Nghiên cứu tác dụng cải thiện trí nhớ trên chuột bị thiếu máu não cục bộ và khả năng ức chế acetylcholinesterase của rau đắng biển (bacopa monnieri (linn) wettst)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN MINH TRANG NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CẢI THIỆN TRÍ NHỚ TRÊN CHUỘT BỊ THIẾU MÁU NÃO CỤC BỘ VÀ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ ACETYLCHOLIN

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN MINH TRANG

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CẢI THIỆN TRÍ NHỚ TRÊN CHUỘT BỊ THIẾU MÁU NÃO CỤC BỘ VÀ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ ACETYLCHOLINESTERASE

CỦA RAU ĐẮNG BIỂN

(BACOPA MONNIERI(LINN.) WETTST)

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2014

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN MINH TRANG

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CẢI THIỆN TRÍ NHỚ TRÊN CHUỘT BỊ THIẾU MÁU NÃO CỤC BỘ VÀ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ ACETYLCHOLINESTERASE

CỦA RAU ĐẮNG BIỂN

(BACOPA MONNIERI(LINN.) WETTST)

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÓA SINH DƯỢC

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình thực hiện luận văn, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ quý báu của các thầy cô cùng đồng nghiệp

Đầu tiên tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS Nguyễn Thị Lập và

TS Phạm Thị Nguyệt Hằng, hai người thầy luôn tận tình hướng dẫn và giúp đỡ

tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn này

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô, các anh chị đồng nghiệp và bạn bè công tác tại Khoa dược lý – sinh hóa - Viện dược liệu và Bộ môn Hóa sinh - Trường Đại học Dược Hà Nội đã phối hợp và tạo điều kiện giúp tôi thực hiện luận văn

Lời cảm ơn cuối cùng xin gửi tới gia đình và bạn bè đã luôn quan tâm động viên, giúp đỡ tôi hoàn thành nhiệm vụ của mình

Hà Nội, tháng 10 năm 2014

Nguyễn Minh Trang

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 TỔNG QUAN 3

1 Bệnh Alzheimer 3

1.1 Dịch tễ 3

1.2 Yếu tố nguy cơ 3

1.3 Triệu chứng 4

1.4 Cơ chế bệnh sinh 5

1.5 Acetylcholinesterase và thuốc kháng enzym acetylcholinesterase 10 1.6 Một số nhóm thuốc khác điều trị bệnh Alzheimer 11

1.7 Đích tác dụng của các thuốc điều trị Alzheimer trong tương lai 11

2 Rau đắng biển 13

2.1 Vị trí phân loại 13

2.2 Đặc điểm thực vật 14

2.3 Phân bố 14

2.4 Thành phần hóa học 15

2.5 Tác dụng dược lý 17

3 Một số mô hình đánh giá khả năng cải thiện trí nhớ 22

3.1 Mô hình đánh giá khả năng ức chế acetylcholinesterase 22

3.2 Mô hình đánh giá khả năng học tập không gian trên chuột 22

4 Liên quan giữa thiếu máu não cục bộ và bệnh Alzheimer 23

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.1 Nguyên liệu và đối tượng nghiên cứu 25

2.1.1 Nguyên liệu 25 2.1.2 Đối tượng nghiên cứu26:

2.1.3 Hóa chất27

2.2 Phương pháp nghiên cứu 28

2.2.1 Đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ in vivo bằng thử nghiệm mê lộ

nước Morris 28 2.2.2 Nghiên cứu khả năng ức chế enzyme acetylcholinesterase (AChE)

ex vivo 31

2.2.3 Nghiên cứu khả năng ức chế enzyme acetylcholinesterase (AChE)

in vitro 32

2.3 Xử lý số liệu 32 Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 33 3.1 Tác dụng cải thiện trí nhớ của rau đắng biển trên chuột bị suy giảm trí nhớ đánh giá qua thử nghiệm mê lộ nước Morris 33

3.1.1 Bài tập nhìn thấy bến đỗ và bài tập không nhìn thấy bến đỗ 33 3.1.2 Bài tập không có bến đỗ 36

3.2 Nghiên cứu tác dụng ức chế hoạt tính enzym acetylcholinesterase

in vitro và ex vivo của rau đắng biển 38

3.2.1 Nghiên cứu tác dụng ức chế hoạt tính enzym AChE in vitro của

các mẫu M1, M2 38

3.2.2 Nghiên cứu tác dụng ức chế hoạt tính enzym AChE ex vivo của

các mẫu M1, M2 41

Chương 4: Bàn luận 43 4.1 Về tác dụng cải thiện trí nhớ của rau đắng biển 43

4.2 Về tác dụng ức chế hoạt tính enzyme AChE in vitro và ex vivo của

rau đắng biển 50 KẾT LUẬN 55 KIẾN NGHỊ VÀ ĐỀ XUẤT 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

FTD Sa sút trí tuệ trán – thái dương (Frontotemporal Dementia)

chromatography)

Protein Tau)

serotonin reuptake inhibitors)

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

1.1 Mối liên quan giữa protein Tau, β amyloid và ApoE4

3.1 Đồ thị biểu diễn thời gian tiềm tàng của các lô chuột thử

nghiệm ở ngày thứ 6 của bài tập không nhìn thấy bến đỗ

36

3.2 Đồ thị biểu diễn tỷ lệ thời gian chuột ở cung phần tư đích phụ

3.3 Đồ thị biểu diễn tác dụng ức chế hoạt tính enzym phụ thuộc vào

ĐẶT VẤN ĐỀ

Cùng với sự phát triển của cuộc sống hiện đại, số lượng người cao tuổi, thậm chí cả người trẻ tuổi mắc bệnh suy giảm trí nhớ ngày càng gia tăng Nghiên cứu cho thấy có khoảng 35 triệu người bị mắc bệnh Alzheimer Thống

kê cho thấy ở châu Á có khoảng gần 13 triệu người mắc bệnh Alzheimer, dự đoán đến năm 2050 con số này tăng lên tới 62,8 triệu người Việt Nam có khoảng hơn 9 triệu người bị sa sút trí tuệ mà dạng bệnh điển hình là Alzheimer Alzheimer là thể bệnh nặng nhất trong nhóm các bệnh sa sút trí tuệ, hiện nay là mối quan tâm hàng đầu của những nhà lão khoa trên toàn thế giới cũng như ở nước ta, khi tuổi thọ trung bình ngày càng cao, số người mắc bệnh ngày càng nhiều [5]

Bệnh nhân bị Alzheimer sẽ bị giảm khả năng xét đoán, định hướng không gian và thời gian, ngôn ngữ, tư duy nhận thức, hành động ảnh hưởng nặng nề đến chức năng và chất lượng cuộc sống, gây nhiều khó khăn cho người bệnh, cho gia đình và cả cộng đồng xã hội

Các thuốc điều trị Alzheimer chủ yếu gồm các thuốc ức chế cholinesterase, thuốc kháng thụ thể N-methyl – D- Aspartat, thuốc tăng cường hoạt tính serotonin Ba nhóm này đa số là thuốc tân dược nhưng giá thành thuốc tương đối cao và có những tác dụng không mong muốn Do đó nhu cầu nghiên cứu phát triển các thuốc mới có nguồn gốc từ dược liệu để hỗ trợ và điều trị Alzheimer là rất cần thiết

Theo Y học cổ truyền Ấn Độ, rau đắng biển (Bacopa monnieri (Linn)

Wettst được sử dụng để điều trị rối loạn tâm thần kinh như lo lắng, sa sút trí tuệ, trí nhớ kém Trên thế giới cũng đã có những nghiên cứu chứng minh hiệu quả

của rau đắng biển trên hệ thần kinh của chuột và người Rau đắng biển (Bacopa

monnieri (Linn) Wettst) nhiều năm nay đã là món ăn phổ biến với người dân

Việt Nam Tuy nguồn nguyên liệu dồi dào như vậy nhưng rau đắng biển vẫn chưa được chú trọng nghiên cứu làm thuốc điều trị Alzheimer, trong khi nhu cầu

sử dụng là khá phổ biến và bệnh nhân phải mua thuốc nhập từ nước ngoài với giá thành khá cao Điều này gây tổn thất về giá trị kinh tế cũng như ý nghĩa xã

hội của loài cây này Vì vậy chúng tối tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu

tác dụng cải thiện trí nhớ trên chuột bị thiếu máu não cục bộ và khả năng

ức chế acetylcholinesterase của rau đắng biển (Bacopa monnieri (Linn)

Wettst)”, nằm trong khuôn khổ đề tài cấp bộ y tế “Nghiên cứu tác dụng cải

thiện khả năng học, nhớ và bảo vệ thần kinh của cây rau đắng biển (Bacopa

monnieri (Linn) Wettst) theo hướng làm thuốc chữa bệnh Alzheimer”

Đề tài “Nghiên cứu tác dụng cải thiện trí nhớ trên chuột bị thiếu máu

não cục bộ và khả năng ức chế acetylcholinesterase của rau đắng biển

(Bacopa monnieri (Linn) Wettst)” được tiến hành với hai mục tiêu:

1 Đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ của rau đắng biển trên chuột nhắt trắng

bị suy giảm trí nhớ do thiếu máu não cục bộ tạm thời bằng thử nghiệm mê

lộ nước Morris

2 Đánh giá khả năng ức chế enzym acetylcholinesterase của rau đắng biển

in vitro và ex vivo

Chương 1 TỔNG QUAN

1 Sa sút trí tuệ và bệnh Alzheimer

Sa sút trí tuệ là trạng thái suy giảm nhận thức xảy đến trên những người

mà tình trạng trí giác vẫn bình thường và không bị những bệnh vốn có thể gây ra suy giảm này nhận thức này (ví dụ như trầm cảm) Tình trạng suy giảm nhận thức mang tính chất nặng dần và không thể đảo ngược được với biểu lộ nổi bật

và xuất hiện sớm nhất là sự suy giảm về trí nhớ, ngoài ra còn có kèm theo các rối loạn khác của trí tuệ như rối loạn nhận thức, rối loạn ngôn ngữ, và rối loạn khả năng tiến hành các cử động hữu ý Sa sút trí tuệ cần được phân biệt với tình trạng giảm trí nhớ sinh lý của người lớn tuổi (quên lành tính của tuổi già) vốn là

hệ quả của sự lão hoá trong đó các quá trình thần kinh bị chậm đi Người có chứng quên lành tính của tuổi già học các thông tin mới chậm hơn và cũng nhớ lại các thông tin mới học được chậm hơn người bình thường, tuy nhiên nếu họ được cho thêm thời gian để thực hiện những hoạt động này thì họ vẫn đạt được các thành tích trí tuệ ở mức chuẩn của người bình thường Các hoạt động thường ngày của họ cũng không bị ảnh hưởng

Bệnh Alzheimer là nguyên nhân hay gặp nhất của các loại sa sút trí tuệ, chiếm tỷ lệ khoảng hai phần ba tổng số các trường hợp sa sút trí tuệ Bệnh Alzheimer thường xuất hiện trễ nhưng một số trường hợp lại xuất hiện sớm, trước 60 tuổi Giữa các thể bệnh Alzheimer xuất hiện sớm và xuất hiện trễ có những điểm khác nhau rõ rệt, trong đó rõ nhất là sự hiện diện của các đột biến di truyền vốn hay gặp nhất trong thể bệnh Alzheimer xuất hiện sớm

1.1 Dịch tễ bệnh Alzheimer

Tỷ lệ mắc sa sút trí tuệ ở những nước phát triển, mà thể nặng nhất là Alzheimer, lên tới 8% đối với người từ 65 tuổi trở lên Với tuổi cao hơn (85 trở lên), tỷ lệ ở nhiều nước có thể lên đến 50%, có nghĩa là cứ hai người thì có một người mắc Có một nửa số trường hợp mất trí mới phát hiện mỗi năm là mắc

bệnh Alzheimer Ngoài ra còn có sự khác biệt giới tính ở các mức tỷ lệ, phụ nữ

có nguy cơ phát triển bệnh Alzheimer cao hơn nam giới [5]

Nghiên cứu của Bệnh viện Lão khoa Trung ương tại huyện Ba Vì, Hà Nội (2005 – 2006) cho thấy tỷ lệ người từ 60 tuổi trở lên sống tại cộng đồng có sa sút trí tuệ (SSTT) là 4,63%, tỷ lệ mắc bệnh tăng lên 1,78 lần sau mỗi 5 tuổi [2]

1.2 Yếu tố nguy cơ bệnh Alzheimer

Yếu tố nguy cơ quan trọng nhất của bệnh Alzheimer là tuổi tác cao, tỷ lệ mắc bệnh toàn bộ bằng 0,5% trong quần thể người thuộc lứa tuổi 65, đạt 10% ở lứa tuổi 80 Bệnh Alzheimer thường xuất hiện trễ nhưng một số trường hợp lại xuất hiện sớm, trước 60 tuổi Giữa các thể bệnh Alzheimer xuất hiện sớm và xuất hiện trễ có những điểm khác nhau rõ rệt, trong đó rõ nhất là sự hiện diện của các đột biến di truyền vốn hay gặp nhất trong thể bệnh Alzheimer xuất hiện sớm Yếu tố nguyên nhân trong thể bệnh Alzheimer xuất hiện trễ thì phức tạp và

đa dạng hơn, trong đó có thể có sự hiện diện của cả yếu tố di truyền, tuối tác và tác động môi trường

Yếu tố nguy cơ rõ rệt tiếp theo là yếu tố di truyền, trong khi đó một số yếu tố khác như giới tính là nữ, chấn thương sọ nặng nề và trình độ học vấn thấp

là những yếu tố nguy cơ đã được đưa ra nhưng vẫn còn gây tranh cãi

1.3 Triệu chứng bệnh Alzheimer

Các triệu chứng đầu tiên thường bị nhầm lẫn là có liên quan đến lão hóa hoặc stress Các kiểm tra tâm lý có thể cho thấy có những khó khăn về nhận thức nhẹ Những triệu chứng sớm có thể ảnh hưởng phức tạp đến các sinh hoạt hàng ngày Đáng chú ý nhất là giảm trí nhớ, khó khăn trong việc nhớ các sự kiện gần đây đã học được và không có khả năng để tiếp thu các thông tin mới Một số triệu chứng ban đầu của bệnh Alzheimer có thể không được chú ý đến, đó là người bệnh có những vấn đề với các chức năng điều hành não bộ về sự chú tâm,

tính quy hoạch, tính linh hoạt, và tư duy trừu tượng, hoặc suy yếu trong phần não bộ lưu trữ ngữ nghĩa (bộ nhớ của ý nghĩa, và các mối quan hệ, khái niệm) Những đặc điểm này thường là triệu chứng tiền lâm sàng của bệnh

Một số rối loạn về năng lực nhận thức [6], [7],[18], [21]:

Rối loạn về trí nhớ

Rối loạn về trí nhớ gần như bao giờ cũng là biểu hiện sớm nhất của bệnh Những dấu hiệu ban đầu thường kín đáo, diễn biến âm thầm và dễ bị nhầm lẫn chỉ là những biểu hiện thông thường của tuổi già Bệnh nhân hay nhắc đi nhắc lại nhiều lần những câu hỏi mà họ nghĩ là mới nêu lần đầu tiên, hay quên những chuyện vừa mới xảy ra

Những rối loạn trí nhớ này nhanh chóng kéo theo những rối loạn khác về hoạt động thần kinh cao cấp, dần dẫn đến hình thành sa sút trí tuệ Rối loạn trí nhớ ảnh hưởng ngày càng nhiều đến mọi hoạt động hàng ngày, và là nguyên nhân quan trọng trong việc hạn chế tính tự quản Các công trình nghiên cứu thần kinh tâm lý học cho thấy các rối loạn về trí nhớ gặp trong bệnh Alzheimer có cơ chế rất phức tạp Một số cơ chế liên quan đến các tổn thương của cấu trúc não đặc biệt, nhất là về lưu giữ thông tin Một số khác liên quan đến các trung tâm của chú ý, tri giác, ngôn ngữ, các trung tâm xử lý thông tin

Rối loạn về ngôn ngữ

Rối loạn ngôn ngữ được coi là những rối loạn về nhận thức hay gặp nhất sau các rối loạn về trí nhớ Gặp trong khoảng 40% các trường hợp sa sút trí tuệ nhẹ và 100% trong các trường hợp nặng Trong quá trình nói chuyện, các dấu hiệu đầu tiên xuất hiện là tình trạng thiếu từ, được thay thế bằng dạng nói quanh Ngôn ngữ viết thường bị rối loạn sớm hơn ngôn ngữ nói

Rối loạn về phối hợp động tác

Các rối loạn trong việc thực hiện các cử chỉ rất phổ biến trong bệnh Alzheimer Các rối loạn này hạn chế nhiều sự tự chủ của người bệnh Khám thần kinh có thể làm bộc lộ các rối loạn khác nhau về cử chỉ Mất dùng động tác phản

xạ được định nghĩa là mất khả năng lặp lại một cách chính xác các cử chỉ của hai bàn tay bằng cách bắt chước Theo một số tác giả, loại mất khả năng dùng động tác phản xạ là dấu hiệu thần kinh sớm nhất gặp trong bệnh Alzheimer

Rối loạn nhận thức bằng giác quan

Về phương diện lâm sàng, các rối loạn nhìn hay gặp nhất, mất nhận thức nhìn gặp trong khoảng 30% trường hợp, biểu hiện duới dạng khó nhìn các đồ vật hoặc khó đọc, mặc dù có dùng kính điều chỉnh cũng không đỡ Chưa có trường hợp nào mất nhận thức về nghe được công bố

1.4 Cơ chế bệnh sinh bệnh Alzheimer

Bệnh Alzheimer sớm hay bệnh Alzheimer trễ đều có ba đặc điểm giải phẫu bệnh giống nhau gồm có sự hiện diện của các mảng amyloid (amyloid plaques), các búi sợi tơ thần kinh (neurofibrillary tangles), và sự mất tế bào thần kinh Bản chất của mảng amyloid là sự kết tập ngoài tế bào của protein β amyloid Sự kết

tập của protein tau và của các tiểu sợi thần kinh (neurofilament) trong thân tế

bào thần kinh tạo ra các búi sợi tơ thần kinh Chính các mảng amyloid và các búi sợi tơ thần kinh là nguyên nhân dẫn đến chết tế bào thần kinh Hiện nay có một cách phân loại dựa trên sự hiện diện ít hay nhiều của các các búi sợi tơ thần kinh

để xếp hạng mức độ nặng nhẹ của bệnh Alzheimer Theo cách phân loại này, bệnh Alzheimer được phân ra thành sáu mức độ từ I đến VI Ở độ I và độ II, các búi sợi tơ thần kinh chỉ hiện diện khu trú tại vỏ hải mã (hippocampal cortex) và

vỏ trong rãnh mũi (entorhinal cortex), trong khi đó các búi sợi tơ thần kinh lại hiện diện lan tràn tại tất cả các vùng vỏ não mới trong bệnh Alzheimer độ V và

VI [1]

1.5 Di truyền học bệnh Alzheimer

Bệnh Alzheimer có thể do tương tác bởi nhiều yếu tố như di truyền, di truyền ngoài ADN và các nhân tố thuộc về môi trường Đột biến ở amyloid protein, presenilin (PS-1 và PS-2) – nguyên nhân gây khởi phát bệnh Alzheimer

sớm (<60 tuổi), thường có liên quan đến bệnh Alzheimer [12] Đột biến có liên quan đến quá trình sinh tổng hợp protein amyloid, dẫn đến làm thay đổi việc sản xuất các β amyloid peptid khác nhau, và do đó làm thay đổi tỉ lệ giữa các peptid này Bệnh nhân mắc hội chứng Down có thêm một bản sao của nhiễm sắc thể thứ 21, trên nhiễm sắc thể này có các gen APP cư trú Những bệnh nhân này thường phát triển sa sút trí tuệ sớm với các dấu hiệu bệnh lý của bệnh Alzheimer trong não Điều này phù hợp với một số ý kiến cho rằng sự biểu hiện quá mức của gen APP gây khởi phát sớm bệnh Alzheimer

Apolipoprotein E4 có liên quan về mặt di truyền với bệnh Alzheimer có tính di truyền khởi phát muộn, chiếm hầu hết các trường hợp mắc bệnh Alzheimer [7] Tất cả những nghiên cứu về hệ gen trên bệnh Alzheimer khởi phát muộn từ các dân tộc khác nhau trên thế giới đã xác định rằng apoE4 là gen

có liên quan nhiều nhất [12]

1.5.1 β amyloid và các sản phẩm APP khác

β amyloid peptid, thành phần chính của mảng amyloid, và các chất chuyển hóa khác đều có nguồn gốc từ APP do sự phân giải protein Nhiều giả thuyết cho rằng APP và β amyloid có mối liên hệ với cơ chế bệnh sinh của Alzheimer Tiểu đơn vị xúc tác của phức hợp protein g-secretase (enzym này có vai trò giải phóng β amyloid peptid từ dạng tiền chất của nó chính là APP) được hình thành bởi PS1 và PS2 Đột biến trội NST gặp ở APP, PS1 hoặc PS2 sẽ làm thay đổi quá trình tạo ra APP, thúc đẩy quá trình tổng hợp và tích lũy β amyloid trong não, là nguyên nhân gây khởi phát sớm bệnh Alzheimer [12]

Một số nghiên cứu đã chứng minh β amyloid làm thay đổi hoạt động của

tế bào thần kinh và các synap, đồng thời sự tích tụ amyloid trong não tạo nên hoạt động bất thường và gây áp lực cho các synap [30] Do việc sản xuất β amyloid được quy định một phần bởi hoạt động của các tế bào thần kinh nên khi hoạt động thần kinh bất thường có thể kích hoạt một vòng tuần hoàn luẩn quẩn

bằng cách tăng sản xuất β amyloid Điều này làm cho bệnh Alzheimer trầm trọng hơn

1.5.2 Protein Tau

Bệnh Alzheimer có tác nhân là nhiều loại protein gây bệnh, tích lũy riêng

rẽ hoặc kết hợp cùng nhau ở trong não Bệnh Alzheimer có liên quan không chỉ với sự tích tụ bất thường các mảng amyloid mà còn của các đám rối thần kinh (NFT) Các đám rối thần kinh hình thành trong tế bào và chủ yếu được tạo thành

do sự bất thường của quá trình biến đổi sau dịch mã sau khi tổng hợp protein

Tau, bao gồm sự tăng phosphoryl hóa và acetyl hóa [14] Một vài nghiên cứu

gần đây đã đưa ra các quan điểm khác với truyền thống rằng chức năng chính

của protein Tau là để ổn định các vi ống và sự kết tập các protein Tau gây khiếm

khuyết thông qua cơ chế làm mất chức năng các vi ống này Các nghiên cứu

nuôi cấy tế bào và trên chuột biến đổi gen cho thấy protein Tau có thể tạo điều

kiện hoặc kích thích việc dẫn truyền thần kinh thông qua việc điều hòa sự phân

bố các phân tử dẫn truyền tín hiệu có liên quan đến hoạt động của synap [32]

Tuy nhiên, khi có những biến đổi bất thường, protein Tau xuất hiện nhiều hơn ở

đuôi gai, tại đó gây ảnh hưởng đến việc dẫn truyền thần kinh Các oligome β

amyloid thúc đẩy quá trình này tại hậu synap làm tăng cường lượng protein Tau

thông qua quá trình có liên quan đến thành phần của nhóm enzym MARK (là nhóm enzym điều tiết ái lực của các vi ống) Một số nghiên cứu trên hệ gen cho thấy đột biến ở APP hoặc presenilin là nguyên nhân tích tụ β amyloid trong não,

từ đó gây nên các mảng amyloid và các đám rối thần kinh (NFTs), trong khi đó

đột biến protein Tau tạo nên các đám rối thần kinh nhưng không tạo mảng

amyloid và cũng không gây nên bệnh Alzheimer

Hình 1.1 Mối liên quan giữa protein Tau, β amyloid và ApoE4

với bệnh Alzheimer

1.5.3 ApoE4

Tác động của ApoE4 trên nguy cơ gây Alzheimer vẫn chưa được quan tâm nhiều so với APP, β amyloid, tau, mặc dù mức độ ảnh hưởng của nó là không hề nhỏ

ApoE4 có thể có cả 2 vai trò: độc lập và phụ thuộc β amyloid trong sinh bệnh học Alzheimer ApoE4 làm giảm thanh thải β amyloid và tăng lắng đọng β amyloid Ngoài ra, tế bào thần kinh apoE4 thông qua quá trình phân giải protein

để tạo ra các mảnh vỡ độc với thần kinh, tạo nên sinh bệnh học độc lập với β amyloid của bệnh Alzheimer Giả thuyết phân giải protein ApoE cho rằng, để đáp ứng với stress hoặc chấn thương, quá trình biểu hiện gen ApoE được kích hoạt để tạo điều kiện sửa chữa tế bào thần kinh Ức chế ApoE biểu hiện trên tế bào thần kinh có thể làm giảm mức độ gây độc của các mảnh vỡ ApoE Việc xác định các protease có liên quan đến ApoE trong tế bào thần kinh có thể giúp phát triển chất ức chế protease đặc hiệu, làm giảm sản xuất các mảnh vỡ ApoE gây

độc thần kinh Ngoài ra còn có thể phát triển các thuốc bảo vệ ty thể và khung tế bào chống lại sự tấn công của các mảnh vỡ ApoE độc hại [12]

Một số nghiên cứu gần đây đã giả định rằng những gốc tự do được sinh ra

do quá trình stress oxy hóa và viêm cũng là nguyên nhân quan trọng trong sinh bệnh học của bệnh Alzheimer

1.6 Acetylcholinesterase và thuốc kháng enzym acetylcholinesterase

Acetylcholin là chất trung gian hoá học có mặt trong phần lớn các synap thần kinh trung ương, thần kinh thực vật, thần kinh - cơ Acetylcholin tìm thấy ở hành não, cầu não, tiểu não, thân não, não trung gian,thể vân và vỏ não mới (nhiều nhất ở vùng vận động) Acetylcholin còn tìm thấy trong tuỷ sống, các hạch thần kinh thực vật, các tận cùng thần kinh tiếp xúc với cơ quan ngoại vi

AChE là một hydrolase thủy phân acetylcholin, được tìm thấy chủ yếu ở các nút thần kinh-cơ và các khe synap, nhằm chấm dứt quá trình truyền tín hiệu

ở các khớp thần kinh AChE có hoạt tính xúc tác cao, mỗi phân tử AChE phân giải 25000 phân tử ACh mỗi giây Có bốn vị trí hoạt động chính của AChE trong quá trình thủy phân ACh là vị trí ester hóa, vị trí anion, túi acyl và vị trí oxy-anion [38]

Nhóm thuốc ức chế enzym acetylcholinesterase được dùng để cải thiện tình trạng suy giảm acetylcholin trong hệ thần kinh trung ương ở các bệnh nhân sa sút trí tuệ do bệnh Alzheimer và những khiếm khuyết này gây suy giảm trí nhớ Các thuốc thuộc nhóm này bao gồm: tacrin, donepezil, rivastigmin, galantamin Donepezil (Aricept): điều trị bệnh Alzheimer trong tất cả các giai đoạn

Donepezil là thuốc rất chọn lọc acetylcholinesterase Sự chọn lọc này được khẳng định là làm giảm tác dụng phụ của thuốc

Rivastigmin (Exelon): điều trị bệnh Alzheimer's trong giai đoạn nhẹ và vừa Rivastigmin chủ yếu ức chế một trong bốn phân nhóm của enzym acetylcholinesterase–G1, được tìm thấy ở vùng dưới đồi và vỏ não

Galantamin (Razadyne): điều trị bệnh Alzheimer trong giai đoạn nhẹ và vừa Tacrin (Cognex): điều trị bệnh Alzheimer giai đoạn nhẹ và vừa

1.6 Một số nhóm thuốc khác điều trị bệnh Alzheimer

 Nhóm thuốc điều trị tổn thương liên quan đến nhận thức bao gồm:

- Nhóm kháng thụ thể N-methyl D aspartat (NMDA) của hệ thống

glutamat

Nhóm này có memantine là thuốc đối kháng thụ thể N-methyl D aspartat (NMDA) của hệ thống glutamat do có hiện tượng tăng kích hoạt thụ thể NMDA làm tổn thương các neuron trong các bệnh lý thoái hóa thần kinh

- Nhóm thuốc chống oxy hóa và các nhóm khác: như vitamin E, ginkgo

biloba, estrogen, kháng viêm NSAIDs, các tiền chất của acetylcholin

 Nhóm thuốc điều trị tổn thương liên quan tới hành vi: nhóm tăng cường

hoạt tính serotonin (ức chế tái hấp thu serotonin chọn lọc SSRIs), gồm có

fluoxetine, sertraline, citalopram, escitalopram, paroxetine

1.7 Đích tác dụng của các thuốc điều trị Alzheimer trong tương lai

Trong hơn 30 năm qua, các nhà nghiên cứu đã đạt được những tiến bộ đáng kể trong việc tìm hiểu chức năng của não và những vấn đề gặp phải của bệnh nhân mắc Alzheimer, từ đó nghiên cứu các thuốc mới dựa trên các đích tác

dụng như Βeta amyloid, protein Tau…

Βeta amyloid:

Βeta amyloid là thành phần chính của mảng bất thường, còn gọi là mảng amyloid, là một dấu hiện của bệnh Alzheimer Các nhà khoa học đã tìm hiểu chi tiết về các mảng này được cắt từ hợp chất APP (amyloid recursor protein) bởi hai enzym là β – secretase và gamma – secretase Các nhà nghiên cứu đang phát triển các loại thuốc nhằm vào quá trình tổng hợp amyloid, bao gồm việc ngăn chặn hoạt động của cả hai enzym vừa nêu, ngăn chặn các mảnh vỡ β amyloid kết

tụ thành mảng, và thậm chí sử dụng các kháng thể chống lại β amyloid để loại trừ chúng khỏi não

Butyrylcholinesterase

Sự dẫn truyền thần kinh xảy ra khi acetylcholin được giải phóng từ màng trước synap rồi liên kết với các thụ thể nicotinic hoặc muscarinic ở màng sau synap Bộ não của động vật có vú thường có hai dạng chính của enzym cholinesterase: acetylcholinesterase và butyrylcholinesterase Cả hai dạng này

đề có khả năng thủy phân acetylcholin, Hai enzym này khác nhau về mặt di truyền, cấu trúc và động học AChE nằm ở khe synap (dạng hòa tan) và màng synap (dạng liên kết với màng), còn butyrylcholinesterase (BuChE) chủ yếu có liên quan đến tế bào thần kinh đệm Một tính chất quan trọng vê sự khác biệt giữa các chất ức chế cholinesterase là tính đặc hiệu với mỗi loại enzym bị ức chế Có ba tác nhân ức chế AChE là ba enzym chính đóng vai trò điều hòa bằng cách làm giảm nồng độ acetylcholin trong não Mặc dù chỉ chiếm 10% tổng hoạt

độ cholinesterase trong vỏ thái dương của não khỏe mạnh, 27 nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng enzym này có khả năng thủy phân acetylcholin và đóng vai trò quan trọng trong việc dẫn truyền thần kinh hơn so với nó từng được đánh giá trước đây Tầm quan trọng của BuChE trong dẫn truyền thần kinh càng tăng khi bệnh Alzheimer tiến triển Bởi vì khi đó hoạt động của enzym AChE giảm tới 45% trong khi hoạt động của BuChE tăng từ 40% đến 90% [19]

Bệnh Alzheimer được đặc trưng bởi sự mất chức năng của hệ cholinergic, trong đó các thuốc điều trị triệu chứng tỏ ra có hiệu quả cho đến nay là các chất

ức chế cholinesterase nhằm tăng cường hoạt động của cholinergic Ở não bộ khỏe mạnh, acetylcholinesterase (AChE) chiếm ưu thế (80%) và butyrylcholinesterase (BuChE) được đánh giá là chỉ đóng vai trò nhỏ trong việc điều hòa mức độ acetylcholin Trong não của bệnh nhân mắc Alzheimer, hoạt độ của BuChE tăng trong khi hoạt độ của AChE không thay đổi hoặc giảm Vì vậy

cả hai enzym này đều có khả năng tham gia vào quá trình điều hòa mức acetylcholin và là mục tiêu trong điều trị bệnh Alzheimer nhằm cải thiện tình trạng thiếu hụt acetylcholin Hai enzym này khác nhau về vị trí, tính chất và

động học Những bằng chứng gần đây cho thấy BuChE có thể cũng có thể là nguyên nhân và tiến triển của bệnh Alzheimer Thử nghiệm lâm sàng được thực hiện bằng cách sử dụng tác nhân có tác dụng chọn lọc với BuChE và một chất

ức chế AChE như rivastigmine, ngoài ra một nhóm bệnh nhân được sử dụng cả thuốc ức chế AChE và ức chế BuChE, cho kết quả khả quan trên nhóm sử dụng đồng thời cả thuốc ức chế AChE và BuChE trong điều trị Alzheimer và chứng suy giảm trí nhớ [20]

Protein Tau

Protein Tau là một protein liên kết vi ống, bị phosphoryl hóa quá mức do

mất cân bằng hoạt động của hai enzym kinase và phosphatase là các enzym điều

hòa hoạt động phosphoryl hóa Ngoài ra, protein Tau tách ra từ các vi ống và tự

tập hợp với nhau tạo thành oligome không hòa tan rồi nhập vào đám rối Do đó độc tính được gây ra bởi các oligomer hoặc do các vi ống đã bị biến đổi Để nghiên cứu thuốc điều trị bệnh này, đã có rất nhiều nghiên cứu được triển khai nhằm xác định và ngăn chặn các enzym kinase chịu trách nhiệm trong điều hòa quá trình phosphoryl hóa và nhiều kinase đã được đưa vào nghiên cứu, bao gồm glycogen synthase kinase (GSK-3), cyclin phụ thuộc kinase-5 (CDK-5), các kinase thuộc nhóm MAPK (microtubule affinity regulating kinase), JNKs (c-Jun N-terminal Kinase), casein kinase, CaMK-II (calcium calmodulin-dependant kinase II), PKA (protein kinase)…[16], [20]

2.1 Vị trí phân loại

Rau đắng biển có tên khoa học là Bacopa monnieri (Linn) Wettst., thuộc

họ hoa mõm chó (Scrophulariaceae) Các tên gọi khác là Bacopa monniera (L.) Pennell yes, Lysimachia monnieri L Cent., Graticola monnieri L., Monniera

cunefolia Michaux, Herpestis monniera L Kunth

Tại Ấn Độ: Tên Brahmi được gọi chung cho rau đắng biển và cả rau má Tại Pakistan: rau đắng biển được gọi là Bamb, Ionika Tại Việt Nam cây còn được gọi là rau sam trắng, rau sam đắng, cây ruột gà

Đặc điểm thực vật

Rau đắng biển là dạng cây thảo sống quanh năm, có thân nhẵn, mọc bò rễ dài 10-40cm Các cành mọc đứng mềm, không lông, rất đắng Lá mọc đối, không cuống, thuôn hình muỗng, dài cỡ 1cm, gân chính hơi khó thấy Hoa màu tím xanh hoặc trắng nhạt, mọc riêng lẻ ở nách lá Quả nang hình trứng có mũi, nhẵn, có đài tồn tại [8]

Hình 1.2 Hình ảnh rau đắng biển (Bacopa monnieri (Linn) Wettst)

2.3 Thành phần hóa học

Một số thành phần hóa học có tác dụng dược lý trong rau đắng biển gồm alkaloid, saponin và sterol Mặc dù alkaloid brahmin là thành phần đầu tiên được xác định trong rau đắng biển nhưng Saponin mới là chất có hoạt tính chính Các saponin là glycosid, một đơn vị đường gắn với 1 aglycon (sapogenin) Phần sapogenin quyết định loại saponin là steroid hoặc triterpenoid Thành phần đem lại hiệu quả cải thiện trí nhớ trong rau đắng biển là saponin triterpenoid có tên là bacosid [33]

Bacosid A và bacosid B:

Bacosid A được phát hiện trong rau đắng biển năm 1965 bởi Chatterji, trong đó bacosid A chiếm khoảng 2,5-3%, khi bị thủy phân trong môi trường acid cho bacogenin A1, A2, A3, A4 Bacosid A, được xác định có tên khoa học

là 3-( α Larabinopyranosyl)-O-β-D-glucopyranosid-10,20- dammar-24-en Bacosid A được coi là hoạt chất có tác dụng chính trong việc cải thiện bệnh suy giảm trí nhớ trong rau đắng biển [25],[26.]

dihydroxy-16-keto-Bằng phương pháp HPLC, các nhà khoa học đã phát hiện bacosid A là hỗn hợp của 4 saponin được đặt tên là bacosid A3, bacosid II, một jujubogenin

là đồng phân của bacopasaponin C là 3-O-[ glucopyranosyl-(1→3)-}- -L-arabinopyranosyl] jujubogenin (còn gọi là bacopasid X) và bacopasaponin C [21]

-L-arabinofuranosyl-(1→2)-{β-D-O

HO

bacoside A

OOH

Bacosid B được phát hiện cùng lúc với bacosid A, ban đầu được phát hiện thấy chỉ khác với bacosid A ở phần đường thể hiện ở khả năng quay cực và có

thể là một đồng phân của bacosid A Tuy nhiên gần đây các nhà khoa học đã xác định được bacosid B là hỗn hợp của các saponin có aglycon là các jujubogenin

bacopasid-V [18]

Bacopasaponin A, bacopasaponin B và bacopasaponin C:

- Ba saponin triterpenoid được phân lập tiếp theo là bacopasaponin A, B

và C, được xác định tên khoa học:

Bacopasaponin D, bacopasaponin E, bacopasaponin F, bacopasaponin G

- Bacopasaponin D là một pseudojujubogenin glycoside có tên là L-arabinofuranosyl- (1→2)-β-Dglucopiranosyl] pseudojujubogenin [42]

3-O-[α Bacopasaponin E và bacopasaponin F (khác nhau ở phần jujubogenins): được phân lập bởi Mahato và cộng sự năm 1996 [28]

- Bacopasaponin G: Hou và cs đã phân lập được một saponin mới năm

2002 đặt tên là bacopasaponin G, một dẫn xuất được Matsutaka đặt tên là (3R) - 1- octan- 3yl- (6-O-sulfonyl) - β- D - glucopyranoside, một phenylethanoid glycoside mới là 3,4-dihydroxyphenylethyl alcohol (2-O-feruloyl)-β-D-glucopyranoside và một glycoside mới khác là phenylethyl

-D-apiofuranosyl-(1→2)]-β-D-glucopyranoside [41]

Một số saponin khác:

Ba saponin mới được phân lập từ rau đắng biển là bacopasids III, IV, V

có tên là : 3-O α-L- arabinofuranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosyljujubogenin, 3- O-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-α-Larabinopyranosyljujubogenin,3-O-β-D-

glucopyranosyl-(1→3)-α-Larabinofuranosyl pseudojujubogenin [42]

Các thành phần khác:

Sau các bacosid, các nhà khoa học phát hiện thêm các alkaloid khác là nicotine và herpesin Ngoài ra D-manitol và một saponin là hersaponin cũng đã được Sastri và cộng sự phân lập năm 1959 [45]

Rau đắng biển có chứa alkaloid như hydrocotylin, brahmin và herpestin glycosid như asiaticosid và thanakunicide flavonoids như apigenin và luteonin Saponin như D-mannitol, acid A, monnierin (C51H82O213H2O) Một số thành phần hóa học khác như betulinic acid, wogonin, oroxindin, betulic acid, stigmastarol, β-sitosterol, một số amino acid như alpha alanin, aspartic acid, glutamic acid, serin và các ester, heptacosan, octacosan, nonacosan, triacontan, hentriacontan, dotriacontan, nicotin, 3-formyl-4-hydroxy-2H-pyran (C6H6O3) brahamosid, brahminosid, brahmic acid, isobrahmic acid, vallerin, pectic acid, các acid béo, tanin, volatile oil, ascorbic acid, thanakunic acid và asiatic acid

2.4 Tác dụng dƣợc lý

2.4.1 Tác dụng trong việc cải thiện trí nhớ và nhận thức

Nghiên cứu trên động vật

Một nghiên cứu thử nghiệm hiệu quả của cao chiết rau đắng biển trên việc thay đổi hành vi của chuột Wistar khi uống cao chiết ở các khoảng thời gian khác nhau và liều dùng khác nhau Sau một khoảng thời gian, chuột được thử nghiệm học tập qua thị giác (mê lộ chữ T) và thử nghiệm tránh né thụ động Dữ liệu được so sánh với những con chuột cùng lứa tuổi Kết quả cho thấy có sự cải thiện rõ rệt về khả năng học tập qua thị giác và cải thiện trí nhớ ở chuột khi điều

trị bằng cao chiết rau đắng biển Những kết quả này càng khẳng định một cách

rõ rệt về hiệu quả của cao chiết rau đắng biển dùng đường uống giúp cải thiện khả năng học và nhớ ở chuột [48]

Tác dụng của rau đắng biển trên khả năng học tập đã được kiểm tra trên chuột uống cao chiết cồn của rau đắng biển (liều 40 mg/kg trong 3-5 ngày liên tục), bằng cách tạo sốc qua việc rọi ánh sáng gây lóa, sau đó đánh giá phản ứng của chuột: kết quả cho thấy nhóm dùng thuốc giữ được khả năng đã học từ trước, đồng thời cải thiện được trí nhớ [46]

Ở Việt Nam cũng đã có nghiên cứu của PGS Nguyễn Thị Thu Hương và cộng sự khảo sát tác dụng cải thiện trí nhớ của rau đắng biển trên mô hình gây suy giảm trí nhớ bằng scopolamine trong thử nghiệm “step-down” Thử nghiệm được sử dụng để đánh giá khả năng ghi nhớ của chuột qua chỉ tiêu: tiềm thời bước xuống (là thời gian từ lúc chuột bắt đầu được đặt lên trên bục cho đến khi chuột bước xuống sàn và đặt hoàn toàn 4 chân lên sàn) và số lần sai lầm (số lần chuột bước xuống sàn trong suốt thời gian quan sát 300 giây) Kết quả cho thấy tiềm thời bước xuống ở lô uống saponin toàn phần liều 50mg/kg tăng so với lô chứng chứng scopolamine liều 1mg/kg đạt ý nghĩa thống kê và số lần sai lầm ở

lô uống saponin toàn phần giảm so với lô chứng scopolamine đạt ý nghĩa thống

kê, chứng tỏ saponin toàn phần có tác dụng cả thiện khả năng ghi nhớ bị suy giảm bởi scopolamine của chuột thử nghiệm

Một nghiên cứu khác cũng của PGS Nguyễn Thị Thu Hương khảo sát tác dụng cải thiện trí nhớ trên mô hình gây suy giảm trí nhớ bằng scopolamine trong thực nghiệm mê lộ nước Morris Kết quả cho thấy saponin toàn phần của rau đắng biển có tác dụng cải thiện khả năng ghi nhớ bị suy giảm bởi scopolamine của chuột thử nghiệm [3]

Cơ chế cải thiện việc suy giảm trí nhớ và bảo vệ tế bào thần kinh của rau đắng biển trên mô hình bệnh Alzheimer đã được một số tác giả trên thế giới tìm

hiểu Có một nghiên cứu đã chỉ ra cao chiết rau đắng biển có tác dụng làm giảm mức độ β-amyloid trong não chuột chuyển gen mang bệnh Alzheimer (chuột

PSAPP) [54] Trên mô hình in vitro, cao chiết rau đắng biển cũng có tác dụng

bảo vệ tế bào thần kinh vỏ não nuôi cấy nguyên phát, đã bị tổn thương bởi amyloid

β-Nghiên cứu trên lâm sàng

Ngoài các nghiên cứu trên chuột cũng đã có những nghiên cứu về tác dụng của rau đắng biển trên hệ thần kinh của người Nghiên cứu của Steven Roodenrys và cộng sự được thực hiện với mục đích đánh giá hiệu quả của rau đắng biển trên bộ nhớ của người 76 người có độ tuổi từ 40 đến 65 tham gia vào một nghiên cứu ngẫu nhiên, mù đôi, dùng giả dược có kiểm soát, được đánh giá chức năng của bộ nhớ và mức độ lo lắng Nghiên cứu được chia làm 3 giai đoạn: giai đoạn trước thử nghiệm, 3 tháng thử nghiệm và 6 tuần sau khi hoàn thành thử nghiệm Kết quả cho thấy rau đắng biển có ảnh hưởng đáng kể trong việc lưu trữ các thông tin mới Điều này gợi ý rằng rau đắng biển làm giảm tỷ lệ quên các thông tin mới ở người Các tác giả dự đoán tác dụng cải thiện trí nhớ của rau đắng biển có được là do khả năng chống oxy hóa ở vùng hải mã [40] Một nghiên cứu khác cũng đánh giá tác dụng của cao chiết rau đắng biển trên quá trình ghi nhớ và học tập ở người của C Stough và cộng sự cho kết quả cao chiết rau đắng biển (300mg) đem lại hiệu quả sau 12 tuần giúp cải thiện quá trình xử

lý thông tin, học tập bằng lời nói và quá trình ghi nhớ ở người Những phát hiện này gợi ý rằng rau đắng biển giúp cải thiện quá trình nhận thức trong đó thông tin được tiếp nhận từ môi trường bên ngoài, ví dụ như học tập và ghi nhớ [47]

Các saponin triterpenoid (bao gồm các bacosid) tạo cho rau đắng biển khả năng cải thiện sự vận chuyển các tín hiệu thần kinh Một thử nghiệm trên 36 trẻ em được chẩn đoán là bị khiếm khuyết khả năng tập trung kéo dài trong 16 tuần 19 em được uống cao chiết rau đắng biển (đã được tiêu chuẩn hóa để chứa

20% bacosids) với liều 50 mg/ngày hai lần, trong 12 tuần 17 em được cho dùng placebo Tuổi trung bình của các em trong 2 nhóm là 8.3 và 9.3 Nhóm dùng rau đắng biển được tiếp tục cho uống placebo 4 tuần kế tiếp (sau 12 tuần dùng thuốc) Tất cả 36 em đều được đánh giá qua các thử nghiệm căn bản về khả năng nhận thức ở các tuần thứ 4, thứ 8, thứ 12 và 16 Kết quả ghi nhận có những cải thiện rõ rệt ở nhóm dùng rau đắng biển ở tuần thứ 12 trong các khả năng như lặp lại những câu đã nghe, trí nhớ căn bản, và phối hợp được những điều được học (ghép hình từng đôi) Các cải thiện này vẫn được duy trì sau 4 tuần ngưng thuốc, chỉ dùng placebo trong 2 tuần kế tiếp [34]

Tác dụng ức chế enzym acetylcholinesterase

Ahirwar S và cộng sự đã nghiên cứu khả ức chế AChE của rau đắng biển

trên các vùng khác nhau của não chuột mô hình in vivo, kết quả cho thấy với

liều uống (100mg/kg thể trọng chuột), dịch chiết rau đắng biển có khả năng ức chế AChE khác nhau ở các vùng não khác nhau Vỏ não (51,6%)> tiểu

não(51%)> đồi thị (41,6%)> bán cầu (38,1%) Nghiên cứu động học enzym in

vivo cho thấy có sự gia tăng giá trị Km của AChE trong từng vùng não do dịch

chiết rau đắng biển Giá trị Km tăng cao nhất được quan sát thấy trong vỏ não Như vậy, rau đắng biển có tác dụng ức chế cạnh tranh với AChE trong tất cả các vùng não [9]

2.4.2 Tác dụng chống oxy-hóa:

Sự có mặt của các chất có trong cao chiết rau đắng biển ảnh hưởng tới các thành phần có liên quan tới stress oxy hóa như sự khử các kim loại hóa trị II, thay đổi hoạt tính lipoxygenase và quá trình peroxyd hóa lipid Nghiên cứu này cũng cho thấy điều trị bằng cao chiết rau đắng biển giúp làm giảm nồng độ β-amyloid có trong não của bệnh nhân Alzheimer [24]

Rau đắng biển có hoạt tính chống oxy hóa khi thử trên não của chuột thông qua việc thay nồng độ của các enzym superoxide dismutase (SOD),

catalase (CAT) và glutathione peroxidase (GPX) Hoạt tính chống oxyhóa có thể

so sánh với deprenyl Tác động của rau đắng biển diễn ra tại mọi khu vực của não bộ, trong khi đó tác động của deprenyl chỉ giới hạn tại khu vực vỏ não và khu vực trán Tác dụng được xem là do kết quả của việc gia tăng hoạt động thu

nhặt các gốc tự do [55]

2.4.3 Tác dụng hướng thần

Các nghiên cứu gần đây đã cho thấy tác dụng bảo vệ thần kinh của rau đắng biển là do khả năng chống oxy hóa ngăn chặn quá trình stress oxy hóa tế bào thần kinh và ức chế acetyl cholinesterase Vì vậy sử dụng cao chiết rau đắng biển có thể là một hướng điều trị cho các bệnh nhân bị rối loạn thần kinh Một nghiên cứu khác cũng cho thấy vai trò bảo vệ thần kinh của cao chiết rau đắng biển trong quá trình co giật và tổn thương nhận thức xảy ra có liên quan tới động kinh gây ra bởi pilocarpine [37]

Yun Zhou và cs đã nghiên cứu và chứng minh trong số các bacopasid đã được phân lập từ rau đắng biển thì bacosid I, bacosid II và bacosaponin C là ba thành phần có hoạt tính chống trầm cảm trên mô hình chuột bơi cưỡng bức và

mô hình treo đuôi chuột [55] Trong một nghiên cứu khác cũng của Yun Zhou

và cộng sự, ba saponin được phân lập từ rau đắng biển là bacopasid XI, bacosid

I và bacopasaponin C được cho là có hoạt tính hướng thần (nootropic) trong thử nghiệm mê lộ nước Morris và thử nghiệm gây suy giảm trí nhớ bằng scopolamine trên chuột [56]

Cao chiết rau đắng biển (chứa 25 % bacosid A) có tác dụng an thần tương đương với benzodiazepin và lorazepam Hoạt tính này tùy thuộc vào liều lượng

sử dụng và đặc biệt là không gây phản ứng phụ như tạo quên lãng, nhầm lẫn như lorazepam mà còn giúp cải thiện trí nhớ [10]

3 Một số mô hình đánh giá khả năng cải thiện trí nhớ

3.1 Mô hình đánh giá khả năng ức chế acetylcholinesterase

Trong bệnh Alzheimer, các tế bào thần kinh cholinergic bị chết làm giảm lượng acetylcholin Acetylcholinesterase là enzym bất hoạt acetylcholin tại synap do xúc tác cho quá trình thủy phân acetylcholin tạo acid acetic và choline Việc ức chế enzym acetylcholinesterase giúp ngăn ngừa sự thiếu hụt acetylcholin Gần đây, acetylcholinesterase được phát hiện là có liên quan đến sinh bệnh học của bệnh Alzheimer do có tương tác trực tiếp với β amyloid bằng cách làm tăng lắng đọng β amyloid ở mảng không hòa tan, do đó cũng là nguyên nhân gây gia tăng các mảng β amyloid [53]

Mô hình đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ của một thuốc trên chuột thông qua việc đánh giá khả năng ức chế enzym AChE đã được áp dụng tương

đối phổ biến trên thế giới Đơn giản nhất là phương pháp in vitro, nhưng phương pháp in vivo hoặc ex vivo cho kết quả chính xác hơn

3.2 Mô hình đánh giá khả năng học tập không gian trên chuột

3.2.1 Mê lộ nước Morris

Thử nghiệm mê lộ nước Morris được phát minh bởi nhà khoa học Morris năm 1980 để đánh giá khả năng học tập, nhận thức không gian trên chuột

Trong mê lộ nước Morris, chuột được đặt trong một bể bơi có hình tròn lớn và nhiệm vụ của nó là tìm thấy bến đỗ bị giấu đi để thoát khỏi nước Có nhiều yếu tố có thể ảnh hưởng đến hiệu suất của chuột, bao gồm môi trường, giới tính, thuốc… Có ba chiến thuật cơ bản để chuột thoát khỏi mê lộ: ghi nhớ các động tác cơ bản để đến được bến đỗ, sử dụng các dấu hiệu trực quan để tìm đến bến đỗ, sử dụng những tín hiệu xa làm điểm tham chiếu để xác định vị trí nó đang bơi và vị trí bến đỗ Đặc biệt, sự linh hoạt của quá trình nhận thức của chuột có thể được đánh giá bằng cách sử dụng mô hình mê lộ nước trong đó bến

đỗ đã được giấu đi liên tục bị thay đổi vị trí Sau này rất nhiều nhà khoa học đã

cải tiến thử nghiệm mê lộ nước Morris để phù hợp với điều kiện thí nghiệm của mình [51], [13], [44].

3.2.2 Một số mê lộ khác

Mê lộ cổ điển

Mê lộ cổ điển bao gồm một khoảng nền rộng với một loạt các bức tường ngăn cách thẳng đứng và có trần trong suốt Chuột xuất phát ở một vị trí, chạy qua mê lộ và kết thúc ở một vị trí khác có đặt thức ăn

Thực tế là sau những thử nghiệm, chuột có xu hướng chạy qua mê lộ để tới đích nhanh hơn, và ít bị lạc hơn Bằng cách thống kê số lần bị lạc đường và thời gian hoàn thành thử nghiệm của chuột, các nhà nghiên cứu có thể xây dựng được đường cong đánh giá khả năng học tập cho những con chuột

Mê lộ chữ T

Mê lộ chữ T có hình dáng giống như chữ T Động vật thí nghiệm xuất phát tại đuôi chữ T, “phần thưởng” của chuột có thể được đặt trong một cánh tay của mê lộ (cánh tay của chữ T) Chuột đi thẳng và chọn cánh tay trái hoặc phải của mê lộ Đây là một trong những mê cung đơn giản nhất, chỉ bao gồm 2 lựa chọn: phải hoặc trái Mê lộ chỉ có thể được thay đổi bằng cách chặn một trong hai con đường Quyết định của chuột có thể có nguyên nhân do thói quen sẵn có hoặc sở thích tự nhiên của chuột Nghiên cứu thường được thực hiện bằng cách lặp đi lặp lại nhiều lần mà không có “phần thưởng” là thức ăn ở cả hai cánh tay của chữ T Một thử nghiệm khác cũng có thể được thực hiện là thay đổi luân phiên hai bên cánh tay phần thưởng của chuột, chuột nhớ tốt sẽ biết chọn cánh tay mà lần đi trước nó không chọn [50]

4 Liên quan giữa thiếu máu não cục bộ và bệnh Alzheimer

Bệnh Alzheimer làm một dạng của chứng sa sút trí tuệ, và những tiến bộ gần đây đã chỉ ra rằng yếu tố nguy cơ về bệnh mạch máu có liên quan bệnh Alzheimer Hơn nữa, xét nghiệm tử thi cho thấy 60-90% các trường hợp mắc

Alzheimer có đi kèm với bệnh mạch máu não Ngoài ra, đột quỵ được tìm thấy nhiều nhất ở những bệnh nhân mắc Alzheimer Tác giả Raj N Kalaria đã đánh giá một số yếu tố mạch máu và sinh lý bệnh mạch máu não liên quan và đưa ra kết luận thiếu máu não cục bộ có thể thúc đẩy quá trình tiến triển bệnh Alzheimer Vì vậy việc kiểm soát bệnh mạch máu là quan trọng trong điều trị và ngăn ngừa bệnh Alzheimer cũng như chứng mất trí nhớ hỗn hợp [59]

Các bằng chứng gần đây cũng cho thấy có mối quan hệ hiệp đồng, và có thê chính là yếu tố gây bệnh giữa bệnh mạch máu não và bệnh Alzheimer, được đặc trưng bởi sự tích lũy cá mảng β amyloid Hơn nữa apoE cũng đã được chứng minh là có liên quan với cả bệnh Alzheimer và thiếu máu não cục bộ Thiếu máu não cục bộ có thể đóng vai trò quan trọng, cả trực tiếp và gián tiếp, trong sinh bệnh học của bệnh Alzheimer Qi JP và cộng sự tiến hành nghiên cứu các biểu hiện và sự phân bố của β amyloid 1-40, β amyloid 1-42 và ApoE trong vùng hải

mã của bệnh nhân sau khi bị thiếu máu não để xác định vai trò của thiếu máu não cục bộ trong bệnh Alzheimer Nghiên cứu cho kết quả sự tích tụ cả β amyloid 1-40 và β amyloid 1-42 đều tăng đáng kể trên các bệnh nhân bị thiếu máu não ApoE cũng tăng lên đáng kể trong tất cả các bệnh nhân thuộc nhóm thiếu máu não cục bộ so với nhóm chứng Điều này giải thích mối liên quan giữa thiếu máu não cục bộ và sinh bệnh học của bệnh Alzheimer [60]

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu và đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Nguyên liệu:

Nguồn nguyên liệu: rau đắng biển (Bacopa monnieri (Linn) Wettst) được

thu hái ở Nghệ An Dược liệu được TS.Phạm Thanh Huyền, Trưởng khoa - Khoa tài nguyên dược liệu - Viện dược liệu giám định mẫu và lưu mẫu tại Viện

Số tiêu bản lưu tại viện là INM484

Mẫu thử được chọn là cao chiết nước và phân đoạn n-butanol từ dịch chiết nước rau đắng biển Quy trình chiết hai mẫu như sau:

Chiết xuất rau đắng biển thu cao chiết nước (mẫu M1)

với tỷ lệ dung môi/dược liệu lần lượt là 10, 10 và 8 lần trong thời gian lần lượt

là 3 h, 2 h và 1,5 h Lọc và gộp dịch lọc, cô cạn thu được 340 g cao có độ ẩm 4,96% Định lượng bacosid A trong cao bằng phương pháp HPLC đạt 1,06%, bacopasid I đạt 0,94% Tổng hàm lượng bacosid A và bacopasid I trong mẫu M1 đạt 2,00%

Rau đắng biển (Bacopa monnieri (Linn) Westts) (1kg)

Chiết xuất rau đắng biển thu cắn BuOH từ cao chiết nước (mẫu M2)

dung môi n-BuOH, thu hồi dung môi, sấy chân không, thu được cắn BuOH có

có khối lượng là 28,1g và định lượng bằng phương pháp HPLC đạt hàm lượng bacosid A 3,33%, hàm lượng Bacopasid I đạt 4,42% Tổng hàm lượng bacosid

A và bacopasid I trong mẫu M2 đạt 7,75%

Rau đắng biển (Bacopa monnieri (Linn) Westts) (1kg)

C (3 lần) Dịch chiết thô

Dịch chiết nước

 Chiết bằng BuOH, thu hồi dung môi, sấy chân không

Cao chiết BuOH (28,1g)

(mẫu M2)

Hình 2.2 Sơ đồ chiết xuất mẫu M2

2.1.2 Đối tƣợng nghiên cứu:

- Chuột nhắt trắng khỏe mạnh cả đực và cái 5 - 6 tuần tuổi, đạt tiêu chuẩn, trọng lượng trung bình 20-22g, đơn vị cung cấp là Học viện Quân y

- Động vật thí nghiệm trên được nuôi trong điều kiện đầy đủ thức ăn, nước uống, độ ẩm, độ thông khí và ánh sáng thích hợp

2.1.3 Hóa chất:

Bảng 2.1 Nguyên vật liệu sử dụng trong quá trình thực nghiệm

DTNB

- Acetylthiocholine iodide 30 mM pha trong đệm phosphate 0.05M, pH=7.2

- DTNB 10 mM pha trong đệm phosphate 0.05M, pH=7.2

Dụng cụ và trang thiết bị:

- Kẹp động mạch (xuất xứ Đức)

- Mê lộ nước Morris

- Camera nối với máy tính

- Phần mềm phân tích kết quả (Công ty An Nhân cung cấp)

- Máy ly tâm Mikro 22R

- Máy ELISA Thermo Labsystem

- Cân phân tích