NỘI DUNG 1: NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT TẠO HẠT NHÂN TẠO TỪ PHÔI CÂY LAN VANDA NỘI DUNG 2: KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN CỦA MYCORRHIZA TRÊN MỘT SỐ GIỐNG LAN

Hiện nay, xã hội chúng ta ngày càng phát triển và hiện đại. Cuộc sống thƣờng bị áp lực nặng nề từ công việc.Vì vậy nhu cầu giải trí và vui chơi lành mạnh là rất cần thiết đối với mỗi ngƣời. Trong đó chơi hoa, cây cảnh cũng là một thú vui tao nhã, giúp chúng ta hoà quyện vào thiên nhiên, nâng cao chất lƣợng đời sống, giúp ta sống lâu sống khoẻ. Hoa là biểu tƣợng cho vẻ đẹp và điều thánh thiện. Mỗi loài hoa có màu sắc, hƣơng thơm đặc trƣng cho từng loài, cho từng vùng, từng miền.Từng loài hoa lại tƣợng trƣng cho tính cách của mỗi ngƣời, mỗi biểu tƣợng trong cuộc sống, đại diện cho tình yêu, tình bạn, tình cảm con ngƣời. Hiện nay hoa đã trở nên phổ biến rộng rãi đối với tất cả mỗi ngƣời, là món quà, là thông điệp trao nhau trong những ngày lễ, ngày kỉ niệm, ngày họp mặt. Hoa cũng đƣợc xem nhƣ một vật trang trí trong nhà tăng vẻ mỹ quan, gần gũi với thiên nhiên. Nhiều lễ hội về hoa đã đƣợc tổ chức ở các quốc gia. Trong đó, hoa lan hiện đƣợc nhiều ngƣời rất quan tâm và không những cảm mến trƣớc vẻ đẹp của hoa mà còn thắc mắc, tìm hiểu cách sinh tồn của lan trong tự nhiên. Lan rất đa dạng phong phú về màu sắc, hƣơng thơm, chủng loại và đặc biệt là phân bổ rộng khắp thế giới. Ngƣời trồng lan thƣờng đƣợc ví nhƣ một nghệ nhân, còn ngƣời thƣởng thức vẻ đẹp của chúng đƣợc xem nhƣ là nghệ sĩ. Về mặt kinh tế, trồng và kinh doanh hoa lan là một ngành đem lại lợi nhuận cao. Giá trị sản lƣợng hoa lan thế giới ngày nay lên tới hàng tỷ đô la. Vì vậy các nƣớc Hà Lan, Đức, Thái Lan, Philippin, Malaysia… vốn đã nổi tiếng về nghề trồng lan thì nay họ phát triển hơn nữa quy trình sản xuất lan nhanh hiệu quả hơn.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện: NGUYỄN HOÀNG QUÂN

Thành phố Hồ Chí Minh

-2007-BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

ThS.TỪ THỊ MỸ THUẬN

Thành phố Hồ Chí Minh

LỜI CẢM ƠN

Thành kính khắc ghi công ơn cha mẹ đã tận tụy suốt đời vì con để con

có được ngày hôm nay

Xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Trần Thị Dung và ThS Từ Thị Mỹ Thuận đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện

và hoàn thành luận văn tốt nghiệp này

Chân thành cảm ơn:

- Ban Giám Hiệu trường Đại Học Nông Lâm

- Quý thầy cô trường Đại Học Nông Lâm

- Quý thầy cô Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học

Đã tận tình truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tập cũng như thực hiện luận văn này

Xin gởi lời cảm ơn đến:

KS Nguyễn Thị Thu Hằng, KS Lê Hồng Thuỷ Tiên cùng tập thể cán bộ nhân viên Trung Tâm Công Nghệ Sinh Học và Phòng Thực Tập Bệnh Cây trường Đại Học Nông Lâm, cùng tất cả bạn bè trong và ngoài lớp Công Nghệ Sinh Học 29 đã luôn động viên, giúp đỡ tôi trong thời gian học tập và thực hiện đề tài

Nguyễn Hoàng Quân

TÓM TẮT

NGUYỄN HOÀNG QUÂN, sinh viên bộ môn Công Nghệ Sinh Học khoá

29, Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2007

Nội dung 1: Nghiên cứu kỹ thuật tạo hạt nhân tạo từ phôi cây lan Vanda

Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ sodium alginate đến sự hình thành

Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của môi trường tạo hạt nhân tạo

Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên 1 yếu tố, gồm 4

nghiệm thức, lăp lại 3 lần

Kết quả thu được ở môi trường dinh dưỡng ½ MS, hạt nhân tạo c ủa phôi lan

Vanda cho tỷ lệ sống sót và nẩy mầm cao

Thí nghiệm 3: Khảo sát môi trường bảo quản hạt nhân tạo

Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên 1 yếu tố, gồm 6

nghiệm thức, 3 lần lặp lại

Môi trường MS bảo quản hạt tốt nhất, cho hạt nhân tạo có tỷ lệ nẩy mầm cao nhất sau khi bảo quản

Thí nghiệm 4: Khảo sát sự nẩy mầm của hạt nhân tạo trên các giá thể khác nhau

Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên 1 yếu tố, gồm 3

nghiệm thức, 3 lần lặp lại

Tỷ lệ hạt nhân tạo nẩy mầm trên bông gòn cao nhất (khoảng 100%)

Nội dung 2: Khảo sát sự hiện diện của mycorrhiza trên một số giống lan

Kết quả khảo sát cho thấy mycorrhiza có các dạng sau:

-Sợi nấm ăn màu xanh, phân nhiều nhánh ăn xuyên qua nhiều lớp tế bào -Sợi nấm cuộn tròn trong 1 tế bào

-Sợi nấm là các cuộn tròn nằm ở các tế bào, nối với nhau bằng sợi nấm Giữa các giống lan trồng, tỷ lệ hiện diện của mycorrhiza có sự khác nhau do nguồn gốc của giống

SUMMARY

NGUYEN HOANG QUAN, student of Biotechnological faculty chronology

29, Nong Lam University of Ho Chi Minh City, 8 -2007

Topic was doen at Biotechnological Centre- Nong Lam University of Ho Chi

Minh City, doen from 3-2007 to 8-2007

CONTENT 1: RESEACHING TECHNOLOGY DOES ARTIFICIAL SEED FROM SOMATIC EMBRYONIC VANDA ORCHID

Experiment 1: Examining sodium alginate strength influenced artificial seed

Experiment 2: Examining influence of nutritional environment do artificial seed

Experimentation was set quite accident one factor, include 4 assays, 3 times

Resulting in ½ MS nutritional environment gave ratio of life and germination highly, consist with artificial seed from embryonic Vanda

Experiment 3: Examining maintainable environment arfiticial seed

Experimentation was set quite accident one factor, include 6 assays, 3 times repetition

MS environment maintained seed better, gave germinant ratio higher after maintenance

Experiment 4: Examining germination of arfiticial seed on different substances

Experimentation was set quite accident one factor, include 3 assays, 3 times repetition

Ratio of germinant arfiticial seed on the silk- coton was highest

CONTENT 2: EXAMINING PRESENCE OF MYCORRHIZA ON SOME ORCHID GENUS

Resulting in mycorrhiza had forms:

- The hyphae was dyed with blue, divided many branches across root cells

- The hyphae scrolled in one cell

- Hypha cirumvolutions entered into cells, allyed each other by the hyphae The present ratio of mycorrhiza had difference among orchid genus because of growing simulant origin

MỤC LỤC

Trang

Trang tựa i

Lời cảm ơn ii

Tóm tắt iii

Summary v

Mục lục vii

Danh sách các bảng x

Danh sách các biểu đồ xi

Danh sách các hình xii

1 GIỚI THIỆU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 2

1.2.1 Mục đích 2

1.2.2 Yêu cầu 3

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1 Khái quát về cây lan 4

2.1.1 Phân loại thực vật học 4

2.1.2 Lịch sử cây lan 4

2.1.3 Tình hình sản xuất lan 5

2.1.4 Đặc điểm thực vật học của cây lan 6

2.1.4.1 Cơ quan dinh dưỡng 6

2.1.4.2 Cơ quan sinh dục của lan- tổ chức hoa 7

2.1.5 Các điều kiện cơ bản cho cây lan 8

2.1.6 Các phương pháp nhân giống lan 8

2.1.6.1 Gieo hột 8

2.2 Phương pháp nuôi cấy mô lan ……… 10

2.2.1 Khái quát về lịch sử nuôi cấy mô 10

2.2.2 Các phương pháp nuôi cấy 10

2.2.3 Chất dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy in vitro 12

2.2.4 Các bước nhân giống in vitro 14

2.2.5 Các yếu tố ảnh hưởng nhân giống in vitro 15

2.3 Công nghệ tạo hạt nhân tạo……… 16

2.3.1 Khái niệm 16

2.3.2 Mục đích 16

2.3.3 Các nhân tố tạo hạt nhân tạo 17

2.3.3.1 Tạo phôi vô tính 17

2.3.3.2 Cơ chế phát sinh phôi soma 18

2.3.3.3 Tạo vỏ bọc bằng sodium alginate 19

2.3.3.4 Quy trình tạo hạt nhân tạo 21

2.4 Nấm rễ cộng sinh- mycorrhiza……… 22

2.4.1 Khái niệm 22

2.4.2 Các dạng mycorrhiza 23

2.4.2.1 Ectomycorrhiza 23

2.4.2.2 Endomycorrhiza 23

2.4.3 Tác động có ích của mycorrhiza 24

2.4.3.1 Mở rộng diện tích hấp thu của rễ cây 24

2.4.3.2 Sự trao đổi dinh dưỡng 24

2.4.3.3 Sự hình thành chất kích thích sinh trưởng mycorrhiza 24

2.4.3.4 Nâng cao sức chống chịu của cây 25

2.4.3.5 Tăng khả năng kháng bệnh của cây trồng 25

2.4.4 Sự xâm nhập của mycorrhiza 25

3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

3.1 Đối tượng thí nghiệm 26

3.2 Thời gian thực hiện 26

3.3 Nội dung nghiên cứu 26

3.4 Vật liệu nghiên cứu 27

3.4.1 Trang thiết bị và dụng cụ nghiên cứu……… 27

3.4.2 Mẫu sử dụng và điều kiện nuôi cấy……… 27

3.4.3 Môi trường sử dụng……… 27

3.5 Phương pháp nghiên cứu 28

3.5.1 Chuẩn bị môi trường……… 28

3.5.2 Bố trí thí nghiệm ………29

3.6 Xử lý số liệu ……… 32

4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33

4.1 Nội dung 1: Nghiên cứu kỹ thuật tạo hạt nhân tạo từ phôi cây lan 33

4.1.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ sodium alginate đến sự hình thành hạt nhân tạo 36

4.1.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của môi trường tạo hạt nhân tạo… 39 4.1.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát môi trường bảo quản……… 41

4.1.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát khả năng nẩy mầm của hạt……… 43

4.2 Nội dung 2: Khảo sát sự hiện diện của mycorrhiza ở các giống lan 45

5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 49

5.1 Kết luận 49

5.2 Đề nghị 50

6 TÀI LIỆU THAM KHẢO 51

7 PHỤ LỤC 53

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 2.1: Sự phát triển của mô trên môi trường nuôi cấy 17

Bảng 4.1: Nồng độ alginate ảnh hưởng lên hình thái vỏ hạt nhân tạo 36

Bảng 4.2: Tỷ lệ sống của hạt nhân tạo ở các nồng độ alginate 38

Bảng 4.3: Tỷ lệ nẩy mầm của hạt nhân tạo ở các nồng độ alginate khácnhau… 39

Bảng 4.4: Tỷ lệ sống của hạt nhân tạo ở các môi trường dinh dưỡng khác nhau… 40 Bảng 4.5: Tỷ lệ nẩy mầm của hạt nhân tạo ở các môi trường dinh dưỡng 42

Bảng 4.6: Khảo sát ảnh hưởng của môi trường bảo quản hạt nhân tạo 42

Bảng 4.7: Tỷ lệ nẩy mầm của hạt nhân tạo sau khi bảo quản 43

Bảng 4.8: Tỷ lệ hạt nhân tạo nẩy mầm trên các giá thể 44

Bảng 4.9: Sự hiện diện của mycorrhiza trên các giống lan 45

DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 4-1: Tỷ lệ sống của hạt nhân tạo ở các nồng độ alginate khác nhau 38 Biểu đồ 4-2: Tỷ lệ sống sót của hạt nhân tạo ở môi trường khác nhau 40 Biểu đồ 4-3: Sự hiện diện của mycorrhiza trên các giống lan 46

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2-1: Cấu tạo hoa lan 8

Hình 2-2: Cấu tạo hạt nhân tạo 16

Hình 2-3: Các giai đoạn phát sinh phôi soma 19

Hình 2-4: Công thức hoá học của alginate 20

Hình 2-5: Các dạng phôi soma 21

Hình 2-6: Quy trình tạo hạt nhân tạo 22

Hình 4-1: Các dạng phôi vô tính 33

Hình 4-2: Cấu trúc của phôi vô tính 34

Hình 4-3: Môi trường tạo hạt nhân tạo 34

Hình 4-4: Các bước tạo hạt nhân tạo 35

Hình 4-5: Sự hình thành hạt nhân tạo 35

Hình 4-6: Cấu tạo vi thể của hạt nhân tạo 36

Hình 4-7: Hạt nhân tạo ở các nồng độ alginate 37

Hình 4-8: Hạt nhân tạo nẩy mầm 39

Hình 4-9: Hạt nhân tạo trên các môi trường bảo quản 42

Hình 4-10: Hạt nhân tạo nẩy mầm trên các giá thể 44

Hình 4-11: Vùng mô có mycorrhiza 47

Hình 4-13: Các dạng mycorrhiza 47

Hình 4-12: Dạng mycorrhiza cuộn tròn 48

CHƯƠNG I

GIỚI THIỆU

1.1 Đặt vấn đề

Hiện nay, xã hội chúng ta ngày càng phát triển và hiện đại Cuộc sống thường bị

áp lực nặng nề từ công việc.Vì vậy nhu cầu giải trí và vui chơi lành mạnh là rất cần thiết đối với mỗi người Trong đó chơi hoa, cây cảnh cũng là một thú vui tao nhã, giúp chúng ta hoà quyện vào thiên nhiên, nâng cao chất lượng đời sống, giúp ta sống lâu sống khoẻ

Hoa là biểu tượng cho vẻ đẹp và điều thánh thiện Mỗi loài hoa có màu sắc, hương thơm đặc trưng cho từng loài, cho từng vùng, từng miền.Từng loài hoa lại tượng trưng cho tính cách của mỗi người, mỗi biểu tượng trong cuộc sống, đại diện cho tình yêu, tình bạn, tình cảm con người Hiện nay hoa đã trở nên phổ biến rộng rãi đối với tất cả mỗi người, là món quà, là thông điệp trao nhau trong những ngày

lễ, ngày kỉ niệm, ngày họp mặt Hoa cũng được xem như một vật trang trí trong nhà tăng vẻ mỹ quan, gần gũi với thiên nhiên Nhiều lễ hội về hoa đã được tổ chức ở các quốc gia

Trong đó, hoa lan hiện được nhiều người rất quan tâm và không những cảm mến trước vẻ đẹp của hoa mà còn thắc mắc, tìm hiểu cách sinh tồn của lan trong tự nhiên Lan rất đa dạng phong phú về màu sắc, hương thơm, chủng loại và đặc biệt

là phân bổ rộng khắp thế giới Người trồng lan thường được ví như một nghệ nhân, còn người thưởng thức vẻ đẹp của chúng được xem như là nghệ sĩ

Về mặt kinh tế, trồng và kinh doanh hoa lan là một ngành đem lại lợi nhuận cao Giá trị sản lượng hoa lan thế giới ngày nay lên tới hàng tỷ đô la Vì vậy các nước Hà Lan, Đức, Thái Lan, Philippin, Malaysia… vốn đã nổi tiếng về nghề trồng lan thì nay họ phát triển hơn nữa quy trình sản xuất lan nhanh hiệu quả hơn Đồng

thời, đẩy mạnh lai tạo giống để chọn ra những giống mới lạ, khả năng chịu đựng với hoàn cảnh khắc nghiệt của tự nhiên.Việt Nam chúng ta cũng nghiên cứu rất nhiều

về lan, đặc biệt là kỹ thuật nhân giống nhanh bằng kĩ thuật nuôi cấy mô

Đặc biệt, cây lan rất khó gieo hạt ngoài tự nhiên, đa phần muốn nhân giống

nhanh thường áp dụng tách chiết hoặc nuôi cấy in vitro Với sự phát triển của kỹ

thuật tạo hạt nhân tạo, chúng ta có thể ứng dụng lấy phôi soma cho bọc vỏ nhân tạo

có chứa môi trường dinh dưỡng, nhằm bảo quản phôi và tạo điều kiện cho hạt nhân tạo nẩy mầm Với kỹ thuật này, thì khắc phục hạn chế nẩy mầm của hạt lan trong tự nhiên, và giúp nhân nhanh các giống lan trồng và các loài thực vật khó nẩy mầm trong tự nhiên

Trong hệ sinh thái nông nghiệp, rất nhiều nấm có lợi cho cây trồng, nấm cộng sinh với rễ là rất phổ biến, chúng giúp cây nhận được một số chất khoáng từ đất, nhất là tăng cường hấp thụ photpho dễ dàng, giúp cây tăng trưởng nhanh, đồng thời cây lại cung cấp nguồn cacbon cho nấm, thường được gọi là mycorrhiza Nắm bắt

được mối quan hệ đó, chúng ta có thể ứng dụng vào lĩnh vực sản xuất cây in vitro

Vì vậy, cần phải có nhiều nghiên cứu hơn nữa về mycorrhiza, đặc biệt là trên rễ lan Được sự đồng ý của bộ môn Công Nghệ Sinh Học cùng với sự hướng dẫn tận tình của TS Trần Thị Dung, ThS Từ Thị Mỹ Thuận, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề

tài này gồm hai nội dung:

NỘI DUNG 1: NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT TẠO HẠT NHÂN TẠO TỪ PHÔI CÂY LAN VANDA

NỘI DUNG 2: BƯỚC ĐẦU KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN CỦA MYCORRHIZA TRÊN MỘT SỐ GIỐNG LAN

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

1.2.1 Mục đích

-Bảo quản phôi soma hiệu quả và lưu trữ giống dễ dàng hơn

-Tạo cơ sở cho việc phân lập mycorrhiza trên cây lan đồng thời thử nghiệm

trong nuôi cấy in vitro

1.2.2 Yêu cầu

Theo dõi tỷ lệ sống, tỷ lệ nẩy mầm của hạt nhân tạo Thu thập mẫu rễ lan, nhuộm và quan sát mycorrhiza

CHƯƠNG 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1.Khái quát về cây lan

Ở phương Đông, lan đựơc chú ý đến vẻ đẹp duyên dáng của lá và hương thơm tuyệt diệu của hoa Vì vậy trên thực tế lan chủ yếu chiêm ngưỡng trước tiên là lá chứ không phải màu sắc của hoa Ở phương Tây, lan được biết đến trước hết là công dụng về dược liệu và sau đó là sức hấp dẫn của hoa cùng các đặc tính về thực vật của nó.Theophrastus được xem là ông tổ của thực vật học và là cha đẻ của ngành học về lan và đến năm 1836 John Lindley đặt tên cho họ lan là Orchidaceae

Ở Việt Nam, năm 1789 Joanis Loureiro, nhà truyền giáo người Bồ Đào Nha lần đầu tiên mô tả trong cuốn”Flora Cochinchinesis” và chỉ đến khi người Pháp đến mới có nhiều công trình công bố H.Lecomte mô tả 101 giống gồm 750 loài lan cho

cả 3 nước Đông Dương Năm 1993 Phạm Hoàng Hộ phát hiện và mô tả khoảng 653 loài

2.1.3 Tình hình sản xuất lan

Trên thế giới

Châu Âu, Hà Lan là quốc gia duy nhất có công nghệ trồng lan xuất khẩu sớm, ứng dụng trồng trong nhà kính nên xuất khẩu được quanh năm, đặc biệt là lan Cymbidium Còn Italia là quốc gia nhập khẩu lan nhiều nhất Châu Âu, chủ yếu từ các nước: Thái Lan 64 triệu cành, Hà Lan 10 triệu cành vào năm 1993 Mỹ nhập từ Thái Lan 16,4 triệu cành, Singapore 289 ngàn cành Dendrobium vào năm 1994 Châu Á, đứng đầu thế giới về nhập khẩu lan vẫn là Nhật, chủ yếu là Dendrobium, Oncidium, Cymbidium, Phalaenopsis từ Malaysia, Singapore và Thái Lan là nhiều nhất

Ở Việt Nam

Do chúng ta ở vùng có khí hậu nhiệt đới gió mùa, vì vậy phong lan rất đa dạng Bên cạnh các loại lan rừng nổi tiếng về màu sắc và hương thơm còn có các giống lan nhập ngoại như Dendrobium, Vanda, Mokara, Phalaenopsis, Cattleya… còn phân bổ lan rừng thì khắp cả nước:

Vùng khí hậu lạnh: Cao Nguyên và các tỉnh phía Bắc có thể trồng được các loài lan như Dendrobium, Cymbidium, Phalaenopsis, Cattleya, Paphiopedilum…)

Vùng khí hậu nóng ẩm như ở Nam và Trung Trung Bộ, nhất là miền Đông Nam Bộ có các loại lan như: Cattleya, Vanda, Mokara, Cymbidium, Ngọc Điểm… Tuy nhiên có những khó khăn của người trồng lan ở nước ta:

-Nông dân trồng lan còn nhỏ lẻ, thiếu quy hoạch chiến lược, kỹ thuật so với nước ngoài

-Chưa tạo được giống lan riêng biệt cho Việt Nam có thể cạnh tranh với các

-Thị trường tiêu thụ còn nhiều khó khăn, chưa ổn định kinh tế lâu dài cho

người trồng lan

Tuy nhiên, thành phố Hồ Chí Minh đã có nhiều chính sách, nguồn vốn đầu tư

để xây dựng và mở rộng khu nông nghiệp cao, chuyển đổi đổi cơ cấu nông nghiệp

cho phù hợp với tình hình và xu hướng phát triển của thành phố, trong đó cây lan

cũng là cây chủ lực

2.1.4 Đặc điểm thực vật học của cây lan

2.1.4.1 Cơ quan dinh dưỡng

a) Sự phát triển ở cây đa thân

Trường hợp lan Cau diệp (Spathoglottis plicata Bl.)

Đây là loài địa lan, giả hành là một thân ngắn phù mập Mỗi giả hành có một số

lá bao che và mang rễ ở đáy Đáy lá to ra tạo thành bẹ bao quanh giả hành Ở nách

của mỗi bẹ lá có thể có các chồi mà mỗi chồi có thể phát triển thành cành mang hoa

(phát hoa) hay tạo ra cơ quan dinh dưỡng mới (giả hành mới)

Các chồi ở nách lá ấy được che chở bởi những lá ngắn không có phiến lá bên

trên Khi chồi bắt đầu phù to có dạng một giả hành sơ khởi thì các lá ló ra về phía

đỉnh, sau đó các rễ mới xuất hiện ở về phía đáy Cuối cùng các lá phát triển lớn lên,

tích trữ dưỡng chất về phía đáy làm cho giả hành lớn dần ra

Trường hợp lan Bạch câu (Dendrobium crumenatum Sw.)

Xuất hiện từ đồng bằng đến núi cao, phụ sinh sống bám trên cây hay trên hốc

đá, rễ chúng không luôn bị ẩm ướt như ở trong đất như lan Cau diệp.Cành lan mới

sinh ra từ gốc của cành cũ: Gồm gốc nhỏ mang rễ, tiếp là đoạn phù mập không rễ,

không lá, kế trên là đoạn dài lỏng khỏng mang lá mọc xen hai hàng, trên cùng là

đoạn dài nhỏ lỏng y như vậy nhưng không có lá, tất cả gọi là giả hành Như vậy

Bạch câu sống nhiều năm (cây đa niên) nhờ các đơn vị nối tiếp nhau, chồi mới sinh

ra từ chồi bên ở gốc của đơn vị trước đó và cứ thế tiếp tục phát triển theo chiều

ngang

b) Sự phát triển ở cây đơn thân

Ở kiểu phát triển độc trụ, nếu ta cắt một đoạn ở phía ngọn của thân thì đoạn bị

cắt rời này vẫn phát triển về phía đỉnh Còn nếu cắt đoạn thân của cây (đỉnh giả hành) thì đoạn cắt rời ấy không thể phát triển về phía đỉnh.Ví dụ như cây Vanda,

Ngọc Điểm (Rhynchostys gigantea), Hồ Điệp (Phalaenopsis)… Lá có phiến hình

trụ dài và có bẹ bọc kín thân Thân luôn luôn mọc cao lên về phía đỉnh Sự mọc dài của đỉnh không có giới hạn nên cây chỉ có một thân phát triển vô hạn Sự phát triển ngừng lại khi đỉnh bị tổn thương, lúc đó chồi bên sẽ xẻ rách bẹ lá để mọc dài ra thành nhánh, nhánh này cũng sinh trưởng không giới hạn như đỉnh ban đầu

2.1.4.2 Cơ quan sinh dục của lan- tổ chức hoa

Hoa lan kiểu tam phân (chia 3): 3 lá đài, 3 cánh hoa, 3 tâm bì

Phấn hoa dính lại thành phấn khối, ít khi rời từng hạt như ở các loài hoa khác

Sự hiện diện của trụ là phần hợp nhất của bộ phận sinh dục đực và bộ phận sinh dục cái Đó là đặc điểm quan trọng chỉ có ở hoa lan

Hình dạng, kích thước của môi, cộng thêm vị trí của nhuỵ đực đã làm cho hoa lan không đều, có sự đối xứng hai bên rõ rệt

Tuy cấu trúc chung như vậy nhưng trong chi tiết từng bông hoa lan cũng có những khác biệt mà từ đó ta chia chúng ra những giống loài khác nhau, chỉ cần đề cập đến cánh môi thôi cũng đã rất phong phú Nhưng 99% các cây lan có 1 nhuỵ đực thụ mà thôi số còn lại có 2-3 nhuỵ đực thụ (Nguyễn Thiện Tịch,1996) Về phái tính thì đại đa số cây lan là hoa lưỡng tính, nhưng ở giống Catasetum và Cycnoches hoa lại là đơn tính

Cánh môi: Ở một số loài thì rất lớn so với hai bên cánh, một số loài có cánh môi rất nhỏ

Hình dạng: Môi có thể nguyên hay có thuỳ, có rìa, có tua, cuộn hay nhăn…có cấu trúc rất kỳ lạ như có sọc, có sóng, có gai, có lông, trơn láng hay nhăn có cựa, móc, túi ở đằng sau

Màu sắc: Thường khác hai bên, hoặc có sọc, điểm, những màu khác biệt

Hình 2-1: Cấu tạo hoa lan 2.1.5 Các điều kiện cơ bản cho cây lan

Ẩm độ: Thông thường tối thiểu là 70% thích hợp cho sự tăng trưởng của nhiều loài Tuy nhiên ẩm độ lý tưởng vẫn là ẩm độ của vùng bản xứ

pH của nước: pH của nước phù hợp cho lan tăng trưởng là 5-6, nếu lên 7 hoặc trên 7 thì không nên tưới nước cho cây

Nhiệt độ: Tuỳ thuộc vào nhiệt độ của điều kiện địa lý, vùng cao độ thì sẽ có

sự phân bổ giống lan phù hợp

Ánh sáng: Yếu tố quyết định cho sự quang hợp, hô hấp và nhất là cho sự trổ hoa

- Sự tự thụ phấn: Khi phấn hoa ở hoa này được rơi vào nuốm của chính hoa

ấy, điều này không thể xảy ra ngoài tự nhiên đối với hoa lan được

- Sự thụ phấn chéo: Khi phấn hoa ở hoa này được để vào nuốm của hoa khác trên cùng cây hay cùng một loài, hay khác loài, khác giống (chỉ con người mới làm được)

Hạt lan quá nhỏ, không chứa chất dự trữ và chỉ có một phôi chưa phân hoá nên không thể phát triển theo cách bình thường mà việc làm cho hạt lan nẩy mầm thành cây lan trưởng thành là vấn đề khó khăn

Năm 1844, Neumann- người Pháp- đã cho nẩy mầm thành công hạt lan khi ông liệng hạt lan quanh gốc cây lan lớn, nhưng không hiểu vì sao

Năm 1899, Noel Bernard- người Pháp- đã khám phá bí mật đó, vì những hạt lan nẩy mầm đều bị nhiễm nấm Năm 1904, ông cô lập các nấm rễ lan và cho nhiễm lên hạt lan thì 100% hạt nẩy mầm

Người ta đã khám phá ra 3 loài nấm giúp hạt lan nẩy mầm:

- Rhizoctonia repens giúp hạt lan Cattleya, Laelia nẩy mầm

- Rhizoctonia mucoroides giúp hạt lan Vanda, Phalaenopsis nẩy mầm

- Rhizoctonia lanugiosa giúp hạt lan Oncidium, Miltonia nẩy mầm

Năm 1922, Knudson ở Mỹ, đã thành công khi gieo hạt lan trên môi trường thạch có bổ sung dinh dưỡng (thêm 2% đường )

Ở Phalaenopsis có lúc cây con mọc trên cọng phát hoa đến khi có rễ tốt thì tách

ra để trồng

Với những loài đơn thân như Vanda, Hồ Điệp, Ngọc Điểm… khoẻ mạnh, hoặc

bị tổn thương ở đỉnh ngọn, chúng sẽ sinh ra cây con từ chồi bên ở gần gốc, các chồi này có rễ dài ra, có thể tách ra để trồng riêng

2.2 Phương pháp nuôi cấy mô lan

2.2.1 Khái quát về lịch sử nuôi cấy mô

Năm 1838, hai nhà sinh vật học người Đức, Schleiden và Schwann đưa ra thuyết tế bào và nêu rõ mọi cơ thể sinh vật có phức tạp tới đâu thì đều có cấu tạo đơn vị rất nhỏ là tế bào

Năm 1902, Haberlandt thực hiện nuôi cấy tế bào thực vật đầu tiên từ lá một số

cây một lá mầm như: Errythronium, Orrnithogalum…

Năm 1922, Kotte và Robins lập lại thí nghiệm của Haberlandt nhưng trên đỉnh sinh trưởng của rễ một cây hoà thảo, trên môi trường lỏng có muối khoáng và glucose Tuy nhiên sự sinh trưởng này chỉ kéo dài trong thời gian ngắn

Năm 1934, White và Gautheret đã nuôi cấy thành công rễ cà chua trên môi trường muối khoáng và dich chiết nấm men

Năm 1934, Nobecourt và Gautheret duy trì sự sinh trưởng của mô sẹo cà rốt Năm 1955, Các chất kích thích sự phân bào được Skoog đặt tên là kinetin, và gộp với các chất kích thích phân bào tự nhiên gọi là cytokinin

Năm 1956, Morel, học trò của Gautheret, áp dụng thành công nuôi cấy mô vào cây lan (Cymbidium) tạo ra các protocorm

Đến nay, hầu hết các giống lan đã được nhân giống nhanh bằng phương pháp nuôi cấy mô như: Cattleya, Hồ Điệp, Ngọc Điểm, ngay cả lan Hài nổi tiếng của Việt

Nam (Câu lạc bộ học viên hoa lan, 1999)

2.2.2 Các phương pháp nuôi cấy

a) Nuôi cấy nốt đơn thân

Sử dụng mẫu cấy là chồi ngọn hoặc chồi bên có mang một đoạn thân ngắn Chồi này được kích thích tăng trưởng, ra rễ tạo cây nguyên vẹn, nhiều chồi và lá

được hình thành, tiếp tục cấy chuyền trên môi trường dinh dưỡng thích hợp, phương

pháp này dùng nhân giống vô tính in vitro và có thể áp dụng được in vivo (Nguyễn

Đức Lượng, 2002)

b) Nhân chồi bên

Giống như nuôi cấy nốt đơn thân về nguyên tắc nhưng khác là nuôi cấy nốt đơn thân có sự kéo dài chồi, thân và thường không cần đến cytokinin để phát triển Còn phương pháp nhân chồi bên, chồi ngọn được cô lập trên môi trường dinh dưỡng và các chồi bên từ các nách lá phát triển dưới tác dụng của cytokinin nồng độ cao Cytokinin có tác dụng hạn chế ưu tính ngọn để các chồi bên phát triển (Nguyễn Đức Lượng, 2002)

c) Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

Chồi ngọn được rửa sạch và khử trùng bằng cồn, hypoclorite calcium Sau đó dùng dao mổ tách rời đỉnh sinh trưởng (gồm vùng mô phân sinh và cả phần dưới ngọn) ra khỏi ngọn và cấy trên môi trường tái sinh cây hoàn chỉnh Với phương pháp này, chúng ta tạo được cây sạch bệnh, sạch virus

d) Nuôi cấy mô sẹo

Tạo mô sẹo được tiến hành lần đầu tiên vào năm 1920, mô sẹo là một khối tế bào không có tổ chức, hình thành từ các mô hoặc cơ quan đã phân hoá dưới các điều kiện đặc biệt (vết thương, xử lý hoá chất, tia phóng xạ ).Các tế bào của mô sẹo phải chịu sự phản phân hoá trước lần phân chia đầu tiên (Halperin, 1969)

Mô sẹo tăng trưởng nhanh trên môi trường có chất auxin và trong môi trường không có chất kích thích thì mô sẹo có thể tái sinh thành cây hoàn chỉnh Cụm mô sẹo có thể tái sinh cùng một lúc nhiều chồi hơn là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, nhưng khả năng bị biến dị tế bào soma lại cao hơn

e) Nuôi cấy huyền phù tế bào

Huyền phù tế bào được tạo từ các mảnh mô sẹo nuôi cấy trong môi trường lỏng lắc liên tục Trong môi trường lỏng, mô sẹo phóng thích ra những tế bào riêng lẻ hay những cụm tế bào dính nhau để hấp thụ dinh dưỡng Sau đó tế bào được chuyển

f) Nuôi cấy thể đơn bội

Cây thể đơn bội mang bộ nhiễm sắc thể giảm đi một nửa, sử dụng những phần

sau cho việc nuôi cấy in vitro:

Túi phấn: Thu túi phấn từ chồi hoa thì chỉ khử trùng chồi hoa Còn thu túi phấn của hoa đã nở thì phải khử trùng túi phấn

Hạt phấn: Được nuôi cấy trên môi trường để tạo mô sẹo

Cụm hoa: Thường nuôi cấy trong môi trường lỏng

g) Nuôi cấy protoplast( tế bào trần)

Tế bào thực vật được xử lý bằng hoá lý để tách lớp vỏ cenlulose, nhưng vẫn còn giữ chức năng của tế bào Trong môi trường thích hợp, protoplast có thể phân chia

tế bào hay tái sinh thành cây (Nguyễn Đức Lượng, 2002)

Với cách nuôi cấy này, ta có thể áp dụng để chuyển gene vào tế bào trần hay tạo cây đa bội bằng cách dung hợp hai tế bào trần với nhau

2.2.3 Chất dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy in vitro

Về nguyên tắc, mô thực vật nuôi cấy trong môi trường in vitro cũng cần các

chất dinh dưỡng giống như cây trồng trên đất

a) Các chất vô cơ

Chất vô cơ ở nồng độ lớn hơn 0,5 mM/l được xếp vào nhóm đa lượng, còn nồng độ thấp hơn 0,05 mM/l được xếp vào nhóm vi lượng

Nguồn đạm trong môi trường in vitro được cung cấp ở hai dạng ion NH4+ và

NO3- Lượng đạm tổng số cần trong khoảng từ 12-60 mM/l, trong đó có NH4+ biến thiên từ 6-20 mM/l và NO3- từ 6-40 mM/l ( Bùi Bá Bổng, 1995) Phần lớn cây ưa

NO3- hơn NH4+ nhưng cũng có những trường hợp ngược lại Lượng K+ cần trong môi trường biến thiên từ 2-25 mM/l Còn các ion khác Ca2+

, H2PO4-, SO42-, Mg2+, thường thấp hơn khoảng 1-5 mM/l

Khoáng vi lượng thường được dùng ở nồng độ 0,1-100 µM/l

b) Nguồn carbon

Mô cấy trong môi trường tự dưỡng không có khả năng tự dưỡng (autotrophic),

do không tiến hành được quang hợp đầy đủ trong điều kiện không thuận lợi như

thiếu sự trao đổi khí bên trong chai và bên ngoài chai Do đó nguồn carbon phải được cung cấp cho môi trường nuôi cấy như các dạng đường, chủ yếu là đường sucrose, thường chiếm khoảng 2-3%

c) Vitamin và amino acid

Các vitamin thường dùng là thiamine (B1), nicotinic acid (B3), pyridoxine (B6), calcium pentothenate (B5) và myo- inositol Nồng độ từ 0,1 đến 10 mg/l Các amino acid thường dùng là L- asparagine (100 mM/l), L-glycine (2mM/l), L-arginine (10 mM/l), L-cysteine (10 mM/l) Khác với đạm vô cơ, các amino acid thường được tế bào hấp thụ nhanh hơn Tuy nhiên, có thể dùng các chất hữu cơ trong nuôi cấy như nước dừa (5-20%), các chất trích từ khoai tây, cam, cà chua, chuối

d) Các chất điều hoà sinh trưởng

Auxin: Các dạng auxin thường dùng trong nuôi cấy in vitro là 2,4-D,NAA,

IBA và IAA ở nồng độ 0,1-5 mg/l NAA và IBA thường dùng để cho ra rễ và dùng phối hợp với cytokinin trong sự nhân chồi Còn 2,4-D rất hữu hiệu trong tạo ra mô sẹo.c

Cytokinin: Có tác dùng trong sự phân chia tế bào, sự phân hoá chồi, sự nhân chồi Các cytokinin thông dụng là kinetin, BAP, nồng độ khoảng 1-10 mg/l, kích thích sự ra chồi bên, làm giảm ảnh hưởng ngọn và ức chế sự thành lập rễ

Gibberellin: Có khoảng 20 loại nhưng GA3 là loại thông dụng nhất, có tác dụng làm tăng sự vươn lóng và sự phát triển của đỉnh sinh trưởng hoặc chồi Tuy nhiên gibberellin không được dùng phổ biến trong nuôi cấy mô

e) Agar (thạch)

Được bào chế từ rong biển, dùng làm chất nền cho môi trường nuôi cấy, có nguồn gốc thực vật tự nhiên, không gây độc đối với cây Agar hoà tan thành một thể keo có thể bám nước và hấp thụ các hợp chất Lượng agar thường dùng từ 0,6- 0,8%, nếu nồng độ thấp (0,4%) môi trường mềm loãng Nồng độ cao (1%) môi trường bị cứng, khó cấy và mô khó tiếp xúc với môi trường

f) Nước

Nên sử dụng nước cất để bảo đảm chất lượng nước, chiếm khoảng 95% môi trường nuôi cấy Ngoài nước cất có thể dùng nước khử ion nhưng không dùng nước máy

g) Yêu cầu pH

pH môi trường cấy mô từ 5,0-6,5 và thường được điều chỉnh để đạt khoảng 6,0 Môi trường có pH thấp (thấp hơn 4,5) hoặc cao (cao hơn 7,0) ức chế sự phát triển của mô Nếu pH bắt đầu khoảng 5,0-7,0, sau khi hấp sẽ giảm đi 0,3-0,5 đơn vị

2.2.4 Các bước nhân giống in vitro

Bước 1: Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

Mẫu cấy thường là chồi, mắt lóng, đỉnh sinh trưởng, lá, rễ đem rửa sạch và

khử trùng bằng cồn, natri hypochlorit, calci hypochlorit Sau đó, mẫu được đưa vào môi trường tạo điều kiện phân chia và phân hoá mạnh Đối với mẫu dễ bị hoá nâu, môi trường thường bổ sung than hoạt tính hoặc ngâm mẫu với ascorbic acid và citric acid (25-150 mg/l mỗi loại) trước khi cấy (Bùi Bá Bổng, 1995)

Bước 2: Tạo thể nhân giống in vitro

Thể chồi (multiple shoot) và thể cắt đốt (cutting) cấy vào môi trường có chất kích thích sinh trưởng (cytokinin, GA3 ) để tạo mô sẹo, tạo cụm chồi

Bước 3: Nhân giống in vitro

Đây là giai đoạn quan trọng nhất nhằm mục đích tăng sinh khối thể nhân giống Sự nhân giống này tuỳ thuộc vào khả năng tạo chồi nách hoặc phát khởi chồi bất định từ những khối giống như callus dưới gốc chồi, rồi ra rễ

Bước 4: Tái sinh cây hoàn chỉnh in vitro

Các chồi, callus hay mô sẹo sẽ được cấy vào môi trường có auxin để tạo rễ, tạo thân, lá đầy đủ Cây phải được nuôi cấy trong điều kiện giống như bên ngoài vườn ươm để thuần hoá cho đến khi cây con khỏe mạnh

Bước 5: Chuyển cây in vitro ra vườn ươm

Cây con phát triển tốt trong môi trường in vitro được lấy ra và rửa sạch môi

trường nhân tạo bám ở gốc rễ, rồi đem trồng ra vườn ươm Do thay đổi về điều kiện

sống, cây con dễ bị tress, mất nước và mau héo nên vườn phải mát, ẩm độ cao

2.2.5 Các yếu tố ảnh hưởng nhân giống in vitro

a) Lựa chọn mẫu cấy

Mô non (chồi đỉnh), chồi nách hay chồi bất định tái sinh tốt hơn so với mô già của cùng một cây

b) Môi trường nuôi cấy

Môi trường MS (Murashige và Skoog) cho kết quả tốt trong nhân giống cây ban đầu và nhân chồi tiếp theo Để tạo chồi nách nồng độ auxin và cytokinin tương đối thấp, còn tạo chồi bất định cần nồng độ cytokinin cao và auxin thấp; Còn tạo mô sẹo thì ngược lại

Môi trường rắn hay lỏng cũng ảnh hưởng đến khả năng phát triển rễ Agar giúp cây đứng vững và tăng khả năng thoáng khí tạo điều kiện hấp thu dưỡng chất Đối với cây tiết các độc tố như phenol thì cần thêm than hoạt tính hay PVP (polyvinyl pyrrolidone) để hấp thụ các chất này giúp cây tăng trưởng tốt hơn

Môi trường có thể bổ sung các chất ngăn cản sự oxyt hoá phenols như citric acid, ascorbic acid, thiourea hoặc L- cystine Hoặc bổ sung thêm amino acid như glutamine, arginine và asparagine

Thường xuyên cấy chuyền vào môi trường mới nhằm tạo điều kiện dinh dưỡng

đầy đủ cho cây nuôi cấy in vitro sinh dưỡng tốt

c) Ánh sáng và nhiệt độ

Ánh sáng: Cường độ ánh sáng phù hợp trong khoảng 1000-5000 lux Thời gian chiếu sáng thường 16 giờ sáng/8 giờ tối

Nhiệt độ: Ảnh hưởng rất lớn đến sự sinh trưởng và phát triển của cây in

vitro Nhiệt độ tối ưu khoảng 20-250C

2.3 Công nghệ tạo hạt nhân tạo

2.3.1 Khái niệm

Năm 1978, Murashige phát hiện đầu tiên về kỹ thuật hạt nhân tạo Năm 1987, Redenbaugh và cộng sự đã phát triển thành công kỹ thuật tạo hạt nhân tạo Về cơ bản, hạt nhân tạo giống hạt tự nhiên, có cấu tạo là phôi vộ tính được bọc bởi lớp áo bên ngoài bởi lớp gel và có khả năng nẩy mầm như hạt tự nhiên, nhưng khác biệt là hạt nhân tạo không có phôi nhũ

Hình 2-2: Cấu tạo hạt nhân tạo

Năm 1988, McKersie và cộng sự đã tạo thành công hạt nhân tạo cây cỏ linh lăng, 65% hạt biến đổi sau bước làm khô Năm 1985, Kitto và Janick bọc hạt nhân tạo cà rốt bằng polyxyethylene đạt tỷ lệ sống 3% Janick (1988), tạo hạt nhân tạo thành công trên cần tây Gray (1987) thành công trên nho và cây cỏ nón Năm 1988, lúa mì được tạo hạt nhân tạo do Carman và cộng sự

2.3.2 Mục đích

Sự phát triển của công nghệ nuôi cấy in vitro, tái sinh thành cây hoàn chỉnh từ

phôi vô tính, đã mở rộng phạm vi ứng dụng mới cho việc tạo hạt nhân tạo nhằm mục đích vận chuyển, bảo quản, lưu trữ giống dễ dàng hơn Trong điều kiện tối ưu thì hạt sẽ nẩy mầm khỏi lớp vỏ nhân tạo còn không sẽ chuyển sang trạng thái ngừng sinh trưởng cho đến khi gặp điều kiện thuận lợi Ngoài ra, còn có nhiều lợi ích cho việc nhân giống nhanh những thực vật như:

- Không tạo được hạt

- Hạt tạo thành nẩy mầm với một số lượng thấp

- Khả năng hạt sống sót rất thấp sau khi bảo quản

2.3.3 Các nhân tố tạo hạt nhân tạo

2.3.3.1 Tạo phôi vô tính

Phôi soma được hình thành không thông qua quá trình tạo mô sẹo được gọi là phôi vô tính, phôi vô tính có thể tái sinh cây hoàn chỉnh hoặc nhân sinh khối trực tiếp bằng hệ thống nuôi cấy phù hợp

Phôi soma khác với phôi hợp tử, phôi hợp tử thành lập do sự phối hợp giữa giao tử đực và giao tử cái, khởi đầu được thành lập có cấu trúc đơn cực nối liền với

các mô mạch của mô sẹo Con phôi soma thành lập từ mô tế bào , có cấu trúc lưỡng

cực và không có mạch nối liền với mô sẹo

Năm 1958, khi những tế bào phôi thực vật đầu tiên được thu nhận từ mô dinh

dưỡng của cây cà rốt (Daucus carota) Sau đó, hàng loạt các mô thực vật khác sử dụng để nuôi cấy tạo phôi (Triticum aestivum và Glycine max)

Giai đoạn trước khi hình thành tế bào soma gọi là tiền phôi (PEDC- preembryogenic determined cell) (Sharp và csv, 1980) Vì tế bào tiền phôi có thể phân chia để hình thành tế bào phôi trực tiếp, gọi là phát sinh phôi trực tiếp

Bảng 2.1: Sự phát triển của mô trên môi trường nuôi cấy

Tuy có nhiều tế bào phát sinh tế bào phôi không cần các chất kích thích sinh trưởng như tế bào cây cà rốt, đậu ván… nhưng cũng có nhiều tế bào lại cần auxin để phân bào trước khi phát sinh tế bào phôi (IEDC- induced embryonic determined cell) (Sharp và scv, 1980) Và có nhiều tế bào hình thành phôi từ mô sẹo, sự phát sinh phôi tiến hành gián tiếp Ngoài ra, còn sử dụng tế bào phôi hợp tử để tạo phôi, ngoại trừ hạt được tạo trong quá trình thụ phấn mà kiểu di truyền không xác định

2.3.3.2 Cơ chế phát sinh phôi soma

Những quan sát chi tiết về quá trình phát sinh phôi phát hiện có 4 pha : 0, 1, 2

và 3, được nhận thấy trong giai đoạn đầu của tiến trình phát sinh phôi trong hệ thống nuôi cấy nói trên (Fujimura và Komamine, 1979)

Ở pha 0, những tế bào đơn (giai đoạn 0) hình thành những cụm tế bào có khả năng phát sinh phôi (giai đoạn 1) trên môi trường có auxin Trong suốt giai đoạn này, những cụm tế bào hình thành từ những tế bào đơn có khả năng tạo phôi khi môi trường nuôi cấy không có auxin, để hình thành những cụm tế bào giai đoạn 1 Sau đó, pha 1 xuất hiện khi cấy chuyển những cụm tế bào giai đoạn 1 qua môi trường không có auxin Trong suốt pha 1, những cụm tế bào tăng sinh chậm và dường như không biệt hóa

Sau pha 1 sự phân bào xuất hiện nhanh trên một phần của những cụm tế bào, dẫn đến việc hình thành những tế bào phôi hình cầu Pha này được gọi là pha 2

Pha tiếp theo sau, pha 3, cây con in vitro phát triển từ những phôi hình cầu qua

phôi hình tim và phôi hình thủy lôi

Hình 2-3: Các giai đoạn phát sinh phôi soma 2.3.3.3 Tạo vỏ bọc bằng sodium alginate

Có rất nhiều tác nhân tạo gel được sử dụng làm vỏ bọc cho phôi Đó có thể là agar, alginate, polyco 2133 (Bordon Co.), carboxyl methyl cellulose, carrageenan, gelrite (Kelko Co.), guargum, sodium pectate, tragacanth gum, dextran, xanthan gum … những hợp chất này sẽ đông lại thành gel khi được cho vào môi trường có chất điện phân thích hợp như đồng sulphate, calcium chloride hoặc ammonium chloride nhờ vào những liên kết ion Phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất để tạo vỏ bọc cho phôi đó là sử dụng sodium alginate (Bajaj, 1995; Jeon và csv, 1986; Redenbaugh và csv, 1993) Alginate được sử dụng nhiều do nó có những đặc tính rất thuận lợi như tính dính vừa phải, không gây độc cho phôi sinh dưỡng, có các đặc tính tương hợp sinh học, khả năng tạo thành gel nhanh, rẻ tiền, để được lâu, độ cứng của gel vừa phải để có thể vừa tạo thuận lợi cho sự hô hấp của phôi và vừa bảo vệ được phôi khỏi những tổn thương bên ngoài

Hình 2-4: Công thức hoá học của alginate

Alginate, chất hữu cơ mạch thẳng, kỵ nước, muối của acid alginic, là một polyuronic bao gồm -D-mannuronate (M) và mảnh bên C5 -L-guluronate (G) (Aoyagi và csv, 1998)

Nguyên tắc chính trong quá trình tạo vỏ bọc alginate đó là sodium alginate chứa phôi sẽ tạo thành từng hạt nhỏ, tròn và cứng khi nhỏ vào trong hỗn hợp NaCl2.2H2O nhờ vào sự trao đổi ion giữa ion Na+

có trong hỗn hợp sodium alginate với Ca2+ có trong hỗn hợp CaCl2.2H2O Vỏ bọc cứng nhiều hay ít là phụ thuộc vào

số lượng ion Na+ trao đổi với ion Ca2+ Do đó nồng độ của hai tác nhân tạo gel, sodium alginate và CaCl2.2H2O, và thời gian cho việc tạo liên kết ion phải thật tối

ưu để có thể tạo thành vỏ bọc ở một độ cứng thích hợp nhất

Không như phôi hợp tử, phôi vô tính thiếu lớp nội nhũ chứa chất dinh dưỡng bên ngoài nuôi phôi, do đó bằng việc thêm vào chất nền gel những chất dinh dưỡng, chất điều hòa tăng trưởng, carbohydrate sẽ tạo một nội nhũ nhân tạo thích hợp tối đa cho tăng trưởng và sống sót của phôi (Gray, 1990; Gray và Purohit, 1991; Redenbaugh và Walker, 1990) Ngoài ra nhằm tránh cho phôi bị mất nước, hay các tổn thương cơ học, tăng sức đề kháng cho phôi người ta có thể thêm vào chất nền gel chất kháng sinh, thuốc trừ nấm, trừ sâu, vi sinh vật

Mặc dù việc tạo hạt nhân tạo từ cách bọc phôi vô tính bằng sodium alginate cho thấy có một số thành công nhất định trong việc tái sinh cây con, vẫn còn nhiều vấn đề khó khăn khi sử dụng vỏ bao alginate này, chất dinh dưỡng có thể bị mất đi khỏi vỏ bao (Redenbaugh và csv, 1987), sự trao đổi khí kém (Redenbaugh và csv, 1993)… Đã có một số đề nghị cho rằng, việc thêm vào than hoạt tính sẽ giúp nâng

cao khả năng sống sót, phát triển của phôi vô tính hơn Nguyên nhân là do than hoạt tính tăng cường khả năng hô hấp của phôi, và nó giữ lại những chất dinh dưỡng nhiều hơn trong vỏ bọc, phóng thích chúng rất chậm dùng cho sự phát triển của phôi

2.3.3.4 Quy trình tạo hạt nhân tạo

Hình cầu Hình tim Hình thuỷ lôi Hình lá mầm

Hình 2-6: Quy trình tạo hạt nhân tạo

2.4 Nấm rễ cộng sinh- mycorrhiza

2.4.1 Khái niệm

Các loài thực vật khai thác từ đất trồng từ sự giúp ích của vi sinh vật có lợi được gọi là mycorrhiza (nấm vùng rễ) Các sợi nấm len lõi giữa các hạt đất, phát triển bên trong chất hữu cơ, thậm chí chúng còn xâm nhập vào vỏ côn trùng chết, từ

đó sử dụng các dưỡng chất hữu cơ và photphorus, sau đó trả lại cho cây trồng Như vậy, có sự kết hợp cao độ giữa nấm đất và rễ cây trồng trong đó các nấm tạo nên mycorrhiza thường là một số nấm Basidiomycetes, Ascomycetes, và Zygomycetes (theo Harley & Smith 1983, Kendrrick 1992, Brundrett 1992)

Nấm rễ là một thuật ngữ được Frank sử dụng lần đầu vào năm 1885 khi phát hiện mối liên hệ giữa sợi nấm và rễ trên cây thông và một số cây lá rộng, được lấy

từ chữ Hy Lạp “Mykes” và “Rhiza” Sau đó ghép từ tiếng Anh “Myco” vào thành

từ “Mycorrhiza”

Người ta dự đoán, trên thế giới ngày nay có 1000 chi 200 họ thực vật có nấm

rễ Theo thống kê của Trappe năm 1962 có 535 loài nấm thuộc 81 chi 30 họ 10 bộ

nấm có thể cộng sinh với trên 1500 loài cây gỗ khác nhau

Dung dịch sodium alginate Đưa phôi/chồi vào giọt sodium alginate

Rửa hạt trong nước cất 5 phút

để sạch CaCl2.2H2O Ngâm trong dung dịch CaCl2.7H2O 100

mM trong 15 phút

2.4.2 Các dạng mycorrhiza

2.4.2.1 Ectomycorrhiza

Được hình thành chủ yếu trên cây rừng do nhiều loài nấm đảm và một vài loài nấm túi Hầu hết bào tử của Ectomycorrhiza được sinh ra trên mặt đất và được phát tán nhờ gió Sợi nấm của Ectomycorrhiza thường sinh ra một lớp nấm phủ chung quanh phía ngoài của các rễ dinh dưỡng Các nấm này cũng đi vào bên trong rễ nhưng chỉ phát triển xung quanh các tế bào vỏ rễ thay thế một phần phiến mỏng và hình thành cái gọi là mạng lưới Hartig (Hartig net) Tuỳ thuộc vào màu sắc của nấm phát triển trên rễ mà Ectomycorrhiza có màu vàng, nâu, trắng, đen

2.4.2.2 Endomycorrhiza

Được hình thành trên hầu như tất cả cây trồng và trên một số cây rừng bởi các

nấm tiếp hợp, chủ yếu là giống Glomus và một số nấm khác như Acaulospora

Endomycorrhiza cũng được hình thành bởi một vài nấm đảm, rễ cây có Endomycorrhiza bên ngoài giống với rễ không có mycorrhiza về hình dạng và màu sắc (Agrios, 1997)

a)Vesicular –arrbuscular mycorrhiza (=arrgbusular mycorrhiza, VAM hoặc AM)

Đây là nhóm phổ biến, hiện diện trên cả cây thân gỗ, là nhóm mycorrhiza quan trọng nhất trong Endomycorrhiza Các sợi nấm mọc bên trong tế bào vỏ của rễ dinh dưỡng hình thành vòi hút gọi là bụi (arbuscules) hoặc hình thành các u sưng lớn dự trữ thức ăn gọi là túi nang (vesicules) Bào tử được hình thành trong đất

2.4.3 Tác động có ích của mycorrhiza

Mối quan hệ giữa lan và nấm là mối quan hệ mật thiết, trên 80% loài lan đều

có mối quan hệ với nấm Theo Currah et al (1997), nhóm nấm chính ở rễ lan là Basidiomycetes mặc dù cũng có Ascomycetes, tuy nhiên Ba sidiomycetes cũng là

tác nhân gây bệnh trên những cây khác như nấm Rhizoctonia solani (theo Harley,

1982) Thậm chí, nấm cộng sinh trên loài lan này là tác nhân gây bệnh cho loài lan khác, và lan có khả năng điều tiết sự xâm nhiễm và phát triển của nấm cộng sinh

2.4.3.1 Mở rộng diện tích hấp thu của rễ cây

Sợi nấm cộng sinh là cơ quan hấp thu chủ yếu của rễ nấm, sợi nấm có thể kéo dài ra xung quanh rễ làm tăng tốc độ hút P lên gấp 6 lần Tuổi thọ của thể sợi nấm cũng vượt xa lông hút

2.4.3.2 Sự trao đổi dinh dưỡng

Do hạt lan không dự trữ chất dinh dưỡng nên sự nẩy mầm của hạt phụ thuộc vào mycorrhiza Mycorrhiza ở lan khác với loại mycorrhiza khác về bản chất trao đổi dinh dưỡng Sau khi hình thành mycorrhiza, cacbon hữu cơ và những chất dinh dưỡng đi vào hạt Bởi vì sự nẩy mầm của hạt lan khi không có sự cộng sinh với nấm đòi hỏi phải có các chất đường, acid amin và vitamin nên người ta giả định rằng hạt lan nhận được các chất này từ nấm để nẩy mầm Sau đó, nấm tiếp tục cung cấp nguồn năng lượng cho cây lan

Còn đối với các cây trong đất, do lượng P cố định, thường các gốc phosphat kết hợp với Fe, Na, Al khó di động Do đó, nấm rễ ngoại cộng sinh làm nhiệm vụ sản sinh enzyme phosphorase chuyển P không tan thành P hòa tan, tăng khả năng hấp thụ của rễ, cung cấp cho cây trồng

2.4.3.3 Sự hình thành chất kích thích sinh trưởng mycorrhiza

Trong quá trình cộng sinh với rễ cây, nấm hình thành nhiều chất kích thích sinh trưởng như auxin, cytokinin, gibberellin, vitamin B1, indole-3acetic acid (IAA)

2.4.3.4 Nâng cao sức chống chịu của cây

Nhiều nghiên cứu đều chứng minh, sau khi nhiễm nấm cho cây, cây chủ có khả năng chống khô hạn, chống chịu mặn, nhiệt độ, độ ẩm và pH cực đoan, kim loại nặng

2.4.3.5 Tăng khả năng kháng bệnh của cây trồng

Năm 1942, Davis phát hiện nấm rễ cộng sinh có thể làm giảm bớt bệnh hại rễ Năm 1968, 1982, 1994 nhiều tác giả đều đề cập đến nấm cộng sinh có thể giảm bệnh thối rễ thông xuống 25%, còn làm giảm bệnh do tuyến trùng, bệnh mốc sương, bệnh bướu rễ (Trần Văn Mão, 1999)

2.4.4 Sự xâm nhập của mycorrhiza

Nấm có thể xâm nhập qua hạt, rễ, hoặc thân Đối với hạt, nấm mọc xuyên qua hạt vào bên trong lông biểu bì Còn ở rễ, nấm thường mọc xuyên qua vỏ rễ nơi gần đầu rễ lối vào là một tế bào “cửa” của ngoại bì Nấm nhanh chóng lan rộng khắp vỏ Trong mỗi tế bào vỏ rễ, sợi nấm xoắn cuộn dày đặc, được gọi là “ peleton” (Harley, 1982)

CHƯƠNG 3

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Đối tượng thí nghiệm

Cả hai nội dung đều làm thí nghiệm trên cây lan

3.2 Thời gian thực hiện

Thời gian thực hiện đề tài từ tháng 3/2007 đến tháng 8/2007 tại phòng nuôi cấy mô_ Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học và phòng thực tập bệnh cây _ khoa Nông Học_ trường Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh

3.3 Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Nghiên cứu kỹ thuật tạo hạt nhân tạo từ phôi cây lan Vanda

Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ sodium alginate đến sự hình thành

hạt nhân tạo

Phôi soma đem bọc vỏ hạt ở các nồng độ alginate khác nhau xác định ảnh hưởng lên tính chất vỏ hạt nhân tạo

Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của môi trường tạo hạt nhân tạo

Sử dụng môi trường MS có nồng độ khoáng đa lượng khác nhau  xác định

tỷ lệ sống của hạt nhân tạo

Thí nghiệm 3: Khảo sát môi trường bảo quản hạt nhân tạo

Hạt nhân tạo sau khi tạo xong đem lưu trữ ở các môi trường khác nhau  Xác định điều kiện môi trường bảo quản tối ưu

Thí nghiệm 4: Khảo sát sự nẩy mầm của hạt nhân tạo trên các giá thể khác nhau

Hạt nhân tạo cho nẩy mầm trên các giá thể khác nhau  xác định tỷ lệ nẩy mầm của hạt nhân tạo

Nội dung 2: Khảo sát sự hiện diện của mycorrhiza trên một số giống lan

Lấy mẫu rễ lan Dendrobium lai, Dendrobium rừng, Catleya, Ngọc Điểm đem nhuộm quan sát hình dạng và sự có mặt của mycorrhiza trên các giống lan

3.4 Vật liệu nghiên cứu

3.4.1 Trang thiết bị và dụng cụ nghiên cứu

Thiết bị: Tủ cấy vô trùng, nồi hấp (autolave), máy đo pH, cân điện tử, đèn neon

Dụng cụ: Pince, kéo, dao cấy, chai nước biển, đĩa petri, đèn cồn, ống đong, pipet

3.4.2 Mẫu sử dụng và điều kiện nuôi cấy

Mẫu: Dùng phôi vô tính hay chồi cây lan

Điều kiện phòng nuôi cấy: