Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu tích hợp gen kháng bệnh bạc lá vào một số dòng giống lúa phục vụ chọn tạo giống

3.1 Thống kê số lượng và tỉ lệ nucleotit vùng CDS Coding DNA Sequence của gen ứng viên xa5 ở một số giống lúa có trình tự tương đồng với gen tham chiếu xa5 đã công bố 54 3.2 Thống kê s

-*** -

NGUYỄN THÚY ĐIỆP

NGHIÊN CỨU TÍCH HỢP GEN KHÁNG BỆNH BẠC LÁ

VÀO MỘT SỐ DÒNG/GIỐNG LÚA PHỤC VỤ

CHỌN TẠO GIỐNG

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

Hà Nội, 2019

-*** -

NGUYỄN THÚY ĐIỆP

NGHIÊN CỨU TÍCH HỢP GEN KHÁNG BỆNH BẠC LÁ

VÀO MỘT SỐ DÒNG/GIỐNG LÚA PHỤC VỤ

1 PGS.TS Khuất Hữu Trung

2 TS Hoàng Hoa Long

Hà Nội, 2019

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn tận tình của các Thầy hướng dẫn và sự giúp đỡ của tập thể cán bộ nghiên cứu thuộc

Bộ môn Kỹ thuật Di truyền, Bộ môn Bệnh Học Phân tử - Viện Di truyền Nông nghiệp Toàn bộ số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận án này là trung thực và chưa từng được sử dụng để công bố trong các công trình nghiên cứu để nhận học vị Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những số liệu trong luận án này

Hà Nội, ngày tháng năm 2019

Tác giả luận án

Nguyễn Thúy Điệp

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành được luận án này, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, quan tâm

và tận tình giúp đỡ của các thầy cô, bạn bè và đồng nghiệp

Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Khuất Hữu Trung

và TS Hoàng Hoa Long đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận án

Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ nghiên cứu thuộc Bộ môn Kỹ thuật

Di truyền, Bộ môn Bệnh Học Phân tử - Viện Di truyền Nông nghiệp đã nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện và thời gian cho tôi hoàn thành luận án này

Đồng thời, tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn đến thầy cô thuộc Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, các đồng nghiệp và bạn bè đã luôn quan tâm giúp đỡ, động viên tinh thần cho tôi trong thời gian làm luận án

Hà Nội, ngày tháng năm 2019

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC BẢNG viii

DANH MỤC HÌNH xi

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3

4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 3

5 Những đóng góp mới của đề tài 4

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

1.1 Tổng quan về bệnh bạc lá ở lúa 5

1.1.1 Lịch sử phát hiện bệnh 5

1.1.2 Vi khuẩn gây bệnh bạc lá lúa 6

1.1.3 Các chủng sinh lý trên thế giới và ở Việt Nam 7

1.2 Tổng quan về gen kháng và bản chất của gen kháng bệnh bạc lá 10

1.3 Chỉ thị phân tử và vai trò của chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống cây trồng 18

1.3.1 Vai trò của chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống cây trồng 18

1.3.2 Các chỉ thị phân tử DNA dùng phổ biến trong lai tạo và chọn giống 19

1.3.3 Phương pháp chọn lọc nhờ sự hỗ trợ của chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống lúa (Marker Assisted Selection - MAS) 22

1.4 Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá 26

1.4.1 Sàng lọc nguồn gen kháng bệnh bạc lá 26

1.4.2 Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá trên thế giới 26

1.4.3 Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá ở Việt Nam 29

1.5 Tổng quan về gen chất lượng và chỉ thị liên kết với gen chất lượng 33

1.6 Khuynh hướng nghiên cứu quy tụ nhiều gen vào 1 giống lúa 39

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 41

2.1 Vật liệu 41

2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 41

2.1.2 Các loại hóa chất 43

2.1.3 Máy móc thiết bị sử dụng 44

2.2 Nội dung nghiên cứu 44

2.3 Phương pháp nghiên cứu 45

2.3.1 Phương pháp xác định các gen ứng viên liên quan kháng bệnh bạc lá 45

2.3.2 Phương pháp thiết kế các chỉ thị SSLP 46

2.3.4 Phương pháp PCR 47

2.3.5 Phương pháp đánh giá tính kháng/nhiễm bạc lá bằng lây nhiễm nhân tạo 49

2.3.6.Thí nghiệm đồng ruộng 51

2.3.7 Phương pháp xử lý số liệu 53

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 54

3.1 Xác định gen kháng bệnh bạc lá và thiết kế mồi nhận diện các gen ứng viên kháng bệnh bạc lá 54

3.1.1 Xác định và thiết kế mồi nhận diện các gen ứng viên kháng bệnh bạc lá có trong các giống lúa bản địa của Việt Nam 54

3.1.1.1 Xác định và thiết kế mồi nhận diện các gen ứng viên xa5 54

3.1.1.2 Xác định và thiết kế mồi nhận diện các gen ứng viên xa13 60

3.1.2 Xác định các gen kháng bệnh bạc lá có trong các nguồn vật liệu thu thập nhờ sử dụng các chỉ thị liên kết 64

3.1.2.1 Kiểm tra gen ứng viên xa5 và xa13 ở các dòng/giống thu thập nhờ sử dụng các cặp mồi thiết kế 64

3.1.2.2 Kiểm tra gen/gen ứng viên Xa4, Xa7 và Xa21 ở các dòng/giống bố mẹ 65

3.2 Đánh giá khả năng kháng/nhiễm bệnh bạc lá của các nguồn vật liệu 69

3.3 Tạo nguồn vật liệu mang đa gen/gen ứng viên kháng bệnh bạc lá 72

3.3.1 Xác định các con lai ở thế hệ BC1F1 mang đa gen/gen ứng viên kháng bệnh bạc lá 73

3.3.2 Xác định các con lai ở thế hệ BC2F1 mang đa gen/gen ứng viên kháng bệnh

bạc lá 78

3.3.3 Xác định các con lai ở thế hệ BC3F1 mang đa gen/gen ứng viên kháng bệnh bạc lá 82

3.3.4 Xác định các cá thể BC3F2 mang đa gen/gen ứng viên kháng bệnh bạc lá và gen chất lượng (Waxy, BADH2) 86

3.4.1 Đánh giá một số đặc điểm nông sinh học chính và khả năng kháng bệnh bạc lá (lây nhiễm nhân tạo) của các dòng BC3F3 mang gen ứng viên kháng bệnh bạc lá có nền di truyền của giống An dân 11 99

3.4.2 Đánh giá một số đặc điểm nông sinh học chính và khả năng kháng bệnh bạc lá (lây nhiễm nhân tạo) của các dòng BC3F3 mang gen ứng viên kháng bệnh bạc lá có nền di truyền của giống DT39 104

3.4.3 Đánh giá một số đặc điểm nông sinh học chính và khả năng kháng bệnh bạc lá (lây nhiễm nhân tạo) của các dòng BC3F3 mang gen ứng viên kháng bệnh bạc lá có nền di truyền của giống Thủ Đô 1 111

3.4.4 Đánh giá một số đặc điểm nông sinh học chính và khả năng kháng bệnh bạc lá (lây nhiễm nhân tạo) của các dòng BC3F3 mang gen kháng bệnh bạc lá có nền di truyền của giống Bắc thơm số 7 115

3.4.5 Chọn tạo các dòng/giống lúa triển vọng 120

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 128

1 Kết luận 128

2 Đề nghị 128

CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 130

TÀI LIỆU THAM KHẢO 131

PHỤ LỤC 1 MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VÀ BẢO QUẢN VI KHUẨN 149

PHỤ LỤC 2 MỘT SỐ HÌNH ẢNH KIỂM TRA GEN/GEN ỨNG VIÊN KHÁNG BỆNH BẠC LÁ 150

PHỤ LỤC 3 KẾT QUẢ XỬ LÝ SỐ LIỆU IRRISTAT 164

AFLP Amplified Fragment Length

Polymorphism

Sự đa hình các đoạn khuếch đại

BADH2 Betaine aldehyde

dehydrogenase

-

CAPs Cleaved Amplified

Polymorphic sequence

Trình tự đa hình khuếch đại

bị cắt CTAB Cetyltrimethyl Amonium

ddNTPs Dideoxynucleotit

Triphosphate

2',3'dideoxynucleotide (ddGTP, ddATP, ddTTP và ddCTP)

EDTA Ethylenediaminetetra Acetic

Acid

-

InDels Insertions or Deletions Đoạn thêm/bớt

IRRI International Rice Research

Biotechnology Information

Trung tâm thông tin Công nghệ Sinh học quốc gia

NILs Near-isogenic lines Dòng cận đẳng gen

microsatellite site

Vị trí vi vệ tinh đƣợc đánh dấu bởi trình tự

STS Sequence Tagged Site Vị trí đƣợc đánh dấu bởi

3.1 Thống kê số lượng và tỉ lệ nucleotit vùng CDS (Coding DNA

Sequence) của gen ứng viên xa5 ở một số giống lúa có trình tự

tương đồng với gen tham chiếu xa5 đã công bố

54

3.2 Thống kê số lượng và tỉ lệ (%) axit amin vùng CDS của gen ứng

viên xa5 ở một số giống lúa có trình tự tương đồng với gen tham

chiếu xa5 đã công bố

56

3.3 Thống kê số lượng và nucleotit vùng CDS (Coding DNA

Sequence) của gen ứng viên xa13 ở một số giống lúa có trình tự

tương đồng với gen tham chiếu xa13 đã công bố

61

3.4 Thống kê số lượng và tỉ lệ (%) axit amin vùng CDS của gen ứng

viên xa13 ở một số giống lúa có trình tự tương đồng với gen tham

chiếu xa13 đã công bố

62

3.5 Bảng tổng hợp các dòng/giống mang gen ứng viên kháng bệnh bạc

lá

68

3.6 Đánh giá khả năng kháng/nhiễm của các dòng/giống lúa nghiên

cứu bằng lây nhiễm nhân tạo (vụ Xuân 2014- Thạch Thất, Hà Nội)

71

3.8 Thống kê kết quả xác định các gen/gen ứng viên kháng bệnh bạc

lá và chọn lọc các cá thể BC1F1, tạo BC2F1 (vụ Xuân 2015- Tây

Tựu, Hà Nội)

77

3.9 Thống kê kết quả xác định các gen/gen ứng viên kháng bệnh bạc 81

lá và chọn lọc các cá thể BC2F1, tạo BC3F1 (vụ Mùa 2015 - Tây

3.13 Kiểu gen của các cá thể BC3F2 của một số tổ hợp lai mang 2-3

gen/gen ứng viên Xa4+Xa7/Xa4+Xa7+Xa21

90

3.14 Kiểm tra và chọn lọc các cá thể ở thế hệ BC3F2 của các tổ hợp lai

mang gen/gen ứng viên kháng bệnh bạc lá (vụ Mùa 2016)

93

3.15 Một số đặc điểm hình thái của các cá thể BC3F2:3 mang gen/gen

ứng viên kháng bệnh bạc lá (vụ Mùa 2016 - Thạch Thất, Hà Nội)

3.18 Đặc điểm sinh trưởng của các cá thể BC3F3 mang gen ứng viên

kháng bệnh bạc lá có nền di truyền của giống An Dân 11 (Vụ

Xuân 2017 - Thạch Thất, Hà Nội)

102

3.19 Các yếu tố cấu thành năng suất của các dòng BC3F3 mang gen ứng

viên kháng bệnh bạc lá có nền di truyền của giống An Dân 11 (Vụ

Xuân 2017 - Thạch Thất, Hà Nội)

104

3.20 Đánh giá khả năng kháng bệnh bạc lá (lây nhiễm nhân tạo) của các

dòng BC3F3 có nền di truyền của giống DT39 (Vụ Xuân

2017-Thạch Thất, Hà Nội)

107

3.21 Một số đặc điểm sinh trưởng của các dòng BC3F3 mang gen kháng

bệnh bạc lá có nền di truyền của giống DT39 (Vụ Xuân 2017 -

Thạch Thất, Hà Nội)

108

3.22 Các yếu tố cấu thành năng suất của các dòng BC3F3 mang gen

kháng bệnh bạc lá có nền di truyền của giống DT39 (Vụ Xuân

109

2017 - Thạch Thất, Hà Nội)

3.23 Đánh giá khả năng kháng bệnh bạc lá (lây nhiễm nhân tạo) của các

dòng BC3F3 có nền di truyền của giống Thủ Đô 1 (Vụ Xuân 2017 -

Thạch Thất, Hà Nội)

112

3.24 Đặc điểm sinh trưởng của các cá thể BC3F3 mang gen/gen ứng

viên kháng bệnh bạc lá có nền di truyền của giống Thủ Đô 1 (Vụ

Xuân 2017 - Thạch Thất, Hà Nội)

113

3.25 Các yếu tố cấu thành năng suất của các dòng BC3F3 mang gen

kháng bệnh bạc lá có nền di truyền của giống Thủ Đô 1 (Vụ Xuân

2017 - Thạch Thất, Hà Nội)

114

3.26 Đánh giá khả năng kháng bệnh bạc lá (lây nhiễm nhân tạo) của các

dòng BC3F3 mang gen kháng bệnh bạc lá có nền di truyền của

giống Bắc thơm số 7 (Vụ Xuân 2017 - Thạch Thất, Hà Nội)

117

3.27 Đặc điểm sinh trưởng của các dòng BC3F3 mang gen kháng bệnh

bạc lá có nền di truyền của giống Bắc thơm số 7 (Vụ Xuân 2017 -

Thạch Thất, Hà Nội)

118

3.28 Các yếu tố cấu thành năng suất của các dòng BC3F3 mang gen

kháng bệnh bạc lá thuộc tổ hợp lai Bắc thơm số 7/IRBB62 (Vụ

3.34 Bảng tổng hợp một số đặc điểm sinh trưởng, yếu tố cấu thành

năng suất và năng suất của dòng triển vọng KTDT18

126

DANH MỤC HÌNH

TT

hình

2.2 Sơ đồ lai tạo tổng quát của các tổ hợp lai đã thiết kế 51 3.1 Trình tự một đoạn gen ứng viên kháng bệnh bạc lá xa5 của một số

giống lúa bản địa (đoạn mất 35 nucleotit)

58

3.3 Ảnh điện di sản phẩm PCR xác định gen ứng viên xa5 ở các

dòng/giống lúa bản địa sử dụng cặp mồi xa5add35

60

3.4 Trình tự một đoạn gen ứng viên kháng bệnh bạc lá xa13 của một số

giống lúa bản địa (đoạn mất 4 nucleotit)

61

3.6 Ảnh điện di sản phẩm PCR xác định gen ứng viên xa13 ở các giống

lúa bản địa của Việt Nam sử dụng cặp mồi xa13add4

64

3.7 Ảnh điện di sản phẩm PCR xác định gen ứng viên xa5 (a) và xa13

(b) ở các dòng/giống lúa ưu tú sử dụng cặp mồi xa5add35 và

xa13add4 tương ứng

65

3.8 Ảnh điện di sản phẩm PCR xác định gen ứng viên Xa7 ở các

dòng/giống lúa ưu tú (a) và giống lúa bản địa (b) với cặp mồi P3

66

3.9 Ảnh điện di sản phẩm PCR xác định gen ứng viên Xa21 ở các

dòng/giống lúa nghiên cứu sử dụng cặp mồi pTA248

67

3.11 Đánh giá khả năng kháng/nhiễm của một số dòng/giống lúa nghiên

cứu

70

3.12 Ảnh điện di sản phẩm PCR xác định gen ứng viên Xa4 (a), xa5 (b)

đối với các cá thể BC1F1 của tổ hợp lai Thủ đô 1*2/Chấn thơm sử

dụng cặp mồi MP1-2, xa5add35 tương ứng

74

3.13 Tạo hạt lai ở thế hệ BC2F1 của các tổ hợp lai (vụ Xuân 2015) 75

3.14 Ảnh điện di sản phẩm PCR xác định gen Xa4 (a), Xa7 (b) và Xa21

(c) đối với các cá thể BC1F1 của tổ hợp lai Bắc thơm số 7*2/IRBB62

76

3.15 Ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR xác định gen ứng viên Xa4 (a)

và xa5 (b) đối với các cá thể BC2F1 của tổ hợp lai DT39*3/Chấn

78

thơm sử dụng cặp mồi MP1-2 và xa5add35 tương ứng

3.16 Ảnh điện di sản phẩm PCR xác định gen Xa4 (a), Xa7 (b), Xa21 (c)

đối với các cá thể BC2F1 của tổ hợp lai Thủ Đô 1*3/IRBB62 sử

dụng cặp mồi MP1-2, P3, pTA248 tương ứng

3.19 Ảnh điện di sản phẩm PCR xác định gen ứng viên xa5 (a), Xa7 (b),

xa13 (c) đối với các cá thể BC3F1 của tổ hợp lai An Dân 11*4/Hom

râu sử dụng cặp mồi xa5add35, P3, xa13add4 tương ứng

85

3.20 Hạt tự thụ (BC3F2) của các cá thể thuộc thế hệ BC3F1 mang gen

kháng bệnh bạc lá của 1 số tổ hợp lai

87

3.21 Ảnh điện di sản phẩm PCR xác định gen ứng viên Xa4 (a), xa5(b)

đối với các cá thể BC3F2 của tổ hợp lai Thủ đô 1/Chấn thơm sử dụng

cặp mồi MP1-2, xa5add35 tương ứng

91

3.22 Ảnh điện di sản phẩm PCR xác định gen Xa4 (a), Xa7 (b), Xa21 (c)

đối với các cá thể BC3F2 của tổ hợp lai Thủ Đô 1/IRBB62 sử dụng

cặp mồi MP1-2, P3, pTA248 tương ứng

92

3.23 Ảnh điện di sản phẩm PCR xác định gen Xa4 (a), Xa7 (b), Xa21 (c)

đối với các cá thể BC3F2 của tổ hợp lai Bắc thơm 7/IRBB62 sử

dụng cặp mồi MP1-2, P3, pTA248 tương ứng

92

3.24 Ảnh điện di sản phẩm PCR gen chất lượng (BADH2 (a), Waxy (b)) ở

các dòng BC3F2 mang đa gen/gen ứng viên bạc lá

96

3.26 Đánh giá lây nhiễm nhân tạo khả năng kháng bệnh bạc lá của các

của các dòng BC3F3 có nền di truyền của giống An Dân 11 (Vụ

Xuân 2017)

101

3.27 Các cá thể BC3F3:4 mang gen ứng viên kháng bệnh bạc lá có nền di

truyền của giống An Dân 11

103

3.29 Đánh giá lây nhiễm nhân tạo khả năng kháng bệnh bạc lá của các

của các dòng BC3F3 có nền di truyền của giống DT39 (Vụ Xuân

2017)

106

3.30 Các cá thể BC3F3:4 mang gen ứng viên kháng bệnh bạc lá có nền di

truyền của giống DT39

110

3.31 Sơ đồ lai tạo của tổ hợp lai Thủ đô 1/Chấn thơm (a) và Thủ đô

1/IRBB62 (b)

111

3.32 Các cá thể BC3F3:4 của các dòng mang gen ứng viên kháng bệnh bạc

lá có nền di truyền của giống Thủ Đô 1

115

3.33 Sơ đồ lai tạo của tổ hợp lai Bắc thơm số 7/IRBB62 (b) 116

3.34 Các cá thể BC3F3:4 của các dòng mang gen ứng viên kháng bệnh bạc

lá có nền di truyền của giống Bắc thơm số 7

119 3.35 Các dòng khảo nghiệm tại Văn Lâm, Hƣng Yên (Vụ Mùa 2017) 124

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Bệnh bạc lá gây ra bởi Xanthomonas oryzae pv oryzae (Xoo) là một trong

những bệnh nghiêm trọng nhất ở lúa, gây thiệt hại đến năng suất của nhiều giống lúa trên khắp thế giới Bệnh bạc lá lúa xuất hiện ở tất cả các giai đoạn phát triển của cây lúa Mức độ nhiễm bệnh cũng như những ảnh hưởng về năng suất tùy thuộc vào giai đoạn phát triển của cây, độ mẫm cảm với mầm bệnh và các yếu tố môi trường Bệnh bạc lá lúa được ghi nhận đầu tiên ở Nhật Bản vào năm 1884 và cho đến nay bệnh đã thành dịch hại ở hầu hết các vùng trồng lúa trên thế giới, đặc biệt là các nước trồng lúa ở Châu Á Bệnh bạc lá lúa có nguy cơ gây hại cả ở vụ xuân và vụ mùa Hiện nay, việc sử dụng các chất hóa học để kiểm soát bệnh bạc lá vẫn chưa có hiệu quả, gây ô nhiễm môi trường, sức khỏe con người và chất lượng nông sản (Khuất Hữu Trung và cs, 2015) Người ta nhận thấy rằng việc tăng cường tính kháng di truyền là phương pháp hiệu quả nhất để kiểm soát bệnh bạc lá lúa Do đó, việc phát triển các dòng/giống lúa mang gen kháng bệnh thông qua các ứng dụng chọn giống phân tử kết hợp với phương pháp chọn giống truyền thống hiện đang là một trong những chiến lược quan trọng để kiểm soát bệnh bạc lá lúa

Ngày nay, nhờ công cụ giải mã hệ gen thế hệ mới, việc giải mã một hệ gen hoàn chỉnh chỉ trong vài ngày cho phép xây dựng cơ sở dữ liệu hệ gen để khai thác một cách hiệu quả các nguồn gen, đặc biệt các nguồn gen lúa hoang dại và lúa bản địa Với sự phát triển mạnh mẽ của tin sinh học, việc phân tích hệ gen, sàng lọc, phát hiện các gen/QTL kháng ngày càng nhiều và nhanh chóng Tính đến nay, các nhà khoa học đã tìm ra được 43 gen kháng bệnh bạc lá ở cây lúa trồng và lúa hoang

dại, trong đó có 27 gen trội và 16 gen lặn (Yogesh et al, 2017; Suk, 2018) Trong số

43 gen đã được tìm thấy thì có 15 gen đã được phân lập, lập bản đồ vật lý và 6 gen

kháng đã được tách dòng, nhân bản và giải trình tự (Basabdatta et al., 2014; Mueen

et al., 2015; Ranjith et al., 2016; Yogesh et al., 2017; Suk, 2018) Các gen kháng

này hoạt động theo cơ chế gen đối gen và là nguồn gen chính để cải tiến di truyền ở

các giống lúa kháng với Xanthomonas Mức độ biểu hiện tính kháng của các gen rất

khác nhau và biểu hiện ở các giai đoạn phát triển khác nhau của cây lúa, những gen chính kháng theo cơ chế hoàn toàn, những gen phụ kháng theo từng phần và được kiểm soát bởi QTL/gen (Khuất Hữu Trung và cs, 2015)

Tuy nhiên, với sự phát triển của các chủng Xanthomonas mới và sự biến đổi

đa dạng quần thể bệnh đã làm phá vỡ tính kháng của nhiều giống lúa (Yogesh et al,

2017) Để kiểm soát sự phá vỡ tính kháng, khuynh hướng quy tụ nhiều gen vào một giống đã được áp dụng và mang lại hiệu quả đáng kể Mặt khác, mỗi gen chính thường chỉ kháng được với một chủng gây bệnh hoặc nòi gây hại nào đó, do vậy nếu quy tụ được vài gen kháng vào một dòng hoặc giống lúa thì sẽ tạo ra được dòng lúa kháng được nhiều chủng gây bệnh hoặc nhiều nòi gây hại, cải thiện tính kháng ngang từ tính kháng dọc, tạo ra tính kháng bền vững và ổn định

Việc phát triển nhanh chóng của các chỉ thị phân tử kết hợp với các chỉ thị chức năng cho phép lai qui tụ nhiều gen kháng một cách chính xác đã mở ra cơ hội mới cho các nhà chọn tạo giống trong việc tạo ra các giống kháng bệnh bạc lá phổ rộng, kháng ở mọi giai đoạn phát triển của cây lúa, kháng bền vững với các nòi gây bệnh Việc chọn tạo các giống lúa mang đa gen với sự hỗ trợ của chỉ thị phân tử (MAS) giúp chọn lọc các cá thể mang các tính trạng mong muốn với độ tin cậy cao,

có thể chọn lọc ở giai đoạn phát triển đầu của cá thể, phân biệt được kiểu gen dị hợp

tử, chọn lọc được các alen lặn và giúp quy tụ được nhiều gen vào cùng một giống, giúp đẩy nhanh sự phát triển các dòng trong chương trình chọn tạo giống (Guvvala

et al, 2013; Pradhan et al, 2015)

Xuất phát từ những lý do nêu trên chúng tôi đã thực hiện nghiên cứu đề tài

“Nghiên cứu tích hợp gen kháng bệnh bạc lá vào một số dòng/giống lúa phục vụ chọn tạo giống” nhằm sử dụng chỉ thị phân tử kết hợp với lai trở lại để nhanh chóng

đưa các gen/gen ứng viên kháng bệnh bạc lá vào các giống lúa ưu tú, phục vụ cho các chương trình nghiên cứu chọn tạo giống lúa và trực tiếp cho sản xuất

2 Mục tiêu nghiên cứu

- Ứng dụng chỉ thị phân tử trong lai trở lại nhằm tích hợp các gen/gen ứng

viên kháng bệnh bạc lá (Xa4, xa5, Xa7, xa13 và Xa21) vào một số dòng/giống lúa

ƣu tú, tạo đƣợc các nguồn vật liệu mang 2-3 gen kháng bệnh bạc lá phục vụ công tác chọn tạo giống lúa;

- Tạo ra dòng triển vọng có năng suất cao, chất lƣợng tốt, có khả năng kháng bền vững với các chủng gây bệnh bạc lá của Việt Nam để phát triển thành giống, đáp ứng đƣợc nhu cầu của sản xuất

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

4 Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu

* Đối tượng nghiên cứu

- Các dòng/giống lúa ƣu tú đang đƣợc trồng phổ biến ở phía Bắc Việt Nam, các giống lúa bản địa, các dòng NIL mang gen kháng bệnh bạc lá nhập nội từ IRRI;

- Cơ sở dữ liệu hệ gen của 36 giống lúa bản địa của Việt Nam và các chỉ thị phân tử có liên quan ứng dụng trong nghiên cứu chọn tạo giống

* Phạm vi nghiên cứu

- Đề tài ứng dụng công cụ tin sinh học để khai thác trình tự hệ gen đầy đủ của các giống lúa bản địa của Việt Nam, xác định đƣợc các gen ứng viên kháng bệnh bạc lá, từ đó thiết kế chỉ thị chức năng để nhận biết các gen mục tiêu, phục vụ cho nghiên cứu tính kháng và công tác chọn tạo giống lúa;

- Đề tài tập trung nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử và lai trở lại để tích hợp nhiều gen kháng bệnh bạc lá vào cùng một giống lúa, nhằm tạo ra nguồn vật liệu kháng bệnh bạc lá, phục vụ cho công tác chọn tạo giống

* Địa điểm và thời gian nghiên cứu

- Thí nghiệm đƣợc triển khai tại: Bộ môn Kĩ thuật Di truyền, Viện Di truyền Nông nghiệp; Viện Bảo vệ Thực vật; Trạm Khảo kiểm nghiệm giống, sản phẩm cây trồng Văn Lâm, Hƣng Yên và Trung tâm Nghiên cứu ứng dụng khoa học kĩ thuật giống cây trồng nông nghiệp Thanh Hóa thuộc Trung tâm Khảo kiểm nghiệm Giống, sản phẩm Cây trồng Quốc gia; khu đồng ruộng thí nghiệm thuộc xã Tây Tựu, Bắc Từ Liêm, Hà Nội; xã Đại Đồng, Thạc Thất, Hà Nội

- Thời gian nghiên cứu: Từ năm 2014 đến năm 2017

5 Những đóng góp mới của đề tài

- Lần đầu tiên ứng dụng công cụ tin sinh học để khai thác trình tự hệ gen đầy đủ

của các giống lúa bản địa của Việt Nam, xác định đƣợc các gen ứng viên xa5 và xa13, từ đó thiết kế các chỉ thị chức năng và ứng dụng chỉ thị phân tử nhằm tích hợp

nhiều gen kháng vào các dòng/giống lúa ƣu tú, phục vụ lai tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá và công tác nghiên cứu tính kháng;

- Tạo ra 10 nguồn vật liệu mang 2-3 gen/gen ứng viên (Xa4+xa5/ Xa4+Xa7/ xa5+Xa7/xa5+xa13/xa5+Xa7+xa13 - có nguồn gốc từ dòng NIL của IRRI) hoặc 2-3 gen ứng viên (Xa4+Xa7/Xa4+Xa21/Xa7+Xa21/Xa4+Xa7+Xa21 - có nguồn gốc từ

các giống lúa bản địa) có khả năng kháng bệnh bạc lá, phục vụ cho công tác chọn tạo giống lúa năng suất cao, chất lƣợng tốt, kháng bệnh bạc lá;

- Tạo ra 01 dòng triển vọng (KTDT18) có năng suất, chất lƣợng, mang 2 gen

ứng viên Xa4+xa5 (có nguồn gốc từ giống lúa bản địa), có khả năng kháng bệnh bạc

lá, để phát triển phục vụ cho sản xuất

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về bệnh bạc lá ở lúa

1.1.1 Lịch sử phát hiện bệnh

Bệnh bạc lá lúa được phát hiện đầu tiên ở Fukuoka - Nhật Bản vào năm

1884 Ban đầu người ta lầm tưởng nguyên nhân gây nên triệu chứng bệnh là do acid đất Nhưng không lâu sau đó, người ta đã công nhận nguyên nhân của nó là do vi khuẩn gây nên Năm 1911, Bokura đã phân lập một loại vi khuẩn và sau khi nghiên

cứu về hình thái và sinh lý đã đặt tên là Bacillus oryzae Năm 1922, Ishiyama đã nghiên cứu sâu hơn về bệnh bạc lá và đã đặt tên lại là Pseudomonas oryzae theo hệ thống Migula Sau nhiều nghiên cứu tiếp theo, người ta đặt tên nó là Bacterium oryzae và sau này là Xanthomonas oryzae Theo sửa đổi của Bộ luật quốc tế về

danh mục vi khuẩn (ICNB), ủy ban phân loại vi khuẩn của Hiệp hội Thực vật Quốc

tế đã thông qua tên Xanthomonas campestris pv oryzae Dye Năm 1990, tác nhân gây bệnh bạc lá đã được phân loại là loài và được đặt tên là Xanthomonas oryzae

pv oryzae (Trích theo Pranamika Sharma et al., 2017)

Xanthomonas oryzae pv oryzae tồn tại chủ yếu trong cây lúa và trên vật chủ là

cỏ dại, đáng chú ý là Leersia oryzoides, Zizania latifolia Leptocholoa chinensis, L panicea và Cyperus rotundis Ở Úc, vi khuẩn được biết là tồn tại trong các loài Oryza hoang dã (O rufipogon và O australiensis) Xoo cũng có thể tồn tại thời gian

ngắn trên hạt bị nhiễm bệnh và trong đất, nhưng chúng chưa được chứng minh là nguồn quan trọng trong việc lây nhiễm mầm bệnh Ở những vùng nhiệt đới, vi

khuẩn cũng có thể tồn tại trong nước tưới (Trích theo Pranamika Sharma et al.,

2017)

Bệnh bạc lá lúa trở nên phổ biến ở tất cả các vùng trồng lúa trên khắp thế giới vào cuối thập kỉ 60 đến đầu thập kỉ 80 của thế kỉ XX, đặc biệt trên các nước trồng lúa ở Châu Á như: Ấn Độ (1990), Philippin (1918), Indonesia (1950), Trung Quốc (1957) Bệnh bạc lá lúa có xu hướng tăng trở lại và gây hại cả ở vụ xuân

(David O N et al., 2006) Hiện nay, bệnh đã gây hại phổ biến ở hầu hết các nước

trồng lúa trên thế giới

1.1.2 Vi khuẩn gây bệnh bạc lá lúa

Vi khuẩn Xanthomonas oryzae thuộc chi Xanthomonas, họ Pseudomonadaceae, bộ Eubacteriales, lớp Schizomycetes (Eubacteria)

Tuy nhiên hệ thống phân loại này còn có nhiều tiêu chí chưa được nghiên cứu đầy đủ nên hệ thống chưa có được sự thống nhất toàn diện Trong những năm gần đây, phân loại vi khuẩn hiện đại dựa trên các nghiên cứu và phân tích trực tiếp cấu trúc ADN Các cá thể, các isolate khác nhau nhưng cùng một loài sẽ có cấu trúc

di truyền tương tự nhau Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng, hàm lượng các nucleotit G+C đặc trưng cho mỗi loài và được sử dụng làm 1 trong những chỉ tiêu phân loại Theo đó, các kết quả nghiên cứu cũng cho thấy hàm lượng G+C của những loài

trong chi Erwinia là 50-54%; Corynebacterium là 54-55%; Pseudomonas là 63%; còn ở Xanthomonas là 63-69% (Vũ Triệu Mân, 2007)

58-Trong hệ thống phân loại, Xanthomonas bao gồm 3 loài là X Oryzae pv oryzae, X Axonopodis pv citri, và X Campestris pv campestris Hệ gen của Xanthomonas oryzae pv oryzae (gọi tắt là Xoo) có chiều dài xấp xỉ 5 triệu bp

(4.940.217 bp), trong đó thành phần G+C chiếm 63,72% và vùng mã hoá protein

chiếm tới 84,12% (Ochiai et al., 2005) Về đặc tính gây bệnh của vi khuẩn, các nghiên cứu chỉ ra rằng có 3 nhóm gen đó là: nhóm hrp, avr và hrpX

- Nhóm gen hrp mã hoá cho hệ thống các enzyme tiết, có chức năng chuyển các protein thụ thể vào tế bào cây chủ Ở Xanthomonas oryzae pv oryzae, nhóm

này bao gồm 27 gen khác nhau

- Nhóm gen avr đóng vai trò quyết định sự đặc hiệu ký sinh - ký chủ Chúng

mã hoá ra các yếu tố tạo nên độc lực của vi khuẩn, giúp vi khuẩn ký sinh, gây bệnh

Xanthomonas oryzae pv oryzae bao gồm 17 bản copy các thành viên của họ gen avrBs3/pth, một kiểu gen chính avr được định vị trên 7 vùng khác nhau của hệ gen

- Nhóm gen HrpX: Ở cả 3 loài thì sự biểu hiện của nhóm gen hrp và avr đều phụ thuộc vào sản phẩm của gen hrpG và hrpX Một vài gen HrpX có sự đồng nhất

về trình tự (TTCGC-N15-TTCGC), người ta đặt tên cho nó là đoạn PIP box Vì vậy

PIP box là đặc điểm để phân loại các gen HrpX Ở loài Xoo, các nghiên cứu đã tìm

thấy có 37 bản copy hoàn chỉnh hoặc gần hoàn chỉnh của đoạn PIP box trong vùng khởi đầu phiên mã của các gen, 5 trong số các gen đó nằm trong vùng của nhóm

gen hrp, còn lại thì nằm rải rác khắp bộ genom của vi khuẩn Họ gen avrBs2 có ở cả

3 loài, họ gen avrBs1 chỉ tìm thấy ở X.campestis pv campestris, còn họ gen avrBs3/pth xuất hiện phổ biến ở loài X Oryzae pv Oryzae (NIAS, 2010) Ở loài X Axonopodis pv citri thì những gen avr đều nằm trên plasmid Còn ở loài X Oryzae

pv oryzae có 1 gen là thuộc họ gen avrBs2, còn lại đa số thuộc họ gen avrBs3 và nằm trong cấu trúc hệ gen của vi khuẩn Ví dụ nhƣ avrxa5 thuộc nhóm avrBs3, avrXa7 cũng là một thành viên của họ gen avrBs3 AvrXa7 có đặc trƣng là chứa trình tự lặp ở vùng trung tâm Đoạn sợi kép của avrXa7 rất giàu trình tự T Nếu xảy

ra đột biến ở vùng kết thúc có chứa trình tự CCC thì AvrXa7 sẽ trở thành avrXa7 (tức là gen gây độc) AvrXa21 muốn hoạt động đƣợc đòi hỏi sự có mặt của các gen raxA, raxB, raxC, những gen mã hoá cho các thành phần của hệ thống bài tiết Trong khi đó với loài Xanthomonas campestris pv campestris thì avrXa21 chỉ hoạt động khi có gen raxA và raxST, mã hoá ra enzym sulfotransferase Sự biểu hiện của các gen rax lại phụ thuộc vào mật độ chủng cũng nhƣ các gen rax chức năng khác

1.1.3 Các chủng sinh lý trên thế giới và ở Việt Nam

Một đặc điểm cơ bản của vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv Oryzae là chủng

có khả năng đột biến tạo thành một quần thể rộng gồm nhiều nhóm chủng Mỗi vùng sản xuất có thể có nhiều chủng vi khuẩn gây bệnh có độc tính khác nhau (Nguyễn Thị Liên và cs, 2012) Vi khuẩn bạc lá rất phong phú và đa dạng về thành phần nòi Các nghiên cứu để phân chia các nòi thành các chủng sinh lý đều dựa trên độc tính gây bệnh của chúng trên các giống lúa khác nhau Tuy nhiên, mỗi quốc gia lại gieo trồng các giống khác nhau vì thế để phân nhóm và so sánh các chủng sinh

lý giữa các quốc gia, các nhà khoa học của Viện Nghiên cứu lúa Quốc tế (IRRI) và Nhật Bản xây dựng nên hệ thống các dòng lúa phục vụ cho mục đích này Hệ thống này bao gồm các dòng cận đẳng gen (NIL) đƣợc tạo ra dựa vào việc lai chuyển các gen kháng bệnh bạc lá vào nền gen của 3 giống IR24, Toyonishiki và Milyang 23

(NIAS, 2010) Các dòng NIL này được dùng để phân nhóm các chủng vi khuẩn bạc

lá Ngoài ra, các dòng NIL còn là nguồn cho gen kháng

Đã có hơn 30 nòi Xanthomonas oryzae pv Oryzae (Xoo) đã được báo cáo,

Tuy nhiên, các chủng khác nhau không được xác định một rõ ràng có phản ứng đặc

hiệu với giống lúa nào (Trích theo Pranamika Sharma et al., 2017)

Ở Nhật Bản, nghiên cứu nòi vi khuẩn bạc lá được tiến hành từ năm 1957, khi phát hiện thấy giống Aisacase kháng bệnh trở nên nhiễm bệnh Họ đã xác định được

ở Nhật Bản có 5 nhóm nòi vi khuẩn Phillipin đã xác định được 6 nhóm nòi và ở Indonesia có 9 nhóm nòi

Ở Việt Nam, những nghiên cứu bước đầu về thành phần nòi vi khuẩn gây bệnh bạc lá đã được Tạ Minh Sơn (1987) nghiên cứu và cho thấy: Vi khuẩn bạc lá

có 4 nhóm nòi phổ biến nhất Nhóm I tập trung ở các tỉnh đồng bằng Bắc Bộ Nhóm

II tập trung ở các tỉnh đồng bằng Nam Bộ Nhóm III và nhóm IV phân bố rải rác trong cả nước So với thành phần nòi ở Nhật Bản thì nòi tìm thấy ở Việt Nam khác hẳn Một số nhóm nòi ở Philippin và Indonesia đều tìm thấy ở Việt Nam Nhóm II ở Việt Nam tương tự như nhóm IV của Philippin, nhóm IV ở Việt Nam tương tự nhóm I ở Philippin hay nhóm B ở Indonesia Như vậy, thành phần nhóm nòi ở Việt Nam thể hiện đa dạng và phức tạp hơn ở các quốc gia khác (Tạ Minh Sơn, 1987) Gần đây, tác giả Phan Hữu Tôn (2004) khi nghiên cứu về bệnh bạc lá ở 15 tỉnh

miền Bắc đã nhận thấy các nhóm chủng Xoo thường xuất hiện đan xen, ở một địa

phương có thể xuất hiện nhiều nhóm chủng, trái lại một nhóm chủng có thể hiện diện ở nhiều địa phương Trên một vết bệnh đôi khi có thể tồn tại một hoặc một số chủng vi khuẩn nhất định (Phan Hữu Tôn, 2004)

Khi nghiên cứu về thành phần nhóm nòi vi khuẩn gây bệnh bạc lá ở vùng đồng Bằng Sông Hồng, tác giả Lưu Văn Quyết (1999) đã xác định có 7 nhóm nòi dựa trên phản ứng của các isolate được thu thập với bộ giống chuẩn nòi quốc tế bao gồm nhóm I đến nhóm VII Trong 7 nhóm nòi trên, nhóm I gây nhiễm với các giống DV85, Zenith, BJ1, Nigeria và IR20 Nhóm II gây nhiễm với các giống Kuntlan, IR1545, Chugoku, IR346, IR8, Tẻ Tép, Cas209, IR24, Milyang46 và Kinmaze

Nhóm III gây nhiễm trên các giống IR1545, Chugoku, Kogyoku, IR346, IR8, Tẻ Tép, Cas209, IR24, Milyang46 và Kinmaze Nhóm IV gây nhiễm trên các giống Kogyoku, IR346, IR8, Tẻ Tép, Cas209, IR24, Milyang46 và Kinmaze Nhóm V gây nhiễm trên các giống IR346, IR8, Tẻ Tép, Cas209, IR24, Milyang46 và Kinmaze Nhóm VI nhiễm trên giống Chugoku, IR24, Milyang46 và Kinmaze Dựa trên cơ sở phản ứng của các isolate đƣợc thu thập từ các vùng sinh thái khác nhau đối với các

dòng cận đẳng gen có nền chung là IR24 có chứa gen kháng là Xa1 Bùi Trọng

Thủy và Phan Hữu Tôn (2003) cũng đã phân lập 64 isolate thành 10 chủng khác nhau: kiểu 1, kiểu 2A, 3B, 3A, 3B, 4, 5A, 5B, 6,7,8, 10 Các tác giả cũng phân tích

và cho biết kiểu 2 (A‟, A và B) phổ biến hầu hết các vùng trồng lúa với 73,8%, các chủng còn lại tùy vùng sinh thái mà tồn tại hoặc không Theo kết quả nghiên cứu

của Bùi Trọng Thuỷ (2004) các gen đơn trội Xa7, Xa21 và gen lặn xa5 có phản ứng kháng (R), kháng vừa (M) với tất cả 10 chủng vi khuẩn X oryzae gây bệnh bạc lá ở miền Bắc Việt Nam Đây là ba gen Xa - gen kháng rất có ý nghĩa trong việc sử dụng lai tạo, chọn lọc các giống lúa kháng bệnh bạc lá Gen Xa4 kháng đƣợc các chủng Y3, Y4, Y5 và Y7 Gen Xa3 có phản ứng kháng (R) chủng Y1 Gen Xa10 kháng

đƣợc chủng Y2 và kháng vừa (M) chủng Y3 Sau đó, tác giả Bùi Trọng Thủy và

cộng sự đã xác định đƣợc 12 nhóm nòi vi khuẩn X.oryzae có mặt ở miền Bắc Việt

Nam đồng thời xây dựng đƣợc bảng chuẩn thể hiện phổ phản ứng kháng, nhiễm của

12 dòng cận đẳng gen với 12 nòi đó (Bùi Trọng Thủy và cs, 2007) Từ năm

2006-2007, một số nhà khoa học đã phân lập đƣợc 41 isolate vi khuẩn gây bệnh bạc lá ở các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long và phân vào 6 nhóm nòi; qua lây nhiễm nhân tạo

đã xác định đƣợc gen xa5 kháng hiệu quả với nòi B, C, E và F, gen xa13 kháng hiệu quả với nòi A, gen Xa21 kháng hiệu quả với nòi A, C, D và F (Dinh D.H et al.,

2008) Đến năm 2008, Nguyễn Văn Viết và cộng sự đã xác định đƣợc 13 nhóm chủng sinh lý của vi khuẩn gây bạc lá hiện diện ở các vùng trồng lúa miền Bắc Việt Nam (Nguyễn Văn Viết và cs, 2008)

Ở Việt Nam, có khoảng 84 chủng Xoo đã đƣợc chọn lọc, phân lập ở các tỉnh

miền bắc và đƣợc phân loại vào 4 nhóm nòi G1, G2, G3 và G4 Hầu hết các chủng

thuộc nhóm nòi G2 và G3 Gen Xa21 kháng trung bình với 84 chủng vi khuẩn này (Furuya et al., 2012) Tuy nhiên, theo tác giả Nguyễn Thị Huệ và cộng sự nghiên cứu thì nhận thấy Xa21 (dòng IRBB21) mẫn cảm với chủng 1035.HUA10153, điều này chứng tỏ độc tính của các nòi Xoo ở miền bắc Việt Nam đã thay đổi (Hue T N.,

et al., 2018)

Năm 2016, tác giả Lưu Văn Quyết và cộng sự, đã phân lập và đánh giá các

isolate vi khuẩn Xanthomonas oryzae ở các tỉnh phía bắc và đã xác định được các

isolate này thuộc 3 nhóm nòi, đó là: nhóm nòi I là isolate phân bố ở Yên Đồng - Ý Yên - Nam Định, nhóm nòi II là các isolate phân bố ở Bắc Giang, Hà Nội, Hòa Bình, Hải Dương, Nghệ An và nhóm nòi III là các isolate phân bố ở Hải Dương, Thanh Hóa Trong đó nhóm II có độc tính mạnh và phổ xuất hiện rộng hơn nhóm I

và III (Lưu Văn Quyết và cs, 2016)

Năm 2018, một nhóm nghiên cứu đã tiến hành lây nhiễm 37 giống lúa bản địa của Việt Nam với 10 chủng vi khuẩn gây bệnh bạc lá thu thập ở các tỉnh phía bắc đã

xác định được các giống có gen Xa4 kháng với 6/10 chủng lây nhiễm, các giống có gen xa5 kháng với 9/10 chủng lây nhiễm và các giống có gen Xa7 kháng với 8/10

chủng lây nhiễm, các giống này có phản ứng kháng tương tự như các dòng IRBB4,

IRBB5 và IRBB7 tương ứng của IRRI (Thanh T et al, 2018)

Điều đó chứng tỏ thành phần các chủng nòi sinh thái ở miền Bắc Việt Nam rất

đa dạng và phong phú

1.2 Tổng quan về gen kháng và bản chất của gen kháng bệnh bạc lá

Đã có rất nhiều nghiên cứu liên quan đến việc chẩn đoán, quản lý và kiểm soát bệnh bạc lá lúa Tuy nhiên, người ta nhận thấy rằng việc tăng cường tính kháng

di truyền là phương pháp hiệu quả nhất để kiểm soát bệnh bạc lá lúa Theo số liệu cập nhật nhất hiện nay, các nhà khoa học đã xác định được 43 gen kháng bệnh bạc

lá từ Xa1 đến Xa42 kháng các chủng Xoo khác nhau, trong đó có 27 gen trội và 16

gen lặn (bảng 1.1) Trong số đó thì có 10 gen được tìm thấy kháng đặc hiệu với nòi

(xa5, xa8, xa9, xa13, xa24, xa25(t), xa26(t), xa28(t), xa33(t) và xa34(t)), 3 gen được gây ra bởi đột biến và có phổ kháng rộng (xa15, xa19 và xa20) Các gen kháng này

được xác định từ các loài lúa trồng, quần thể lúa đột biến và các loài lúa dại (Suk et al., 2015; Busungu et al., 2016; Suk, 2018) Các gen kháng được xác định nằm rải

rác trên các nhiễm sắc thể (NST) khác nhau (trừ NST số 9 và 10) Trong đó nhiễm

sắc thể 11 chứa 14 gen (Xa3/Xa26, Xa4, Xa6, xa9, Xa10, Xa21, Xa22, Xa23, Xa30(t), Xa32(t), Xa35(t), Xa39, Xa40 và xa44(t)) Một số gen chưa xác định được

vị trí, đó là: xa15, Xa16, Xa17, Xa18, xa19, xa20, xa26(t), xa28(t), Xa34(t), Xa36(t), Xa38 và Xa41(t) 15 gen đã được phân lập và lập bản đồ vật lý (mapping) đó là: Xa1, Xa2, Xa12, Xa14 và Xa25 (trên nhiễm sắc thể số 4); xa5 (trên nhiễm sắc thể số 5); Xa7 (trên nhiễm sắc thể số 6); xa13 (trên nhiễm sắc thể số 8); Xa3, Xa4, Xa10, Xa21, Xa22, Xa23 và xa44(t) (trên nhiễm sắc thể số 11) Các gen kháng này hoạt

động theo cơ chế gen đối gen và là nguồn gen chính để cải tiến di truyền ở các

giống lúa kháng với Xanthomonas (Basabdatta et al., 2014) 6 gen kháng đã được tách dòng, nhân bản và giải trình tự là Xa1, xa5, xa13, Xa21, xa26 và Xa27 (Mueen

et al., 2015; Ranjith et al., 2016; Yogesh et al., 2017; Suk, 2018)

Gen trội Xa4 được sử dụng rộng rãi trong chương trình chọn giống lúa kháng

bệnh bạc lá ở Châu Á Ở Trung Quốc, hầu hết các dòng lúa lai thương mại và các

giống lúa indica truyền thống đều chứa vùng gen Xa4 Gen trội Xa4 kháng chủng 1

của Philipin và được xác định ở các giống lúa TKM6, IR20, IR22 và IR72) Năm

2001, Wang và cộng sự đã xác định locus Xa4 được định vị giữa 2 chỉ thị G181 và L1044 ở khoảng cách 4,4 và 3,8 cM tương ứng Sau đó, gen Xa4 được lập bản đồ di

truyền ở vùng ít hơn 1 cM trên nhiễm sắc thể số 11 ở quần thể IRBB4 và IR24 (Sun

et al., 2003)

Gen xa5 là một trong những gen lặn mà có khả năng kháng đặc hiệu với

nhiều chủng vi khuẩn gây bệnh bạc lá, kháng chủng 1, 2, 3 và 5 của Philipin (Iyer

và McCouch, 2004; Suh et al., 2013) Gen này được tìm thấy ở đầu cuối đoạn ngắn

của nhiễm sắc thể số 5 và một số nhà nghiên cứu đã tìm thấy các chỉ thị phân tử liên

kết chặt với gen xa5 (Singh et al., 2001) Năm 2003, Matthew và cộng sự đã lập bản

đồ di truyền có độ phân giải cao vùng xung quanh gen xa5 với 44 chỉ thị ADN ở

đầu cuối nhiễm sắc thể số 5 Tác giả đã lập bản đồ dựa trên việc sàng lọc PCR 1016

cá thể của quần thể F2 bắt nguồn từ tổ hợp lai IRBB5 x IR24, trong đó IRBB5 là

dòng NIL cho gen xa5 Gen xa5 được lập bản đồ ở khoảng cách 0,5cM giữa 2 chỉ thị RS7 và RM611, kéo dài khoảng 70kb và chứa 11 khung đọc mở (Matthew et al., 2003) Gen xa5 cũng đã được nhân dòng và xác định là mã hóa cho tiểu đơn vị gamma nhân tố phiên mã IIA (TFIIAγ) Ở alen kháng xa5 có sự thay thế 2 bp ở

exon thứ 2 dẫn đến sự thay đổi trình tự axít amin từ valine thành glutamiate ở vị trí

39, vì vậy gây rối loạn chức năng của các yếu tố phiên mã và tăng cường tính kháng

với Xanthomonas ở tất cả các giống có gen xa5 ở trạng thái đồng hợp (Iyer và

McCouch, 2004).

Xa7 là gen kháng đồng trội, kháng trực tiếp với các chủng Xoo, và kết hợp cùng với gen xa5 tăng hiệu lực, kháng cao với chủng Z-173 ở Trung Quốc (Wang et al., 2005) Xa7 định vị trên NST số 6 và ban đầu được xác định trong giống lúa

DV85 Gen kháng ở giai đoạn ra trỗ, và kháng mạnh nhất với chủng bạc lá ở

Indonesia (Kadir et al., 2004) và biểu hiện tính mẫn cảm thấp với chủng bạc lá của Hàn Quốc (Jena et al., 2007) Năm 2003, Porter và cộng sự đã nghiên cứu về chỉ thị AFLP, SSR và STS để lập bản đồ gen Xa7 và xác định được Xa7 định vị tại vị trí

107,3 cM trên bản đồ RGP Sau đó, bản đồ độ phân giải cao và dự đoán di truyền

của gen kháng Xa7 đã được được báo cáo bởi Chen và cộng sự, 2008 Gen Xa7 đã

được lập bản đồ ở vị trí 0,21cM khoảng giữa chỉ thị STMS (GDSSR02) và SSR

(RM20593) (Chen et al., 2008)

Gen xa13 là gen lặn hoàn toàn, chỉ kháng ở trạng thái đồng hợp Gen này đặc biệt kháng với nòi có độc tính mạnh nhất là nòi 6 của Philippin Gen xa13 tiên được

phát hiện đầu tiên trong giống lúa BJ1 và được lập bản đồ trên nhiễm sắc thể 8 Gen

xa13 tương tác mạnh với các gen kháng khác như xa5, Xa4 và Xa21 Các nghiên

cứu biểu hiện gen ở quy mô nhỏ và các phân tích thư viện cDNA không tính đến sự mẫn cảm với mầm bệnh đã cho thấy rằng một số gen đáp ứng với việc phòng vệ đã

kích hoạt trong kháng thể trung gian xa13 không liên quan đến tính kháng mà thông qua 1 cách gián tiếp bởi gen kháng đồng trội (Xa4, Xa10 và Xa26) (Chu et al., 2004) Kết quả cho thấy rằng chức năng của xa13 khác với các gen kháng khác

trong việc khởi tạo ra phản ứng kháng với Xoo Tác giả Chu (2006) báo cáo bản đồ vật lý của xa13 tại đoạn DNA 14,8kb Vị trí của xa13 được xác định ở giữa 2 chỉ thị

RFLP là RG136 và S14003 Chỉ thị E6a (CAPS) được lập bản đồ giữa locus RG136 trong vùng 1,6 và 0,4 cM giữa E6a và S14003, tương ứng Bản đồ vật lý bao phủ khu vực bên sườn bởi chỉ thị E6a và S14003, đã được xây dựng bởi nhiễm sắc thể sử dụng dòng clone Minghui 63 BAC Những kết quả này là cơ sở để phân

xa13-lập và phân tích đặc điểm của gen xa13 và đặc tính của gen này Sau đó, gen xa13

đã được nhân dòng và một loạt các đoạn thêm, bớt (InDels) trong vùng promoter của gen ứng viên Os8N3 được phân tích đặc điểm liên quan đến chức năng của gen

(Chu et al., 2006) Sự biểu hiện của allele trội của gen, ví dụ như Xa13, mã hoá nhân tố vận chuyển đường có tên là Os8N3, thường mẫn cảm với các chủng Xoo

tương thích mà có mang yếu tố kích hoạt phiên mã pthXo1, liên kết với promoter

của Os8N3 để kích thích sự biểu hiện của gen (Yuan et al., 2009) Ở các kiểu gen lúa mang gen allele lặn xa13 thì pthXo1 không thể liên kết với promoter của Os8N3

do các đoạn InDels và do đó không thể tạo ra nhân tố vận chuyển đường để thiết lập

lây nhiễm (Antony et al., 2010) Gen xa13 mã hóa cho protein màng plasma của họ

protein MtN3/saliva, biểu hiện tính kháng lặn với chủng PXO99 và đã được sử

dụng rộng rãi trong các chương trình cải tiến giống lúa kháng bệnh (Yogesh et al.,

2017)

Gen kháng đầu tiên đã được tách dòng là Xa21, đây là gen có phổ kháng

rộng và đã được sử dụng nhiều nhất trong chương trình nhân giống lúa Gen này

khác với các gen kháng bệnh bạc lá đã biết và được gọi là gen Xa21(t) Phân tích di truyền và vật lý của Xa21 được xác định ở khoảng cách 8,3cM trên nhiễm sắc thể

số 11 và khoảng cách vật lý của vùng chứa gen Xa21 là khoảng 800kb Các phân tích hệ gen cho thấy gen Xa21 thuộc họ đa gen chứa ít nhất 8 thành viên Hầu hết

các thành viên trong họ này được lập bản đồ trên nhiễm sắc thể số 11, mà liên kết

với ít nhất 9 gen kháng chính và một QTL (Ronald et al., 1992) Xa21 là kiểu gen

chứa các thụ thể kinase lặp lại giàu leucine và có phổ kháng rộng, kháng được nhiều

chủng Xoo so với các gen kháng khác Gen Xa21 đã được tích hợp thành công hoặc

đơn lẻ hoặc kết hợp với các gen Xa4, xa5 và xa13 vào một số giống lúa ƣu tú và lúa

lai trên toàn thế giới, tạo ra tính kháng ổn định của các giống lúa mang tổ hợp các

gen này (Yogesh et al., 2017)

Bảng 1.1 Tổng hợp các gen kháng đã được xác định ở các giống lúa

TT Gen kháng Vị trí xác định Nguồn kháng Nguồn cho gen Nguồn gốc Nòi kháng

2 Xa2 NST số 4 Indica IRBB2 Việt Nam Nòi II của Nhật

Bản

3 Xa3/ Xa26 NST số 11 Japonica

Wase Aikoku 3, Minghui 63, IRBB3

Nhật Bản

Nòi của Nhật Bản, Trung Quốc, Philippin

4 Xa4 NST số 11 Indica TKM6, IRBB4 Ấn Độ Nòi I của

và Sateng Lào Nòi Philipin

10 Xa10 NST số 11 - Cas 209 Xê-nê-gan Nòi Philippin,

Nhật Bản

11 Xa11 NST số 3 Indica IR8 Philippin Nòi IB, II, IIIA, V của Nhật Bản

12 Xa12 NST số 4 Japonica Kogyoku,

Nòi V của Indonesia

13 xa13 NST số 8 - BJ1, IRBB13 Ấn Độ Nòi 6 của

Bản

Triều Tiên

Nòi của Nhật Bản

TT Gen kháng Vị trí xác định Nguồn kháng Nguồn cho gen Nguồn gốc Nòi kháng

Japonica

IR24, Miyang23, Toyonishiki

Philippin, Nhật Bản Nòi của Myanma

XM5 (là dòng đột biến của IR24)

Bản

XM6 (là dòng đột biến của IR24)

Nòi của Nhật Bản

21 Xa21 NST số 11

Loài lúa hoang dại

chi Oryza

O nata, IRBB21

longistami-Châu Phi, Mali

Nòi của Nhật Bản và Philippin

22 Xa22(t) NST số 11 - Zhachanglong Trung

chi Oryza

O rufipogon

(CBB23)

Trung Quốc/

phuchia

Cam-Nòi của Indonesia

Băng-la-đét

Nòi của Trung Quốc và Philippin

Trung Quốc

Nòi của Trung Quốc và Philippin

26

xa26(t) - Indica Nep Bha Bong

Trung Quốc Nòi của Philippin

27 Xa27(t) NST số 6

Loài lúa hoang dại

chi Oryza

O minuta

IRGC 101141, IRBB27

Philippin

Chủng của Trung Quốc và nòi 2-6 của Philippin

28 xa28(t) - Indica Lota sail Băng-la-đét Nòi 2 của Philippin

29 Xa29(t) NST số 1

Loài lúa hoang dại

chi Oryza

O rufipogon

(Y238) Ấn Độ Nòi Indonesia

TT Gen kháng Vị trí xác định Nguồn kháng Nguồn cho gen Nguồn gốc Nòi kháng

31 Xa31(t) NST số 4 Japonica Zhachanglong Trung

chi Oryza

Oryza australiensis

(dòng tích hợp C4064)

- Nòi của Philippin

33 Xa33 NST số 6

Loài lúa hoang dại

35

xa34(t) NST số 1 Indica Pin Kaset

Sri Lanka Nòi của Thái Lan

36 Xa35(t) NST số 11

Loài lúa hoang dại

Nòi của Hàn Quốc

42

Xa42

NST số 3

XM14 (là dòng đột biến của IR24)

(Nguồn Kou et al., 2013, Mueen A K et al., 2014; *: Zhang F et al., 2015; **: Suk

M K et al., 2015; Yogesh et al., 2017, ***: Suk-Man Kim, 2018)

Ghi chú: (-): chưa xác định

Vào những năm 80 và 90, gen Xa3 và Xa4 là nguồn gen chính sử dụng trong chọn tạo giống lúa Japonica và Indica tương ứng Hiện nay, các gen xa5, Xa7, Xa21

và Xa23 đang được sử dụng rộng rãi trong việc cải tiến các giống lúa kháng bệnh bạc lá Gen xa5 là gen lặn, nó biểu hiện tính kháng ở tất cả các giai đoạn Gen Xa21

và Xa23 là các gen có phổ kháng rộng, Xa21 tăng cường tính kháng từ giai đoạn mạ đến giai đoạn trưởng thành (Xia Chun et al., 2012)

Song song với việc phát hiện ra các gen kháng bệnh bạc lá, các nhà nghiên cứu cũng đã tìm hiểu về bản chất của các gen kháng, cơ chế kháng của nó và đã chỉ ra rằng:

- Các gen khác nhau có phổ kháng rộng hay hẹp khác nhau với các nòi Xoo

khác nhau Qui tụ nhiều gen kháng, cho khả năng kháng tốt hơn và bền vững hơn so

với dòng/giống đơn gen kháng (Salgotra et al., 2012)

- Bản chất của gen kháng khác nhau biểu hiện mức độ kháng khác nhau, theo

cơ chế gen - protein - kháng khác nhau; những gen chính kháng theo cơ chế hoàn toàn, những gen phụ kháng theo từng phần và được kiểm soát bởi QTL

- Thành phần alen khác nhau biểu hiện kháng khác nhau, Xa3/Xa26 kháng hiệu quả hơn Xa3/Xa26-2 và Xa3/Xa26-3

- Các giống có nền di truyền khác nhau biểu hiện mức độ kháng khác nhau với

cùng một gen kháng: Mức độ kháng của gen Xa3, Xa26 và Xa22 (t) khác nhau ở lúa Japonica và Indica; gen Xa7 kháng hiệu quả với nhiều giống lúa nhưng lại không hiệu quả với những giống lúa thơm, trong khi đó Xa4 lại hiệu quả với những giống lúa thơm (Ullah et al., 2012)

- Cùng một gen kháng khả năng kháng khác nhau ở các giai đoạn phát triển

khác nhau của cây lúa: Xa10 kháng hiệu quả ở giai đoan mạ non, Xa7 kháng hiệu quả ở giai đoạn sau 21 ngày tuổi; các gen Xa1, Xa3, Xa21 và Xa27 kiểm soát tính kháng ở giai đoạn nở hoa và giai đoạn sau; các gen Xa4 và xa5, xa13 và Xa23 kháng ở mọi giai đoạn phát triển của cây lúa (Yong et al., 2012)

Như vậy, bản chất của gen kháng, sự tương tác giữa gen kháng và cây lúa, các nhân tố ảnh hưởng đến chức năng của gen kháng và cơ chế điều hòa của gen kháng

là cơ sở rất quan trọng để xác định việc quy tụ nhóm gen kháng tương tác hiệu quả

và bền vững Việc phân loại gen kháng phổ rộng - hẹp, phân loại kháng theo các giai đoạn phát triển của cây lúa và bản chất gen - protein và cơ chế kháng cùng với

việc phân loại nền di truyền của giống cho/nhận là vô cùng quan trọng để định hướng, chọn lọc dòng cho gen, dòng nhận gen với nền di truyền phù hợp tạo các dòng cận đẳng gen ưu tú và từ đó tích hợp lại để tạo giống siêu kháng bệnh bạc lá

1.3 Chỉ thị phân tử và vai trò của chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống cây trồng

1.3.1 Vai trò của chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống cây trồng

Chỉ thị phân tử hay chỉ thị di truyền là các dấu hiệu hoặc các đặc trưng có tính phân biệt giữa các cá thể dựa trên sự khác biệt về trình tự gene của mỗi sinh vật Chỉ thị phân tử thường là các đoạn DNA ngắn đã biết vị trí trên nhiễm sắc thể

và đoạn DNA này liên kết chặt với tính trạng đang khảo sát

Việc phát triển và sử dụng các chỉ thị phân tử có vai trò quan trọng trong lai tạo và chọn giống ở thực vật, đặc biệt là việc phát hiện và phân tích các QTLs (quantitative trait loci) và vị trí của chúng trên bản đồ liên kết; nhân dòng các gen cho những tính trạng nhất định dựa trên bản đồ liên kết phân tử; quy tụ gen; việc chọn lọc dựa trên chỉ thị phân tử (Marker assisted selection (MAS)); việc xác định

và phân tích đa dạng di truyền và phân tích cấu trúc hệ gen Khi được ứng dụng trong chương trình lai tạo và chọn giống, các chỉ thị phân tử cho phép đẩy nhanh quá trình tích hợp các gen mà chi phối tính đa hình của tính trạng và cung cấp thông tin đáng tin cậy về quan hệ họ hàng và quan hệ phát sinh chủng loại giữa các loài Việc áp dụng rộng rãi các chỉ thị trong lai tạo giống cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật và công nghệ cho thấy ngày càng có nhiều chỉ thị phân tử được phát triển để phục vụ cho công tác chọn tạo giống Rất nhiều loại chỉ thị đã được phát triển như: RFLP, RAPD, AFLP, SSR, SSLP, SNP Những chỉ thị này rất khác nhau

về độ phân giải, độ bao phủ hệ gen và mức độ liên kết với tính trạng quan tâm Mặt khác, nhà chọn giống cũng quan tâm đến những đặc điểm như: mức độ đơn giản của việc thiết kế các thí nghiệm, các yêu cầu về kỹ năng đặc biệt sử dụng trong lai tạo (Ranade và Yadav, 2014)

Các chỉ thị chức năng đã thiết kế dựa vào các trình tự mã hóa của các gen khác nhau

như xa5 (Iyer và McCouch 2004), xa13 (Chu et al., 2006) có thể tăng cường độ tin

cậy của việc chọn lọc nhờ chỉ thị phân tử Ngoài ra, các chỉ thị liên kết chặt với gen

Xa4 (Ma et al., 1999; Sun et al., 2003), Xa7 (Porter et al., 2003; Taura et al., 2004)

và Xa21 (Ronald et al., 1992) đã được sử dụng để sàng lọc nguồn gen kháng, phục

vụ cho việc chọn tạo các giống có đa gen kháng (Ullah et al., 2012, Ruisen et al.,

2016)

Trong những năm gần đây, với sự gia tăng về dữ liệu trình tự hệ gen, các đa hình đơn nucleotit (SNP) và sự đa dạng trong cấu trúc hệ gen đã được dùng để phát triển những chỉ thị có độ tin cậy cao Sự phát triển của những chỉ thị với mật độ dày đặc cũng như việc xác định trình tự nucleotit của cả hệ gen của nhiều cây có quan

hệ họ hàng gần gũi cho phép so sánh những chỉ thị, so sánh hệ gen, và sự phân bố của những chỉ thị này trong khắp hệ gen (Ranade và Yadav, 2014)

1.3.2 Các chỉ thị phân tử DNA dùng phổ biến trong lai tạo và chọn giống

* Các SSR (trình tự lặp đơn giản)

Phân tích trình tự bộ gen lúa hoàn chỉnh giúp nhận diện được 10/1000 mục tiêu mới cho các chỉ thị phân tử DNA, đặc biệt là các SSR Sử dụng các clone PAC/BAC có sẵn, các nhà khoa học đã công bố hơn 2200 SSR có giá trị vào năm

2002 Đến năm 2004 là 3.225 SSR Sau khi hoàn tất bản đồ hệ gen lúa Nipponbare thì người ta tìm thấy thêm 18.828 SSR lớp I (lặp lại 2, 3, 4 lần) Con số này lớn hơn rất nhiều số các SSR đã công bố của bất kỳ loại cây lương thực nào Sự phong phú của các SSR (khoảng 51 SSR trên 1 Mb) sẽ là nguồn tài nguyên đáng kể cho việc xây dựng bản đồ và MAS (quá trình chọn lọc giống được chỉ thị trợ giúp) cho rất nhiều ứng dụng Hiện tại nhiều phòng thí nghiệm được trang bị tốt cho các phân tích SSR, các SSR vẫn tiếp tục là các chỉ thị được lựa chọn sử dụng trong những

năm tới (Cordeiro et al., 2002)

* Các SNP (đa hình nucleotit đơn)

Các đa hình nucleotit là loại đa hình có nhiều và có khắp nơi ở tất cả các sinh vật, và nhiều nhà nghiên cứu cho rằng những chỉ thị này sẽ là sự lựa chọn trong tương lai Ở họ lúa, các SNP có thể được dễ dàng nhận diện bằng cách so sánh trực tiếp bộ gen Nipponbare và 93-11, hoặc bằng cách sắp thẳng hàng trình tự với một hay hai trình tự tham khảo từ các dữ liệu trình tự sẵn có Gần đây, nhiều dữ liệu

SNP có sẵn được tạo ra nhờ so sánh các trình tự theo cặp của các kiểu gen khác nhau Trong một vài trường hợp, người ta cần phải có trước trình tự ADN của các vùng đích ở một số kiểu gen đặc hiệu Tuy nhiên, các chỉ thị dựa trên SNP vẫn phải được kiểm chứng trong phòng thí nghiệm trước khi được công nhận do các trình tự

đã công bố không phải lúc nào cũng có độ chính xác cao (Jin et al., 2003, Kumar et al., 2010)

Tính đa hình của chỉ thị SNP ở mức thấp hơn thường được tìm thấy ở các kiểu gen có quan hệ gần nhau hơn, mà những kiểu gen này đại diện cho các vật liệu

sinh học ưu việt của nhà chọn giống (vật liệu nhận từ indica x indica hay japonica x japonica), khi so sánh với kiểu gen tham khảo japonica-indica thường xác định rõ

tần số SNP Tần số các SNP giữa các loài phụ được báo cáo là từ 0,68% tới 0,7%,

trong khi đó giữa các cây japonica là 0,03% tới 0,05% và giữa các cây indica là 0,49% Một điều thú vị, các SNP không phân bố dọc theo các nhiễm sắc thể (Kumar

et al., 2010)

Nguồn tài nguyên lớn cho những nhà chọn giống phân tử đó là trình tự ADN được cung cấp từ các trình tự bộ gen vì vậy điều này cho phép nhận diện các chỉ thị nào liên kết chặt chẽ với các vị trí đích trở nên “tùy dụng” để phù hợp với mục đích của MAS (sự lựa chọn dựa vào chỉ thị) Số lượng cực lớn các chỉ thị ứng dụng đã được thiết kế mới là đặc điểm ưu việt duy nhất của phòng thí nghiệm chọn giống phân tử cây lúa Con số các chỉ thị có tiềm năng được tạo ra bằng cách sử dụng trình tự bộ gen cây lúa và dựa vào máy tính thì hầu như không có giới hạn Theo nguyên tắc, các chỉ thị ứng dụng có thể là bất kỳ kiểu nào mặc dù hầu hết chúng thường chứa các SSR mới, các đoạn InDels, các SNP dựa trên PCR, CAPS, SSLP, dCAPs chúng là những chỉ thị đơn giản nhất về mặt kỹ thuật để được dùng cho xác

định kiểu gen thông qua chỉ thị (Nagaki et al., 2004)

* Chỉ thị CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequence) và dCAPS (derived CAPS)

Chỉ thị đầu tiên dựa vào PCR, khuếch đại chuỗi đa hình được chia tách (cleaved amplified polymorphic sequence - CAPS) (Konieczny & Ausubel 1993), có thể so sánh

được với RFLP vì nó dựa trên phân cắt các mảnh khuếch đại PCR bằng các endonuclease giới hạn Chỉ thị CAPs có ưu điểm là cần lượng mẫu phân tích rất nhỏ (50-100 ng/phản ứng) So với chỉ thị RFLP, phân tích kiểu gen CAPS không yêu cầu lớn về mặt kỹ thuật và thời gian thực hiện các bước lai Southern và sử dụng đồng vị phóng xạ Tuy nhiên khi sử dụng chỉ thị này cần có dữ liệu trình tự của hệ gen để phân tích, tổng hợp mồi cũng như việc xác định các enzym giới hạn phù hợp để phân tích đa hình của các đoạn ADN có thay đổi về trình tự (Lê Huy Hàm và Trần Đăng Khánh, 2015) Khuyết điểm chính của CAPS là, cũng như RFLPs, SNP phải ở trong vùng cắt giới hạn Điều này giới hạn ứng dụng của nó trong một số nhỏ các đa hình mà thôi Để vượt qua vấn đề này, phương pháp dCAPS (“bắt nguồn từ” CAPS) đã được phát triển trong đó một vùng cắt giới hạn sẽ được tạo ra nhờ thêm vào một đoạn không tương thích vào mồi PCR gần vị trí SNP Thêm vào đó, các tác giả tạo ra một hệ thống phần mềm đơn giản gọi là dCAPS Finder để hỗ trợ việc thiết kế chỉ thị dCAPS Các chỉ thị CAPS/dCAPS có thể được phân tích đơn giản bằng PCR, sau đó cắt bằng enzyme giới hạn và chạy kiểm tra bằng gel agarose, vì vậy mà vẫn là lựa chọn trong nghiên cứu và trong các chương trình chọn, tạo giống (Komori và Nitta, 2005)

* Chỉ thị SSLP (Simple sequence length polymorphism):

Kỹ thuật đa hình độ dài các chuỗi đơn giản (Single Sequence Length Polymorphism-SSLP) là kỹ thuật chỉ thị tạo các chuỗi lặp lại với độ dài khác nhau nằm giữa hai gen Các chuỗi có độ dài khác nhau là do số lượng trình tự lặp lại trong chuỗi khác nhau do quá trình trao đổi chéo không cân hoặc do sự giảm nucleotit trong quá trình sao chép Cả hai quá trình này đều có thể dẫn đến giảm hoặc tăng số lượng đơn vị lặp lại trong hệ gen Sự khác nhau về độ dài của SSLP được sử dụng để đánh giá sự thay đổi di truyền giữa các cá thể trong loài Kỹ thuật SSLP giống như kỹ thuật SSR, cũng được tiến hành bằng các cặp mồi đặc hiệu nhân bản các chuỗi đơn giản nằm giữa hai gen, sản phẩm PCR được phân tách trên gel polyacrylamide SSLP đã được sử dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền, xác định giống, xác định dị hợp tử và lập bản đồ di truyền (Nguyễn Đức Thành, 2014) SSLP cũng là loại chỉ thị được sử dụng phổ biến trong phòng thí nghiệm bởi kỹ

thuật đơn giản và chi phí không cao, nó dựa trên sự khác nhau về chiều dài các sản

phẩm PCR, có thể dễ dàng phân tích bằng agarose gel (Kwon et al., 2005) Chỉ thị

SSLP là những chỉ thị đồng trội, và thường cho mức độ đa hình cao hơn so với RFLP và RAPD Chỉ thị SSLP đã được sử dụng thành công trong đánh dấu di truyền và đánh giá đa dạng, lập bản đồ gen và QTL, cũng như được dùng làm chỉ

thị trong chọn lọc ở thực vật (Jing et al., 2001)

* Chỉ thị STS (Sequencetagged Sites-STS):

STS là đoạn DNA ngắn trong hệ gen (có độ dài 200-300 cặp bazơ) mà trình

tự của nó không thể có ở bất cứ nơi nào khác trong hệ gen Chuỗi trình tự duy nhất này có thể nhân bản được bằng PCR Trình tự DNA của STS có thể có các yếu

tố lặp lại và các trình tự xuất hiện bất cứ ở đâu trong hệ gen, nhưng trình tự ở hai đầu của STS là duy nhất Chúng ta có thể tổng hợp các mồi duy nhất bổ sung với trình tự ở hai đầu STS và nhân đoạn STS bằng PCR Với nghĩa rộng, STS bao gồm các chỉ thị như microsatellites (SSRs, STMS hoặc SSRPs), SCARs, CAPs và ISSRs Kỹ thuật STS là sử dụng PCR để nhân chọn lọc vị trí đánh dấu (STS) bằng cặp mồi đặc hiệu gắn với hai đầu của chuỗi STS với điều kiện của phản ứng sao cho chỉ nhân được chuỗi STS đích mà không phải chuỗi nào khác trong hệ gen (Nguyễn Đức Thành, 2014)

1.3.3 Phương pháp chọn lọc nhờ sự hỗ trợ của chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống lúa (Marker Assisted Selection - MAS)

Chỉ thị phân tử đã trở thành công cụ quan trọng cho phân tích di truyền và cải tiến cây trồng Có nhiều chỉ thị phân tử (RFLP, RAPD, AFLP, ISSR, SSR, EST, CAPS, và SNP) đã được phát triển và ứng dụng trong chọn tạo một số cây trồng

(Doveri et al., 2008) Chúng đều có những ưu, nhược điểm nhất định Tuy nhiên,

một số chỉ thị phân tử vẫn được sử dụng rộng rãi trong chọn tạo giống cây trồng có

sự hỗ trợ bởi các kỹ thuật như MAS và MABC

Nguồn tài nguyên lớn cho những nhà chọn giống phân tử đó là trình tự ADN được cung cấp từ các trình tự bộ gen vì vậy điều này cho phép nhận diện các chỉ thị phân tử nào liên kết chặt chẽ với các vị trí đích trở nên “tùy dụng” để phù hợp với

mục đích của MAS (sự lựa chọn dựa vào chỉ thị phân tử) Số lượng cực lớn các chỉ thị phân tử ứng dụng đã được thiết kế là đặc điểm ưu việt duy nhất của phòng thí nghiệm chọn giống phân tử cây lúa Con số các chỉ thị phân tử có tiềm năng được tạo ra bằng cách sử dụng trình tự bộ gen cây lúa và dựa vào máy tính thì hầu như không có giới hạn Theo nguyên tắc, các chỉ thị phân tử ứng dụng có thể là bất kỳ kiểu nào mặc dù hầu hết chúng thường chứa các SSR mới, các đoạn InDels, các SNP dựa trên PCR, CAPS, SSLP, dCAPs, chúng là những chỉ thị phân tử đơn giản

nhất về mặt kỹ thuật dùng để xác định kiểu gen nhờ chỉ thị phân tử (Nagaki et al.,

2004) Ngoài ra, khả năng sử dụng dữ liệu hệ gen lúa phụ thuộc vào hiệu quả của cơ

sở thông tin hạ tầng bởi dữ liệu về hệ gen lúa tăng theo cấp số nhân theo từng ngày

do sự nỗ lực của rất nhiều nhà khoa học Trình tự hệ gen là nền tảng cho các phân tích phía sau như: xác định từng gen, dự đoán các protein mà gen đó quy định, xác định khi nào và ở đâu gen đó biểu hiện và sự tương tác với từng điều kiện cụ thể Vì vậy, cần phải kết nối nhiều nguồn thông tin khác nhau dựa trên một trình tự hệ gen lúa tiêu chuẩn Hiện nay, các nghiên cứu giải trình tự hệ gen các giống lúa vẫn đang

tiếp tục để làm rõ bức tranh về bản chất hệ gen của cây lúa (Yamamoto et al.,

2010)

Trước đây, các nhà chọn tạo giống thường tạo ra các giống lúa kháng bệnh bạc lá bằng phương pháp nhân giống truyền thống Nhưng nhược điểm của phương pháp này là tốn thời gian do phải tạo ra số lượng lớn cá thể để xác định hiệu quả và chọn lọc các kiểu gen mong muốn Mặt khác, phương pháp nhân giống truyền thống không phân biệt được kiểu gen dị hợp tử, mà điều này là cần thiết trong các chương trình chọn giống Kỹ thuật MAS và MABC được ứng dụng để chọn lọc các tính trạng chất lượng trong các quần thể phân ly Việc ứng dụng phương pháp chọn lọc nhờ sự hỗ trợ của chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống lúa (MAS) mang lại hiệu quả

và đáng tin cậy hơn chọn lọc kiểu hình, có thể rút ngắn được thời gian, công sức so với phương pháp chọn giống truyền thống MAS cho phép chọn lọc các tính trạng phức hợp mà phương pháp chọn giống truyền thống không giải quyết được (Lê Huy Hàm và Trần Đăng Khánh, 2015)

Chọn lọc nhờ sự hỗ trợ của chỉ thị phân tử (MAS) có tầm quan trọng đáng kể vì nó

sẽ cải thiện hiệu quả của việc nhân giống cây trồng thông qua chuyển chính xác các gen quan đích và tăng tốc độ phục hồi của bộ gen bố mẹ MAS đã được sử dụng rộng rãi hơn đối với các tính trạng di truyền đơn giản hơn so với tính trạng đa gen

(Jhansi Rani et al., 2014) MAS được cho là chỉ thị phân tử liên kết với các locus

đích để thay thế cho việc sàng lọc theo kiểu hình Bằng cách xác định alen của chỉ thị phân tử, cây trồng có chứa các gen đặc hiệu hoặc các QTL có thể được xác định dựa trên kiểu gen chứ không cần xác định theo kiểu hình Các ưu điểm nổi trội của MAS đó là:

- Có thể được áp dụng để tiến hành chọn lọc ở giai đoạn phát triển đầu của cá thể, do đó rút ngắn được thời gian chọn lọc;

- MAS không chịu tác động của các điều kiện môi trường;

- MAS giúp hỗ trợ hiệu quả việc chọn lọc các alen lặn quy định tính trạng mong muốn;

- MAS giúp tăng cường hiệu quả của việc quy tụ nhiều gen mong muốn vào một giống/dòng mới;

- Tùy thuộc vào từng tính trạng, MAS có thể có giá thành rẻ hơn và dễ thực hiện hơn so với hình thức chọn lọc truyền thống;

Tuy nhiên việc sử dụng MAS cũng có một vài hạn chế sau:

- Chi phí cho MAS có thể cao hơn các kĩ thuật truyền thống;

- Sự phân ly và tái tổ hợp giữa chỉ thị và gen cần quan tâm có thể xảy ra dẫn đến việc chọn lọc không chính xác Nhược điểm này có thể được hạn chế bằng cách

sử dụng cùng lúc hai chỉ thị nằm ở hai phía của gen cần quan tâm;

- Việc sử dụng một số chỉ thị phân tử trong quá trình chọn giống rất phức tạp,

vì vậy các chỉ thị phân tử này cần được cải tiến thành dạng dễ sử dụng hơn cho các nhà chọn giống;

- Việc ước lượng không chính xác vị trí của QTL và mức độ tác động một QTL đối với tính trạng mong muốn có thể làm kéo dài thời gian chọn lọc;

- Chỉ thị phân tử phát triển cho MAS ở một quần thể có thể không thể sử dụng được ở quần thể khác

Chọn lọc với sự hỗ trợ của chỉ thị phân tử (MAS - Marker Assisted Selection) bao gồm việc chọn lọc cá thể dựa vào chỉ thị phân tử (kiểu gen) thay vì chọn lọc dựa vào việc quan sát biểu hiện tính trạng (kiểu hình) Nghiên cứu của Hospital (2003) đã chứng minh ứng dụng MAS giúp làm tăng hiệu quả phục hồi các đặc tính của dòng lai trở lại so với phương pháp lai trở lại và chọn lọc theo truyền thống Có hai phương thức chọn lọc với chỉ thị phân tử trong phép lai trở lại (Hopital, 2003)

Ở phương thức thứ nhất, nhà chọn giống chọn lọc các cá thể có các chỉ thị alen của dòng cho ở các locus đích với mục đích là duy trì các locus đích ở trạng thái dị hợp

tử (mang một alen từ dòng cho và một alen từ dòng lai trở lại) cho đến khi hoàn tất chu kì lai trở lại cuối cùng Sau đó, các cá thể được chọn lọc sẽ được cho tự thụ để chọn lọc các cá thể với kiểu gen đồng hợp mang hai alen từ dòng cho Đối với phương thức thứ 2, nhà chọn giống sẽ sử dụng chỉ thị để chọn lọc các alen của dòng lai trở lại ở tất cả các vị trí trên hệ gen ngoại trừ locus đích, là locus gen có nguồn gốc từ dòng cho Locus đích này được chọn lọc dựa vào kiểu hình

Tuy nhiên, việc ứng dụng các chỉ thị phân tử trong nghiên cứu chọn tạo giống bằng MAS vẫn bị hạn chế do tác động của phân ly tái tổ hợp, chỉ thị phân tử và gen không còn liên kết với nhau trên một nhiễm sắc thể Khi đó việc chọn lọc dựa vào chỉ thị phân tử sẽ cho kết quả không chính xác Để loại bỏ tác động của hoạt động phân ly tái tổ hợp, có thể sử dụng các chỉ thị chức năng là những chỉ thị nằm trên gen kháng, khi đó sự biểu hiện của chỉ thị có thể đảm bảo sự có mặt của gen kháng trong cá thể Ngoài ra có thể sử dụng kết hợp 2 chỉ thị nằm ở hai phía của gen kháng trong quá trình chọn lọc Sự có mặt của hai chỉ thị này trong cùng một cá thể sẽ giúp tăng đáng kể hiệu quả chọn lọc Chính vì vậy, việc phân tích hệ gen, xác định chính xác vị trí, trình tự gen để thiết kế các chỉ thị chức năng là những chỉ thị nằm trong hoặc ngay 2 đầu gen đích có thể loại bỏ tác động của sự phân ly tái tổ hợp, làm tăng đáng kể hiệu quả chọn lọc cá thể mang gen kháng phục vụ công tác lai tạo

giống (Miah et al., 2013)