferulic, và acid chlorogenic cùng với flavonoid như rutin.
38 epicatechin, isoquercetin) [67] đã được chứng minh thể hiện khả năng kháng oxy hóa mạnh
Nghiên cứu của Phạm Ngọc Khôi và cộng sự (2019) cho thấy hoạt tính kháng oxy hóa của cao chiết lá Gai khi chiết xuất bằng dung môi nước với tỷ lệ 1:30 g/ml, thời gian 30 phút và nhiệt độ 60°C, đạt kết quả IC50 là 82,09 µg/ml Kết quả này tương đồng với phân đoạn n-BuOH Bên cạnh đó, Jin Woo Nho và cộng sự (2010) đã khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của cao chiết lá Gai trong EtOH 70%, cho kết quả IC50 là 688±0,002 µg/ml cho cao EtOH 70%, 484±0,004 µg/ml cho cao hexan, và các phân đoạn khác.
Kết quả nghiên cứu cho thấy nồng độ cao của các hợp chất là (97 ± 0.004 g/ml) và cao nước (1127± 0,006 g/ml), tuy nhiên có sự khác biệt so với hai nghiên cứu trước đó Sự khác biệt này có thể do các yếu tố như dung môi, thời gian, nhiệt độ, tỷ lệ nguyên liệu và địa điểm thu hái dược liệu Do đó, việc tối ưu hóa các điều kiện chiết xuất và khảo sát các mẫu dược liệu khác nhau là cần thiết để cung cấp thêm bằng chứng cho việc lựa chọn dược liệu chất lượng, phục vụ cho việc phát triển thực phẩm chức năng và thuốc trong tương lai.
Lá Gai đã chứng minh khả năng chống oxy hóa, cung cấp cơ sở khoa học cho các ứng dụng y học trong tương lai Việc giảm thiểu tác động của chất oxy hóa là cần thiết để ngăn ngừa stress oxy hóa, tình trạng có thể dẫn đến nhiều bệnh mãn tính như ung thư, bệnh tim mạch và bệnh thoái hóa thần kinh Do đó, nghiên cứu các hợp chất tự nhiên có khả năng kháng oxy hóa và điều trị bệnh là rất quan trọng.
4.3 Về kết quả đánh giá tác dụng ức chế enzym xanthine oxidase in vitro các phân đoạn dịch chiết từ lá cây gai
Gout là một trong những bệnh rối loạn chuyển hóa phổ biến ở con người
Bệnh gout được đặc trưng bởi mức acid uric trong máu tăng cao, dẫn đến sự lắng đọng của tinh thể urate monohydrate tại các khớp và thận, gây ra viêm khớp do gout và hình thành sỏi thận acid.
Mức acid uric cao có liên quan đến nguy cơ phát triển tăng huyết áp, tăng lipid máu, bệnh tiểu đường và béo phì, do đó, kiểm soát acid uric là cách hiệu quả để phòng ngừa bệnh gout và các rối loạn khác Allopurinol, một thuốc ức chế enzym XO, được sử dụng để điều trị gout mãn tính, nhưng có thể gây ra tác dụng phụ như viêm gan, tổn thương thận và hội chứng quá mẫn Ngoài ra, các hợp chất hóa học trong thực vật, như flavonoid, có tiềm năng dược lý lớn và được sử dụng trong y học cổ truyền, mang lại hy vọng cho việc điều trị bệnh.
Trong y học cổ truyền tại DR Congo, cây Gai được sử dụng bằng cách nghiền nát và ngâm trong nước để tạo ra một loại thuốc bôi, giúp điều trị bệnh thấp khớp.
Trong một nghiên cứu gần đây, Phạm Ngọc Khôi đã đánh giá tác dụng ức chế enzym xanthine oxidase (XO) in vitro của cao nước lá Gai, với kết quả cho thấy giá trị IC50 đạt 273.
Nghiên cứu đã chỉ ra rằng cao chiết từ các phân đoạn khác nhau của lá cây Gai có khả năng ức chế enzym XO, trong đó phân đoạn n-BuOH có hiệu quả ức chế mạnh nhất với IC50 là 162,81 ± 6,87 (µg/ml), mặc dù vẫn thấp hơn 20 lần so với Allopurinol (IC50 là 7,38 ± 1,25 µg/ml) Các phân đoạn EtOH, EtOAc và n-Hexan có giá trị IC50 lần lượt là 261,91 ± 7,82; 279,83 ± 8,65; và 455,53 ± 9,32 (µg/ml) Điều này cho thấy các chất ức chế enzym XO chủ yếu tập trung trong phân đoạn n-BuOH Đặc biệt, thứ tự ức chế enzym XO và khả năng chống oxy hóa của các cao phân đoạn lá Gai là tương đồng: n-Hexan < EtOAc < EtOH < n-BuOH, có thể được giải thích bởi sự hiện diện của các hợp chất phenolic và flavonoid trong lá gai, bao gồm caffeic acid, rutin và isoquercetin.
Chlorogenic acid được đánh giá có khả năng ức chế enzym XO và có hoạt tính chống oxy hóa cao, theo nghiên cứu của Li-Na Huo và cộng sự.
Năm 2015, một nghiên cứu đã xác định các thành phần ức chế xanthine oxidase từ lá cây tía tô, phát hiện ra năm hợp chất, trong đó chủ yếu là axit caffeic.
Chiết xuất n-butanol từ lá tía tô chứa 40 thành phần, trong đó có axit rosmarinic, vinyl caffeate, methyl rosmarinate và apigenin, cho thấy khả năng ức chế mạnh mẽ enzym khi được rửa giải bằng EtOH 70%.