Ứng dụng kỹ thuật Nat (Nucleic Acid) để phát hiện sớm sự có mặt của vi rút HIV, HBV, HCV ở người cho máu : Luận văn ThS. Sinh học: 60 42 01 07

Ưu điểm của xét nghiệm là đơn giản, tốn ít thời gian, giá thành hợp lý, song phương pháp này có nhược điểm là trong giai đoạn “cửa sổ” khi đó kháng thể hoặc kháng nguyên chưa đạt ngưỡng

-Trần Vân Chi

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT NAT (NUCLEIC ACID)

ĐỂ PHÁT HIỆN SỚM SỰ CÓ MẶT CỦA VI RÚT

HIV, HBV, HCV Ở NGƯỜI CHO MÁU

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2015

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Bạch Khánh Hòa

XÁC NHẬN HỌC VIÊN ĐÃ CHỈNH SỬA THEO GÓP Ý CỦA HỘI ĐỒNG

Giáo viên hướng dẫn Chủ tịch hội đồng chấm luận văn

thạc sĩ khoa học

Hà Nội - 2015

Bạch Khánh Hòa; người thày đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi làm luận văn

Người thày đưa tôi đến với Huyết học Truyền máu, người thày đã truyền cho tôi

niềm đam mê với Huyết học Truyền máu Người thày đã bồi dưỡng cho tôi những

đức tính trung thực, cần mẫn của một người làm công tác nghiên cứu từ những ngày

đầu tiên bước vào nghề

Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc đến BSCKII Phạm Tuấn Dương người

đã động viên cho tôi đi học cao học và trong suốt quá trình học Người đã tận tình

giúp đỡ, dìu dắt tôi trong công tác

Tôi bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc đến TS Trần Văn Tuấn người đã hướng dẫn

chỉ dẫn, giúp đỡ tôi làm luận văn

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ đoàn kết của anh chị em đồng

nghiệp trong Khoa Xét nghiệm sàng lọc máu đã giúp tôi hoàn thiện số liệu, mọi

điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong suốt quá trình học và làm luận văn

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới: Ban lãnh đạo Viện HHTMTW đã cấp kinh phí

cho tôi đi học, các khoa phòng hành chính đã giúp tôi hoàn thành thủ tục học tập,

Khoa Di truyền và sinh học phân tử, Khoa Thalassemia, Khoa Hemophilia, khoa

HIV viện vệ sinh dịch tễ đã cho phép và giúp đỡ tôi xét nghiệm định lượng virus,

toàn thể Khối truyền máu đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện đề tài

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Phòng sau đại học, Khoa Sinh học, Bộ môn Vi

sinh học của trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã giúp tôi hoàn thành các thủ tục

luận văn

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các bậc bố mẹ đẻ, bố mẹ chồng, chồng con đã

giúp đỡ động viên, dành tình cảm và điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành luận văn

Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn đến người hiến máu đã cho tôi những số liệu

quý báu

Học viên Trần Vân Chi

MỤC LỤC ii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT iv

DANH MỤC CÁC BẢNG v

DANH MỤC CÁC HÌNH, BIỂU ĐỒ vi

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC HIV, HBV, HCV 3

1.1.1 Bệnh viêm gan B, tình hình nhiễm, cơ chế gây bệnh 3

1.1.2 Bệnh viêm gan C, tình hình nhiễm, cơ chế gây bệnh 9

1.1.3 Bệnh HIV/AIDS, tình hình nhiễm, cơ chế gây bệnh 15

1.2 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP XÉT NGHIỆM SÀNG LỌC HBV, HCV, HIV 22

1.2.1 Xét nghiệm Miễn dịch HBV, HCV, HIV 24

1.2.2 Xét nghiệm sinh học phân tử NAT 25

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

2.1 NGUYÊN LIỆU 27

2.2 MÁY MÓC VÀ TRANG THIẾT BỊ 27

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

2.3.1 Xét nghiệm sàng lọc miễn dịch HBV, HCV, HIV 30

2.3.2 Xét nghiệm sinh học phân tử NAT HBV, HCV, HIV 33

2.3.3 Quản lý và xử lý số liệu 41

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 42

3.1 KẾT QUẢ XÉT NGHIỆM MIỄN DỊCH KHÁNG NGUYÊN KHÁNG THỂ 42

3.1.1 Tỷ lệ HBsAg phản ứng ở đơn vị máu hiến 42

3.1.2 Tỷ lệ anti HCV phản ứng ở đơn vị máu hiến 44

3.1.3 Tỷ lệ HIV AgAb phản ứng ở đơn vị máu hiến 47

3.1.4 Tỷ lệ nhiễm HBV, HCV, HIV ở bệnh nhân nhận máu nhiều lần 49

3.2.3 Kết quả xét nghiệm NAT (MP NAT, ID NAT) 53

3.2.4 KQXN tư vấn người cho máu NAT phát hiện ở giai đoạn cửa sổ HBV 55

3.2.5 KQXN tư vấn người cho máu NAT phát hiện ở giai đoạn cửa sổ HCV 59

3.2.6 KQXN tư vấn người cho máu NAT phát hiện giai đoạn cửa sổ HIV 62

KẾT LUẬN 67

KIẾN NGHỊ 68

TÀI LIỆU THAM KHẢO 69

PHỤ LỤC

ADN: Axit deoxiribo nucleic

ARN: Axit ribonucleic

PCR: Phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymer chain reaction)

IC: Chứng nội (internal control)

TMA: Phản ứng khuếch đại qua trung gian (Transcription-Mediated Amplification)

CMIA: Hóa phát quang (Chemiluminescent Microparticle Immunoassay)

ECLIA: Điện hóa phát quang (Electronic Chemiluminescent Immunoassay)

ELISA: Xét nghiệm miễn dịch gắn men (Enzyme – Linked Immunosorbent Assay)

EIA: Xét nghiệm miễn dịch men (Enzyme Immunosorbent assay)

HBV: Vi rút viêm gan B (Hepatitis B Virus)

HCV: Vi rút viêm gan C (Hepatitis C Virus)

HIV: Vi rút suy giảm miễn dịch người (Human immunodeficiency Virus)

AIDS: Bệnh suy giảm miễn dịch mắc phải

AE: Acridinium Ester

Viện HHTMTW: Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương

Bảng 3.1: Tỷ lệ HBsAg phản ứng bằng xét nghiệm miễn dịch 42

Bảng 3.2: Tỷ lệ HBsAg người hiến máu trong nghiên cứu so với các tác giả 43

Bảng 3.3: Tỷ lệ anti HCV phản ứng bằng xét nghiệm miễn dịch 44

Bảng 3.4: Tỷ lệ anti HCV phản ứng ở người hiến máu so với các tác giả 45

Bảng 3.5: Tỷ lệ HIV AgAb phản ứng bằng xét nghiệm miễn dịch 47

Bảng 3.6: Tỷ lệ HIV AgAb phản ứng ở người hiến máu so với các tác giả 48

Bảng 3.7: Tỷ lệ nhiễm HBV, HCV, HIV ở bệnh nhân nhận máu nhiều lần

tại Viện HHTMTW 49

Bảng 3.8: Kết quả xét nghiệm MP NAT 52

Bảng 3.9: Kết quả các mẫu xét nghiệm ID NAT 52

Bảng 3.10: Tỷ lệ HBV, HCV, HIV phản ứng bằng kỹ thuật MP NAT và

ID NAT 53

Bảng 3.11: Tỷ lệ HBV, HCV, HIV phản ứng xét nghiệm ID NAT và MP NAT

ở người hiến máu so với các tác giả 54

Bảng 3.12: KQXN tư vấn người hiến máu giai đoạn cửa sổ HBV

mã số BM2.11573 55

Bảng 3.13: KQXN người hiến máu giai đoạn cửa sổ HCV mã số ACA.67515 59

Bảng 3.14: KQXN người hiến máu giai đoạn cửa sổ HIV mã số ACA.78780 62

Bảng 3.15: Xét nghiệm người hiến máu giai đoạn cửa sổ HIV

mã số AM9.97435 64

Hình 1.2: Chu trình sống của HBV [62] 7

Hình 1.3: Sơ đồ chuyển đổi huyết thanh HBV (theo Michael P 2001) 9

Hình 1.4: Mô hình cấu trúc của HCV [66] 11

Hình 1.5: Chu trình sống của HCV [67] 14

Hình 1.6: Sơ đồ chuyển đổi huyết thanh HCV (Michael P 2001) 15

Hình 1.7: Cấu trúc HIV (Hoffmann, 2007) 17

Hình 1.8: Chu kỳ sống của HIV [65] 20

Hình 1.9: Sơ đồ chuyển đổi huyết thanh HIV (Michael P 2001) 22

Hình 1.10: Kỹ thuật Homogeneous áp dụng trong xét nghiệm miễn dịch 25

Hình 2.1: Mô hình nghiên cứu 29

Hình 2.2: Phản ứng hóa phát quang CMIA (hãng Abbott) 31

Hình 2.3: Phản ứng điện hóa phát quang ECLIA (hãng Roche) 33

Hình 2.4: Nguyên tắc bắt giữ trình tự đích (hãng Grifol) 35

Hình 2.5: Nguyên lý khuếch đại TMA 36

Hình 2.6: Phản ứng động học DKA qua tín hiện AE 37

Biểu đồ 3.1: Tỷ lệ nhiễm HBV, HCV, HIV ở bệnh nhân nhận máu nhiều lần 50

Biểu đồ 3.2: Tỷ lệ HBsAg, anti HCV, HIV phản ứng ở đơn vị máu các năm

2013, 2014, 2015 50

Hình 3.1: Kết quả xét nghiệm ID-Cobas® TaqScreen MPX PCR BM2.11573 58

Hình 3.2: Kết quả xét nghiệm ID-Cobas® TaqScreen MPX PCR

mẫu ACA.67515 61

Hình 3.3: Kết quả xét nghiệm ID-Cobas® TaqScreen MPX PCR

mẫu ACA.78780 63

Hình 3.4: Kết quả xét nghiệm ID-Cobas® TaqScreen MPX PCR

mẫu AM9.97435 65

MỞ ĐẦU

Vi rút là một trong những nguyên nhân gây ra một số bệnh nghiêm trọng ở người nói chung Riêng vi rút viêm gan B gọi tắt là HBV (Hepatitis B virus ), vi rút viêm gan C gọi tắt là HCV (Hepatitis C virus), vi rút gây suy giảm miễn dịch ở người HIV (Human immunodeficiency virus) là vi rút gây bệnh thông qua đường máu Các vi rút này biến đổi liên tục về cấu trúc và hệ gen để trốn thoát các loại sinh phẩm xét nghiệm hậu quả là tăng tỷ lệ lây nhiễm trong cộng đồng

Phương pháp xét nghiệm dùng cho sàng lọc HIV, HBV và HCV lây qua đường truyền máu là xác định tác nhân gây bệnh gián tiếp dựa trên kết quả của phản ứng miễn dịch “kháng nguyên-kháng thể” Ưu điểm của xét nghiệm là đơn giản, tốn ít thời gian, giá thành hợp lý, song phương pháp này có nhược điểm là trong giai đoạn “cửa sổ” khi

đó kháng thể hoặc kháng nguyên chưa đạt ngưỡng phát hiện, do vậy xét nghiệm sẽ cho

ra kết quả âm tính Bên cạnh đó, tương tác không đặc hiệu của kháng thể hoặc kháng nguyên với những bất thường protein khác trong máu có cấu trúc gần giống với kháng nguyên hoặc kháng thể có thể dẫn đến kết quả dương tính giả Cùng với sự phát triển của kỹ thuật sinh học phân tử, kỹ thuật NAT đã được đưa vào sử dụng, kỹ thuật này có

độ nhạy cao cho phép phát hiện và nhân bản đặc hiệu theo hàm mũ các trình tự đích của tác nhân gây bệnh từ một lượng nhỏ vi rút, do đó, cho phép phát hiện sớm và chính xác các tác nhân gây bệnh Hơn thế nữa, NAT có thể được sử dụng để phát hiện đồng thời HIV, HBV và HCV thông qua một xét nghiệm trong thời gian là 4-5 giờ, đảm bảo

an toàn cho đơn vị máu truyền

Trên Thế giới, ở các nước phát triển, để đảm bảo sàng lọc máu Anh, Pháp, Mỹ,

Úc thực hiện xét nghiệm song song giữa phương pháp gián tiếp kháng nguyên – kháng thể và xét nghiệm NAT cho đơn vị máu từ cuối những năm 1990 đầu những năm 2000 Năm 1997, Hội chữ thập đỏ Đức đã sử dụng PCR cho mục đích sàng lọc HCV RNA cho người hiến máu, tiếp theo là Nhật Bản và Scotland Sau đó vào tháng 3/1998 người

ta đã giới thiệu NAT cho xét nghiệm HCV RNA[50]

Ở Việt Nam, hầu hết các phòng xét nghiệm sàng lọc HIV, HBV và HCV đều sử dụng phương pháp xét nghiệm miễn dịch kháng nguyên kháng thể hay còn gọi là xét nghiệm huyết thanh học, xét nghiệm NAT chưa được sử dụng Năm 2008 đề tài cấp Bộ

về ứng dụng NAT cho xét nghiệm sàng lọc máu đạt kết quả tốt [3] Đến năm 2015, Viện HHTMTW thực hiện theo Thông tư 26 TT-BYT ngày 16/9/2014 Hướng dẫn hoạt động truyền máu, triển khai xét nghiệm NAT đảm bảo an toàn truyền máu

Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu “Ứng dụng kỹ thuật NAT (nucleic acid) phát hiện sớm sự có mặt vi rút HIV, HBV, HCV ở người cho máu” nhằm hướng tới công tác xét nghiệm sàng lọc sớm các tác nhân lây qua đường truyền máu này một cách chính xác, đảm bảo an toàn, chất lượng cho máu và chế phẩm sử dụng trong điều trị

2 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài

- Khảo sát tỷ lệ HBsAg, anti HCV, HIVAgAb phản ứng trên đơn vị máu hiến được xét nghiệm miễn dịch bằng kỹ thuật CMIA, ECLIA Tỷ lệ nhiễm HBV, HCV, HIV ở bệnh nhân truyền máu nhiều lần

- Tỷ lệ HBV, HCV, HIV phản ứng phát hiện bằng kỹ thuật NAT (nucleic acid) trên đơn vị máu hiến mà xét nghiệm miễn dịch không phát hiện được, theo dõi người hiến máu có phản ứng kỹ thuật NAT, phát hiện sớm hệ gen vi rút nhằm bổ trợ cho xét nghiệm miễn dịch kháng nguyên- kháng thể

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Trong xét nghiệm sàng lọc máu nói riêng và trong chẩn đoán bệnh nói chung, xét nghiệm vi rút luôn là 1 trong những xét nghiệm liên tục được nâng cấp nhờ có sự biểu biết ngày càng sâu về sinh học phân tử của vi rút

1.1 ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC HBV, HCV, HIV

1.1.1 Đặc điểm sinh học của HBV

1.1.1.1 Bệnh viêm gan B

Vi rút viêm gan B (HBV) được phát hiện đầu tiên bởi Blumberg vào năm 1976 Cho đến nay khoa học đã có được những hiểu biết sâu sắc về dịch tễ học, cách thức truyền nhiễm, cơ chế sao chép phân tử, miễn dịch, các phương thức ngăn chặn hữu hiệu và các phương pháp điều trị đối với HBV Cho đến nay đã phát hiện được 5 loại vi rút chính gây nên bệnh viêm gan đó là vi rút viêm gan A,B,C,D,E Trong đó vi rút viêm gan B là nguy hiểm nhất với tỷ lệ tử vong cao nhất, trung bình hàng năm trên thế giới có 1-2 triệu người tử vong do vi rút này gây ra[61]

Viêm gan do vi rút hiện nay vẫn là một bệnh rất phổ biến trên toàn Thế giới và luôn là mối quan tâm lớn đối với công tác y tế của toàn cầu Bệnh có tỉ lệ người mắc cao và thường gây nên những hậu quả nặng nề như viêm gan mạn, xơ gan và ung thư gan nguyên phát Viêm gan là tổn thương tại gan với sự có mặt của các tế bào bị viêm trong mô gan Tình trạng bệnh có thể là tự khỏi hoặc có thể phát triển tới việc gây sẹo tại gan Viêm gan cấp tính là khi bệnh chỉ kéo dài dưới 6 tháng, còn viêm gan mãn tính

là khi bệnh kéo dài hơn

Theo đánh giá của các nhà nghiên cứu thì không có sự giống nhau về triệu chứng và sự đáp ứng lại liệu pháp kháng vi rút của bệnh nhân mắc bệnh viêm gan mạn tính ở các vùng khác nhau trên Thế giới do có sự khác nhau giữa các kiểu gen của HBV [31,33]

1.1.1.2 Tình hình nhiễm HBV

Theo Tổ chức Y tế Thế giới thì gần 30% dân số Thế giới, tương đương khoảng

2 tỷ người có bằng chứng huyết thanh nhiễm HBV Ước tính khoảng 350-400 triệu người trong tổng số những người này mắc viêm gan B mạn tính, và mỗi năm có khoảng 1-2 triệu trường hợp tử vong vì bệnh gan mạn tính, gồm bệnh xơ gan và ung thư gan Châu Á và Tây Thái Bình Dương là vùng lưu hành cao của HBV, chiếm khoảng 3/4 số nhiễm HBV mạn tính trên Thế giới [38,58,59]

Việt Nam là nước có tỷ lệ hiện mắc viêm gan B cao; ước tính có khoảng 8,6 triệu người nhiễm vi rút viêm gan B Tỷ lệ nhiễm vi rút viêm gan B mạn tính được ước tính khoảng 8,8% ở phụ nữ và 12,3% ở nam giới Nhiễm vi rút viêm gan B mạn tính là nguyên nhân chính gây bệnh gan ở Việt Nam như xơ gan và ung thư gan.Tiêm chủng vắc xin viêm gan B cho tất cả trẻ sơ sinh đã được triển khai từ năm 2003 Tỷ lệ bao phủ của vắc xin viêm gan B năm 2012 là 97% và tỷ lệ bao phủ liều sau sinh tăng lên 75% trong năm 2012 so với 65% của năm 2006 Theo một cuộc khảo sát năm 2011, chỉ còn 2% trẻ dưới 5 tuổi bị nhiễm vi rút viêm gan B Việt Nam đang hướng tới mục tiêu giảm

tỷ lệ hiện mắc viêm gan B xuống dưới 1% ở trẻ dưới 5 tuổi vào năm 2017 [12]

1.1.1.3 Cấu trúc và đặc điểm nhân lên của HBV

Trước đây, HBV được phân ra làm 4 kiểu huyết thanh: adr, adw, ayr và ayw dựa trên việc xác định các kiểu kháng nguyên bề mặt vi rút B, tuy nhiên cho đến nay có rất

ít dữ liệu về vai trò của các kiểu huyết thanh này Ngày nay, những tiến bộ của kỹ thuật sinh học phân tử đã giúp khám phá ra sự đa dạng trong trình tự chuỗi ADN của HBV,

từ đó đã phân loại HBV thành 8 kiểu gen khác nhau (A-H) dựa vào sự khác nhau trên 8% toàn bộ trình tự chuỗi của hệ gen Sự phân bố các kiểu gen là khác nhau ở các châu lục và các nước khác nhau Kiểu A thấy nhiều nhất ở châu Âu, Bắc Mỹ và châu Phi trong khi đó kiểu B và C phổ biến ở Đông Nam Á, kiểu D là dạng chiếm ưu thế nhất ở Nam Âu cũng như ở vùng Trung Đông, kiểu E phân bố khắp châu Phi trong khi kiểu F được tìm thấy ở người Ấn Độ gốc Nam Mỹ Kiểu G mới được tìm thấy gần đây và thấy

ở châu Âu và Bắc Mỹ [6,12]

HBV có 3 loại kháng nguyên là HBsAg, HBcAg và HBeAg HBsAg là kháng nguyên bề mặt của lớp vỏ ngoài lipoprotein của vi rút với các polypeptide có khối lượng phân tử khác nhau Kháng nguyên này thường thấy xuất hiện trong tế bào chất của các tế bào gan của bệnh nhân viêm gan B Kháng nguyên bề mặt có ở 3 loại vi rút HBV và có sự khác nhau giữa chúng Có loại HBV mang cả 3 loại kháng nguyên HBsAg đó là HBsAg kích thước lớn, vừa và nhỏ Có loại HBV chỉ có HBsAg kích thước lớn và vừa, loại HBV hình cầu nhỏ kích thước 20-200 nm chỉ có HBsAg loại nhỏ Lõi bên trong của vi rút có protein HBcAg, HBeAg, một sợi ADN đơn (-) và enzyme ADN polymerase Trong tất cả các vi rút đã biết thì HBV là nhỏ nhất HBcAg

là kháng nguyên của capsid, thường thấy trong nhân tế bào gan của bệnh nhân mắc bệnh và chỉ có ở HBV kích thước 42-45nm HBeAg là protein chưa biết rõ nguồn gốc nhưng người ta cho rằng nó có thể là một phần của HBcAg đã bị biến đổi Nếu có mặt HBeAg thì chứng tỏ vi rút viêm gan B đang nhân lên mạnh mẽ và bệnh nhân đang ở trạng thái viêm gan nặng rất dễ dẫn đến viêm gan mạn tính và ung thư gan [12]

Hình 1.1: Cấu tạo của HBV[63]

1.1.1.3.2 Hệ gen HBV, chu trình nhân lên của HBV

Hệ gen ADN của HBV chỉ được thấy ở dạng vòng kép Chuỗi dài hay chuỗi (-) phần lớn là dạng vòng phức và liên kết cộng hóa trị với enzyme reverse transcriptase ở đầu 5’[14,37] Chuỗi ngắn hay chuỗi (+) có chiều dài chiếm khoảng 50-80% so với chuỗi (-) với đầu 5' cố định và đầu 3' tự do Gắn với đầu 5' của chuỗi (+) là oligoribonucleotide được chụp mũ Hệ gen của vi rút có 4 hệ thống đọc mở được xê dịch bộ mã hóa cho 4 bản sao mARN Bản sao dài nhất (3,5 kb) làm khuôn cho quá trình sao chép hệ gen và sự biểu hiện của phần tiền lõi hay lõi và polymerase (pol proteins) Pol có 3 vùng chính là vùng amin đầu cùng, reverse transcriptase và RNase

H Vùng tận cùng của protein cũng đóng vai trò then chốt trong việc đóng gói ARN Bản sao mã kích thước 2,4 kb mã hóa cho các protein pre S1, pre S2 và HBsAg, trong khi bản sao kích thước 2,1 kb chỉ mã hóa cho các protein pre S2 và HBsAg Bản sao nhỏ nhất mã hóa cho protein X Protein X là protein không cấu trúc, nó đóng vai trò như các protein điều hòa của vi rút và ảnh hưởng tới số lượng protein của nhân trong

sự điều khiển chu trình tế bào, sao chép và sửa chữa ADN [14,24,37]

Chu trình sống của HBV bắt đầu khi vi rút gắn vào tế bào vật chủ (tế bào gan)

Sự tấn công vào tế bào có sự tham gia trung gian của vùng pre-S1của HBsAg lớn Sau khi liên kết với thụ thể và virion cởi bỏ lớp vỏ, các nhân của vi rút trong tế bào chất

được vận chuyển tới nhân bên trong - nơi hệ gen vòng lỏng lẻo và kép được chuyển thành ADN vòng đóng (cccADN) và tồn tại như vi thể nhiễm sắc của vi rút Sự chuyển đổi được thực hiện bởi các enzyme của tế bào vật chủ Các vi thể nhiễm sắc của vi rút làm khuôn cho quá trình sao mã 4 loại mARN của vi rút bởi ARN polymerase II của tế bào vật chủ Các ARN này được đóng gói và sau đó diễn ra quá trình tổng hợp chuỗi

âm và chuỗi dương Trong các mảnh nhân của tế bào chất, sự sao chép của hệ gen HBV diễn ra nhờ cơ chế tổng hợp không liên tục của chuỗi (-) Cuối cùng, sự hình thành virion theo phương thức nảy chồi trong mạng lưới nội chất là nơi tất cả các protein bề mặt vi rút viêm gan được tổng hợp Sau khi nảy chồi, các virion được đưa ra ngoài chủ yếu theo cách vận chuyển của bọng và tiếp tục lây nhiễm sang các tế bào khác Trong khi tấn công các tế bào gan, HBV không trực tiếp giết các tế bào vật chủ

do nó được giải phóng khỏi tế bào mà không cần dung giải chúng Vì thế, sự tổn thương của gan là do sự ảnh hưởng lẫn nhau một cách trực tiếp giữa hệ thống miễn dịch của vật chủ với các tế bào gan bị nhiễm HBV[37]

Hình 1.2: Chu trình sống của HBV [62]

1.1.1.3.3 Giai đoạn gây bệnh

a, Viêm gan cấp tính

Thời gian ủ bệnh từ 1 - 6 tháng Một số bệnh nhân có cảm giác như bị cảm nhẹ, đôi khi không biết mình bị HBV Một số khác bị vàng da, mệt mỏi, đau nhức, buồn ói, chán ăn, sốt nhẹ, biến đổi cảm giác (hiện tượng đặc biệt là người nghiền thuốc lá tự nhiên không thích mùi thuốc lá), đau bụng (dưới sườn bên phải) Những trường hợp bị viêm nặng sẽ đưa đến gan to, khó ngủ, mê muội, lãng trí hoặc bất tỉnh

Biểu hiện lâm sàng: Tăng nhiệt độ, vàng da (1 tuần sau khi bị nhiễm và có thể kéo dài đến 1-3 tháng), gan to, lách to Hiếm khi thấy bàn tay ửng đỏ[12,16]

b, Viêm gan mạn tính

Phần lớn khi bị viêm mạn tính cảm thấy bệnh nhân hoàn toàn bình thường Một

số bị viêm mạn tính nặng thì tiếp tục bị các triệu chứng viêm cấp như mệt mỏi, chán

ăn, đau bụng, và suy gan

Biểu hiện lâm sàng: Gan to, bàn tay ửng đỏ Khi bị biến chứng xơ gan có thể bị

ứ nước trong bụng, vàng da, loãng máu, chảy máu trong dạ dày, tĩnh mạch toả lớn từ rốn (do tăng áp làm giãn tĩnh mạch cửa gan), nam vú lớn như vú nữ, tinh hoàn teo nhỏ (vì gan yếu làm thay đổi cân bằng của các hormone giới tính)

1.1.1.3.4 Đáp ứng miễn dịch:

Khi các vi rút đi vào cơ thể, nó gây ra sự đáp ứng của các hệ thống miễn dịch bao gồm cơ chế phòng thủ bẩm sinh và sự đáp ứng miễn dịch thích ứng với tế bào và các sự đáp ứng miễn dịch của người đối với các vi rút Phụ thuộc vào khả năng của các

hệ miễn dịch chống lại các vi rút mà bệnh sẽ diễn tiến khác nhau; hoặc khỏi bệnh hoặc

bị ung thư mạn tính và dẫn đến tử vong [37]

Hình 1.3: Sơ đồ chuyển đổi huyết thanh HBV (theo Michael P 2001)

1.1.2 Đặc diểm sinh học của HCV

1.1.2.1 Bệnh viêm gan C

Trước đây, vi rút viêm gan B được xem là nguyên nhân chính dẫn đến viêm gan

do truyền máu nhưng sau khi các phương pháp chẩn đoán và phòng ngừa vi rút này được công bố thì tình trạng viêm gan do truyền máu vẫn tiếp tục xảy ra Các trường hợp này được gọi là viêm gan không A, không B và lây sau truyền máu Tác nhân gây bệnh là một loại vi rút chưa biết và rất khó xác định Mãi đến năm 1989, sau nhiều thử nghiệm, nhóm nghiên cứu của Choo [17] đã thành công trong việc nhân dòng một phần kiểu gen của vi rút này, gọi là vi rút viêm gan C và xây dựng thành công phương pháp phát hiện nhờ kháng thể kháng HCV trong máu Nghiên cứu này cũng chỉ rõ, HCV là thủ phạm chính gây ra các trường hợp viêm gan không A, không B và lây sau truyền máu Sự nhiễm HCV trong thời gian dài là nhân tố chính dẫn đến viêm gan mạn tính,

xơ gan và ung thư gan [46]

Viêm gan C là bệnh truyền nhiễm, chủ yếu ảnh hưởng đến gan, do siêu vi viêm gan C (HCV) gây ra Bệnh thường không có triệu chứng, nhưng viêm mạn tính có thể dẫn đến mô sẹo ở gan và cuối cùng là xơ gan Nhìn chung, triệu chứng của xơ gan biểu

hiện rõ sau nhiều năm mắc phải Trong một số trường hợp, bệnh nhân xơ gan sẽ bị suy gan, ung thư gan hoặc thực quản và giãn tĩnh mạch dạ dày có thể gây tử vong

HCV được xếp vào họ Flaviviridae, được chia thành 6 kiểu gen (genotype) chính và hơn 50 kiểu phụ (subtype) khác nhau Giữa các kiểu gen khác nhau, trình tự trong hệ gen HCV sai khác khoảng 1/3 còn giữa các kiểu phụ khác nhau trong cùng một kiểu gen thì sự khác biệt ít hơn nhưng vẫn ở mức đáng kể Một số nghiên cứu đã tìm thấy có một vài khác biệt trong cách gây bệnh của các kiểu gen, mặc dù bản chất

và quy mô của chúng vẫn đang được bàn cãi Do đó, kiểu gen HCV có ảnh hưởng lớn đến quá trình điều trị Theo tính toán, mỗi ngày trong cơ thể người bệnh có khoảng

1012 thể HCV mới được sản sinh [46,60]

1.1.2.2 Tình hình nhiễm HCV

HCV là nguyên nhân chính dẫn đến bệnh viêm gan cấp và mạn tính, gồm cả xơ gan và ung thư gan Vi rút này được coi là một "sát thủ thầm lặng" do đa số bệnh nhân không có triệu chứng lâm sàng trong suốt thời gian dài nhiễm HCV nên gan bị hủy hoại nặng nhưng bệnh nhân không biết Hiện nay, các số liệu về sự lây truyền HCV trong cộng đồng cho thấy vi rút này là một mối lo ngại nghiêm trọng Tổng cộng trên thế giới có khoảng 200 triệu người (khoảng 3% dân số thế giới) đang bị nhiễm HCV và 34 triệu người mới nhiễm mỗi năm 57 Tỷ lệ nhiễm HCV ở các khu vực trên thế giới là khác nhau, trong đó các nước châu Phi và châu Á có tỷ lệ nhiễm cao nhất, có khu vực lên tới >10% dân số

Ở Việt Nam hiện nay, theo số liệu của WHO có khoảng 510% dân số nhiễm HCV Tỷ lệ nhiễm HCV tại thành phố Hồ Chí Minh là 2,53%, tại tỉnh An Giang là 4,1% và tại Cà Mau là 2,15% Trong số các bệnh nhân mắc bệnh liên quan đến gan, khoảng 13% có xét nghiệm dương tính với HCV Tỷ lệ này thậm chí lên tới 2139%

28 Đối với các bệnh nhân bị viêm gan, tỷ lệ có HCV trong máu là khoảng 11%, còn

ở các bệnh nhân xơ gan là 12,5% và ung thư gan là 8% 9

glycoprotein

sợi ARN

Protein lõi

1.1.2.3 Cấu trúc và sự nhân lên của HCV

HCV được xếp vào họ Flaviviridae, là vi rút ARN sợi đơn dương, có hình cầu với đường kính khoảng 55-56 nm Sợi ARN vi rút được đóng gói trong vỏ capsid hình thành từ các protein lõi và bao bọc ngoài cùng là lớp vỏ bọc gồm các glycoprotein (hình 1.4) Hệ gen của HCV có kích thước khoảng 9,6 kb vừa là nơi chứa và bảo quản thông tin di truyền, vừa có chức năng như mARN làm khuôn tổng hợp protein HCV phân lập được từ các bệnh nhân thuộc các khu vực khác nhau trên thế giới có thể khác nhau về kích thước hệ gen [17,32] Cấu trúc ARN của HCV bao gồm hai đầu tận cùng 5’ và 3’ không mã hóa, ở giữa là vùng mã hóa cho protein cấu trúc (C, E1, E2) và protein không thuộc nhóm cấu trúc (NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A và NS5B) Vùng 5’ không mã hóa (5’-noncoding viết tắt là 5’-NC) có tính bảo thủ rất cao, gồm khoảng 341-344 nucleotide Giữa các sợi HCV riêng biệt, giữa các kiểu phụ và kiểu gen khác nhau thì độ tương đồng về trình tự 5’-NC tối thiểu là hơn 90% Đây cũng là phần duy nhất trong hệ gen HCV cho thấy sự tương đồng với hệ gen của các vi rút đã biết khác, chẳng hạn, so với các pesti vi rút thì sự tương đồng là khoảng 50% [35] Chính vì vậy, đây là vùng trình tự lý tưởng để thiết kế các cặp mồi cho xét nghiệm RT-PCR phát hiện

sự có mặt của HCV [15]

Hình 1.4: Mô hình cấu trúc của HCV [66]

Tương tự như tất cả vi rút khác, HCV không thể tự tái bản vì nó không có đầy

đủ các nguyên liệu cần thiết Vì vậy, để tái bản, vi rút phải nhiễm vào tế bào vật chủ và chiếm lấy bộ máy sao chép của tế bào, bao gồm các enzyme và protein Sau khi nhiễm vào tế bào vật chủ, các bước tái bản của HCV sẽ xảy ra trong tế bào chất Cả hai loại protein của tế bào và vi rút đều giúp cho HCV tái bản một cách dễ dàng Hệ gen của HCV mã hoá cho tối thiểu 10 protein vi rút khác nhau, bao gồm các protein cấu trúc (protein vỏ và protein lõi) giúp hình thành vỏ capsid và các protein không thuộc nhóm cấu trúc (NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A và NS5B) liên quan đến quá trình tái bản của

vi rút [35] Các nghiên cứu gần đây đã làm sáng tỏ chức năng của nhiều protein trong

số này Tuy nhiên, vai trò của một vài protein cũng như một số khía cạnh của quá trình tái bản vi rút và mối tương quan giữa protein vi rút và tế bào chủ vẫn chưa được hiểu một cách đầy đủ

Chu trình tái bản của HCV gồm các bước sau:

(i) Gắn vào tế bào vật chủ: HCV gắn vào tế bào chủ nhờ các tương tác giữa lớp

vỏ protein của vi rút (protein E1 và E2) với các phân tử là thụ thể bề mặt khảm trên màng ngoài tế bào đích

(ii) Xâm nhập vào tế bào chủ và cởi lớp vỏ bọc, giải phóng ARN vi rút, HCV đi vào tế bào đích chủ yếu do cơ chế ẩm bào nhờ thụ thể 47] Sau khi HCV gắn lên bề mặt thụ thể, các tế bào đồng hóa thụ thể sẽ hình thành một túi màng mỏng chứa HCV Sau khi vào trong tế bào, HCV sẽ giải phóng hệ gen vào tế bào chất của tế bào chủ và bắt đầu quá trình tái bản

(iii) Dịch mã hệ gen HCV thành protein vi rút: Khi được giải phóng, ARN của HCV được dùng làm khuôn để tổng hợp các protein của nó HCV sử dụng các thành phần của tế bào chủ, đặc biệt là ribosome để tiến hành dịch mã Quá trình này chỉ đòi hỏi một vài thành phần trong bộ máy dịch mã của tế bào chủ chứ không phải là tất cả

Điều đó cho phép HCV khởi động dịch mã hiệu quả ngay cả khi các điều kiện tế bào không thuận lợi Sản phẩm đầu tiên của quá trình dịch mã là một sợi polyprotein dài khoảng 3000 axit amin có chứa tất cả 10 protein vi rút cần cho quá trình tái bản của HCV Đây là quá trình then chốt đối với HCV vì nếu không có các protein quan trọng này sẽ không tạo được các vi rút mới

(iv) Tái bản hệ gen HCV: Quá trình tái bản xảy ra nhờ enzyme polymerase NS5B, là một protein không thuộc nhóm cấu trúc, tổng hợp ARN trên sợi khuôn ARN gồm hai bước chính: 1) hệ gen vi rút gốc được dùng làm khuôn để tổng hợp sợi ARN

âm và 2) sợi ARN âm sau đó được dùng làm khuôn để tổng hợp sợi ARN dương của HCV mới Hai sợi ARN mới tổng hợp có thể gắn với nhau hình thành ARN sợi đôi, trong khi đó, tế bào cho rằng ARN sợi đôi là báo hiệu nhiễm vi rút và sẽ kích hoạt hàng rào phòng thủ của tế bào để ngăn chặn quá trình tái bản và phá hủy ARN vi rút Hơn nữa, polymerase HCV không thể đọc được từ ARN đang ở dạng sợi đôi Vì vậy, để tránh hàng rào phòng thủ của tế bào và duy trì quá trình tái bản, HCV phải giữ cho các sợi ARN âm và dương tách rời nhau Lúc này enzyme helicase, nằm trong vùng trình

tự mã hóa cho protein không thuộc nhóm cấu trúc NS3, thực hiện nhiệm vụ bằng cách bám vào và tách các sợi ARN ra trong suốt quá trình tái bản hệ gen 47]

(v) Đóng gói vi rút mới và giải phóng chúng ra khỏi tế bào chủ: Các hạt vi rút mới bao gồm 3 thành phần chính là sợi đơn ARN hệ gen HCV, vỏ capsid và lớp vỏ bọc của vi rút Các vi rút mới sau đó được chuyển tới màng ngoài của tế bào vật chủ, giải phóng ra ngoài và lây nhiễm cho các tế bào mới

b Viêm mạn

Khoảng 80% số người nhiễm siêu vi viêm gan C chuyển sang viêm mạn Hầu hết rất ít biểu hiện triệu chứng hoặc không có triệu chứng trong vài chục năm đầu mắc bệnh Mặc dù viêm gan siêu vi C mạn có thể gây mệt mỏi Viêm gan siêu vi C lâu năm

là nguyên nhân gây xơ gan và ung thư gan Có khoảng 10-30 % viêm mạn chuyển sang

xơ gan trong thời gian 30 năm Xơ gan thường xảy ra ở những người cũng bị viêm gan siêu vi B hoặc nhiễm HIV, nghiện rượu, và nam giới Những người chuyển sang xơ gan có nguy cơ gấp 20 lần bị ung thư biểu mô tế bào gan Tỉ lệ bị ung thư ở những người này là 1-3% mỗi năm, và nếu bị xơ gan lại thêm nghiện rượu thì nguy cơ cao

hơn gấp 100 lần Viêm gan siêu vi C là nguyên nhân gây ra 27% số ca xơ gan và 25%

số ca ung thư biểu mô tế bào gan trên thế giới

Xơ gan có thể dẫn đến tăng áp lực tĩnh mạch cửa, cổ trướng (tích tụ nước ở bụng),dễ bầm tím hoặc chảy máu, giãn tĩnh mạch (tĩnh mạch giãn to, đặc biệt ở dạ dày

và thực quản), vàng da, và hội chứng suy giảm nhận thức gọi là bệnh não do gan Đây chính là nguyên nhân phổ biến đòi hỏi phải ghép gan

c Chuyển đổi huyết thanh

Hình 1.6: Sơ đồ chuyển đổi huyết thanh HCV (Michael P 2001)

1.1.3 Đặc điểm sinh học của HIV

1.1.3.1 HIV và bệnh AIDS

HIV lần đầu tiên được Montagnier và tập thể ở Viện Pasteur Paris phân lập vào năm 1983 với tên gọi ban đầu là vi rút liên quan tới viêm hạch (LAV) Năm 1984 công trình này được Gallo và tập thể [56] ở Viện Nghiên cứu Ung thư quốc gia Mỹ khẳng định sau khi phân lập được một vi rút gọi là vi rút hướng tế bào lympho T ở người Vào năm 1986, vi rút này được ủy ban quốc tế thống nhất gọi tên HIV Cùng thời điểm

đó người ta đã phân lập được một vi rút mới ở Tây Phi và đặt tên là HIV–type 2 Hai loại vi rút này đều làm suy giảm hệ thống miễn dịch của người và đặt tên chung là HIV Mặc dù HIV-type 2 có một số điểm giống với HIV-type 1 như về cách thức truyền bệnh, các hình thức nhiễm bệnh cơ hội và phương pháp điều trị, nhưng người nhiễm HIV-type 2 ít phát sinh bệnh hơn so với nhiễm HIV-type 1 và HIV-type 2 thấy chủ yếu ở các vùng của châu Phi [25] Vì vậy, HIV-type 1 được xem như là nguyên nhân chính gây nên bệnh AIDS

1.1.3.2 Tình hình nhiễm HIV

Đại dịch HIV/AIDS ảnh hưởng về mặt kinh tế và xã hội hết sức nghiêm trọng, gây tổn thất về nhân lực Đến nay vẫn chưa có vaccine phòng ngừa HIV hay thuốc chữa hữu hiệu Các biện pháp phòng ngừa chủ yếu vẫn dựa vào các chiến dịch nâng cao hiểu biết của người dân

Theo thông báo của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) ngày 28/11/2014, kể từ khi phát hiện (1981) cho đến nay có khoảng 78 triệu người nhiễm HIV, 39 triệu người đã chết vì HIV/AIDS, ước tính có 0.8 % dân số trên thế giới độ tuổi 15-49 tuổi đang

nhiễm HIV Việt Nam theo số liệu thống kê của UNAIDS (2015) số người nhiễm 2014

là 250000 người, độ tuổi từ 15-49 tuổi chiếm 0.5% người lớn tuổi trên 15 tuổi là 240

000 người, phụ nữ có 77 000, trẻ em từ 0-14 tuổi là 5300 Chết vì HIV/AIDS là 11 000 người [53]

Tại Việt Nam, có khoảng 250.000 người nhiễm HIV, tập trung chủ yếu tại một

số quần thể đích Vào năm 2013, tỷ lệ hiện nhiễm HIV trên toàn dân số (độ tuổi 49) là 0,39%, trong khi tỷ lệ hiện nhiễm ở những người tiêm chích ma túy là 10,3%, tiếp đến là 3,7% ở nam quan hệ tình dục đồng giới và 2,6% ở phụ nữ bán dâm Tuy nhiên, việc đánh giá ước tính khoảng 12.000 ca nhiễm mới xuất hiện trong năm 2014

15-và sẽ tiếp tục tăng lên với cùng tốc độ này trừ phi có sự thay đổi trong việc ứng phó hiện nay

1.1.3.3 Cấu trúc và sự nhân lên của HIV

1.1.3.3.1 Cấu trúc hình thể của HIV

Trên kính hiển vi điện tử, HIV-1 và HIV-2 có cấu trúc gần như giống nhau hoàn toàn Chúng chỉ khác nhau ở khối lượng của các protein cũng như các gen phụ trợ Cả HIV-1 và HIV-2 đều nhân bản trong tế bào lympho CD4 và đều gây bệnh ở người, mặc

dù mức độ suy giảm miễn dịch do HIV-2 gây ra là ít hơn (Hoffmann và tập thể, 2007)

Hình 1.7: Cấu trúc HIV (Hoffmann, 2007)

HIV có kích thước khoảng 120 nm, dạng cầu (hình 1.7) Vỏ ngoài của vi rút là lớp lipid kép làm yếu đi màng tế bào vật chủ khi một phần của vi rút được nảy chồi từ

tế bào Có nhiều protein gắn ở lớp vỏ nhô lên từ bề mặt của vi rút được ký hiện là Env Protein Env có phần chỏm được tạo thành từ 3 phân tử glycoprotein có khối lượng phân tử là 120 kDa (gp120) và phần thân được tạo thành bởi 3 phân tử gp41, gp120 và gp41 gắn với nhau tạo thành các phân tử gp160 đính vào lớp vỏ ngoài của vi rút Lớp

vỏ ngoài của HIV trưởng thành là capsid, có dạng như hạt đậu tạo thành từ 2000 bản copy protein p24 Lõi có dạng hình trụ được bao bọc bởi lớp capsid [7]

1.1.3.3.2 Hệ gen của HIV

Hệ gen của HIV nằm trong phần lõi của vi rút và bao gồm hai sợi ARN (+) đơn, mỗi sợi có chiều dài khoảng 9,8 kb và có 9 gen mã hóa cho 15 protein khác nhau

So với các vi rút khác thuộc họ Retrovirus thì hệ gen của HIV phức tạp hơn

Trên mỗi sợi ARN có 3 gen cấu trúc là gag, env và pol mã hóa cho các protein cấu trúc

(Gag, Pol và Env) Tất cả các vi rút thuộc họ Retrovirus đều có 3 vùng này, HIV cũng

có hơn 6 gen mã hóa cho các protein điều tiết là Tat và Rev và protein phụ là Vpu, Vpr, Vif và Nef [25]

Quá trình nhiễm HIV vào tế bào vật chủ bắt đầu bằng việc gắn một phần vi rút lên bề mặt của tế bào Quá trình này được bắt đầu khi protein bề mặt vỏ gp120 gắn vào thụ thể trên bề mặt tế bào đích Nhiều trường hợp thụ thể là CD4 có ở tế bào lympho T hoặc có ở một số tế bào khác như: đại thực bào, bạch cầu đơn nhân hay tế bào lympho

B Các tế bào này có vai trò rất quan trọng trong hệ thống miễn dịch của cơ thể, nó nhận diện, báo động và huy động các tế bào lympho tấn công và tiêu diệt vi sinh vật lạ khi chúng vào cơ thể Sự liên kết đầu tiên của gp 120 với CD4 để lộ ra vị trí khác của trimer Env, sau đó gp120 liên kết với đồng thụ thể, thường là thụ thể chemokine CXCR4 hoặc thụ thể chemokine CCR5 Tiếp đó phân tử gp41 qua thụ thể gắn vào màng tế bào đích và hòa tan màng, vi rút cởi bỏ lớp vỏ lipid bên ngoài và bơm vật liệu

di truyền của nó là ARN và protein Pol (reverse transcriptase hay RT) vào tế bào chất của tế bào vật chủ Nhờ enzyme phiên mã ngược, từ sợi ARN của vi rút tạo thành sợi ADN bổ sung (ADNc) [16] Sợi ARN gen của vi rút kết hợp ADNc thành chuỗi ARN/ADN – chuỗi lai này chuyển thành 2 sợi ADN xoắn mạch thẳng, sau đó chuyển thành ADN xoắn dạng vòng chui qua màng nhân đi vào nhân tế bào và nhờ enzyme integrase, ADNc của vi rút được chèn vào ADN nhiễm sắc thể của tế bào chủ ADN vi rút được hợp thành (hay gọi là tiền vi rút, phân biệt nó với dạng virion) có thể tồn tại ở trạng thái tiềm tàng trong nhiều giờ hoặc nhiều năm trước khi trở thành dạng hoạt động trong suốt quá trình sao chép (thành ARN) mà có thể không có biểu hiện bệnh Quá trình sao chép hệ gen của vi rút được thực hiện dưới sự điều khiển phức tạp của một số protein, bao gồm Tat và các yếu tố sao chép ADN của tế bào Chính việc gắn vật chất

di truyền của vi rút vào hệ gen đã làm thay đổi cấu trúc gen của tế bào vật chủ ADN của vi rút bắt đầu chỉ thị cho tế bào sản xuất ra ARN của vi rút nhờ enzyme ARN polymerase Các ARN này được nhân lên, các protein của vi rút cũng được tổng hợp nhờ ribosome của tế bào vật chủ, chúng di chuyển ra mạng lưới nội chất hoặc màng tế bào, tiếp theo là quá trình nảy chồi tạo thành các virion nằm trên màng hoặc tách ra khỏi tế bào chủ, đi vào máu và lại gắn vào các tế bào lympho T khác Sự vận chuyển ARN của vi rút đã được sao chép ra khỏi nhân cũng phụ thuộc vào một số nhân tố của

vi rút và vật chủ trong đó có Rev ARN của vi rút đã được sao chép có thể được vận chuyển ra ngoài nhân dưới dạng vật liệu di truyền cho các virion mới, hoặc có thể được nối từng phần hoặc toàn bộ nhằm tổng hợp nên những protein khác nhau của vi rút Mặc dù, đích chính của vi rút HIV là các tế bào lympho T CD4+, song các tế bào của

hệ thống miễn dịch khác cũng bị lây nhiễm Trong số đó có các tế bào sống lâu là tế bào đơn nhân và đại thực bào có thể chứa một số lượng lớn vi rút mà không bị phá hủy,

vì thế nó hoạt động như các nguồn tích trữ lượng lớn HIV Các tế bào lympho T CD4+

cũng đóng vai trò như các nguồn tích trữ lượng lớn HIV trong khi một phần nhỏ của các tế bào này có chứa HIV dưới dạng không hoạt động và bền vững Các phương thức miễn dịch thông thường có thể hoạt hóa các tế bào này dẫn đến việc sản sinh ra các virion HIV mới Do đó HIV phá hủy và làm các tế bào bị nhiễm của hệ thống miễn dịch mất khả năng bảo vệ Mặc dù hệ thống miễn dịch của cơ thể tạo ra được kháng thể chống lại HIV nhưng dường như nó không có khả năng làm trung hòa HIV và không ngăn chặn được những tổn thương do HIV gây ra Các nhà khoa học hiện nay vẫn chưa giải thích được hiện tượng này

Hình 1.8: Chu kỳ sống của HIV [65]

Các tế bào lympho T CD4+ bị nhiễm có thể chết khi một lượng lớn vi rút nảy chồi, phá vỡ màng tế bào Khi các protein và axit amin của vi rút có mặt bên trong tế bào, cản trở sự hoạt động của bộ máy tế bào Mặt khác, các tế bào lympho T CD4+

bị nhiễm rơi vào tình trạng tự chết (chết theo chương trình) khi HIV gây rối loạn chức năng tế bào Thêm vào đó, nhiều nghiên cứu cho thấy rằng HIV cũng phá hủy các tế bào tiền thân miễn dịch đặc hiệu, mất khả năng tái sinh, làm hệ thống miễn dịch giảm khả năng bảo vệ cơ thể Người nhiễm HIV, hệ thống miễn dịch thể dịch và miễn dịch

tế bào đều sinh ra miễn dịch[22] Tế bào lympho T CD8+ và T CD4+ trung gian kìm hãm sự sao chép HIV bằng cách nhận diện, giết tế bào bị nhiễm và sản sinh nhân tố kháng vi rút chemokine hòa tan Các kháng thể của hệ thống miễn dịch người được sản sinh chống lại các kháng nguyên của vi rút Tuy nhiên, vi rút có các phương thức để chống lại sự tấn công của hệ thống miễn dịch nhờ sự biến đổi của các epitope đích

hoặc thoát ra khỏi sự bắt giữ Vì vậy, hệ thống miễn dịch cơ thể không thể ngăn chặn được sự tiến triển cuối cùng của bệnh và cuối cùng HIV phá hủy hệ thống miễn dịch

tế bào lympho T CD4+ tăng lên dẫn tới các hoạt động khác của hệ miễn dịch, khả năng kháng vi rút của người bệnh tăng lên làm cho người bệnh lầm tưởng là đã khỏi nhưng lúc này vi rút vẫn có khả năng truyền bệnh Khoảng vài năm sau đó mật độ các vi rút trong máu tăng nhanh và duy trì cho tới lúc chết, các kháng thể kháng vi rút giảm dần, giai đoạn này gọi là giai đoạn toàn phát hay giai đoạn cuối Người bệnh có mức độ nhiễm khuẩn tăng lên, người gầy yếu, các vi sinh vật cơ hội có điều kiện tấn công Biểu hiện lâm sàng là một số bệnh nhiễm trùng cơ hội[19,25]

Hình 1.9: Sơ đồ chuyển đổi huyết thanh HIV (Michael P 2001)

1.2 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP XÉT NGHIỆM SÀNG LỌC HBV, HCV, HIV

Trên thế giới, xét nghiệm sàng lọc máu ứng dụng xét nghiệm miễn dịch bắt đầu

từ những năm 1960, với phương pháp đầu tiên là xét nghiệm miễn dịch phóng xạ (radioimmunoassays - RIA) RIA sử dụng các đồng vị phóng xạ làm chất đánh dấu, lượng hoạt tính phóng xạ đo được thể hiện lượng chất cần phân tích trong mẫu Tuy nhiên, do sự phức tạp trong xử lý thuốc thử, RIA ít được ứng dụng trong phòng xét nghiệm hơn một phương pháp xét nghiệm miễn dịch khác, gọi là xét nghiệm miễn dịch men (EIA) Trong EIA, enzyme được sử dụng làm chất đánh dấu Enzyme điển hình là alkaline phosphatase, horseradish peroxidase, và β- galactosidase EIA dựa vào sự thay đổi màu, ánh sáng phát ra, hoặc các tín hiệu khác gây ra bởi enzyme ELISA, hay Enzyme Linked Immunosorbent Assay, sử dụng phương pháp xét nghiệm miễn dịch tạo phức hợp kẹp chả “sandwich”, gắn kết thuốc thử chứa kháng thể gắn enzyme với pha rắn bao kháng thể Ban đầu, người ta sử dụng các đĩa vi giếng hoặc các hạt 1/4 inch làm pha rắn Đĩa vi giếng gồm các giếng bao phủ bởi kháng thể Chuyển sang những năm 1970 và những năm 1980 – 1990, có thêm những tiến bộ lớn trong tự động

hóa và cải thiện về độ nhạy của xét nghiệm miễn dịch, và đặc biệt trong EIA Kỹ thuật miễn dịch phân cực huỳnh quang (Fluorescence Polarization Immunoassay - FPIA) và

kỹ thuật miễn dịch men vi hạt (Microparticle Enzyme Immunoassay - MEIA) là hai kỹ thuật ưu thế trong những năm đầu thế kỷ 21 Gần đây, kỹ thuật miễn dịch Hóa phát quang (Chemiluminescent Magnetic Immunoassay - CMIA), điện hóa phát quang đã được sử dụng trong nhiều trung tâm truyền máu trên thế giới Năm 2001, các nước Đức, Pháp đã đưa xét nghiệm NAT vào sàng lọc máu

Bảng 1.1: Xét nghiệm viêm gan B NAT sàng lọc đơn vị máu [21]

2007 Hồng Kong, Kuwait, Malaysia, New Zealand, Slovenia, Thụy sĩ

độ nhạy của sàng lọc nhưng các kỹ thuật đó chỉ dùng vào một số trường hợp nghiên cứu vì tốn kém kháng thể nhiều và không thuận lợi khi xét nghiệm hàng loạt Đầu những năm 1980 bắt đầu triển khai kỹ thuật xét nghiệm ngưng kết hồng cầu thụ động Năm 1984, kỹ thuật ELISA bắt đầu được sử dụng cho sàng lọc vi rút viêm gan B Đầu những năm 1991 kỹ thuật ngưng kết hồng cầu thụ động được triển khai cho xét nghiệm

sàng lọc HIV Đến đầu những năm 1995 thì kỹ thuật ELISA bán tự động được triển khai thường quy cho sàng lọc cả 03 loại vi rút viêm gan B, viêm gan C, HIV Giai đoạn 2005-2006: xét nghiệm ELISA được thực hiện trên hệ thống tự động Năm 2011 xét nghiệm hóa phát quang được đưa và sử dụng sàng lọc máu Năm 2014 xét nghiệm điện hóa phát quang được đưa vào sử dụng song song với hóa phát quang Năm 2015, NAT đưa vào xét nghiệm sàng lọc máu tại 4 trung tâm truyền máu lớn trên cả nước theo thông tư 26/2013 BYT

Có 4 loại xét nghiệm miễn dịch được chia thành các nhóm không cạnh tranh và cạnh tranh, đồng môi trường (homogeneous) và khác môi trường (heterogeneous) Các phương pháp xét nghiệm miễn dịch trải qua giai đoạn tách phức hợp gắn kết kháng thể- kháng nguyên được gọi là xét nghiệm miễn dịch heterogeneous Còn những xét nghiệm không trải qua giai đoạn này được gọi là homogeneous Kỹ thuật Homogeneous đã được ứng dụng rộng rãi vì kỹ thuật homogeneous không cần phân tách phức hợp kháng thể - kháng nguyên ra khỏi kháng nguyên gắn chất đánh dấu tự do, và cũng do đó thực hiện dễ dàng hơn và nhanh hơn

Hình 1.10: Kỹ thuật Homogeneous áp dụng trong xét nghiệm miễn dịch

Xét nghiệm miễn dịch mang lại độ nhạy và độ đặc hiệu cao nhất được các hãng sinh phẩm lựa chọn là “sandwich” (kẹp chả) chất cần phân tích được gắn kẹp giữa hai kháng thể đặc hiệu cao có trong thuốc thử Xét nghiệm 2 bước, thông qua các bước rửa, nhằm loại bỏ thuốc thử gắn chất đánh dấu không gắn kết và những thành phần có thể gây nhiễu

1.2.2 Xét nghiệm sinh học phân tử NAT (Phát hiện dựa trên nguyên tắc nhân bản gen đích)

Khai thác mặt mạnh của PCR, nhiều công ty, đã nghiên cứu và phát triển nhiều thế hệ sinh phẩm phát hiện HIV và HBV như COBAS Ampliscreen HIV-1 Test, Roche Amplicor HIV-1 Monitor Test và COBAS Ampliscreen HBV Test v.v Tuy nhiên, các sinh phẩm này được nghiên cứu và sản xuất để phù hợp sử dụng trong sàng lọc máu của những người cho máu Không thể phủ nhận rằng PCR có mặt hạn chế của nó đó là phương pháp có thể cho kết quả dương tính giả khi một lượng rất nhỏ chuỗi đích được khuếch đại bị nhiễm vào mẫu phân tích hay các hóa chất dùng cho phân tích ADN bị nhiễm này có thể sau đó lại được dùng làm khuôn cho phản ứng nhân bản tiếp theo và

vì thế sẽ cho kết quả dương tính giả Một xu hướng mới đó là sử dụng các xét nghiệm

đa thành phần (multiplex PCR) để phát hiện đồng thời một số tác nhân gây bệnh bằng

cách sử dụng đồng thời một số mồi đặc hiệu cho các gen đích khác nhau trong cùng một phản ứng PCR Dạng multiplex PCR có một số ưu điểm như giảm số lượng mẫu cần phải thao tác, cũng như giảm được giá thành hóa chất và tiết kiệm được thời gian, trong khi vẫn đảm bảo được mức độ an toàn gần giống với các phản ứng PCR riêng lẻ, đặc biệt là phù hợp cho xét nghiệm sàng lọc máu với số lượng lớn Đối với các tác nhân vi sinh vật gây ra những triệu chứng lâm sàng giống hoặc tương tự nhau hay có cách thức lây nhiễm giống nhau như HIV, HBV hoặc HCV thì NAT sẽ có những ưu thế Sử dụng phương pháp NAT, giai đoạn cửa sổ có thể giảm xuống 26 ngày đối với HBV, chỉ 4 ngày đối với HCV và 7 ngày đối với HIV Tính đặc hiệu của các phương pháp được đảm bảo bởi sự liên kết đặc hiệu của các mồi lên các chuỗi đích và khả năng tổng hợp chuỗi polynucleotide chính xác của DNA polymerase

Chương 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 NGUYÊN LIỆU

2.1.1 Mẫu máu

Mẫu máu từ người hiến máu được lấy miền Bắc Trung Nam từ tháng 1/2015 đến hết 9/2015 xét nghiệm HBsAg, anti HCV, HIVAgAb bằng hóa phát quang và điện hóa phát quang tại Viện Huyết học Truyền máu TW

192221 mẫu máu từ người hiến máu lấy từ tháng 1/2015 đến hết 9/2015 (âm tính HBsAg, anti HCV, HIVAgAb) xét nghiệm NAT (HBV, HCV, HIV) tại Viện Huyết học Truyền máu TW

2.1.2 Các hóa chất, nguyên liệu khác

- Hóa chất, vật tư tiêu hao xét nghiệm sàng lọc miễn dịch Roche Elecsys HBsAg, Roche anti HCV, Roche HIV combi PT phù hợp máy xét nghiệm tự động (Roche - Switzerland)

- Hóa chất, vật tư tiêu hao xét nghiệm sàng lọc miễn dịch Abbott Architect HBsAg Qual II, Abbott Architect anti HCV, Abbott Architect HIV AgAb Combo phù hợp máy xét nghiệm tự động (Abbott – USA)

- Hóa chất, vật tư tiêu hao xét nghiệm sinh học phân tử NAT Procleix Ultrio Elite Assay phù hợp máy xét nghiệm tự động (Grifol – USA)

- Hóa chất, vật tư tiêu hao xét nghiệm sinh học phân tử NAT cobas® TaqScreen MPX Test, version 2.0 phù hợp máy xét nghiệm tự động (Roche - Switzerland)

2.2 MÁY MÓC VÀ TRANG THIẾT BỊ

Các máy móc chính dùng cho nghiên cứu bao gồm

2.2.1 Máy ly tâm, phân loại mẫu tự động Cobas p512 (Roche – Switzerland)

2.2.2 Máy xét nghiệm miễn dịch tự động Abbott Architect i2000 (Abbott – USA)

2.2.3 Máy xét nghiệm miễn dịch tự động Cobas e602 (Roche – Switzerland)

2.2.4 Hệ thống máy xét nghiệm NAT tự động Cobas s201 (Roche – Switzerland) + Máy trộn mẫu tự động Hamilton MICROLAB ® STAR/STARLet IVD Pipettor + Máy tách chiết mẫu tự động COBAS® AmpliPrep Instrument

+ Máy khuếch đại nucleic acid và phát hiện sản phẩm realtime PCR COBAS®TaqMan® Analyzer

+ Hệ thống quản lý dữ liệu

2.2.5 Hệ thống máy xét nghiệm NAT tự động Procleix® Panther System

(Grifols-USA)

+ Máy chuẩn bị hóa chất RPI 250

+ Máy trộn mẫu tự động Hamilton

+ Máy xét nghiệm tự động Procleix Panther

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Thiết kế nghiên cứu:

Theo hướng dẫn của WHO khi xét nghiệm sàng lọc có kết quả

- Không phản ứng: đơn vị máu được sử dụng

- Phản ứng: xét nghiệm lại đơn vị máu đó 2 lần, kết luận theo kết quả xét nghiệm lại Nếu 1 trong 2 lần xét nghiệm lại hoặc cả 2 lần xét nghiệm lại phản ứng thì hủy đơn vị máu Nếu cả 2 lần xét nghiệm lại không phản ứng thì kết luận không phản ứng có thể

sử dụng đơn vị máu

Hình 2.1: Mô hình nghiên cứu

Chúng tôi thiết kế mô hình nghiên cứu theo hướng dẫn hoạt động truyền máu TT26/2013/TT-BYT

XN miễn dịch HBsAg, anti HCV, HIVAgAb

XN antiHBc

2.3.1 Xét nghiệm miễn dịch HBV, HCV, HIV theo phương pháp miễn dịch tự động

hóa phát quang CMIA và Miễn dịch tự động điện hóa phát quang ECLIA

Các vi rút được phát hiện gián tiếp kháng thể/kháng nguyên dựa trên nguyên lý tương tác miễn dịch kháng nguyên-kháng thể bằng kỹ thuật Hóa phát quang CMIA hoặc kỹ thuật Điện hóa phát quang ECLIA Các mẫu máu được xét nghiệm cùng thời điểm trong ngày và được chia vào 2 hệ thống xét nghiệm tự động: 50% mẫu được chia vào hệ thống tự động Abbott Architect i2000 (CMIA), 50% mẫu được chia vào hệ thống tự động Roche Cobas e602

2.3.1.1 Kỹ thuật Hóa phát quang CMIA (Chemiluminescent Microparticle Immunoassay)(theo quy trình kỹ thuật của hãng Abbott)

Nguyên tắc: dựa vào tương tác miễn dịch kháng nguyên-kháng thể và gắn chất phát

quang là Acridium Chất này sẽ được giải phóng ra nhờ dung dịch pretrigger và phản ứng với trigger tạo ra các photon ánh sáng Năng lượng được đo bằng cường độ ánh sáng

Quy trình thực hiện như sau:

Mẫu máu được ly tâm 3500 vòng/phút trong 20 phút để tách huyết thanh và xét nghiệm trên máy Abbott Architect i2000 Máy xét nghiệm quét barcode chỉ định xét nghiệm HBsAg, anti HCV, HIV AgAb Combo cho mẫu Máy chạy xét nghiệm hoàn toàn tự động cho đến khi ra kết quả xét nghiệm Các bước thực hiện trong máy xét nghiệm tự động:

Bước 1: Phản ứng giữa vi hạt có gắn kháng thể/kháng nguyên và kháng nguyên/kháng thể có trong mẫu, ủ để phản ứng diễn ra hoàn toàn

Bước 2: Rửa bằng dung dịch rửa để loại bỏ các thành phần không phản ứng

Bước 3: Cho cộng hợp có đánh dấu Acridinium, ủ để hình thành phức hợp

Bước 4: Rửa để loại bỏ cộng hợp thừa

Bước 5: Cho Pre – trigger vào tạo môi trường acid cũng như giải phóng Acridinium thành dạng tự do

Bước 6: Cho Trigger vào tạo phản ứng giải phóng photon, năng lượng được đo ngay lâp tức bằng CMIA optic dưới dạng cường độ ánh sáng

Hình 2.2: Phản ứng hóa phát quang CMIA (hãng Abbott) Nhận định kết quả:

- Giá trị ngưỡng của phản ứng Cut off (CO) bằng trung bình tính hiệu hóa phát quang (Relative Light Unit) Calibrator qua 3 lần chạy lặp lại

- S/CO (sample/ cut off)= RLU mẫu/ RLU ngưỡng

S/CO <0,9: không phản ứng, không cần xét nghiệm lại

S/CO ≥ 0,9: phản ứng, xét nghiệm lặp lại 2 lần Kết quả xét nghiệm 2 lần lặp lại không

có phản ứng, mẫu được coi là không có phản ứng Kết quả xét nghiệm 2 lần lặp lại có một hay cả 2 kết quả S/CO≥ 0,9, mẫu được coi là phản ứng

2.3.1.2 Kỹ thuật Điện hóa phát quang ECLIA (Electrochemiluminescence Immunoassay)(theo quy trình kỹ thuật của hãng Roche)

Nguyên tắc: dựa vào tương tác miễn dịch kháng nguyên-kháng thể và gắn chất phát

quang là Ruthenium: Tris(2,2’-bipyridyl) ruthenium (II)- complex (Ru(bpy) 3 2+ Các vi hạt đối từ sẽ được bắt giữ trên bề mặt của điện cực Cho điện áp vào điện cực sẽ tạo nên sự phát quang hóa học được đo bằng bộ khuyếch đại quang tử

Quy trình thực hiện như sau:

Mẫu máu được ly tâm 3500 vòng/phút trong 20 phút để tách huyết thanh và xét nghiệm trên máy Roche Cobas e602 Máy xét nghiệm quét barcode chỉ định xét nghiệm cho mẫu Máy chạy xét nghiệm hoàn toàn tự động cho đến khi ra kết quả xét nghiệm Các bước thực hiện trong máy xét nghiệm tự động:

Bước 1: Mẫu ủ với chất ly giải vi rút

Bước 2: Mẫu được ủ với 2 kháng thể/kháng nguyên gắn biotin và kháng thể/ kháng nguyên gắn ruthenium Một phức hợp sandwich được thành lập có gắn nhãn biotin và ruthenium

Bước 3: Sau đó các vi hạt từ tính phủ streptavidin được cho vào, các vi hạt sẽ gắn với các phức hợp được thành lập trước đó thông qua mối liên kết biotin-streptavidin

Bước 4: Hỗn hợp phản ứng được đưa vào buồng đo, nơi các vi hạt được giữ lại trên bề mặt điện cực dưới tác động của từ trường Sau đó các thành phần không gắn kết bị rửa trôi Phản ứng phát quang diễn ra dưới tác động kích thích của dòng điện và được đo bằng máy nhân quang