Nấm đảm sinh tổng hợp laccase có khả năng loại màu thuốc nhuộm hoạt tính được sử dụng để nhuộm vải may quân trang

Trong nghiên cứu này, nhóm tác giả thông báo kết quả nghiên cứu phân lập, phân loại chủng nấm đảm có khả năng sinh tổng hợp laccase, lựa chọn môi trường nuôi cấy để sinh[r]

NẤM ĐẢM SINH TỔNG HỢP LACCASE CÓ KHẢ NĂNG LOẠI MÀU THUỐC NHUỘM HOẠT TÍNH ĐƯỢC SỬ DỤNG

ĐỂ NHUỘM VẢI MAY QUÂN TRANG

Phùng Khắc Huy Chú1,3*, Đào Thị Ngọc Ánh2, Đặng Thị Cẩm Hà2

Tóm tắt: Từ 6 trong số 45 mẫu nấm đảm được thu thập, phân lập từ rừng Quốc

gia Ba Vì, Hà Nội, đã lựa chọn được chủng FBV40 có khả năng sinh tổng hợp laccase thô cao nhất Dựa theo các đặc điểm hình thái và trình tự vùng ITS1-5,8S-ITS2 chủng FBV40 được xác định thuộc chi Rigidoporus và được đặt tên là Rigidoporus sp FBV40 Hoạt tính laccase thô cao nhất của chủng này đạt 107.708 U/l trên môi trường TSH1 sau 8 ngày nuôi cấy và có khả năng loại 8 màu thuốc nhuộm hoạt tính thương mại sử dụng để nhuộm vải may quân trang ở mức độ khác nhau, hiệu suất loại màu MN.FBN với nồng độ 100 mg/L đạt cao nhất 88,11% khi

có mặt 200 µM ViO sau 24 h Ở nồng độ màu MN.FBN là 10 mg/L thì hiệu suất loại màu đạt 92,72% Từ các minh chứng thu được cho thấy laccase sinh tổng hợp bởi chủng nấm đảm FVB40 có khả năng ứng dụng trong xử lý nước thải nhà máy dệt

nhuộm vải may quân trang cho quân đội

Từ khóa: Laccase, Rigidoporus, Loại màu, Thuốc nhuộm hoạt tính, Vải quân trang

1 MỞ ĐẦU

Laccase là enzyme ngoại bào thuộc nhóm oxidoreductase là một trong số ít các enzyme

đã được nghiên cứu từ thế kỷ thứ 19 Sự quan tâm đối với các loại laccase đã được gia tăng trong những năm gần đây do tiềm năng ứng dụng chúng trong việc khử độc các chất ô nhiễm

và trong xử lý sinh học các hợp chất phenol [7, 4] Chúng chỉ cần oxy nguyên tử trong phản ứng xúc tác, vì vậy chúng phù hợp đối với các ứng dụng công nghệ sinh học trong xử lý hỗn hợp các chất ô nhiễm khi được cố định trên các chất mang phù hợp [13] Vai trò của laccase

đã được xác định khi ứng dụng trong loại màu thuốc nhuộm, phân hủy sinh học các hóa chất thải có độc tính như các hợp chất hữu cơ clo, các hydrocarbon thơm mạch vòng, các chất vòng thơm có nitro và thuốc chất trừ sâu và chế tạo sensor sinh học [11, 6]

Hiện nay, công nghiệp dệt nhuộm sử dụng khoảng 2/3 tổng lượng thuốc nhuộm và tiêu thụ một lượng lớn nước và hoá chất [5] Các hoá chất được sử dụng đa dạng về thành phần hoá học, chủng loại từ các hợp chất vô cơ để tổng hợp đến các sản phẩm hữu cơ Có khoảng 100.000 loại thuốc nhuộm thương mại với trên 7.105 tấn thuốc nhuộm được sản xuất hàng năm Các vấn đề nảy sinh đối với ô nhiễm bởi thuốc nhuộm là khả năng sinh ra các chất gây ung thư như benzidine và các hợp chất vòng thơm khác [4] Hầu hết các phương pháp hiện tại để xử lý nước thải dệt nhuộm không đạt hiệu quả và không kinh tế như mong muốn Do đó, việc nghiên cứu và phát triển phương pháp mới dựa trên laccase chuyên hoạt động như là chất xúc tác là giải pháp có tiềm năng cao trong loại màu thuốc nhuộm có các cấu trúc hoá học đa dạng như vậy [15] Hiện tại, chưa có công bố nào về việc nghiên cứu loại màu thuốc nhuộm trong công nghiệp quốc phòng khi sử dụng laccase hay hỗn hợp của nhiều laccase để xử lý loại hình ô nhiễm này

Nhiều loài nấm đảm đã được phân lập từ đất, lá chè mục, lá keo mục và đặc biệt là gốc các loại cây mục thuộc địa bàn rừng Quốc gia Ba Vì, khi xác định sơ bộ hoạt tính các enzyme ngoại bào thuộc họ oxidoreductase, peroxidase mà đại diện là laccase, mangan peroxidase (MnP) và lignin peroxidase (LiP) đã cho ta thấy có đến 50% tổng số mẫu nấm thu được có khả năng sinh tổng hợp 1 trong 3 loại enzyme ngoại bào trên, trong đó, rất ít nấm có hoạt tính MnP và LiP Việc phát hiện, sàng lọc các laccase mới có hoạt tính cao

với các phổ cơ chất đặc biệt và nghiên cứu nâng cao tính ổn định là rất quan trọng để triển khai ứng dụng ở quy mô công nghiệp

Trong nghiên cứu này, nhóm tác giả thông báo kết quả nghiên cứu phân lập, phân loại chủng nấm đảm có khả năng sinh tổng hợp laccase, lựa chọn môi trường nuôi cấy để sinh tổng hợp laccase cao và so sánh khả năng loại một số màu thuốc nhuộm hoạt tính thương mại được sử dụng trong công đoạn nhuộm vải may quân trang của nhà máy X20/Bộ Quốc phòng

2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu

Các chủng nấm đảm được thu thập từ đất và gỗ mục ở độ cao trên 600m rừng Quốc gia

Ba vì, thành phố Hà Nội

2.2 Hóa chất và môi trường nuôi cấy

Tám loại màu tổng hợp hoạt tính được cung cấp bởi nhà máy X20, Tổng Cục công nghiệp Quốc phòng, Bộ Quốc phòng Sử dụng các môi trường nuôi cấy TSH1 (100 ml dịch chiết khoai tây, 10 g/L glucose, 1 g/L cám gạo, 5 g/L bột đậu tương, 100 µM Cu2+); PDB (Dịch chiết khoai tây 200g/l, 10g/l glucose); PDB + 1%BDT (Dịch chiết khoai tây 200g/l, 10g/l glucose, 10g/l bột đậu tương); Czapeck (Saccharose 30 g/l, MgSO4 0,5 g/l,

KH2PO4 1 g/l, NaCl 1 g/l, NaNO3 2 g/l, KCl 0,5 g/l, FeSO4 0,01 g/l, pH 7); Dịch chiết khoai tây (Khoai tây 200g/l, pH 7); MEG (KH2PO4 1 g/l, Na2HPO4 4 g/l, NaCl 0,2 g/l, MgSO4 0,2 g/l, CaCO3 0,5 g/l, cao men 4 g/l, cao malt 2 g/l, glucose 4 g/l, pH 6,5) và Vis (pepton 3 g/l, glucose 10 g/l, KH2PO4 0,6 g/l, ZnSO4 0,001 g/l, K2HPO4 0,4 g/l, FeSO4

0,0005 g/l, MnSO4 0,05 g/l, MgSO4 0,5 g/l, pH 6)

2.3 Phân lập chủng nấm

Các mẫu nấm và đất có gỗ mục được thu thập tươi từ rừng Quốc gia Ba Vì, mang về phòng thí nghiệm chụp ảnh Sau đó, tiến hành đo hoạt tính laccase của các mẫu tươi (gọi là

hoạt tính in-situ) Tiến hành phân lập, làm sạch trên môi trường thạch chứa dịch chiết

khoai tây, agar 18g/l và bổ sung guaniacol 1 % để song song nhận biết khả năng sinh tổng hợp oxydoreductase (laccase, LiP và MnP) thông qua vòng màu nâu đỏ là sản phẩm oxy hóa guaniacol

2.4 Phương pháp xác định hoạt tính laccase

Để phân biệt chính xác laccase, LiP hay MnP được sinh tổng hợp bởi chủng nấm nghiên cứu, hoạt tính laccase đã được xác định dựa trên sự oxy hóa ABTS

(2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) của laccase theo phương pháp của Eggert [1]

2.5 Phân loại chủng nấm

DNA tổng số của nấm được tách chiết theo mô tả của Eric và Boehm Sản phẩm PCR được nhân lên từ DNA tổng số với cặp mồi ITS1 (5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’

và ITS4 (5’-TCCTCCGCTTATTGATATG-3’) [18] Trình tự các đoạn gene được xử lý bằng phần mềm FinchTV và so sánh với các chủng được công bố trên GenBank (NCBI database) Cây phát sinh chủng loại được xây dựng bằng phần mềm MEGA 6.06

2.6 Sàng lọc khả năng loại các màu hoạt tính bằng laccase thô

Dịch enzyme thô có nồng độ cuối 1.000 U/l được sử dụng để đánh giá khả năng loại màu với sự tham gia của chất gắn kết (CGK) Violuric acid (ViO) Các thuốc nhuộm hoạt tính thương mại của Nhà máy X20 được sử dụng để đánh giá hiệu quả loại màu bằng laccase thô Tổng thể tích phản ứng loại màu là 5 ml gồm đệm 20 mM natri acetate pH 4, màu thuốc nhuộm (nồng độ 100 mg/L), dịch laccase thô (nồng độ cuối 1.000 U/l) và CGK (nồng độ cuối 200 µM) Mẫu đối chứng có chứa màu, enzyme bị biến tính nhiệt ở 100oC

trong 10 phút và đệm natri acetate 20 mM pH4 Hiệu quả loại màu thuốc nhuộm được đánh giá trong vòng 24 giờ và được tính bằng công thức:

D = 100*(Ai - At)/Ai

Trong đó: D: Phần trăm loại màu thuốc nhuộm (%);

Ai: Độ hấp thụ ban đầu;

At: Độ hấp thụ tại thời gian t

2.7 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ CGK ViO lên khả năng loại màu thuốc nhuộm MN.FBN

Tổng thể tích phản ứng loại màu MN.FBN là 5 ml gồm đệm 20 mM natri acetate pH 4, màu thuốc nhuộm (nồng độ 100 mg/L), dịch laccase thô (nồng độ cuối 1.000 U/l) và nồng

độ CGK ViO với các nồng độ 0; 100; 200; 400; 600; 800 và 1000 µM Mẫu đối chứng có chứa màu, enzyme bị biến tính nhiệt ở 100oC trong 10 phút và đệm natri acetate 20 mM pH4 Hiệu suất loại màu được tính toán ở các khoảng thời gian khác nhau trong vòng 24

giờ Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần

2.8 Nghiên cứu khả năng loại màu ở các nồng độ khác nhau bởi laccase thô chủng FBV 40

Tổng thể tích loại màu MN.FBN là 5ml gồm đệm 20 mM natri acetate pH 4, màu thuốc nhuộm ở các nồng độ màu 5; 10; 15; 20; 30; 40 và 50 mg/L, dịch laccase thô nồng độ cuối

1000 U/L và nồng độ CGK là 600 µM Mẫu đối chứng có chứa màu ở các nồng độ khác nhau, enzyme bị biến tính nhiệt ở 100oC trong 10 phút và đệm natri acetate 20 mM pH4 Hiệu suất loại màu được tính toán ở các khoảng thời gian khác nhau trong vòng 24 giờ Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần

3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Các chủng nấm đã được phân lập

Từ 45 mẫu nấm và đất có gỗ mục được thu thập tại khu vực lấy mẫu, sau khi xử lý bề mặt được lắc và gạt trên môi trường PDA bổ sung chất chỉ thị guaiacol 0,01% Sau 4 ngày nuôi cấy, 6 chủng nấm có hệ sợi phát triển tốt, lan rộng trên bề mặt môi trường, hệ sợi nấm bông xốp có màu trắng, không mịn và tạo vòng nâu đỏ trên môi trường có chứa chất chỉ thị guaiacol Hoạt tính laccase insitu hiện trường cũng đã được tiến hành Kết quả thu được chứng tỏ các chủng này có khả năng sinh tổng hợp các enzyme ngoại bào thuộc nhóm peroxidase (MnP, LiP) hoặc oxidoreductase (laccase) Các kết quả được thể hiện ở bảng 1

Bảng 1 Các chủng nấm có khả năng sinh tổng hợp laccase

(U/L)

BT5 50

Chú thích: Hình thái khuẩn lạc (mặt trước - B và mặt sau - C) và hoạt tính laccase in situ (là hoạt tính của mẫu ngay trước khi phân lập) của các chủng nấm được nuôi cấy trên môi trường PDA bổ sung 0,01% guaiacol làm chất chỉ thị

Dựa vào kết quả đo hoạt tính enzyme laccase tại bảng 1, cho thấy chủng FBV40 có hoạt tính cao nhất, khả năng phát triển nhanh nên được lựa chọn để nghiên cứu phân loại, khả năng sinh tổng hợp laccase và khả năng loại màu thuốc nhuộm Chủng nấm được phân loại bằng sự kết hợp cả hai phương pháp truyền thống và so sánh độ tương đồng giữa trình

tự vùng ITS1-5,8S-ITS2 của chủng với các chủng đại diện trên GenBank

Hình 1 Hình thái sợi và bào tử của chủng FBV40 dưới kính hiển vị điện tử quét

JOLE với độ phân giải x 1.500

Quan sát các đặc điểm hình thái, khuẩn lạc trên đĩa thạch và hệ sợi nấm dưới kính hiển

vi điện tử, dựa vào khóa phân loại Robert A Samson chủng FBV40 thuộc nấm đảm Tuy

nhiên để làm rõ các kết quả phân loại truyền thống, việc xác định và so sánh so sánh độ tương đồng giữa trình tự vùng ITS1-5,8S-ITS2 của chủng này đại diện trên với các đại diện trên GenBank đã được tiến hành Trình tự vùng ITS1-5,8S-ITS2 được khuếch đại bởi

cặp mồi ITS1-ITS4 của chủng nấm FBV40 Sử dụng các phần mềm đã được mô tả ở phần phương pháp, cây phát sinh chủng loại đã được xây dựng ở hình 2 Từ cây phát sinh chủng

loài cho thấy chủng FBV40 gần gũi nhất với các đại diện thuộc chi Basidiomycetes với mức độ tương đồng 96 đến 99% tương ứng với các chủng là B sp HKC4 được thu thập từ vùng biển Hawai (Mỹ) [10] và chủng B sp C2-14 được thu thập từ rặng san hồ ở Phúc Kiến (Trung Quốc) và 93 đến 99% với chi đại diện của Rigidoporus lần lượt là R Vinctus C1-9 được phân lập từ vùng biển san hô của vùng biển Phúc Kiến và R Vinctus FRIM 142 được phân lập từ rừng nhiệt đới ở Malaysia (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) Hiện chưa có

nhiều nghiên cứu về đặc điểm hình thái cũng như khả năng sinh tổng hợp laccase của các chủng nấm trên Từ cây phát sinh chủng loại, đặc điểm hình thái, chủng nấm FBV40 thuộc

chi Rigidoporus và được đặt tên là Rigidoporus sp FBV40

Hình 2 Cây phát sinh chủng loại chủng FBV40

Hình 3 Sinh tổng hợp laccase thô chủng FBV 40 trên các môi trường

Môi trường phù hợp để sinh tổng hợp laccase

Bảy môi trường nuôi cấy đã được lựa chọn để khảo sát khả năng sinh tổng hợp laccase thô của chủng FBV40, kết quả được mô tả ở hình 3

Từ kết quả ở hình 3, trên môi trường TSH1 chủng FBV40 có khả năng sinh tổng hợp laccase thô cao nhất lên tới 107.708 U/L sau 8 ngày nuôi cấy Tiếp đến là ở môi trường PDB

có bổ sung 1% bột đậu tương đạt 41.343 U/L sau 6 ngày nuôi cấy và ở các môi trường Czapeck, Vis và MEG với hoạt tính lần lượt thu được là 5; 13; 12 và 68,7 U/L mặc dù đây đều là các môi trường cơ bản để nuôi cấy nấm nhưng hoạt tính laccase thô thu được lại rất

thấp Theo nghiên cứu của Cambria và cs về chủng nấm R lignosus có hoạt tính lần lượt là

120.000 U/L và 75.000 U/L khi bổ sung chất cảm ứng là phenylhydrazine, guaniancol trong môi trường nuôi cấy có bổ sung 25mM Nito và 500 µg/L CuSO4 trong môi trường sau 21-24 ngày nuôi cấy [8] Ở Việt Nam, khi nghiên

cứu khả năng sinh tổng hợp laccase của chủng nấm Trichoderma sp FCP3 phân lập từ gỗ

mục ở rừng Quốc gia Cúc Phương hoạt tính đạt cao nhất khi bổ sung NaNO3 và KNO3 (tỷ lệ 3:7) với nồng độ 3 g/l vào môi trường và có hoạt tính là 132 U/l Như vậy, có thể thấy rằng thành phần môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng rất lớn tới khả năng sinh tổng hợp laccase của chủng FBV40 Môi trường TSH1 là môi trường phù hợp nhất trong số các môi trường khảo sát để FBV40 có khả năng sinh tổng hợp laccase có hoạt tính cao nhất

Hiệu suất loại màu thuốc nhuộm hoạt tính bởi laccase thô

Với mục đích sử dụng enzyme thô để phục vụ khảo sát khả năng loại màu thuốc nhuộm hoạt tính để nhuộm vài may quân trang, chủng nấm FBV40 được nuôi lắc trên môi trường TSH1 và hoạt tính laccase cao nhất thu được sau 8 ngày nuôi cấy là 107.708U/L Kết quả chứng minh rằng laccase thô từ chủng FBV40 trên có khả năng loại được các màu hoạt tính ở mức độ khác nhau, khi sử dụng phương pháp đánh giá khả năng loại màu trên thiết

bị UV-VIS Kết quả loại màu được trình bày ở bảng 2

Bảng 2 Khả năng loại màu một số thuốc nhuộm hoạt tính sử dụng

trong quân đội bằng laccase thô chủng FBV40

C

T

MT BES

NY S3R

C

T

MY BES

C

Chú thích: C- Đường biểu diễn màu đối chứng; T- Đường biểu diễn màu thí nghiệm

Đối với các màu thuốc nhuộm hoạt tính khi không sử dụng CGK, laccase của chủng nấm FBV40 có ít khả năng loại màu thuốc nhuộm hoạt tính được sử dụng trong nghiên cứu này Hiệu suất loại các màu này bởi laccase thô chủng FBV40 khi không có CGK dao động trong khoảng từ 1 đến 5,56% sau 24 giờ thí nghiệm, cao nhất chỉ đạt 5,56% đối với màu MR.EBR

Hiệu suất loại màu thuốc nhuộm hoạt tính bởi laccase thô khi sử dụng CGK là ViO sau

24 giờ khá cao Với hiệu suất loại màu hoạt tính thương mại nằm trong khoảng rất rộng từ 4,22% đến 88,11%, trong đó, hiệu suất loại màu thấp nhất là màu MY-BES chỉ đạt 4,22%

và cao nhất đối với màu MN FBN lên tới 88,11% sau 24h phản ứng Kết quả thu được cho thấy vai trò của CGK trong phản ứng loại màu của laccase bởi chủng FBV40 đối với các màu thuốc nhuộm hoạt tính từ nhà máy X20, trong đó, đặc biệt là khả năng loại màu MN.FBN với hiệu suất tăng từ 0,22% đến 88,11% và màu NN.SG từ 0,11% đến 77,05% Đặc biệt, hiệu suất loại màu không có sự biến động lớn sau 24 giờ khi có mặt của CGK

Từ kết quả này cho thấy vai trò của CGK rất quan trọng trong việc loại màu thuốc nhuộm bởi laccase thô chủng FBV40 Số liệu thực nghiệm cho thấy, enzyme thô chủng FBV40 có hiệu quả cao trong việc loại các màu thuốc nhuộm thuộc nhóm màu có 2 gốc azo và có màu xanh lá cây hoặc xanh đen (đây là những màu được sử dụng chính để nhuộm vải may quân trang cho quân đội hiện nay), còn những màu mang nhóm màu có gốc azo đơn và có màu vàng, đỏ hoặc xanh da trời, laccase thô từ chủng FBV40 loại màu kém hơn rất nhiều Theo nghiên cứu khi sử dụng 09 chủng trong tập đoàn HN1 đã loại màu được 83,89% đối với màu 100 mg/L Reactive Blue 222 (MN.FBN) sau 15 h nuôi lắc [2] Khi loại màu RB

222 bằng phản ứng phenton thì loại màu được gần 90% và tăng lên đạt 96,88% và đạt

95,23% sau khi xử lý hiếu khí bằng 2 chủng nấm đảm trắng P.ostreatus IBL-02 và P chrysosporium IBL-03 [14] Chủng Pseudomonas sp D4 được phân lập từ nước thải nhà

máy nhuộm có khả năng loại màu cao nhất đối với màu 100 mg/l RB 222 sau 24 h đạt 70%

ở pH 7 và nhiệt độ nuôi cấy 350C [18] Hiện chưa có nhiều công trình nghiên cứu trong nước

và quốc tế về sử dụng laccase thô để loại màu RB 222 Khi nghiên cứu khả năng loại màu của laccase tinh sạch với hoạt tính 20 U/L rLac15 thu từ chủng vi khuẩn nước biển khi có

T

C MR EBR

C

T

MN FBN

NY FN2R

C

T

T

C

NN SG