Nghiên cứu ảnh hưởng của các elicitor hệ thống LED cải tiến môi trường hai lớp đến quá trình nhân giống tạo củ và tích lũy saponin trong sâm ngọc linh panax vietnamensis ha et grushv in vitro

HỒ CHÍ MINH --- CÔNG TRÌNH DỰ THI GIẢI THƯỞNG SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC EURÉKA LẦN THỨ XX NĂM 2018 NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC ELICITOR, HỆ THỐNG LED CẢI TIẾN, MÔI TRƯỜNG HAI LỚP

ĐOÀN THANH NIÊN CỘNG SẢN HỒ CHÍ MINH

BAN CHẤP HÀNH TP HỒ CHÍ MINH

-

CÔNG TRÌNH DỰ THI GIẢI THƯỞNG SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC EURÉKA

LẦN THỨ XX NĂM 2018

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC ELICITOR, HỆ THỐNG LED CẢI TIẾN, MÔI TRƯỜNG HAI LỚP ĐẾN QUÁ TRÌNH NHÂN GIỐNG, TẠO CỦ VÀ TÍCH LŨY SAPONIN

TRONG SÂM NGỌC LINH (PANAX

VIETNAMENSIS HA ET GRUSHV.) IN VITRO

LĨNH VỰC NGHIÊN CỨU: CÔNG NGHỆ SINH – Y SINH

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Mã số công trình: ………

(Phần này do BTC Giải thưởng ghi)

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT viii

DANH MỤC HÌNH ẢNH ix

DANH MỤC BẢNG xii

TÓM TẮT 1

MỞ ĐẦU 2

1 Lý do chọn đề tài 2

2 Mục tiêu nghiên cứu 3

3 Đối tượng nghiên cứu 4

4 Phạm vi nghiên cứu 6

5 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn 7

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 9

1.1 Giới thiệu về vi nhân giống và các elicitor 9

1.1.1 Khái niệm vi nhân giống 9

1.1.2 Các chất cảm ứng – Elicitor 10

1.1.2.1 Than hoạt tính 10

1.1.2.2 Saccharose 11

1.1.2.3 Bạc nitrate 12

1.1.3 Phương pháp nuôi cấy lỏng lắc 12

1.1.4 Vai trò của ánh sáng trong vi nhân giống 14

1.1.4.1 Vai trò của ánh sáng đối với quá trình quang hợp ở thực vật 14

1.1.4.2 Vai trò của ánh sáng đối với quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật 15

1.1.4.3 Vai trò của ánh sáng trong nhân giống in vitro 17

1.1.4.4 Nguồn chiếu sáng nhân tạo sử dụng trong nuôi cấy in vitro hiện nay 18

1.1.5 Đèn LED (Light Emitting Diode) 21

1.1.5.1 Giới thiệu đèn LED 21

1.1.5.2 Ưu, nhược điểm của đèn LED 22

1.1.5.3 Một số thành tựu trên thế giới và Việt Nam khi sử dụng nguồn sáng LED trong nuôi cấy in vitro 23

1.1.5.4 Hướng phát triển ứng dụng của đèn LED trong nuôi cấy in vitro ở Việt Nam 26

1.1.6 Ánh sáng đối với thực vật 27

1.1.6.1 Vai trò của một số phổ ánh sáng đơn sắc đến đời sống thực vật 27

1.1.6.2 Vai trò của ánh sáng đến quá trình tích lũy các chất hữu cơ đối với thực vật 29

1.2 Phương pháp định tính và định lượng saponin trong Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 32

1.2.1 Định tính saponin trong Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) bằng phương pháp Sắc ký lớp mỏng 32

1.2.2 Định lượng saponin trong Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) phương pháp Sắc ký lỏng hiệu năng cao 33

1.3 Sơ lược về cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 36

1.3.1 Giới thiệu sơ lược về cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 36

1.3.2 Đặc điểm hình thái 37

1.3.3 Đặc điểm sinh trưởng và phát triển 38

1.3.4 Đặc điểm phân bố 39

1.3.5 Nhân giống cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 39

1.3.5.1 Nhân giống từ hạt 39

1.3.5.2 Nhân giống in vitro 41

1.3.6 Thành phần hóa học và tác dụng dược lý của cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 41

1.3.6.1 Thành phần hóa học 41

1.3.6.2 Tác dụng dược lý 42

1.3.7 Một số nghiên cứu về nhân giống và bảo tồn cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 44

1.3.7.1 Nghiên cứu về nhân giống và bảo tồn nguồn gene cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) trên thế giới 44

1.3.7.2 Nghiên cứu về nhân giống và bảo tồn nguồn gene cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) ở Việt Nam 45

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 49

2.1 Địa điểm và thời gian tiến hành đề tài 49

2.1.1 Địa điểm 49

2.1.2 Thời gian 49

2.2 Vật liệu 49

2.2.1 Nguồn mẫu 49

2.2.2 Môi trường và điều kiện nuôi cấy 49

2.2.3 Thiết bị và dụng cụ 50

2.3 Phương pháp nghiên cứu 50

2.3.1 Thiết kế hệ thống chiếu sáng cải tiến đèn LED đơn 52

2.3.2 Thiết kế hệ thống chiếu sáng cải tiến đèn LED hỗn hợp 53

2.4 Bố trí thí nghiệm 54

2.4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của than hoạt tính đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 54

2.4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của saccharose đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 54

2.4.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của bạc nitrate (AgNO3) đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 55

2.4.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của ánh sáng LED đơn cải tiến đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 56

2.4.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của ánh sáng LED hỗn hợp với tỷ lệ 50:50 (đỏ-vàng; đỏ-xanh dương, vàng-xanh dương) đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 57

2.4.6 Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng của nuôi cấy lỏng tĩnh và lỏng lắc (giai đoạn cảm ứng) đến khả năng tăng trưởng của Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) in vitro 58

2.4.7 Thí nghiệm 7: Khảo sát ảnh hưởng của môi trường hai lớp (kiểu bổ sung các thành phần dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy) đến khả năng tăng trưởng, tạo củ Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) in vitro 59

2.5 Hình thái giải phẫu Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) in vitro 59

2.5.1 Hình thái giải phẫu khí khổng Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) in vitro sau 12 tuần nuôi cấy trong các hệ thống LED cải tiến 59

2.5.2 Hình thái giải phẫu củ Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) in vitro 61

2.6 Xác định hàm lượng chlorophyll trong sản phẩm Sâm Ngọc Linh (Panax

vietnamensis Ha et Grushv.) từ quá trình nuôi cấy in vitro dưới hệ thống LED cải

tiến 62

2.7 Thu nhận hợp chất saponin triterpenoid từ sản phẩm của quá trình nuôi cấy in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) trong môi trường hai lớp 63

2.7.1 Định tính saponin triterpenoid bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng 63

2.6.2 Định lượng saponin triterpenoid bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chrotomatography – HPLC) 63

2.7 Chỉ tiêu theo dõi 64

2.8 Thống kê và xử lý số liệu 64

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 65

3.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của elicitor than hoạt tính đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 65

3.2 Thí nghiệm 2 Ảnh hưởng của elicitor saccharose đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 68

3.3 Thí nghiệm 3 Ảnh hưởng của elicitor AgNO3 đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 71

3.4 Thí nghiệm 4 Ảnh hưởng của ánh sáng LED đơn cải tiến đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 74

3.5 Thí nghiệm 5 Ảnh hưởng của ánh sáng LED hỗn hợp cải tiến đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 76

3.6 Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng của nuôi cấy lỏng tĩnh và lỏng lắc (giai đoạn cảm ứng) đến khả năng tăng trưởng của Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 80

3.7 Thí nghiệm 7: Ảnh hưởng của kiểu bổ sung các thành phần môi trường nuôi cấy (môi trường hai lớp) đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro và tích lũy saponin của Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 82

3.8 Hình thái Giải phẫu cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) in vitro 88

3.8.1 Hình thái Giải phẫu khí khổng Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) in vitro sau 12 tuần nuôi cấy trong hệ thống LED cải tiến 88

3.8.2 Hình thái Giải phẫu củ in vitro cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 90

3.9 Xác định hàm lượng chlorophyll trong sản phẩm Sâm Ngọc Linh (Panax

vietnamensis Ha et Grushv.) từ quá trình nuôi cấy in vitro dưới hệ thống LED cải tiến 92

3.10 Định tính saponin bằng sắc ký lớp mỏng 93

3.11 Định lượng saponin trong củ sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) in vitro sau 16 tuần nuôi cấy bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao 93

CHƯƠNG 4: KẾT LUẠN VÀ KIẾN NGHỊ 96

4.1 Kết luận 96

4.2 Kiến nghị 97

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao Sắc ký lớp mỏng cao áp Acid b-Indolyacetic Acid b-Indolybutyric Cường độ ánh sáng đỏ xa Cường độ ánh sáng đỏ Monopotassium phosphate Khoa học công nghệ Kinetin

Light-Emmitting Diode Murashige và Skoog, 1962 Acid a-naphtaleneacetic Sodium hypocloride Schenk và Hildebrandt, 1972 Thidiazuron

Sắc ký lớp mỏng Sắc ký lỏng hiệu năng cao siêu nhanh Woody Plant Medium

2,4-Dichlorophenoxy acetic acid

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Các bước sóng ánh sáng (nguồn Internet) 14

Hình 1.2 A Sự hấp thu các bước sóng bởi các loại sắc tố quang hợp và cường độ quang hợp; B Sự hấp thu ánh sáng của chlorophyll a và chlorophyll b (nguồn Internet) 16 Hình 1.3 Các hệ thống chiếu sáng bằng đèn LED a Đèn LED với tỷ lệ chiếu sáng 70% LED đỏ kết hợp 30% LED xanh; b LED uni-Pack (LP) (Nguyễn Bá Nam, 2012) 21

Hình 1.4 Hệ thống nuôi cấy LED truyền điện không dây (Wireless power transfer – LED uni-Pack (WPT - LP)) a Thiết bị phát; b Thiết bị thu; c.d Hoạt động của hệ thống (Nguyễn Bá Nam, 2012) 26

Hình 1.5 Các bước của quá trình sắc ký lớp mỏng 33

Hình 1.6 Sơ đồ hệ thống Sắc ký lỏng hiệu năng cao – HPLC 35

Hình 1.7 Hệ thống Sắc ký lỏng hiệu năng cao – HPLC 35

Hình 1.8 Cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) (Nhut et al., 2011) 36

Hình 1.9 Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) (nguồn Internet) 37

Hình 2.1 Mô hình thiết kế hệ thống chiếu sáng cải tiến đèn LED đơn a Hệ thống chiếu sáng đèn LED trắng; b Hệ thống chiếu sáng đèn LED vàng; c Hệ thống chiếu sáng đèn LED xanh dương; d Hệ thống chiếu sáng đèn LED đỏ 53

Hình 2.2 Hệ thống chiếu sáng cải tiến đèn LED đơn sau khi thiết kế và thi công a Hệ thống chiếu sáng đèn LED trắng; b Hệ thống chiếu sáng đèn LED vàng; c Hệ thống chiếu sáng đèn LED xanh dương; d Hệ thống chiếu sáng đèn LED đỏ 53

Hình 2.3 Mô hình hệ thống chiếu sáng cải tiến đèn LED kết hợp a 100% LED đỏ (ĐC); b 50% LED đỏ kết hợp 50% LED vàng; c 50% LED đỏ kết hợp 50% LED xanh dương; d 50% LED vàng kết hợp 50% LED xanh dương 54

Hình 2.4 Hệ thống chiếu sáng cải tiến đèn LED hỗn hợp sau khi thiết kế và thi công a Tỷ lệ chiếu sáng 100% LED đỏ (ĐC); b Tỷ lệ 50% LED đỏ kết hợp 50% LED vàng; c Tỷ lệ 50% LED đỏ kết hợp 50% LED xanh dương; d Tỷ lệ 50% LED vàng kết hợp 50% LED xanh dương 54

Hình 3.1 Ảnh hưởng của elicitor than hoạt tính đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro

Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) sau 12 tuần nuôi cấy A0,

A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7 tương ứng với nồng độ than hoạt tính lần lượt là 0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5 g/L 67

Hình 3.2 Ảnh hưởng nồng độ elicitor saccharose đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro

Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) sau 12 tuần nuôi cấy B0,

B1, B2, B3, B4, B5, B6, B7 tương ứng với nồng độ saccharose lần lượt là 30; 40; 50; 60; 70; 80 g/L 70 Hình 3.3 Ảnh hưởng nồng độ elicitor AgNO3 đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro

Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) sau 12 tuần nuôi cấy C0,

C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7 tương ứng với nồng độ AgNO3 lần lượt là 0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5 mg/L 73

Hình 3.4 Ảnh hưởng của ánh sáng LED đơn cải tiến đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in

vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) sau 12 tuần nuôi

cấy D0, D1, D2, D3, D4 tương ứng với với nguồn sáng là đèn huỳnh quang; LED trắng; LED vàng; LED xanh dương; LED đỏ 75 Hình 3.5 Ảnh hưởng của ánh sáng LED hỗn hợp cải tiến đến khả năng tăng trưởng, tạo củ

in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) sau 12 tuần nuôi

cấy G0, G1, G2, G3 tương ứng với với các tỷ lệ 100% đỏ; 50% đỏ:50% vàng; 50% đỏ:50% xanh dương và 50% vàng:50% xanh dương 79 Hình 3.6 Ảnh hưởng của nuôi cấy lỏng tĩnh và lỏng lắc (giai đoạn cảm ứng) đến khả năng

tăng trưởng của Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) sau 3

tuần nuôi cấy L0, L1, L2 tương ứng với trạng thái nuôi cấy là rắn (agar), lỏng tĩnh, lỏng lắc 81 Hình 3.7 Ảnh hưởng của kiểu bổ sung các thành phần môi trường nuôi cấy đến khả năng

tăng trưởng, tạo củ in vitro của Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et

Grushv.) sau 16 tuần nuôi cấy 83

Hình 3.8 Ảnh chụp hiển vi soi nổi hình thái cây và củ Sâm Ngọc Linh (Panax

vietnamensis Ha et Grushv.) in vitro sau 16 tuần nuôi cấy 87

Hình 3.9 Cấu tạo củ Sâm Ngọc Linh Ngọc in vitro sau 16 tuần nuôi cấy 88

Hình 3.10 Ảnh chụp dưới kính hiển vi sôi nổi và ảnh chụp hình thái giải phẫu khí khổng

dưới kính hiển vi quang học của lá Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) in vitro sau 12 tuần nuôi cấy dưới các điều kiện chiếu sáng khác nhau 89

Hình 3.11 Ảnh chụp hình thái giải phẫu dưới kính hiển quang học củ Sâm Ngọc Linh

(Panax vietnamensis Ha et Grushv.) sau 16 tuần nuôi cấy; a) Lát cắt dọc chồi

mọc từ củ; b) Lát cắt ngang củ; c1) Lát cắt ngang mô củ, c2) Hình thái tế bào

mô củ, c3) Mô củ với tế bào nhân bắt màu hồng đậm (mũi tên), c4) Hình thái

bó mạch trong lát cắt dọc củ 91 Hình 3.12 Sắc ký đồ HPLC định lượng Rg1 và Rb1 ở nghiệm thức E8 (nuôi cấy trên môi

trường 2 lớp lỏng-rắn: có than hoạt tính) Sâm Ngọc Linh (Panaxx

vietnamensis Ha et Grushv.) sau 16 tuần nuôi cấy 92

Hình 3.13 Sắc ký đồ HPLC định lượng Rg1 và Rb1 ở nghiệm thức ĐC (nuôi cấy trên môi

trường agar một lớp: không than hoạt tính) Sâm Ngọc Linh (Panaxx

vietnamensis Ha et Grushv.) sau 16 tuần nuôi cấy 94

Hình 3.14 Sắc ký đồ HPLC định lượng Rg1 và Rb1 ở nghiệm thức E8 (nuôi cấy trên môi

trường 2 lớp lỏng-rắn: có than hoạt tính) Sâm Ngọc Linh (Panaxx

vietnamensis Ha et Grushv.) sau 16 tuần nuôi cấy 95

Bảng 2.1 Khảo sát ảnh hưởng của than hoạt tính đến sự tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm

Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 55 Bảng 2.2 Khảo sát ảnh hưởng của saccharose đến sự tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm

Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 56

Bảng 2.3 Khảo sát ảnh hưởng của AgNO3 đến sự tăng trưởng, tạo củ in vitro của cây Sâm

Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 57 Bảng 2.4 Ảnh hưởng ánh sáng LED đơn đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm

Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 58

Bảng 2.5 Ảnh hưởng của ánh sáng LED cải tiến hỗn hợp với tỷ lệ 50:50 (vàng;

đỏ-xanh dương, vàng-đỏ-xanh dương) đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 59

Bảng 2.6 Khảo sát ảnh hưởng của nuôi cấy lỏng tĩnh và lỏng lắc (giai đoạn cảm ứng) đến

khả năng tăng trưởng của Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 60

Bảng 2.7 Khảo sát ảnh hưởng của kiểu bổ sung các thành phần môi trường nuôi cấy đến

khả năng tăng trưởng, tạo củ và tích lũy saponin trong củ Sâm Ngọc Linh

(Panax vietnamensis Ha et Grushv.) in vitro 61 Bảng 3.1 Ảnh hưởng của elicitor than hoạt tính đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro

của Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) sau 12 tuần nuôi cấy 65 Bảng 3.2 Ảnh hưởng nồng độ elicitor saccharose đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in

vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) sau 12 tuần nuôi cấy 68

Bảng 3.3 Ảnh hưởng nồng độ elicitor AgNO3 đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro

Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) sau 12 tuần nuôi cấy 71 Bảng 3.4 Ảnh hưởng của ánh sáng LED đơn cải tiến đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in

vitro của cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) sau 12 tuần

nuôi cấy 74

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của ánh sáng LED hỗn hợp cải tiến đến khả năng tăng trưởng, tạo

củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) sau 12 tuần

nuôi cấy 77 Bảng 3.6 Ảnh hưởng của nuôi cấy lỏng tĩnh và lỏng lắc (giai đoạn cảm ứng) đến khả

năng tăng trưởng của cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)

sau 3 tuần nuôi cấy 80

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của môi trường hai lớp đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro và

tích lũy saponin của Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) sau

16 tuần nuôi cấy 82

Bảng 3.8 Hàm lượng chlorophyll trong lá Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et

Grushv.) in vitro sau 12 tuần nuôi cấy trong các điều kiện chiếu sáng khác

nhau 92

Bảng 3.9 Kết quả phân tích HPLC hàm lượng saponin (ginsenoside Rg1 và Rb1) trong củ

Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) in vitro sau 16 tuần nuôi

cấy khi khảo sát ảnh hưởng của kiểu bổ sung dinh dưỡng vào môi trường nuôi cấy 94

TÓM TẮT

Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành các hướng sau đây:

Đầu tiên là khảo sát ảnh hưởng của các elicitor (than hoạt tính, saccharose và bạc

nitrate) đến sự tăng trưởng và tạo củ in vitro cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha

et Grushv.) Kết quả cho thấy môi trường SH bổ sung 1 g/L than hoạt tính thích hợp cho

sự tăng trưởng và tạo củ in vitro cây Sâm Ngọc Linh Đối với saccharose, bổ sung 30 g/L

thích hợp cho việc tạo cây con hoàn chỉnh, để nhân sinh khối mô sẹo Sâm Ngọc Linh thì

in vitro Sâm Ngọc Linh

Thứ hai là cải tiến hệ thống chiếu sáng LED (sử dụng các bóng LED tròn, dễ sử dụng, dễ lắp đặt, dễ thay thế, linh hoạt trong thiết kế và thi công, tiết kiệm điện năng, tỏa nhiệt lượng thấp, tiết kiệm chi phí đầu tư, tăng hiệu quả kinh tế) Kết quả cho thấy khi

nghiên cứu ảnh hưởng của LED đơn đến sự tăng trưởng và tạo củ in vitro cây Sâm Ngọc

Linh Đối với nguồn sáng LED hỗn hợp thì LED xanh dương và LED đỏ kết hợp tỷ lệ

50:50 thích hợp cho sự tăng trưởng và tạo củ in vitro cây Sâm Ngọc Linh

Thứ ba là tiến hành nuôi cấy lỏng (lỏng tĩnh và lỏng lắc – giai đoạn cảm ứng) Kết quả cho thấy nuôi cấy lỏng lắc giúp mẫu cấy tăng trưởng mạnh, nhân nhanh sinh khối, rất thích hợp cho giai đoạn nuôi cấy cảm ứng Sâm Ngọc Linh

Thứ tư là sau giai đoạn nuôi cấy cảm ứng các mẫu cấy được cấy chuyền sang môi trường hai lớp (lớp trên và lớp dưới khác nhau về trạng thái vật lý, thành phần các chất dinh dưỡng) nhằm tìm ra các kiểu bổ sung các thành phần dinh dưỡng thích hợp cho sự

tăng trưởng, tạo củ và tích lũy saponin trong củ Sâm Ngọc Linh in vitro Đây là một

hướng nghiên cứu mới rất có ý nghĩa đối với nhân giống Sâm Ngọc Linh, một loài dược liệu quý hiếm, có giá trị kinh tế cao, là loài Sâm đặc hữu của Việt Nam Kết quả cho thấy môi trường hai lớp lỏng-rắn (lỏng-agar): lớp trên lỏng có than hoạt tính và lớp dưới rắn có than hoạt tính thích hợp nhất cho sự tăng trưởng, tạo củ và tích lũy saponin trong Sâm

Ngọc Linh in vitro Sau 16 tuần nuôi cấy, mẫu cấy tăng trưởng mạnh, tạo củ kích thước

lớn, hình thái củ tương tự trong tự nhiên Kết quả định tính saponin bằng sắc ký lớp mỏng

cho thấy có sự xuất hiện saponin trong Sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro Kết quả định

lượng saponin bằng phương pháp HPLC (ginsengnoside Rg1 và Rb1) cho thấy có sự hiện diện của 2 loại saponin này với hàm lượng cao

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Sâm Ngọc Linh có tên khoa học là Panax vietnamensis Ha et Grushv., thuộc họ Nhân Sâm (Araliaceae) Chữ Panax xuất phát từ chữ Panacea trong tiếng Hy Lạp, có nghĩa là thuốc trị bá bệnh, thần dược Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et

Grushv.) là một loài Sâm đặc hữu của Việt Nam được biết đến từ năm 1973 Tại hội nghị quốc tế về Sâm, loài Sâm này được xếp vào nhóm Sâm quý trên thế giới cùng với Sâm

Triều Tiên (Panax ginseng), Sâm Mỹ (Panax quinquefolium),… (Phai et al., 2002)

Sâm Ngọc Linh là một trong những cây dược liệu quý cần được bảo tồn, có tên trong Sách Đỏ Việt Nam 2007 [25] Sâm Ngọc Linh chứa 52 loại saponin, 17 acid amin,

20 chất khoáng vi lượng và 0,1% tinh dầu Sâm Ngọc Linh có hàm lượng saponin khung dammaran cao nhất (khoảng 12 – 15%) và lượng saponin triterpenoidoid nhiều nhất so

với các loài khác của chi Panax trên thế giới (Le Thi Hong Van et al., 2015) Qua nhiều

nghiên cứu, các nhà khoa học ở Việt Nam và trên thế giới đã thấy rằng Sâm Ngọc Linh không chỉ có các tác dụng dược lý đặc trưng của chi Nhân Sâm mà còn có những tác dụng dược lý điển hình như chống stress, chống trầm cảm, chống oxy hóa, chống ung thư và tăng cường hệ miễn dịch (Nguyễn Thượng Dong và cộng sự, 2007) Với những đặc điểm

đó, Sâm Ngọc Linh không chỉ là loài Sâm quý của Việt Nam mà còn là của thế giới Việc nhân giống Sâm Ngọc Linh còn gặp nhiều khó khăn do đây là loài đặc hữu của Việt Nam, yêu cầu sinh thái rất khắt khe, tăng trưởng rất chậm và chỉ trồng được ở các khu vực quanh đỉnh núi Ngọc Linh (thuộc địa phận hai tỉnh Kon Tum và Quảng Nam) Thời gian trồng trọt phải kéo dài từ 6 đến 7 năm mới có thể thu hoạch (do củ cần nhiều thời gian để tích lũy các hợp chất sinh học quý giá) Các nghiên cứu về loài Sâm này chưa nhiều, chưa có một quy trình nhân giống hoàn chỉnh phổ biến được chuyển giao công nghệ Đây là loài dược liệu đắt tiền bậc nhất, nhu cầu thị trường rất cao, khai thác cạn kiệt

và đang đứng trước nguy cơ bị tuyệt chủng Đang được Chính phủ quan tâm và chú trọng đầu tư phát triển Xuất phát từ những yêu cầu cấp thiết đó chúng tôi tiến hành đề tài

“Nghiên cứu ảnh hưởng của các elicitor, hệ thống LED cải tiến, môi trường hai lớp đến

quá trình nhân giống, tạo củ và tích lũy saponin trong Sâm Ngọc Linh (Panax

vietnamensis Ha et Grushv.) in vitro” được thực hiện tại phòng thí nghiệm Công nghệ

sinh học thực vật nhằm mục đích cải tiến môi trường, điều kiện nuôi cấy, hệ thống nuôi cấy, kiểu bổ sung thành phần dinh dưỡng (môi trường hai lớp lỏng-rắn) và hoàn thiện quy trình nhân nhanh loài Sâm quý này góp phần bảo tồn và nhân nhanh giống loài Sâm đặc hữu của Việt Nam

2 Mục đích nghiên cứu

hưởng đến quá trình sinh trưởng và tích lũy saponin của cây Sâm Ngọc Linh (Panax

vietnamensis Ha et Grushv.) nhằm tìm ra nồng độ thích hợp của các elicitor trên bổ sung

vào môi trường nuôi cấy giúp mẫu cấy tăng trưởng và tích lũy saponin tối ưu

thích hợp, tiến hành thiết kế hệ thống chiếu sáng cải tiến sử dụng đèn LED bóng tròn được sản xuất sẵn có thể sử dụng trực tiếp nguồn điện 220V để lắp đặt và thi công trong thiết kế hệ thống LED đơn và LED kết hợp để khảo sát ảnh hưởng của các bước sóng ánh sáng LED riêng lẻ (đỏ, xanh dương, vàng và trắng) và LED kết hợp (đỏ-vàng; đỏ-xanh dương, vàng-xanh dương với tỷ lệ kết hợp là 50:50) đến quá trình quá trình sinh trưởng,

tạo củ và tích lũy saponin của cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)

Sau khi xác định được nguồn chiếu sáng thích hợp, để đẩy nhanh tốc độ tăng trưởng của mẫu cấy, tiến hành nuôi cấy lỏng (lỏng tĩnh và lỏng lắc) nhằm tìm ra điều kiện nuôi cấy thích hợp (lỏng lắc-giai đoạn cảm ứng) giúp thúc đẩy mẫu cấy tăng trưởng nhanh Sau giai đoạn nuôi cấy cảm ứng các mẫu cấy sẽ được cấy chuyền sang môi trường nuôi cấy hai lớp nhằm tìm ra kiểu bổ sung các thành phần môi trường nuôi cấy thích hợp cho sự

tăng trưởng, tạo củ và tích lũy saponin trong củ Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha

et Grushv.) Mục đích nghiên cứu giúp rút ngắn thời gian nhân giống, tăng số lượng và

chất lượng cây giống, giúp hạ giá thành sản phẩm, góp phần bảo tồn và cung cấp nguồn

gene Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) quý giá Cung cấp cây giống

chất lượng cao với số lượng lớn không giới hạn cho các nhà vườn, doanh nghiệp trồng làm nguyên liệu dược và thực phẩm chức năng, từ đó có thể cải thiện đời sống nhân dân, tiến dần đến thương mại hóa sản phẩm Sâm Ngọc Linh, tạo thương hiệu cho sản phẩm đặc hiệu của Việt Nam

3 Đối tượng nghiên cứu

Sâm Ngọc Linh là một cây dược liệu quý và có giá trị kinh tế cao của Việt Nam (40 – 100 triệu VNĐ/kg) Từ đầu tháng 10/2017, Ủy Ban Nhân Dân huyện Nam Trà My (Quảng Nam) đã chính thức mở phiên chợ Sâm Ngọc Linh nhằm góp phần tìm ra giải pháp duy trì, bảo tồn và phát huy giá trị Sâm Ngọc Linh theo Chương trình phát triển sản phẩm quốc gia đến năm 2020 do Thủ tướng Chính Phủ phê duyệt Tại phiên chợ Sâm Ngọc Linh lần thứ 6 được tổ chức vào đầu tháng 3/2018, Sâm Ngọc Linh có giá bán từ 85 triệu/kg [79] Từ khi phát hiện năm 1973 đến 1995 thì loài này đã bị khai thác cạn kiệt và đang đối mặt với nguy cơ tuyệt chủng mất nguồn gene quý hiếm (Trần Công Luận, 2003) Đến nay, quần thể Sâm Ngọc Linh tự nhiên đang bị khai thác mạnh mẽ, dẫn tới nguy cơ tận diệt do nhu cầu của thị trường dược liệu ngày càng tăng cao Ngày 12/9/2015, Phó Thủ tướng Chính phủ Vũ Đức Đam đã phê duyệt Đề án bảo tồn và phát triển cây Sâm Ngọc Linh (Sâm Việt Nam) đến năm 2030 trị giá 9.500 tỷ đồng nhằm bảo vệ nguồn gene quý, kết hợp bảo vệ và phát triển nguồn nguyên liệu Sâm góp phần xóa đói giảm nghèo,

phát triển kinh tế - xã hội (nguồn Internet)

Hoàng Hải Anh và cộng sự (2011) đã báo cáo rằng Sâm Việt Nam nuôi cấy mô cũng

có các saponin chính tương tự như Sâm Việt Nam tự nhiên, gồm G-Rb1, G-Rg1, G-Rd, G-Re, N-R1 và M-R2 Tuy hàm lượng tổng cộng các saponin chính trong Sâm Việt Nam nuôi cấy mô chưa cao (0,3% so với 12,96% trong Việt Nam thiên nhiên)

Việc nghiên cứu hoàn chỉnh quy trình nuôi cấy mô cây Sâm Ngọc Linh cung cấp nguồn cây Sâm giống cho trồng trọt và sử dụng để thay thế Sâm thiên nhiên, đã mở ra một hướng mới trong sản xuất nguyên liệu cây Sâm Ngọc Linh: chủ động được nguồn nguyên liệu dồi dào trong thời gian ngắn, phục vụ công tác nghiên cứu, sản xuất thuốc và các sản phẩm thực phẩm chức năng

Hiện nay, cây Sâm Ngọc Linh là đối tượng đang rất được quan tâm và chú ý nghiên cứu nhằm xây dựng quy trình nhân giống nhanh, rút ngắn được thời gian sinh trưởng so với cây Sâm Ngọc Linh trong tự nhiên mà vẫn đảm bảo được hàm lượng các dược chất quý giá vốn có như saponin triterpenoid, ginsengnosidee để đảm bảo được nhu cầu tiêu dùng của thị trường Trong đó phải kể đến các công trình nghiên cứu như Hoàng Văn Cương (2012) đã chứng minh ảnh hưởng của ánh sáng đơn sắc lên sự sinh trưởng và khả

năng tích lũy saponin thông qua quá trình nuôi cấy mô sẹo và cây Sâm Ngọc Linh Panax

vietnamensis Ha et Grushv in vitro

Nguyễn Thị Liễu và cộng sự (2011) đã tạo được rễ bất định của Sâm Ngọc Linh

trong nuôi cấy in vitro

Hà Thị Loan (2014) đã sử dụng Agrotobacterium rizogenes chứa gene rol cảm ứng

tạo rễ tóc Kết quả cho thấy rễ tóc được nuôi cấy trong môi trường lỏng lắc sinh trưởng tốt

và có sự hiện diện của 3 hoại chất saponin đặc trưng trong Sâm Ngọc Linh Nuôi cấy rễ tóc với những ưu điểm vượt bậc đã được khẳng định là sinh trưởng mạnh, không hướng đất, không phụ thuộc vào chất điều hòa sinh trưởng thực vật ngoại sinh, bền vững về mặt

di truyền và có khả năng tổng hợp các hoạt chất thứ cấp với hàm lượng cao hơn hoặc bằng cây mẹ giúp giảm được những ảnh hưởng không mong muốn đến sức khỏe người tiêu dùng và nâng cao tính an toàn của sản phẩm, mở ra giải pháp mới cho sản xuất saponin ở quy mô công nghiệp

Mai Trường và cộng sự (2014) đã thành công trong việc tạo và nhân phôi soma Sâm

Ngọc Linh Panax vietnamensis Ha et Grushv trong môi trường lỏng

Vũ Thị Hiền và cộng sự (2015) đã sử dụng kỹ thuật nuôi cấy lớp mỏng tế bào trong

nghiên cứu quá trình cứu hình thái của cây Sâm Ngọc Linh Panax vietnamensis Ha et

Grushv Trước nhu cầu rất lớn về Sâm Ngọc Linh dùng để làm thuốc, thực phẩm chức năng của các công ty dược và người dân, một số Trung tâm nuôi cấy mô đã chuyển hướng

nghiên cứu nhân nhanh giống Sâm Ngọc Linh in vitro

Trong nhân giống in vitro thực vật, ánh sáng khác nhau về chất lượng, cường độ và

thời gian chiếu sáng đều có ảnh hưởng lên sự sinh trưởng, phát triển của thực vật Tổng lượng ánh sáng mà cây thu nhận trong suốt quá trình chiếu sáng có tác động trực tiếp lên quang hợp, sự sinh trưởng và năng suất của cây Nguồn sáng nhân tạo sử dụng phổ biến

trong nhân giống in vitro hiện nay là đèn huỳnh quang Mặc dù một số đèn huỳnh quang

thích hợp cho sự tăng trưởng thực vật nhưng tất cả các đèn huỳnh quang đều tỏa nhiệt, lại phải tiêu tốn thêm một phần điện năng để làm giảm nhiệt độ nóng do các đèn này gây ra Theo Dương Tấn Nhựt (2002), chi phí điện năng ước tính khoảng 65% dùng cho thắp sáng trong phòng nuôi cây và khoảng 25% để làm mát phòng nuôi Do đó, sự phát triển

nguồn bức xạ hiệu quả hơn được sử dụng trong các phòng nuôi cấy mô sẽ mang lại nguồn lợi đáng kể để giảm chi phí sản xuất trong vi nhân giống.

Từ trước đến nay, các nghiên cứu trong lĩnh vực nuôi cấy mô ở đối tượng cây Sâm Ngọc Linh chưa nhiều vì đây là loài Sâm đặc hữu của Việt Nam Các nghiên cứu trong nước về lĩnh vực nuôi cấy mô hiện nay chủ yếu tập trung vào nghiên cứu ảnh hưởng của các phytohormone trong quá trình phát sinh hình thái hay sinh trưởng và phát triển của thực vật, cải tiến thành phần môi trường nuôi cấy, điều kiện nuôi cấy, chuyển gene, chủ yếu là nghiên cứu tạo mô sẹo, phát sinh phôi, nuôi cấy rễ tóc, thu sinh khối trong bioreactor, các kết quả đạt được là tiền đề cho các nghiên cứu sâu Đặc điểm của Sâm Ngọc Linh là tăng trưởng rất chậm, yêu cầu sinh thái khắt khe, việc nghiên cứu về tạo củ

in vitro vẫn chưa nhiều, chưa có nghiên cứu nào báo cáo về kiểu bổ sung các thành phần

môi trường nuôi cấy (môi trường hai lớp lỏng-rắn) lên sự tăng trưởng, tạo củ và tích lũy saponin ở cây Sâm Ngọc Linh Nghiên cứu về ảnh hưởng của ánh sáng đơn sắc đến quá trình sinh trưởng của Sâm Ngọc Linh chỉ có một vài báo cáo được công bố, các nghiên

cứu cũng đã cho thấy rằng Sâm Ngọc Linh được nuôi cấy in vitro có thành phần hóa học

tương tự như Sâm Ngọc Linh tự nhiên tuy nhiên với hàm lượng thấp, thậm chí một số chất chỉ được phát hiện ở dạng vết, một số chất chưa được phát hiện trong Sâm nuôi cấy

in vitro Một số nghiên cứu đã cho thấy rằng các chất cảm ứng-elicitor có tác động tích

cực đến sự tăng trưởng cũng như quá trình sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp ở thực vật Tuy nhiên, đối với từng loại thực vật và mục đích nuôi cấy, việc lựa chọn loại và nồng độ các elicitor phải được xem xét kỹ lưỡng Đây là một loài dược liệu vô cùng quý giá, việc hoàn thiện quy trình nhân giống và gia tăng hàm lượng dược chất quý hiếm là điều mà nhiều nhà nghiên cứu quan tâm và được Chính phủ chú trọng phát triển nguồn cây trồng

quốc gia Trong đó, nghiên cứu tạo củ in vitro, kích thích tăng trưởng, rút ngắn thời gian

nhân giống, tăng sức sống của cây con nhằm tạo được số lượng lớn cây giống khỏe mạnh, tăng tỷ lệ sống sót khi chuyển ra vườn ươm là điều vô cùng cấp thiết

4 Phạm vi nghiên cứu

Trong nghiên cứu này, nguồn mẫu chúng tôi sử dụng là Sâm Ngọc Linh (Panax

vietnamensis Ha et Grushv.) in vitro, chúng tôi tập trung vào việc cải tiến môi trường nuôi

cấy bằng cách kế thừa môi trường nhân giống Sâm Ngọc Linh tối ưu của Dương Tấn

Nhựt và cộng sự (2012), sau đó khảo sát ảnh hưởng của các elicitor (than hoạt tính,

này cho sự tăng trưởng của mẫu cấy tối ưu nhất Ánh sáng LED là nguồn chiếu sáng đang ngày càng phổ biến bởi những tính năng ưu việt của nó như tiêu thụ điện năng thấp, chỉ chứa một số bước sóng ánh sáng nhất định, độ bền cao, tỏa nhiệt ít, do vậy rất tiết kiệm

năng lượng LED đã được nghiên cứu trên thực vật nuôi cấy in vitro và mang lại hiệu quả

rất tốt cho sự tăng trưởng của thực vật Tuy nhiên, trên đối tượng Sâm Ngọc Linh thì chỉ

có một số báo cáo về vai trò của LED Vì vậy, chúng tôi thiết kế hệ thống LED đơn và LED kết hợp cải tiến sử dụng các bóng LED tròn được sản xuất sẵn dễ lắp đặt, dễ thi công, tỏa nhiệt thấp, không gây phát sinh chi phí chuyển đổi điện năng từ dòng điện 110v sang 220v do các bóng đèn LED tròn có thể sử dụng trực tiếp nguồn điện 220v để khảo

sát vai trò của đèn LED trong nhân giống in vitro Sâm Ngọc Linh nhằm tìm ra nguồn

sáng LED phù hợp cho nhân nhanh giống và gia tăng chất lượng cây giống Sâm Ngọc Linh Nuôi cấy lỏng cho thấy có hiệu quả đối với nhiều loài thực vật vì mẫu cấy tiếp xúc với môi trường toàn diện hơn hấp thu chất dinh dưỡng tốt hơn, tăng sinh khối nhanh hơn, tuy nhiên đối với mỗi loài các điều kiện nuôi cấy lỏng, các thông số kỹ thuật là không giống nhau, Sâm Ngọc Linh là loài tăng trưởng chậm, khó nuôi cấy vì vậy giai đoạn nuôi cấy lỏng đóng vai trò cảm ứng giúp mẫu cấy tăng trưởng nhanh rút ngắn thời gian nuôi cấy, gia tăng sinh khối Trong nghiên cứu này, lần đầu tiên kiểu bổ sung các thành phần vào môi trường nuôi cấy (môi trường hai lớp) được thiết lập cho nhân giống cây Sâm Ngọc Linh nhằm tăng cường khả năng tăng trưởng, tạo củ, tích lũy saponin và gia tăng chất lượng cây giống

5 Ý nghĩa của đề tài

5.1 Ý nghĩa khoa học

Đề tài sẽ giúp hoàn thiện quy trình nuôi cấy in vitro cây Sâm Ngọc Linh (Panax

vietnamensis Ha et Grushv.) sẽ cung cấp những cơ sở khoa học cho công tác nhân giống

in vitro cây trồng nói chung và cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)

nói riêng Cung cấp cơ sở khoa học cho bảo vệ nguồn gen cây Sâm Ngọc Linh là một trong những mối quan tâm hàng đầu hiện nay

Nghiên cứu ảnh hưởng hệ thống LED cải tiến đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in

vitro của Sâm Ngọc Linh cung cấp cơ sở khoa học để đánh giá ảnh hưởng của đèn LED

đến nuôi cấy in vitro cây Sâm Ngọc Linh Góp phần định hướng cho những nghiên cứu tiếp theo về ảnh hưởng của ánh sáng LED đến nuôi cấy Sâm Ngọc Linh in vitro.

Đề tài sẽ cung cấp những tài liệu khoa học về Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis

Ha et Grushv.), thuộc chi Panax Cung cấp những cơ sở khoa học về quy trình nhân giống

in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) Các kết quả nghiên cứu sẽ

bổ sung thêm tài liệu khoa học phục vụ cho nghiên cứu khoa học về loài Sâm Ngọc Linh

(Panax vietnamensis Ha et Grushv.).

5.2 Ý nghĩa thực tiễn

Xây dựng quy trình nhân nhanh Sâm Ngọc Linh thông qua khảo sát các chất yếu tố

ảnh hưởng đến cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) nhằm nhân

nhanh với số lượng lớn, hạ giá thành cây giống, góp phần bảo tồn nguồn gene cây thuốc quý

Nghiên cứu ảnh hưởng của đèn LED đến sự sinh trưởng của cây Sâm Ngọc Linh là

cơ sở đánh giá khả năng ứng dụng của đèn LED trong nuôi cấy in vitro cây trồng nói

chung và Sâm Ngọc Linh nói riêng, hướng tới tìm nguồn ánh sáng thích hợp thay thế đèn huỳnh quang và các loại đèn đang dùng trong nuôi cấy Sâm Ngọc Linh hiện nay, là cơ sở giúp hạ giá thành sản phẩm cây Sâm Ngọc Linh giống Hoặc định hướng cho các nghiên

cứu tiếp theo về ứng dụng của đèn LED đến cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha

et Grushv.)

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu về vi nhân giống và các elicitor

1.1.1 Khái niệm vi nhân giống

Vi nhân giống (micropropagation) hay còn gọi là nhân giống in vitro (in vitro

propagation) được sử dụng đặc biệt cho việc ứng dụng các kỹ thuật nuôi cấy mô để nhân giống thực vật, bắt đầu bằng nhiều bộ phận khác nhau của thực vật có kích thước nhỏ, sinh trưởng ở điều kiện vô trùng trong các ống nghiệm hoặc trong các loại bình nuôi cấy khác

Nhân giống in vitro, trong nhiều thập niên vẫn được xem là một trong những kỹ

thuật hữu hiệu nhất dùng để nhân nhanh các giống cây trồng sạch bệnh đã được tuyển chọn hoặc các nguồn gene thực vật quý hiếm

1.1.2 Các chất cảm ứng – Elicitor

Hợp chất thứ cấp của thực vật không chỉ giúp thực vật tự vệ, chống chịu lại sâu bệnh

và điều kiện môi trường khắc nghiệt mà còn hữu ích cho con người khi có khả năng ứng dụng trong nhiều lĩnh vực: y dược, hóa học, mỹ phẩm và nông nghiệp Saponin triterpenoid là hợp chất quý hơn cả vàng có trong chi Nhân Sâm nói chung và Sâm Ngọc Linh nói riêng Để thu được lượng lớn hợp chất thứ cấp, theo phương pháp truyền thống đòi hỏi hao tốn rất nhiều sinh khối thực vật Do đó, khoa học hiện đại đã nghiên cứu ứng dụng các chất cảm ứng (elicitor) trong nuôi cấy mô tế bào thực vật để thu được lượng lớn hợp chất đích như mong muốn Elicitor được định nghĩa là một chất cơ bản mà khi đưa với các nồng độ nhỏ vào hệ thống tế bào sống thì kích thích sự sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp trong tế bào Sự kích kháng thực vật là quá trình cảm ứng hoặc tăng cường sinh tổng hợp các chất chuyển hóa thứ cấp do sự bổ sung theo hàm lượng của elicitor (Namdeo, 2007) Đối với loài có thời gian tăng trưởng kéo dài và khó nhân giống trong tự nhiên như Sâm Ngọc Linh, việc bổ sung các chất cảm ứng vào môi trường nuôi cấy vừa giúp nhân nhanh sinh khối, rút ngắn thời gian tăng trưởng và thu được lượng lớn hợp chất thứ cấp

Elicitor bao gồm các chất có nguồn gốc từ mầm bệnh và các chất được tiết ra từ thực vật bằng phản ứng của mầm bệnh (elicitor nội sinh) Trên cơ sở bản chất tự nhiên, elicitor

có thể được phân thành 2 nhóm là: elicitor phi sinh học và elicitor sinh học

 Elicitor phi sinh học là các chất có nguồn gốc không thuộc sinh vật học, gồm các muối vô cơ, các kim loại nặng và các tác nhân vật lý như sóng siêu âm, áp suất, nhiệt độ,

và pH

có nguồn gốc từ thành tế bào thực vật (pectin hoặc cellulose), các vi sinh vật (chitin hoặc glucan) và các glycoprotein, G-protein hay các protein nội bào có chức năng là gắn với các receptor và tác động bằng cách hoạt hóa hoặc bất hoạt một số enzyme hoặc các kênh ion

Ngoài ra, có thể phân loại elicitor dựa trên nguồn gốc của chúng 2 loại elicitor là elicitor ngoại sinh và elicitor nội sinh

polysaccharide, polyamine và các acid béo

qua các phản ứng thứ cấp, được cảm ứng bằng tín hiệu sinh học hay phi sinh học, chẳng hạn như galacturonide hoặc hepta-β-glucoside, (Namdeo, 2009)

1.1.2.1 Than hoạt tính

Trước đây, than hoạt tính (Actived charcoal – AC) thường được sử dụng để phòng độc, lọc không khí và các chất lỏng Hiện nay, than hoạt tính đã được tinh chế và sản xuất rộng rãi như một chất có tính hấp phụ cao và được sử dụng phổ biến trong nuôi cấy mô

nhờ tác động lên sự phát sinh hình thái và phát sinh cơ quan của thưc vật (Pan et al.,

1998) Vai trò của AC trong nuôi cấy mô tế bào thực vật chủ yếu là tạo điều kiện “tối” cho môi trường nuôi cấy, hấp phụ các chất độc và các chất ức chế sinh trưởng thực vậy như phenolic, dịch rỉ nâu sinh ra từ mẫu môi trường nuôi cấy (Biniak, 1990) Ngoài ra

than hoạt tính cũng có thể hấp thụ các vitamin, cytokinin và auxin (Ebert et al., 1990; Fridborg et al., 1978), làm thay đổi tỷ lệ thành phần các chất có trong môi trường nuôi cấy cũng như pH môi trường (Wann et al., 1997)

Từ khi AC được ứng dụng trong lĩnh vực nuôi cấy mô, các nhà khoa học chủ yếu tập trung nghiên cứu và đã công bố về ảnh hưởng của nó trong việc cải tiến môi trường

nuôi cấy (Buter et al., 1993), tăng cường khả năng tái sinh cây (Krajnáková et al., 2009), phát sinh phôi (Mathews et al., 1993), tăng sinh tế bào trần (Kunitake H et al., 1995),

ngăn cản sự phát triển bất bình thường của cây con, kích thích quá trình hình thành và

phát triển chồi (Kee-Kee-oeup et al., 2000), thúc đây hay ức chế sự tăng trưởng và hình thành rễ (Christopher et al., 2012); ngoài ra AC còn có khả năng làm giảm hiện tượng thủy tinh thể ở một số loài thực vật (Debergh et al.1981)

Nguyễn Thị Nhật Linh và cộng sự (2012) đã tiến hành cấy các chồi cây Hồng môn vào môi trường được phân thành 2 phần, một phần không có AC và phần còn lại bổ sung các nồng độ AC tối ưu đã khảo sát ở hai đối tượng cây Cúc (3 g/L AC) và Hồng môn (2 g/L AC) bằng cách thay đổi vị trí lớp AC trong môi trường nuôi cấy (trên, giữa hoặc dưới) Kết quả cho thấy, hầu hết các rễ phát sinh trong lớp môi trường có AC (trên 80% rễ) Ngoài ra, các kết quả cũng cho thấy sự định hướng rễ của cây Hồng môn phụ thuộc vào vị trí lớp AC nhiều hơn ở cây Cúc Vị trí lớp môi trường có AC ở dưới là tối ưu cho

sự phát triển của cây và rễ in vitro của cả cây Cúc và cây Hồng môn Mặt khác, những cây sinh trưởng và phát triển tốt trong điều kiện in vitro cũng sinh trưởng và phát triển tốt

ở điều kiện ex vitro; điều này có ý nghĩa rất lớn trong nghiên cứu nhân giống vô tính cây

trồng

1.1.2.2 Saccharose

Trong nuôi cấy in vitro, mô và tế bào thực vật sống chủ yếu theo phương thức dị

dưỡng, nên việc đưa đường vào môi trường nuôi cấy làm nguồn chất hữu cơ là điều bắt buộc (Lê Trần Bình và cộng sự, 1997) Đường saccharose không chỉ điều hòa áp suất thẩm thấu của môi trường mà còn là nguồn cacbohydrate tốt nhất cung cấp cho mô và tế bào Nhưng khi nồng độ đường quá cao sẽ hạn chế hiệu quả hấp thu nước của mô cây

Hai dạng đường thường gặp nhất trong nuôi cấy in vitro là glucose và saccharose, trong

đó saccharose được sử dụng phổ biến hơn (Nguyễn Đức Lượng, 2001) Tùy theo mục đích nuôi cấy mà hàm lượng đường cho vào môi trường khác nhau, thông thường là 30 –

40 g/L là tương đối thích hợp cho nhiều loại cây (Vuylsteke, 1989) Các nghiên cứu trên

dưa Cucumis hystrix (Michael et al., 2001), cây dâu tây (Hyung, 1996) và cây hành

(Teruyuki, 1999) đều cho thấy hàm lượng đường 30 g/L là thích hợp cho chồi phát triển

tốt trong nuôi cấy in vitro

Theo nghiên cứu của Lâm Ngọc Phương và cộng sự (2005) đã chứng minh rằng cho thấy sự phát triển của chồi dưa hấu tam bội tốt nhất trong môi trường MS có chứa 30 g/L

saccharose với 0,5 mg/L BA dưới cường độ ánh sáng 1.800 lux Những chồi này phát triển rất tốt, cao và nhiều lá sẽ là vật liệu tốt để nhân chồi, ra nhiều rễ và dễ thuần dưỡng

1.1.2.3 Bạc nitrate

sinh trưởng, phát triển của chồi thông qua tác động vào quá trình trao đổi ethylene

việc tổng hợp ethylene hoặc chức năng của ethylene bằng cách tác động lên quá trình tổng hợp hoặc tác động lên tín hiệu trao đổi chất (Pua và Chi, 1993), qua đó ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của cây trồng Do vậy, bạc nitrate cũng là một elicitor

quá trình phát sinh cơ quan, sinh phôi, ra rễ in vitro, cảm ứng hoa, ra hoa sớm, kiểm soát

hiện tượng rụng lá thông qua việc ức chế hoạt động của ethylene (Sharma, 2008)

Nguyễn Thị Phương Thảo và cộng sự (2015) nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều

hòa sinh trưởng thực vật và khoáng vi lượng đến sự sinh trưởng và ra hoa in vitro của cây

hình thành hoa với tỷ lệ ra hoa ở các giống hoa hồng

quá trình tái sinh cây nghệ đen (Curcuma zedoaria Roscoe) cho thấy kết quả là bổ sung

1.1.3 Phương pháp nuôi cấy lỏng lắc

Nuôi cấy lỏng lắc: nuôi cấy lỏng lắc thúc đẩy sự phân chia và tăng trưởng của tế bào trong môi trường lỏng (Torres, 1989) Là phương pháp nuôi cấy thực vật bằng môi trường lỏng, bình nuôi cấy được đặt trên máy lắc (shaker), tuỳ vào mục đích nuôi cấy, đối tượng nuôi cấy mà số vòng quay của máy lắc được điều chỉnh khác nhau (từ 90 – 180 vòng/phút)

Các tế bào được tiếp xúc với môi trường dinh dưỡng do mẫu được ngâm trực tiếp vào dung dịch môi trường Sự thông khí được thực thực hiện nhờ máy lắc ở tốc độ 100 –

150 vòng/phút Khí đưa vào phải đảm bảo vô trùng Quá trình thông khí còn ngăn chặn và làm giảm sự kết dính của các tế bào với nhau

Theo Thomass và Davey (1975), nuôi cấy huyền phù tế bào có dung tích 25 mL, tốc

độ phù hợp nhất của máy lắc là 100 − 150 vòng/phút Thể tích của môi trường lỏng phải phù hợp với kích thước bình nuôi cấy, thường chiếm 20% thể tích bình

Debergh (1983) và George (1993) đã cho rằng lượng nước trong môi trường thạch rắn thấp khiến cho sự hấp thụ bởi thực vật thấp hơn so với môi trường lỏng lắc

Các nuôi cấy quy mô nhỏ như phòng thí nghiệm và trong những thời gian ngắn, có thể máy lắc từ ở tốc độ 250 vòng/phút và thời gian nuôi cấy thường từ 10 – 15 ngày Sau

đó, các mẫu nuôi cấy phải được chuyển vào môi trường mới để đảm bảo sự sinh trưởng

và phát triển của các tế bào

Phương pháp nuôi cấy lỏng lắc có ưu thế hơn các phương pháp khác là mẫu cấy được tiếp xúc đầy đủ hơn với môi trường dinh dưỡng nên tốc độ sinh trưởng và phát triển nhanh Nhờ việc liên tục được di chuyển trong môi truờng nuôi cấy nên ít xảy ra hiện tượng ưu thế ngọn, sự ngủ của chồi biến mất và kết quả là tạo ra được nhiều chồi hơn

Mục đích của nuôi cấy lỏng lắc:

Phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật bằng môi trường lỏng sẽ khắc phục được một số nhược điểm khi nuôi cấy trên môi trường bán rắn:

Các mẫu nuôi cấy được ngập và phân bố theo không gian 3 chiều nên tiết kiệm được không gian, mẫu cấy hấp thụ hết môi trường dinh dưỡng trong bình nuôi cấy Tăng cường được sự thoáng khí nên kích thích mẫu phát triển nhanh

Khi nuôi cấy ngập và được di chuyển tự do trong môi trường, hiệu ứng ưu thế ngọn

bị biến mất và các chồi phát triển tương đối đồng đều nhau Giảm chi phí sản xuất thông qua việc giảm được lượng agar sử dụng cho môi trường nuôi cấy

Khó khăn của nuôi cấy lỏng lắc:

Khó khăn lớn nhất của nuôi cấy lỏng lắc là mẫu mô nuôi cấy bị tổn thương do quá trình lắc Những khối mô hay cơ quan tế bào thực vật mới hình thành còn non yếu, nếu bị

va đập mạnh sẽ làm dập nát khối mô non Từ đó khả năng nhân nhanh tế bào bị giảm sút Quá trình nhân nhanh khối mô hay tế bào sử dụng môi trường lỏng thay cho môi trường bán rắn kể từ giai đoạn tái sinh đến giai đoạn tăng sinh khối Môi trường nuôi cấy lỏng thường dẫn đến sự phát sinh hình thái bất thường, chẳng hạn như hiện tượng thủy tinh thể (hyperhydricity hay vitrification)

Hình 1.1 Các bước sóng ánh sáng (nguồn Internet)

Hiện nay, khoa học và kỹ thuật phát triển nên hệ thống nuôi cấy lỏng lắc đã cải thiện nhằm phục vụ nhân nhanh sinh khối, hoạt tính có trong cây, hoạt chất,… Các hệ thống như: bioreactor, hệ thống quang tự dưỡng, hệ thống TIS, hệ thống RITA, hệ thống bình sinh đôi BIT, hệ thống Plantima,…

1.1.4 Vai trò của ánh sáng trong vi nhân giống

Trong môi trường nuôi cấy, quang tổng hợp không phải là một hoạt động cần thiết

do sự có mặt của đường trong môi trường, nhưng ánh sáng cần thiết để điều hòa một số quá trình liên quan tới phát sinh hình thái của cây Tùy từng loại nuôi cấy, yêu cầu cường

độ cũng như thời gian chiếu sáng khác nhau, ví dụ như khi nuôi cấy mô sẹo, thường không cần ánh sáng Ánh sáng còn ảnh hưởng tới sinh trưởng của mô nuôi cấy thông qua tác động vào trạng thái và cấu trúc của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật cũng như dinh dưỡng khoáng Thông thường trong phòng nuôi cấy người ta sử dụng ánh sáng huỳnh quang chiếu sáng từ 14 − 15 giờ/ngày với cường độ 2000 lux

1.1.4.1 Vai trò của ánh sáng đối với quá trình quang hợp ở thực vật

Sự sống trên trái đất phụ thuộc vào ánh sáng mặt trời bởi ánh sáng là điều kiện cho quá trình quang hợp xảy ra Mọi sự sống trên trái đất không thể tách rời quá trình này Ngày nay, chúng ta biết đến quang hợp là quá trình giúp thực vật dùng năng lượng ánh sáng để tạo glucose và phóng thích oxy từ carbonic và nước

Cường độ ánh sáng mà thực vật sử dụng trong phản ứng quang hợp thuộc vùng quang phổ có bước sóng từ 400 đến 700 nm với cực đại hấp thụ từ 660 đến 680 nm Đơn

vị đo cường độ ánh sáng trong các nghiên cứu về thực vật hiện nay là dòng photon quang

tham gia vào quá trình quang hợp của thực vật tính trong 1 giây trên một đơn vị diện tích

Các bước sóng ánh sáng được sử dụng trong quang hợp chỉ là một phần nhỏ của toàn bộ quang phổ điện từ Ở thực vật bậc cao, ánh sáng đỏ, tím, xanh điều khiển quá trình quang hợp hiệu quả nhất Khả năng kích thích các electron của ánh sáng liên quan đến bước sóng hơn là cường độ của chùm sáng Chỉ có một phần nhỏ ánh sáng được thực vật thực sự hấp thu

1.1.4.2 Vai trò của ánh sáng đối với quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật

Năng lượng bức xạ được thực vật sử dụng theo hai cách hoàn toàn riêng biệt: như

một nguồn năng lượng và như một nguồn thông tin Ánh sáng đặc biệt phù hợp với vai trò thứ hai Ánh sáng có thể truyền thông tin qua nhiều dạng khác nhau; trong đó, có tối thiểu

4 dạng đặc trưng: chất lượng, lượng, hướng và quang kỳ

cả những từ dùng diễn tả đặc trưng này của ánh sáng

đặc trưng thứ hai này

sáng

ngày theo mùa

Nhiều đặc tính về phát triển hình thái của thực vật ex vitro bị ảnh hưởng bởi các điều

kiện môi trường như ánh sáng (về chất lượng, cường độ, thời gian và hướng chiếu sáng),

Năng lượng bức xạ có những ảnh hưởng quan trọng lên hình thái và hoạt động của thực vật bao gồm sự phát triển khả năng quang hợp, tham gia vào nhịp nội sinh và định hướng về không gian và thời gian

Hình 1.2 A Sự hấp thu các bước sóng bởi các loại sắc tố quang hợp và cường độ quang hợp; B Sự hấp thu ánh

sáng của chlorophyll a và chlorophyll b (nguồn Internet )

Quang phát sinh hình thái là quá trình kiểm soát sự sinh trưởng, phát triển và phát sinh hình thái của thực vật dưới ánh sáng Quá trình này được điều khiển bởi ít nhất bốn con đường khác nhau của các quang thụ thể

Trong điều kiện tối, cây phát triển theo một chương trình gọi là

“kotomorphogensis”, chẳng hạn như kéo dài chồi, có rất ít hay không có lá mầm và lá thật, bị vàng hóa

Sự phát sinh hình thái do ánh sáng (sự nảy mầm, sự kéo dài đốt thân, ) xảy ra ở những dải bước sóng từ 400 − 500 nm (xanh lục), 600 − 700 nm (đỏ) và 700 − 800 nm (đỏ xa)

Ánh sáng có ảnh hưởng rất lớn lên sự quang phát sinh hình thái ở thực vật thông qua các quang thụ thể Thực vật bậc cao có ít nhất ba loại quang thụ thể (photoreceptor) có độ hấp thu chọn lọc với các ánh sáng quang phổ khác nhau, điều hòa sự phát sinh hình thái,

a Cường độ ánh sáng

Cường độ ánh sáng từ 1000 – 2500 lux được dùng phổ biến cho nuôi cấy nhiều loại

mô Với cường độ ánh sáng lớn hơn thì sinh trưởng của chồi chậm lại Theo Ammirato (1987), ánh sáng tham gia vào sự phát sinh và phát triển của phôi soma Ánh sáng ở cường độ cao gây nên sự sinh trưởng của mô sẹo, ở cường độ trung bình kích thích tạo chồi; ngoài ra, ở cường độ thấp sẽ tăng chiều cao và lá có màu xanh đậm

b Quang phổ ánh sáng

Vấn đề quang phổ ánh sáng đã được nhiều tác giả nghiên cứu như Pierik (1987) Ảnh hưởng của ánh sáng ở các bước sóng khác nhau được trình bày tóm tắt trong bảng 1.1

Bảng 1.1 Ảnh hưởng của các bước sóng ánh sáng khác nhau lên thực vật

500

450 Được hấp thu bởi sắc tố vàng

1.1.4.3 Vai trò của ánh sáng trong nhân giống in vitro

Cường độ ánh sáng mà thực vật sử dụng trong phản ứng quang hợp có bước sóng từ

400 − 700 nm, với đỉnh từ 660 − 680 nm Sự phát sinh hình thái do ánh sáng (sự nảy

mầm, sự kéo dài đốt thân,…) xảy ra ở những dải bước song từ 400 − 500 nm (xanh lục),

600 − 700 nm (đỏ) và 700 − 800 nm (đỏ xa)

Sự phân phối phổ ánh sáng, quang kỳ và hướng chiếu sáng cũng đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh trưởng của thực vật nuôi cấy mô Hiện nay, ánh sáng trắng (phổ ánh sáng từ khoảng 200 nm đến 800 nm) của đèn huỳnh quang được sử dụng phổ biến nhất trong các phòng thí nghiệm nuôi cấy mô Ánh sáng đơn sắc từ đèn LED (đi-ốt phát quang) cũng đã và đang được nghiên cứu làm nguồn sáng trong nhân giống thực vật Sử dụng ánh sáng đơn sắc đỏ (600 − 700 nm) hoặc đỏ xa (700 − 800 nm) hoặc kết hợp với xanh lam của đèn LED làm cây tăng trưởng rất tốt và tiết kiệm điện năng hơn so với dùng đèn huỳnh quang

Một trong những yếu tố của môi trường ảnh hưởng lên quá trình tạo rễ của mẫu cấy

là ánh sáng Ánh sáng góp phần vào việc tạo rễ và chồi bất định của đoạn cắt Chỉ cần cường độ ánh sáng thấp cho quá trình tạo rễ, vì cường độ ánh sáng cao quá sẽ ngăn cản sự tạo rễ Đối với một số loài, quang kỳ có thể ảnh hưởng đến sự tạo rễ

Chất lượng ánh sáng cũng ảnh hưởng đến sự ra rễ Ánh sáng đỏ cam thích hợp cho

sự ra rễ hơn ánh sáng xanh da trời Sự phát sinh hình thái thực vật bị ảnh hưởng bởi các

gian và cường độ chiếu sáng Những nhân tố này ảnh hưởng đến sự tăng trưởng chồi và phát sinh hình thái bên cạnh vai trò của nó trong quang hợp Debergh và cộng sự (1992)

đã chứng minh rằng cường độ chiếu sáng có tác dụng điều hòa kích thước lá và thân cũng như con đường phát sinh hình thái đồng thời ảnh hưởng đến sự hình thành sắc tố và thủy tinh thể của cây con Chất lượng ánh sáng có ảnh hưởng quan trọng trên một số đặc tính hình thái như sự kéo dài ở cây Cúc và cây Cà chua Hình thái giải phẫu lá và kích thước lá

ở cây Phong

1.1.4.4 Nguồn chiếu sáng nhân tạo sử dụng trong nuôi cấy in vitro hiện nay

Nguồn chiếu sáng được sử dụng thông dụng trong nuôi cấy in vitro là ánh sáng

huỳnh quang Các loại đèn halogen kim loại, natri cao áp, dây tóc được sử dụng nhằm làm tăng cường độ ánh sáng Tuy nhiên, những nguồn sáng này bao gồm các bước sóng không

cần thiết cho sự sinh trưởng của cây (Kim et al., 2004) Ánh sáng đơn sắc là một nguồn

năng lượng đầy hứa hẹn cho các phòng nuôi cấy mô với khả năng nâng cao quá trình tăng trưởng sinh học nhờ vào kích thước nhỏ, cấu trúc rắn, an toàn, ít tỏa nhiệt, tuổi thọ cao Ánh sáng đơn sắc bao gồm các bước sóng có lợi cho quá trình quang hợp, từ đó ảnh hưởng đến quá trình phát sinh hình thái và sinh tổng hợp của cây Hiện nay, ánh sáng đơn sắc được sử dụng trong nhiều nghiên cứu về quang sinh học như sự tổng hợp chlorophyll, quang hợp và phát sinh hình thái hay quá trình tích lũy các hợp chất có hoạt tính sinh học Ảnh hưởng của ánh sáng đơn sắc lên sự sinh trưởng và phát triển của một số loài cây đã

được nghiên cứu, ví dụ như: Euphorbia milii (Dewir et al., 2007), Zantedeschia (Jao et

al., 2005), Khoai tây (Jao et al., 2004; Miyashita et al., 1995), Cúc (Kim et al., 2004), Lilium (Lian et al.,2002), Chuối (Nhut et al., 2003), Dâu tây (Nhut et al., 2003), Lan Ý

(Nhut et al., 2005), Nho (Puspa et al., 2008), Cymbidium (Schuerger et al., 1997) và Lan

Hồ Điệp (Wongnok et al., 2008) Những nghiên cứu này đều chỉ ra rằng ánh sáng đơn sắc

thích hợp cho sinh trưởng của cây hơn ánh sáng huỳnh quang Ảnh hưởng của chất lượng ánh sáng lên sự sinh trưởng và phát triển thực vật đã được nghiên cứu nhiều Tuy nhiên, các nghiên cứu về tác động của ánh sáng đến quá trình tổng hợp các hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học vẫn còn rất hạn chế Krewzaler và Hahlbrock (1973) đã cho rằng ánh sáng có vai trò kích thích sự tổng hợp flavonoid glycosides trong nuôi cấy tế bào cây

Petroselinum hortense (Krewzaler và Hahlbrock, 1973) Một số nghiên cứu khác cũng đã

tìm hiểu ảnh hưởng của ánh sáng lên sự tích lũy các chất trên một số đối tượng như:

anthocyanin trong cây Perilla fruttiescnens (Zhong et al., 1991), artemisinin từ nuôi cấy

rễ tơ cây Artimisia annua (Liu et al., 2002) Trên đối tượng chi Panax, Yu và cộng sự (2005) đã nghiên cứu ảnh hưởng của ánh sáng lên sự tổng hợp ginsengnosidee trong rễ tơ cây Nhân Sâm (Panax ginseng C A Mayer) Hoàng Văn Cương và cộng sự (2012)

nghiên cứu ảnh hưởng của ánh sáng đơn sắc lên sự khởi tạo và tăng sinh của mô sẹo, cũng như sự sinh trưởng, phát triển và khả năng tích lũy hoạt chất saponin trong cây Sâm Ngọc

Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) nuôi cấy in vitro đã được nghiên cứu

Việc sử dụng ánh sáng nhân tạo trong nhân giống thực vật theo 2 khuynh hướng sau: hoàn toàn thay thế hay cung cấp một phần ánh sáng ban ngày cho quang hợp hay quang phát sinh hình thái

Việc sử dụng ánh sáng nhân tạo trong nhân giống thực vật đòi hỏi phải cân bằng giữa các quá trình sinh lý của thực vật và các vấn đề kinh tế của người nuôi trồng Ánh sáng khác nhau về chất lượng, cường độ và thời gian chiếu sáng, mỗi đặc tính này đều có ảnh hưởng lên sự phát triển của thực vật Tổng lượng ánh sáng mà cây thu nhận trong suốt quá trình chiếu sáng có tác động trực tiếp lên quang hợp, sự tăng trưởng và năng suất cây trồng Sự tác động này có thể đo được dựa trên kích thước cây, số lượng hoa và các thuộc tính khác Trong nhiều trường hợp, hình thái thực vật (chiều cao, hình dáng,…) bị ảnh hưởng chủ yếu bởi chất lượng ánh sáng Điều này tùy thuộc vào cường độ và sự phân phối dải năng lượng như ánh sáng xanh, đỏ và đỏ xa phát ra từ đèn Thực vật rất nhạy cảm với các điều kiện ánh sáng, vì vậy sự tăng trưởng và phát triển ở thực vật có thể tăng bởi ánh sáng nhân tạo và các đặc tính thích nghi

Trong các nguồn chiếu sáng nhân tạo hiện nay, các nguồn sáng chủ yếu được sử dụng cho thực vật là: đèn sợi đốt, đèn compact, đèn huỳnh quang, đèn LED

Đèn sợi đốt là một trong những nguồn sáng nhân tạo cổ điển nhất mà hiện nay vẫn

được dùng ở nước ta Trong đó năng lượng trong vùng khả kiến khoảng 5%, còn chủ yếu

là bức xạ hồng ngoại Tuy nhiên, trong thực tế đèn sợi đốt có ưu điểm là giá rẻ, dễ lắp đặt Đèn sợi đốt được dùng phổ biến để ức chế sự ra hoa của cây hoa Cúc và kích thích sự ra hoa của cây Thanh long trong mùa đông (với cây hoa Cúc mỗi đêm phải thắp khoảng 4 giờ, cây Thanh long khoảng 8 giờ)

Hiện nay trong các phòng nuôi cấy in vitro phần lớn sử dụng đèn huỳnh quang Đèn

huỳnh quang chủ yếu được sử dụng cho sinh hoạt của con người Ánh sáng đèn huỳnh quang là sự phối trộn của nhiều vùng quang phổ từ những vùng ánh sáng có bước sóng ngắn 320 nm đến bước sóng dài 800 nm Có những vùng bước sóng ngắn không có lợi cho sự sinh trưởng và phát triển của thực vật

Một loại đèn nữa cũng thường được sử dụng cho cây trồng là đèn huỳnh quang compact Đèn compact là loại đèn huỳnh quang áp suất thấp, sử dụng bột huỳnh quang đất hiếm 3 màu So với đèn sợi đốt, đèn compact có hiệu suất sáng cao hơn đối với mắt người, nhưng đối với phổ quang hợp của thực vật, đèn compact có ít thành phần đỏ (660 nm) và không có đỏ xa (730 nm) Mặc dù quang phổ phát ra từ đèn huỳnh quang compact bao gồm các vùng sáng đỏ và xanh có hiệu quả hơn đèn sợi đốt, tuy nhiên còn có một tỷ

Hình 1.3 Các hệ thống chiếu sáng bằng đèn LED a Đèn LED với tỷ lệ chiếu sáng 70%

LED đỏ kết hợp 30% LED xanh; b LED uni-Pack (LP) (Nguyễn Bá Nam, 2012)

lệ lớn các vùng quang phổ xanh lá cây (Green) và vàng (Yellow) nên làm lãng phí năng lượng

Như vậy, mặc dù một số đèn huỳnh quang thích hợp cho sự tăng trưởng thực vật nhưng đèn huỳnh quang trong nuôi cấy mô chiếm nhiều không gian, tuổi thọ thấp, có những vùng quang phổ không cần thiết, tiêu tốn nhiều điện năng và tạo ra nhiệt lượng cao trong phòng nuôi cây, do đó chúng ta phải tốn thêm một lượng điện năng đáng kể để điều hòa nhiệt độ trong phòng Chi phí điện năng ước tính khoảng 65% dùng cho tăng sáng trong phòng nuôi cấy và khoảng 25% để làm mát phòng nuôi

1.1.5 Đèn LED (Light Emitting Diode)

1.1.5.1 Giới thiệu đèn LED

Đi–ốt phát quang (LED) là nguồn sáng bán dẫn, sẽ cung cấp lượng ánh sáng đơn sắc khi có dòng điện một chiều chạy qua nó Đèn LED (khác với bóng LED) được định nghĩa

là tổ hợp bóng LED, phần quang học, tỏa nhiệt và nguồn nuôi LED đầu tiên được phát minh bởi Texas Instrument vào năm 1960 Tại thời điểm đó cường độ sáng của LED còn rất thấp và chỉ có ánh sáng đơn sắc đỏ Sau này cường độ sáng của LED đã tăng lên rất nhiều và biên độ dải màu cũng tăng theo (đỏ, cam, vàng, xanh lá, xanh dương, trắng,…) Đến những năm cuối thế kỷ 20 và đầu thế kỷ 21, đèn LED tạo nên một cuộc cách mạng nhanh chóng, đem lại nhiều tiện dụng cho các thiết bị kỹ thuật số và một dãy các thiết bị mới đa chức năng, như tín hiệu ra vào, đèn nổi, đèn giao thông, đèn vòm, đèn tường, đèn dưới nước, đèn ngoài trời Trong những năm gần đây, LED mới thực sự được quan tâm như là một nguồn bức xạ cho thực vật do tiềm năng ứng dụng thương mại của nó rất lớn

Để tiến hành nghiên cứu chế tạo các hệ thống đèn LED thích hợp trong nhân giống cây trồng và kỹ thuật phá đêm, chúng ta sẽ phải lựa chọn các bước sóng thích hợp với phổ hoạt động của các sắc tố thực vật

1.1.5.2 Ưu, nhược điểm của đèn LED

LED đem lại nhiều lợi ích trên các phương diện như sau:

giúp cho việc nhân giống có chi phí hiệu quả và tiết kiệm Sử dụng đèn LED có thể tiết

giờ, đèn huỳnh quang có tuổi thọ 8000 giờ)

có thể được tạo ra khi hòa trộn LED màu đỏ, xanh lơ và xanh lục Thay vào đó, thông qua việc kết hợp một cách sáng tạo các LED có màu sắc khác nhau, ảnh hưởng thay đổi màu

có thể tạo ra từ một vật cố định đơn giản nhờ sự hoạt hóa động lực của các phần khác nhau của LED

vậy là đối tượng phát sáng lý tưởng Ánh sáng LED không gây chói, mỏi mắt Do tiêu hao nhiệt rất ít, LED hầu như không làm nóng môi trường xung quanh, do đó giảm nhiều nhu cầu sử dụng hệ thống làm lạnh để tạo điều kiện cho cây sinh trưởng

ra ít ánh sáng toàn bộ Tuy vậy, điểm yếu này thực sự là thế mạnh của nó Các LED có thể gắn với nhau thành bất cứ hình dạng nào tạo nên một loạt kiện lumen mong muốn Thêm nữa, LED có thể thu nhỏ hỗn hợp ánh sáng, kiểm soát sự phân phối ánh sáng nhờ các thấu kính epoxy, đơn giản hóa cấu trúc của hệ đèn LED Một thiết bị kiểm soát có thể được gắn với phức hợp LED để làm mờ một cách chọn lọc các đèn LED độc lập, dẫn đến việc kiểm soát phân phối động lực, lượng và màu của ánh sáng

 Hiệu suất biến đổi năng lượng cao

Ngoài những lợi ích đó, rào cản duy nhất của công nghệ chiếu sáng rắn là giá thành của LED, nhưng với tốc độ phát triển mau chóng, rào cản này sẽ được dỡ bỏ

1.1.5.3 Một số thành tựu trên thế giới và Việt Nam khi sử dụng nguồn sáng LED

trong nuôi cấy in vitro

Trên thế giới gần đây các đi-ốt phát sáng (LED) là thiết bị chiếu sáng được xem là đầy hứa hẹn cho các phòng nuôi cấy mô và nâng cao khả năng tăng trưởng sinh học Bước sóng của LED phát ra rất đặc biệt, chiều rộng của vạch quang phổ ngắn, do vậy hiện nay LED được sử dụng trong rất nhiều lĩnh vực nghiên cứu về quang sinh học như là sự tổng hợp diệp lục, quang hợp và phát sinh hình thái

Một vài loại cây trồng thành công dưới hệ thống LED, những cây này bao gồm: Tiêu dưa, Lúa mì, Bó xôi Xu hướng nghiên cứu ứng dụng đèn LED vào sản xuất rau và hoa đang được nhiều nước xác định là nhiệm vụ ưu tiên đầu tư để nâng cao chất lượng sản phẩm và tiết kiệm năng lượng

Ở Việt Nam ngoài việc được sử dụng rộng rãi trong các thiết bị, LED cũng được ứng dụng trong các nghiên cứu nông nghiệp Việc sử dụng LED như một nguồn bức xạ cho thực vật được đặc biệt chú trọng trong những năm gần đây do tiềm năng của nó trong ứng dụng thương mại rất lớn Hệ thống bức xạ LED toàn phần có một số lợi điểm vượt trội so với những hệ thống chiếu sáng hiện đang được sử dụng rộng rãi trong nuôi cấy mô

Sự phát sáng cực đại của LED đỏ và xanh với độ dài sóng thích hợp tạo hiệu quả quang hợp tối đa LED đỏ có thể được ứng dụng cho thực tiễn vi nhân giống do sự phát photon cao cũng như giá thành thấp khi so sánh đèn LED với đèn có màu khác Sự kết hợp giữa các đèn LED có màu sắc khác nhau có thể tạo ra ánh sáng thích hợp cho quá trình quang hợp Một số loại cây như Dâu tây, Chuối sinh trưởng tốt dưới đèn LED

Từ năm 1996 đến nay, Dương Tấn Nhựt và cộng sự đã ứng dụng thành công hệ thống phát sáng LED trên một số loại cây trồng như Dâu tây, Bạch đàn, Địa lan, Lan hồ

điệp, Chuối, Lan Ý, Lily, Cúc và Lan Hài Những cây này nuôi cấy ở điều kiện in vitro

dưới hệ thống đèn LED không những sinh trưởng và phát triển tốt, mà còn sinh trưởng và

phát triển tốt cả ở điều kiện ex vitro

Đến nay các nhà khoa học đã đạt được một số thành tựu trong nghiên cứu hệ thống chiếu sáng LED trên thực vật như:

Dương Tấn Nhựt và cộng sự (2003) đã nghiên cứu đáp ứng của cây Dâu tây in vitro

dưới ánh sáng đơn sắc đỏ và xanh Kết quả cây Dâu tây sinh trưởng bình thường dưới điều kiện chiếu sáng 90% ánh sáng LED đỏ + 10% ánh sáng LED xanh, 80% ánh sáng

Trong đó, dưới điều kiện chiếu sáng 70% ánh sáng LED đỏ + 30% ánh sáng LED xanh, các chỉ tiêu đánh giá sự sinh trưởng của cây Dâu tây đều tốt hơn so với các điều kiện chiếu sáng còn lại

Năm 2003, Dương Tấn Nhựt và cộng sự đã đánh giá sự sinh trưởng và phát triển

của cây Chuối nuôi cấy in vitro dưới tỷ lệ đèn LED khác nhau: 100% ánh sáng LED đỏ,

90% ánh sáng LED đỏ + 10% ánh sáng LED xanh, 80% ánh sáng LED đỏ + 20% ánh sáng LED xanh, 70% ánh sáng LED đỏ + 30% ánh sáng LED xanh, 100% ánh sáng LED xanh và đèn huỳnh quang Nghiên cứu đã khẳng định cây Chuối sinh trưởng và phát triển tốt dưới điều kiện chiếu sáng 80% ánh sáng LED đỏ + 20% ánh sáng LED xanh

Dương Tấn Nhựt và cộng sự (2006) đã tiến hành nghiên cứu nguồn phát sáng nhân tạo sử dụng ánh sáng đơn sắc trong nhân giống vô tính hiệu quả của cây Lan Ý Kết quả trọng lượng tươi của cây cao nhất khi sinh trưởng dưới điều kiện 80% ánh sáng LED đỏ kết hợp với 20% ánh sáng LED xanh

Dương Tấn Nhựt và Nguyễn Bá Nam (2009) đã nghiên cứu ảnh hưởng của hệ thống

chiếu sáng đơn sắc lên sự sinh trưởng và phát triển của cây hoa Cúc (Chrysanthemum

morifoliumcv “Nút”) nuôi cấy in vitro Dưới các điều kiện chiếu sáng khác nhau: 100%

LED đỏ, 100% LED xanh, 50% LED đỏ + 50% LED xanh, 70% LED đỏ + 30% LED xanh, 80% LED đỏ + 20% LED xanh, 90% LED đỏ + 10% LED xanh và ánh sáng đèn huỳnh quang (neon) Những chồi Cúc phát triển tốt nhất dưới điều kiện chiếu sáng 90%

ánh sáng LED đỏ kết hợp với 10% ánh sáng LED xanh, cho trọng lượng tươi và số lá lớn

nhất so với các điều kiện chiếu sáng còn lại

Nguyễn Bá Nam và cộng sự (2012) đã nghiên cứu thành công ảnh hưởng của các loại mẫu cấy và hệ thống chiếu sáng đơn sắc lên khả năng tái sinh chồi cây hoa Cúc

(Chrysanthemum morifolium ramat.cv “Jimba”) nuôi cấy in vitro Dưới các điều kiện

chiếu sáng khác nhau: 100% LED đỏ, 100% LED xanh, 50% LED đỏ + 50% LED xanh, 70% LED đỏ + 30% LED xanh, 80% LED đỏ + 20% LED xanh, 90% LED đỏ + 10% LED xanh, ánh sáng đèn huỳnh quang (neon) và trong tối Kết quả 70% ánh sáng LED đỏ kết hợp với 30% ánh sáng LED xanh là tỷ lệ phù hợp cho sự tái sinh chồi trực tiếp từ mẫu

lá và gián tiếp từ lớp mỏng tế bào thân cây Cúc so với các điều kiện chiếu sáng còn lại Hoàng Văn Cương và cộng sự (2012) đã nghiên cứu ảnh hưởng của ánh sáng đơn sắc lên sự sinh trưởng và khả năng tích lũy hoạt chất saponin thông qua nuôi cấy mô sẹo

của cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv) in vitro Các mẫu mô sẹo và

cây được nuôi cấy dưới 5 loại ánh sáng khác nhau: 100% ánh sáng LED xanh, 100% ánh sáng LED đỏ, ánh sáng LED xanh và ánh sáng LED đỏ kết hợp với tỷ lệ 50:50, 30:70, 20:80; ánh sáng huỳnh quang được sử dụng làm đối chứng Kết quả cho thấy trọng lượng tươi và trọng lượng khô của mô sẹo thu được là cao nhất khi các mẫu lá được nuôi cấy

dưới ánh sáng xanh và ánh sáng đỏ kết hợp với tỷ lệ 50:50

Ngoài những nghiên cứu trên, phòng Sinh học phân tử và Chọn tạo giống cây trồng thuộc Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên còn thực hiện trên một số đối tượng khác như: Lan Hài, Đồng tiền đều cho kết quả tốt

Theo Dương Tấn Nhựt (2010), nguồn sáng LED chưa được chú trọng ở Việt Nam Các nghiên cứu về ánh sáng đèn LED trong nuôi cấy mô tế bào thực vật trong nước chủ yếu được thực hiện ở phòng Sinh học phân tử và Chọn tạo giống cây trồng thuộc Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên

Hiện nay một số Viện nghiên cứu và Trung tâm nhân giống cây trồng đã bắt đầu nghiên cứu về đèn LED với mục đích tìm nguồn sáng thích hợp thay thế đèn huỳnh quang

để giảm giá thành trong sản xuất cây giống

Hình 1.4 Hệ thống nuôi cấy LED truyền điện không dây (Wireless power transfer – LED Pack (WPT - LP)) a Thiết bị phát; b Thiết bị thu; c.d Hoạt động của hệ thống (Nguyễn Bá

uni-Nam, 2012)

1.1.5.4 Hướng phát triển ứng dụng của đèn LED trong nuôi cấy in vitro ở Việt Nam

Hệ thống đèn LED là một nguồn sáng cho cây trồng đang được chú ý đặc biệt trong những năm gần đây vì ứng dụng rộng rãi của nó trong thương mại Công nghệ chiếu sáng bằng chất rắn (Solid - state lighting) dựa vào việc sử dụng đèn LED là một trong những tiến bộ lớn nhất trong lĩnh vực chiếu sáng nhân tạo cho cây trồng đã được ứng dụng trong vài thập kỷ gần đây LED có rất nhiều ứng dụng như: nghiên cứu điều khiển môi trường, chiếu sáng trong nuôi cấy mô, chiếu sáng bổ sung và chiếu sáng theo quang chu kỳ trong nhà kính (greenhouse)

Tạ Thế Hùng và Lê Tất Khương đã đưa ra đề xuất nghiên cứu ứng dụng đèn LED vào sản xuất nông nghiệp công nghệ cao ở Đà Lạt và vùng phụ cận như sau:

hoa, quả

+ Phát triển các dạng đèn LED tiết kiệm năng lượng, hiệu quả cao tiến tới thay thế dần các dạng đèn truyền thống

+ Nghiên cứu ứng dụng đèn LED điều khiển nở hoa

+ Nghiên cứu ứng dụng đèn LED sản xuất một số loại rau, quả có giá trị kinh tế cao

Ngọc Linh, Sâm Hàn Quốc, )

 Nghiên cứu ứng dụng đèn LED trong ngành nuôi cấy mô

Tuy nhiên, các nghiên cứu trong nước về lĩnh vực nuôi cấy mô hiện nay chủ yếu tập trung vào nghiên cứu ảnh hưởng của các phytohormone trong quá trình phát sinh hình thái hay sinh trưởng và phát triển của thực vật nuôi cấy mà chưa đi sâu tìm hiểu vai trò của ánh sáng trong vi nhân giống, đặc biệt là nguồn chiếu sáng từ đèn LED

Hiện nay ở nước ta còn hạn chế những nghiên cứu cụ thể tác động của đèn chiếu sáng LED đến sự sinh trưởng của cây trồng, so sánh ưu nhược điểm của việc sử dụng đèn chiếu sáng LED để thay thế các đèn chiếu sáng khác như đèn sợi đốt, đèn huỳnh quang đặc biệt là so sánh về tác động tăng trưởng cây trồng và hiệu quả tiết kiệm điện năng khi

sử dụng các nguồn sáng nhân tạo khác nhau Vì vậy nghiên cứu ứng dụng công nghệ

chiếu sáng LED trong nuôi cấy in vitro là một hướng nghiên cứu có giá trị khoa học và

công nghệ cao, có ý nghĩa thực tiễn rất to lớn đối với công nghệ vi nhân giống ở nước ta Đây là hướng nghiên cứu liên nghành, cần có sự phối hợp chặt chẽ của các nhà sinh học, nông nghiệp, vật lý và công nghệ cao

1.1.6 Ánh sáng đối với thực vật

1.1.6.1 Vai trò của một số phổ ánh sáng đơn sắc đến đời sống thực vật

Ánh sáng trắng:

Là tổng hợp của các loại ánh sáng có bước sóng khác nhau (400 − 800 nm), thích

hợp cho nhiều loại đáp ứng của thực vật Trong nuôi cấy dịch huyền phù của cây Perilla

frutescens, sự chiếu ánh sáng trắng với cường độ 27,2 W.m-2 trong suốt thời gian nuôi cấy rất hiệu quả và lượng anthocyanin được tạo ra cao gấp hai lần so với không chiếu sáng

Ánh sáng trắng tăng cường sự sinh trưởng của chồi cây Artemisia annua L và làm tăng

hàm lượng artemisinin của nó Trong điều kiện tối, chồi không sinh trưởng và artemisinin không tạo ra

Ánh sáng đỏ (700 − 780 nm)/đỏ xa (trên 750 nm): có 2 tác động chủ yếu là:

Kéo dài rễ: trong nuôi cấy lông rễ của Artemisia annua L., sinh khối lông rễ và hàm

lượng artemisinin dưới ánh sáng đỏ cao hơn 17 đến 67% so với dưới ánh sáng trắng Kéo dài lóng thân: tỷ lệ bức xạ tia đỏ: đỏ xa (R: Fr) có ảnh hưởng đến sự kéo dài lóng thân ở thực vật

Ngoài ra protein phytochrome có trong hầu hết các loại thực vật rất nhạy cảm với ánh sáng đỏ và đỏ xa Ánh sáng đỏ sẽ kích thích phytochrome chuyển đổi thành phytochrome FR (PFR) Thực vật có hoa dựa vào protein này để điều chỉnh thời điểm ra hoa (dựa vào nồng độ PFR) và thiết lập nhịp sinh học, ngoài ra nó cũng điều tiết các phản ứng khác như sự nảy mầm của hạt giống, kéo dài thân cây, kích thước-hình dạng và số lượng lá

Ánh sáng đỏ là bước sóng quan trong nhất đối với quá trình quang hợp, ra hoa, đậu quả Được dùng để mở rộng chu kỳ ánh sáng, kích thích cây ra hoa cho cây dài ngày (cây Thanh long, hoa Lay ơn,…) hoặc ngăn chặn ra hoa ở cây ngắn ngày (hoa Cúc,…)

Mặc dù bước sóng 730 nm nằm phạm vi quang hợp của cây nhưng nó tác động mạnh mẽ trong việc chuyển đổi phytochrome FR (PFR) thành phytochrome R (PR) Các loại cây ngắn ngày sẽ ra hoa dựa trên nồng độ protein phytochrome R (PR), vậy nên bước sóng này thường được dùng ở cuối chu kỳ ánh sáng (mỗi ngày là 1 chu kỳ ánh sáng) để kích thích ra hoa ở cây ngắn ngày

Ánh sáng xanh dương:

Phổ ánh sáng 450 nm cho phép cryptochrome và phototropin phản ứng trong cây trồng Cryptochromes sẽ làm thay đổi nhịp sinh học (chuyển từ chu trình hô hấp sang chu trình quang hợp) Protein phototropins kích thích cây mở khí khổng, uốn cong về phía ánh sáng giúp phát triển thân cây và hình thành diệp lục tố

Bước sóng này kích thích tăng trưởng thực vật thông qua hình thành rễ mạnh mẽ và quang hợp với cường độ cao Được dùng trong giai đoạn cây giống, cây non trong giai đoạn sinh trưởng nếu muốn cây ngừng phát triển thì bước sóng này phải được giảm bớt hoặc loại bỏ

Thúc đẩy sự sinh trưởng của mô sẹo và ức chế sự kéo dài thân Mô sẹo được nuôi cấy dưới ánh sáng xanh (435 nm) cho nhiều sinh khối (18,4 g DW/l) và PeG (2,4 g/L) nhất, lần lượt cao hơn 19 và 41% so với khi nuôi cấy dưới ánh sáng trắng Điều này được giải thích do hoạt tính của PAL trong mô sẹo được nuôi cấy dưới ánh sáng xanh cao hơn

so với dưới ánh sáng trắng trong toàn bộ thời gian nuôi cấy Ánh sáng xanh tăng cũng làm

giảm chiều cao của Antirrhinum

Ánh sáng xanh lục: