Nghiên cứu định lượng paraquat trong huyết tương người bằng phương pháp điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc CE – c4d

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --- ĐỖ THỊ TRANG NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG PARAQUAT TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI MAO QUẢN SỬ DỤNG DETECTOR D

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

ĐỖ THỊ TRANG

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG PARAQUAT

TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI BẰNG PHƯƠNG PHÁP

ĐIỆN DI MAO QUẢN SỬ DỤNG DETECTOR

D)

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

ĐỖ THỊ TRANG

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG PARAQUAT TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI MAO QUẢN SỬ DỤNG DETECTOR ĐỘ DẪN KHÔNG

TIẾP XÚC (CE-C4D) Chuyên ngành: Hóa phân tích

Mã số: 60440118

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

PGS.TS Tạ Thị Thảo

TS Nguyễn Thị Ánh Hường

Hà Nội – 2018

LỜI CẢM ƠN

Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn cô giáo PGS.TS Tạ Thị Thảo và cô giáo TS Nguyễn Thị Ánh Hường đã giao đề tài, nhiệt tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất giúp em thực hiện luận văn này

Em xin chân thành cảm ơn các thầy, cô trong bộ môn Hóa Phân tích nói riêng và trong khoa Hóa học nói chung đã dạy dỗ, chỉ bảo và động viên em trong suốt thời gian em học tập tại trường Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội

Em xin gửi tới Ban lãnh đạo và toàn thể nhân viên trong trung tâm Chống độc – bệnh viện Bạch Mai, đặc biệt là các anh chị trong phòng xét nghiệm độc chất lời cảm ơn sâu sắc nhất, cảm ơn các anh chị đã giúp đỡ, động viên em rất nhiều trong quá trình thực hiện đề tài tại trung tâm

đã hỗ trợ các trang thiết bị cũng như tư vấn kỹ thuật trong quá trình thực hiện nghiên cứu này

Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình, các anh chị và các bạn sinh viên của Bộ môn Hóa phân tích đã luôn động viên tinh thần, tận tình giúp đỡ em trong thời gian học tập và thực hiện luận văn này

Hà Nội, ngày 09 tháng 02 năm 2018

Học viên

Đỗ Thị Trang

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về paraquat 3

1.1.1 Công thức hóa học, tính chất lý hoá học của paraquat 3

1.1.2 Thực trạng sử dụng paraquat hiện nay 4

1.1.3 Cơ chế gây độc của paraquat 5

1.1.4 Dược động học paraquat 6

1.2 Các phương pháp xác định paraquat 7

1.2.1 Phương pháp quang phổ 7

1.2.2 Phương pháp sắc ký khí khối phổ (GC-MS) 8

1.2.3 Phương pháp sắc ký lỏng 9

1.2.4 Phương pháp điện di mao quản (CE) 12

1.3 Các phương pháp xử lý mẫu sinh học (huyết tương, nước tiểu) nhằm phân tích paraquat 15

1.3.1 Phương pháp chiết lỏng- lỏng 15

1.3.2 Phương pháp chiết pha rắn 17

1.4 Kết luận chung phần tổng quan 20

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 22

2.1 Trang thiết bị, hóa chất 22

2.1.1 Thiết bị, dụng cụ 22

2.1.2 Chất chuẩn 24

2.1.3 Hóa chất, dung môi 24

2.1.4 Chuẩn bị các dung dịch hóa chất 25

2.2 Nội dung và đối tượng nghiên cứu 26

2.3 Phương pháp nghiên cứu 28

2.4 Các thông số đánh giá độ tin cậy của phương pháp phân tích 31

2.5 Ước lượng độ không đảm bảo đo 35

2.5.1 Độ không đảm bảo đo của đường chuẩn 35

2.5.2 Độ không đảm bảo đo tổng hợp 37

2.6 Phân tích PQ trong huyết tương bệnh nhân ngộ độc PQ 37

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39

3.1 Khảo sát các điều kiện tối ưu tách paraquat bằng phương pháp điện di mao quản sử dụng detector đo độ dẫn không tiếp xúc (CE – C4D) 39

3.1.1 Khảo sát ảnh hưởng của hệ đệm 39

3.1.2 Khảo sát các cation ảnh hưởng đến quá trình phân tách PQ 45

3.1.3 Xây dựng đường chuẩn PQ từ dung dịch chuẩn 46

3.1.4 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của thiết bị (IDL) 48

3.1.5 Đánh giá độ chụm (độ lặp lại) của thiết bị 49

3.2 Nghiên cứu quy trình tách chiết PQ trong nền mẫu huyết tương bằng phương pháp chiết pha rắn 50

3.2.1 Khảo sát khả năng loại bỏ cation của cột C18 50

3.2.2 Khảo sát khả năng tách PQ khi sử dụng và không sử dụng EDTA 10-3M 51 3.2.3 Khảo sát nồng độ EDTA trong bước tiền xử lý mẫu huyết tương 53

3.2.4 Khảo sát pH mẫu 54

3.2.5 Khảo sát loại chất hoạt động bề mặt 55

3.2.6 Khảo sát thành phần, tỉ lệ dung dịch rửa tạp 57

3.2.7 Khảo sát dung dịch rửa giải 59

3.2.8 Khảo sát tỉ lệ axit acetic trong dung dịch rửa giải 62

3.3 Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp 63

3.3.1 Đánh giá độ chọn lọc 63

3.3.2 Xây dựng đường chuẩn PQ trên nền mẫu huyết tương 64

3.3.3 Đánh giá phương trình hồi quy của đường chuẩn 66

3.3.4 Đánh giá độ chính xác của phương pháp 66

3.3.5 Xác định giới hạn phát hiện của phương pháp 68

3.4 Phân tích mẫu thực tế và đối chứng kết quả phân tích bằng phương pháp CE – C4D với phương pháp HPLC 69

3.4.1 Định lượng nồng độ PQ trong mẫu huyết tương bệnh nhân bằng phương pháp CE – C4D 69

3.4.2 Đối chứng kết quả phân tích với phương pháp HPLC 72

KẾT LUẬN 75

TÀI LIỆU THAM KHẢO 77

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Công thức hóa học của paraquat 3

Hình 1.2 Công thức hóa học dạng muối paraquat 3

Hình 1.3 Cơ chế gây độc của paraquat 5

Hình 2.1 Ảnh chụp hệ thiết bị CE – C4D sử dụng nghiên cứu 23

Hình 3.1 Điện di đồ sự ảnh hưởng của pH đến sự phân tách PQ 40

Hình 3.2 Điện di đồ sự ảnh hưởng của thành phần dung dịch điện di đến khả năng phân tách PQ 42

Hình 3.3 Điện di đồ sự ảnh hưởng của nồng độ đệm điện di đến khả năng phân tách PQ 44

Hình 3.4 Điện di đồ sự ảnh hưởng của các cation đến tín hiệu PQ 45

Hình 3.5 Đường chuẩn của PQ trên dung dịch chuẩn 47

Hình 3.6 Điện di đồ minh chứng sự loại bỏ cation Na+ 140 mM của cột C18 51

Hình 3.7 Điện di đồ minh chứng sự loại bỏ cation Ca2+ 5 mM của cột C18 51

Hình 3.8 Điện di đồ minh chứng hiệu quả sử dụng của EDTA đến sự phân tách PQ 52

Hình 3.9 Điện di đồ ảnh hưởng của nồng độ EDTA đến sự phân tách PQ 54

Hình 3.10 Điện di đồ phân tích mẫu SPE ở các điều kiện pH khác nhau 55

Hình 3.11 Điện di đồ sự ảnh hưởng của chất HĐBM trong quá trình SPE đến khả năng phân tách PQ 56

Hình 3.12 Kết quả phân tích điện di sau khi chiết pha rắn sử dụng các loại dung dịch rửa tạp khác nhau 57

Hình 3.13 Điện di đồ sự ảnh hưởng của tỉ lệ dung dịch rửa tạp đến khả năng phân tách PQ 58

Hình 3.14 Điện di đồ ảnh hưởng của thành phần dung dịch rửa giải đến khả năng phân tách PQ 60

Hình 3.15 Kết quả sự ảnh hưởng của HCl trong dung dịch rửa giải đến tín hiệu PQ 61

Hình 3.16 Đồ thị thể hiện phụ thuộc diện tích pic PQ vào thể tích HCl thêm vào

trong dung dịch rửa giải 61 Hình 3.17 Điện di đồ thể hiện sự ảnh hưởng của tỉ lệ axit acetic trong dung dịch rửa

giải đến PQ 62 Hình 3.18 Quy trình chiết dung dịch mẫu trên cột C18 sử dụng chất tạo cặp ion 63 Hình 3.19 Độ chọn lọc của phương pháp 64 Hình 3.20 Đường chuẩn của PQ trong huyết tương 65 Hình 3.21 Điện di đồ thể hiện nồng độ PQ vào viện của 5 bệnh nhân ngộ độc PQ 71 Hình 3.22 Điện di đồ thể hiện nồng độ PQ từ lúc vào viện đến sau lọc hấp phụ lần

3 của một bệnh nhân điển hình 71 Hình 3.23 Đồ thị thể hiện mối quan hệ nồng độ PQ trong huyết tương giữa 2

phương pháp CE – C4D và HPLC 74

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Cách pha dung dịch chuẩn gốc 35 Bảng 2.2 Cách pha dung dịch chuẩn trung gian 40 μg/ml 36

Bảng 2.3 Cách pha đường chuẩn và độ không đảm bảo đo 36

Bảng 3.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH đến diện tích pic (Spic) và thời gian

di chuyển (tdc) của PQ chuẩn 40 Bảng 3.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thành phần dung dịch đệm điện di đến

diện tích pic (Spic)và thời gian di chuyển (tdc) của PQ chuẩn 42 Bảng 3.3 Kết quả khảo sát sự phụ thuộc của diện tích pic (Spic) và thời gian di

chuyển (tdc ) của PQ vào nồng độ dung dịch đệm điện di 44 Bảng 3.4 Điều kiện tối ưu cho phân tích PQ bằng phương pháp CE – C4D 46 Bảng 3.5 Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ dung dịch PQ chuẩn 47 Bảng 3.6 Giới hạn phát hiện của PQ xác định bằng phương pháp điện di mao quản

CE – C4D 48 Bảng 3.7 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của PQ xác định

bằng phương pháp điện di mao quản CE – C4D 49

lượng PQ 49 Bảng 3.9 Ảnh hưởng của nồng độ EDTA đến hiệu suất thu hồi PQ trong huyết

tương 53 Bảng 3.10 Kết quả hiệu suất thu hồi PQ ở các pH khác nhau 55 Bảng 3.11 Kết quả hiệu suất thu hồi PQ khi sử dụngchất HĐBM khác nhau trong

SPE 56 Bảng 3.12 Kết quả hiệu suất thu hồi PQ khi sử dụng các loại dung dịch rửa tạp

khác nhau 58 Bảng 3.13 Kết quả hiệu suất thu hồi PQ ở các tỉ lệ dung dịch rửa tạp khác nhau 59 Bảng 3.14 Kết quả hiệu suất thu hồi PQ khi sử dụng các dung dịch rửa giải khác

nhau 60

Bảng 3.15 Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ PQ trong mẫu huyết tương

64

Bảng 3 16 Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp bằng thêm chuẩn PQ 66

Bảng 3.17 Kết quả xác định độ lặp lại của phương pháp chiết pha rắn trong định lượng PQ trong huyết tương trên nền mẫu thực 67

Bảng 3.18 Kết quả xác định độ tái lặp của phương pháp 68

Bảng 3.19 Kết quả xác định giới hạn phát hiện của phương pháp (MDL) 69

Bảng 3.20 Cách pha dung dịch chuẩn gốc 35

Bảng 3.21 Cách pha dung dịch chuẩn trung gian 40 μg/ml 36

Bảng 3.22 Cách pha đường chuẩn và độ không đảm bảo đo 36

Bảng 3.23 Kết quả định lượng PQ trên 50 bệnh nhân 70

Bảng 3.24 Kết quả đối chứng nồng độ PQ trong huyết tương bằng phương pháp HPLC 72

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

deviation

% Độ lệch chuẩn tái lặp tương đối

Ghi chú: tên hóa chất viết theo nguyên gốc tiếng anh

MỞ ĐẦU

Paraquat (viết tắt củ a paraquaternary bipyridyl) là một thuốc diệt cỏ giá

thành rẻ, hiệu quả diệt cỏ rất tốt nên thường được sử dụng rộng rãi tại Việt Nam Mặc dù paraquat (PQ) rất thân thiện với môi trường nhưng lại rất độc đối với con người Liều tử vong của PQ đối với người trưởng thành ước tính là khoảng 10 ml dung dịch 20% Trong những năm gần đây, trên thế giới cũng như Việt Nam đã có rất nhiều trường hợp ngộ độc PQ (do vô tình hay có chủ ý) [2] Tại trung tâm Chống độc (TTCĐ) - bệnh viện Bạch Mai, số lượng bệnh nhân ngộ độc PQ gia tăng đáng

kể, năm 2014 đã có 391 ca ngộ độc, năm 2015 đã tăng lên đến 401 ca, năm 2016 là

458 ca và 6 tháng đầu năm 2017 là 200 ca Trong đó tỉ lệ tử vong là 72,9% [3] Hầu hết các bệnh nhân ngộ độc PQ đều ở mức độ nặng và tỉ lệ tử vong rất cao Trước thực tế đó, trong những năm trước đã có rất nhiều quốc gia (32 quốc gia) cấm lưu hành và sử dụng PQ, tuy nhiên đến ngày 08/02/2017 Việt Nam mới ban hành thông

tư về việc loại bỏ PQ ra khỏi danh mục các hóa chất bảo vệ thực vật (HCBVTV) được phép sử dụng [1] Mặc dù vậy, số lượng bệnh nhân ngộ độc PQ và đến cấp cứu tại TTCĐ có suy giảm nhưng không đáng kể (từ tháng 1/2017- 6/2017 đã có khoảng 200 ca ngộ độc)

Để định lượng PQ trong huyết tương, các phương pháp phân tích thường được sử dụng bao gồm: phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC- MS), sắc ký khí khối phổ (GC-MS), phương pháp điện di mao quản khối phổ (CE-MS), phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)… Hiện tại, việc phân tích PQ phục vụ cho chẩn đoán và điều trị cũng đã được triển khai tại trung tâm Chống độc - bệnh viện Bạch Mai (sử dụng phương pháp so màu để định tính PQ và định lượng nồng độ PQ trong huyết tương bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC) Tuy nhiên, nhiều bệnh viện tuyến địa phương chưa được trang bị thiết bị HPLC, trong khi đó việc định lượng sớm nồng độ PQ trong huyết tương để xác định mức độ nặng và tiên lượng khả năng sống cũng như tiến hành lọc máu hấp phụ là rất quan trọng Do

đó, một vấn đề đặt ra là làm thế nào để có được một trang thiết bị có giá thành thấp,

có thể trang bị được tại địa phương mà vẫn có thể xác định được nồng độ PQ trong huyết tương, phục vụ nhanh chóng, kịp thời trong điều trị Trên cơ sở đó, chúng tôi

đã tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu định lượng paraquat trong huyết tương người bằng phương pháp điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc (CE-C 4 D)” với hi vọng đóng góp một phần trong chẩn đoán và điều trị sớm cho

những bệnh nhân ngộ độc paraquat tại các bệnh viện tuyến địa phương

Luận văn này thực hiện với mục tiêu nghiên cứu quy trình xử lý mẫu paraquat trong huyết tương, từ đó định lượng paraquat bằng phương pháp điện di

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1.1 Công thức hóa học, tính chất lý hoá học của paraquat

 Công thức hóa học

Paraquat là từ viết tắt của paraquaternary bipyridyl, tên khoa học là

1,1'-dimethyl-4,4' bipyridilium PQ thuộc nhóm hợp chất amin bậc 4, là thuốc diệt cỏ được sử dụng rộng rãi nhất hiện nay với đặc tính diệt cỏ nhanh và hiệu quả

Paraquat có khối lượng phân tử tương đối là 186,2 g/mol và có công thức hóa học như Hình 1.1:

Hình 1.1 Công thức hóa học của paraquat

Tuy nhiên, hiện nay paraquat thường được sử dụng dưới dạng muối và chủ yếu là muối dichloride như Hình 1.2:

Hình 1.2 Công thức hóa học dạng muối paraquat

 Tính chất lý, hóa học của paraquat

1,260; điểm chảy 175-180oC, điểm sôi khoảng 300oC và pH của dung dịch PQ trong nước là 6,5-7,5

PQ thường ở dạng muối, chủ yếu là muối dichloride ở dạng tinh thể trắng,

PQ ổn định trong môi trường axit hoặc trung tính, không ổn định trong môi trường kiềm

PQ tan tốt trong nước (độ tan 700 g/l ở 20oC), ít tan trong các dung môi hữu cơ, PQ bị phân hủy dưới ánh sáng UV, bị bất hoạt bởi các tác nhân hoạt động

bề mặt anionic và bởi đất sét, bị mất hoạt tính nhanh khi tiếp xúc với đất, PQ không bay hơi Dung dịch PQ đặc ăn mòn thép, tấm thiếc, sắt mạ kẽm và nhôm [39]

1.1.2 Thực trạng sử dụng paraquat hiện nay

Paraquat thuộc nhóm trừ cỏ dại Bipyridylium được tập đoàn ICI phát minh

năm 1955, được thương mại hóa và sử dụng năm 1962 [34] Hiện nay, ngoài công

ty Syngenta (Thụy Sỹ), Sundat (Singapore) và United Phosphorus (Ấn Độ) thì hơn

15 doanh nghiệp thuốc BVTV Trung Quốc sản xuất và đưa ra thị trường thế giới một lượng lớn thuốc trừ cỏ PQ

PQ được sản xuất và sử dụng chủ yếu ở 2 dạng chế phẩm SG (hạt tan trong nước) và SL (dung dịch đậm đặc), PQ và thành phẩm chưa PQ thuộc nhóm độc loại

II, không tồn tại lâu trong môi trường sống, tan nhanh trong nước Hiện tại, có hơn

90 quốc gia đăng ký và sử dụng PQ (với mức độ sử dụng khác nhau), trong đó có nhiều nước có nền nông nghiệp phát triển Tuy nhiên, với thực trạng ngộ độc và tử vong do PQ trên thế giới, rất nhiều quốc gia phải xem xét lại công tác quản lý thuốc trừ cỏ PQ, rà soát lại mức độ sử dụng, thậm chí có thể hạn chế, cấm sử dụng

Trong danh mục thuốc BVTV được phép sử dụng ở Việt Nam (ban hành kèm theo thông tư số 21/2013/TT-BNNPTNT) ngày 16/4/2013 của Bộ trưởng Bộ

NN & PTNT) có 45 tên thương phẩm thuốc paraquat, trong đó 41 thành phẩm dạng

SL, 3 thành phẩm dạng AS và 1 thành phẩm dạng WP Tổng số thuốc Paraquat được nhập vào VN năm 2011 là 6895,698 lít, năm 2012 là 10699,374 lít (tăng 15%

so sới năm 2011)và năm 2013 là 9953,223 lít (giảm 7% so với năm 2012) Tổng cộng số lượng paraquat thành phẩm 20% được nhập khẩu và sử dụng ở VN trong 3 năm (2011-2013) là 27548,295 lít (lượng dùng trung bình từ 1,5 – 2,0 L/ha) Trong

số này 17% lượng nhập khẩu từ Syngenta, 70% từ các công ty Trung quốc, số còn lại từ Singapore và Ấn Độ Lượng thuốc trừ cỏ chứa thành phần PQ vẫn được nước

ta ưu tiên sử dụng hàng đầu trong việc diệt cỏ Bên cạnh đó, có rất nhiều người dân

sử dụng sai mục đích của thuốc trừ cỏ PQ đó là dùng để tự tử Hàng năm, trung tâm Chống độc – bệnh viện Bạch Mai đã tiếp nhận rất nhiều trường hợp ngộ độc PQ và trong số đó tỉ lệ tử vong rất cao Năm 2011 tỉ lệ tử vong đối với các bệnh nhân ngộ độc PQ là 72,9% Tỉ lệ này tiếp tục được gia tăng trong những năm gần đây Trước thực trạng đó, đầu năm 2017 (08/02/2017), Bộ NN & PTNT đã đưa ra quyết định loại bỏ PQ ra khỏi danh mục thuốc BVTV được phép sử dụng tại Việt Nam Tuy nhiên, với lượng PQ đã nhập những năm trước (theo thống kê trên) thì PQ vẫn còn tồn dư rất nhiều, có thể sử dụng được trong một thời gian khá dài Do vậy, nguy cơ người dân dùng PQ tự tử vẫn có khả năng xảy ra cao

Diquat cũng là một hóa chất diệt cỏ nhanh và hiệu quả Diquat có tính chất khá giống với paraquat, trong điều kiện thích hợp diquat có thể chuyển thành paraquat và ngược lại Tuy nhiên, ở Việt Nam, diquat không được tìm thấy trong các báo cáo về thành phần thuốc bảo vệ thực vật

1.1.3 Cơ chế gây độc của paraquat

Cơ chế gây độc của PQ [13] được thể hiện ở Hình 1.3:

Hình 1.3 Cơ chế gây độc của paraquat

Trong giai đoạn đầu của chu trình này, ion PQ2+ cùng với NADPH trải qua

trình oxy hoá - khử của PQ xảy ra liên tục, với việc NADPH liên tục bị mất đi và không ngừng tạo ra gốc superoxid Gốc tự do superoxid sau đó phản ứng với bản thân nó để tạo ra peroxid hydro (H2O2) và với H2O2 cùng Fe để tạo thành gốc tự do hydroxyl [17],[ 32] Cạn kiệt NADPH dẫn tới chết tế bào Chu trình oxy hoá - khử tạo thành gốc tự do hydroxyl dẫn tới nhiều cơ chế làm tổn thương tế bào: phản ứng với lipid trên màng tế bào (peroxide hoá lipid), DNA và các protein tối cần thiết cho

tế bào sống sót cũng bị các gốc tự do hydroxyl phá hủy [11],[ 35],[ 36]

1.1.4 Dược động học paraquat

1.1.4.1 Hấp thu

Ở đường tiêu hoá PQ được hấp thu rất nhanh nhưng ít (5-10%) Hấp thu chủ yếu ở ruột non Khi dạ dày ruột bị tổn thương lan rộng, số lượng chất độc được hấp thu sẽ tăng lên, PQ không gắn với protein huyết tương Nồng độ đỉnh của PQ trong huyết tương đạt được trong vòng 2 giờ sau uống [5] Tiếp xúc qua da, hấp thu vào

cơ thể nói chung chỉ xảy ra khi tiếp xúc kéo dài hoặc da bị tổn thương Tiếp xúc với

PQ qua đường hô hấp không làm cho lượng PQ được hấp thu đến mức đủ để gây

PQ không đi sâu được xuống đường hô hấp để hấp thu [5] Mắt tiếp xúc với PQ sẽ

bị tổn thương, nhưng không đủ để gây nhiễm độc toàn thân

1.1.4.2 Phân bố

Sau khi uống, PQ phân bố nhanh chóng nhất tới tất cả các cơ quan chính như phổi, thận, gan và cơ, đặc biê ̣t là phổi , PQ sẽ bi ̣ khử thành da ̣ng gốc tự do hoa ̣t tính cao [7] Thể tích phân bố của PQ là 1,2 - 1,6 l/kg

PQ đạt được nồng độ cao và tồn tại lâu hơn trong phổi, nồng độ trong phổi

có thể cao hơn so với nồng độ huyết tương gấp 50 lần Sau uống 5-7 giờ, nồng độ

PQ trong tổ chức phổi đạt cao nhất Tuy nhiên, lượng PQ huyết tương cũng cần đạt đến một ngưỡng tới hạn để cho quá trình hấp thu ở phổi diễn ra [10]

PQ qua được nhau thai Trong một nghiên cứu, nồng độ PQ trong dịch ối và máu dây rốn, bào thai cao hơn nồng độ trong máu mẹ 4-6 lần [10] Không có bào thai nào sống sót Tuy nhiên nếu mẹ ngộ độc PQ còn sống thì đến lần có thai sau không nguy hiểm đến bào thai

1.1.4.3 Chuyển hoá, thải trừ

PQ được đào thải hầu như hoàn toàn qua thận nhờ cả quá trình lọc của cầu thận và quá trình bài tiết tích cực của ống thận Trong vòng 12-24 giờ sau uống, trên 90% PQ được đào thải dưới dạng không đổi qua thận, nếu chức năng thận bình thường [10] Tuy nhiên có thể xét nghiệm thấy PQ trong nước tiểu vài ngày sau do

có sự tái phân bố PQ từ các cơ quan Thời gian bán thải của PQ có thể kéo dài

12-120 giờ hoặc lâu hơn khi có suy thận Ngoài ra PQ còn đào thải qua phân dướ i da ̣ng không đổi

1.2.1 Phương pháp quang phổ

Phương pháp quang phổ được ứng dụng rất rộng rãi để định lượng paraquat trong huyết tương Phương pháp dựa trên sự khử ion paraquat trong môi trường kiềm hay phản ứng hóa học để tạo ra một dung dịch có màu xanh và tiến hành đo phổ trong vùng Vis Áp dụng định luật Beer có thể định lượng được nồng độ paraquat trong huyết tương

Rai M.K và các cộng sự [31] đã sử dụng NaBH4 để khử paraquat trong môi trường kiềm tạo thành một dung dịch màu xanh có bước sóng hấp thụ cực đại là 600

nm Tuy nhiên, tác giả Kato K và các cộng sự [19] lại cho PQ phản ứng với

tetrabromophenolphthalein etyl este (TBPE) tạo thành một hợp chất PQ-TBPE có màu xanh, sau đó hợp chất này được chiết ra khỏi mẫu bằng dung môi dichloromethan Dung dịch này có phổ cực đại ở bước sóng 603 nm

Phương pháp khử PQ bằng NaBH4 cho độ nhạy cao vì có sự chọn lọc rất lớn đối với PQ Sự khử này không bị ảnh hưởng bởi các hoạt chất thuốc trừ sâu khác (TTS) và các kim loại trong mẫu Tác giả cũng đã so sánh một số các tác nhân khử như axit ascobic, natri dithionite với NaBH4, báo cáo cho thấy rằng tác nhân NaBH4 cho độ nhạy tốt nhất với khoảng tuyến tính là 0,05 - 0,5 µg/ml tuân theo định luật Lambert – Beer, trong khi giới hạn phát hiện là 0,03 µg/ml Nghiên cứu

của Rai M.K và cộng sự đã đưa ra phương pháp định lượng riêng rẽ PQ (không có

sự ảnh hưởng của DQ) DQ là một hoạt chất TTS có cấu trúc và tính chất gần giống như PQ Trong việc định lượng PQ sẽ có sự ảnh hưởng rất lớn của DQ Tuy nhiên NaBH4 đã loại bỏ được ảnh hưởng này [31] Đối với nghiên cứu của Kato K và

cộng sự, hợp chất màu xanh được tạo thành bao gồm PQ-TBPE, DQ-TBPE với bước sóng cực đại lần lượt là 603 nm và 608 nm Phổ của 2 hợp chất này chồng lên nhau, trong quá trình định lượng riêng rẽ PQ là rất khó khăn, phải sử dụng các biểu thức toán học theo tính chất cộng tính của định luật Beer Giới hạn phát hiện PQ

Phương pháp định lượng PQ sử dụng tác nhân khử NaBH4 có thể áp dụng cho nhiều đối tượng mẫu khác nhau: sữa, nước tiểu, huyết tương hay các mẫu thực phẩm với hiệu quả tốt

1.2.2 Phương pháp sắc ký khí khối phổ (GC-MS)

Phương pháp GC-MS là phương pháp đơn giản có độ nhạy và độ tin cậy cao,

từ lâu đã được sử dụng để định lượng PQ trong dịch sinh học Nghiên cứu của Gao

L [20] và Almeida R.M [30] cũng sử dụng phương pháp này để định lượng PQ Cả

này đều được cho qua cột chiết pha rắn SPE Trong quá trình chạy sắc ký khí sử dụng chế độ chọn lọc ion SIM, chất nội chuẩn ethyl paraquat (EPQ), sử dụng khí

He làm khí mang để đưa chất phân tích vào cột Tuy nhiên, mỗi nghiên cứu lại có một điều kiện tối ưu chạy sắc ký khác nhau

Gao L sử dụng cột tách sắc ký là cột mao quản loại Rtx- 5 (10m x 0,18mm x

0,25µm) Nhiệt độ của buồng bơm mẫu, interface, nguồn ion lần lượt là 2800C,

chế độ chia dòng (split) (10:1) Nhiệt độ buồng ban đầu là 700C trong 1 phút, sau đó

giữ trong 10 phút[20] Trong khi đó, Almeida M.R sử dụng cột tách mao quản loại

HP-5MS (30m x 0,25mm x 0,1µm), tốc độ khí mang He là 0,6 ml/phút Bộ phun mẫu hoạt động ở chế độ không chia dòng (splitless) Nhiệt độ buồng được duy trì ở

800C trong 1 phút, tăng đến 2000C với tốc độ 100C/phút, sau đó tăng lên đến 2700C với tốc độ 200C/phút, giữ ở 2700C trong 4 phút [30]

Phương pháp nghiên cứu của Gao.L sử dụng các mảnh ion có khối lượng

m/z= 196 và 224 lần lượt dùng để định lượng PQ và EPQ Phương pháp này cho kết

quả hiệu suất thu hồi cao hơn phương pháp trong nghiên cứu của Almeida M.R (với

mẫu nước tiểu: 95-100%; mẫu huyết tương : 94-99,85%), khoảng tuyến tính nằm trong khoảng 0,1-50 ppm, giới hạn phát hiện của PQ trong các mẫu sinh học rất tốt

đạt 0,01 ppm trong khi phương pháp của Almeida M.R chỉ cho giới hạn phát hiện

0,05 ppm

Hai tác giả Haihua Lu [16] và Wunnapuk K [18] đều sử dụng phương pháp

LC-MS để định lượng PQ trong huyết tương và nước tiểu người

Cả hai tác giả đều sử dụng cột tách trong LC là cột HILIC, dung môi pha động dều sử dụng là ammonium formate /axit formic (cho kênh A) và acetonitrile (kênh B) và sử dụng chế độ gradien dung môi Tuy nhiên kích thước cột tách, tỉ lệ pha động cũng như chương trình dung môi đều có sự khác nhau

Wunnapuk K đã sử dụng cột tách HILIC (50 mm x 2,1 mm x 2,6µm) Thành

phần pha động bao gồm 0,8% axit formic trong 250 mM amonium formate (kênh A) Chạy theo chế độ gradien với tốc độ dòng 0,3 ml/phút Sau khi 10 µl mẫu được tiêm vào thì phần trăm ACN giảm xuống 60%, sau đó giảm tiếp xuống 20% trong 1

phút, duy trì trong 3,5 phút đối với huyết tương và 5 phút đối với nước tiểu, sau đó lại điều chỉnh về 60% Tổng thời gian phân tích là 7-10 phút [18] Trong khi đó,

Haihua Lu lại sử dụng kích thước cột khác là (100mm x 2,1 mm x 1,7µm), chế độ

gradien dung môi được thiết lập như sau: sau khi bơm mẫu, phần trăm ACN từ 75% (giữ trong 1 phút đầu) giảm xuống còn 25% (giảm tuyến tính trong khoảng 4 phút, giữ trong 1 phút), sau đó lại tăng lên 75% (giữ ở 4 phút) Tổng thời gian phân tích là

10 phút [16]

Cả 2 tác giả đều sử dụng chế độ chọn lọc ion (ESI) và sử dụng chất nội chuẩn etyl viologen dibromide (EV), tuy nhiên với điều kiện tách và điều kiện khối phổ khác nhau nên kết quả trong 2 nghiên cứu cũng hoàn toàn khác nhau Phương

pháp của Wunnapuk K cho hiệu suất thu hồi rất tốt: 95,1-102,8%, khoảng tuyến

tính của PQ rất rộng 10-5000 ng/ml, giới hạn phát hiện là 3 ng/ml Trong khi đó,

phương pháp của Haihua Lu cho hiệu suất thu hồi thấp khá tốt 93- 100%, giới hạn

phát hiện PQ trong huyết tương và nước tiểu lần lượt là 0,1 và 0,3 ng/ml, thấp hơn

so với nghiên cứu của Wunnapuk K

Các tác giả Yuangao Zou [37], Guangliang Hong [15], Brunetto M.R [8],

Chiaki Fuke [9] và Paixão P [26] sử dụng phương pháp HPLC với cột tách pha đảo

C18, sử dụng detector UV-DAD cho kết quả phân tích tốt Tuy nhiên, các thông số

về cột tách, pha động, chương trình dung môi hay chất nội chuẩn sử dụng trong các nghiên cứu lại hoàn toàn khác nhau

Trong các nghiên cứu, nghiên cứu của Yuangao Zou, Chiaki Fuke, Brunetto

M.R, Paixão P đều sử dụng cột C18 (150mm x 4,6mm x 5µm), riêng nghiên cứu

của Guangliang Hong sử dụng cột C18 có đường kính cột nhỏ hơn là 2,1 mm

Trong phương pháp sắc ký nói chung hay phương pháp HPLC nói riêng, việc

sử dụng chất nội chuẩn là một kỹ thuật rất phổ biến, đem lại độ chính xác cao Có

rất nhiều chất nội chuẩn có thể dùng, cụ thể như trong nghiên cứu của Yuangao Zou,

Paixão P.2 tác giả sử dụng chất nội chuẩn là dietyl paraquat (EPQ), còn tác giả

Guangliang Hong sử dụng 5- bromopyrimidine, các tác giả Brunetto M.R và Paixão

P lại sử dụng etyl viologen (EV)

Thành phần pha động có ảnh hưởng rất lớn tới kết quả phân tích Chính vì vậy, lựa chọn thành phần và tỉ lệ các dung môi trong pha động là rất cần thiết Các tác giả đã đưa ra rất nhiều loại dung môi dùng làm pha động trong phân tích, định lượng PQ, cụ thể:

Paixão P.định lượng PQ trong huyết thanh và huyết tương người được làm

đơn giản và nhanh bằng phương pháp HPLC PQ và chất nội chuẩn được rửa giải ở

1 - octansulphonic 3,0 mM; axit orthophosphoric 0,1 M trong 900 ml nước khử khoáng điều chỉnh pH đến 3,0 bằng diethylamine, acetonitrile nồng độ 10% (v/v) Kết quả: Thời gian lưu của PQ và chuẩn nội là 6,5 và 9,5 phút Giới hạn phát hiện (LOD) 0,1 µg/ml, giới hạn định lượng (LOQ) 0,4 µg/ml trong huyết tương và huyết thanh Độ đúng trong ngày không vượt quá 3,5%; 3,2% đối với huyết tương, huyết thanh Độ đúng trong khác ngày không vượt quá 4,7%; 3,1% đối với huyết tương, huyết thanh Độ thu hồi trong huyết tương và huyết thanh lần lượt là 98,9% và 98,7%

Định lượng PQ trong huyết tương sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo

cặp ion đã được Brunetto M.R thực hiện trên hệ thống sắc ký được sử dụng có 2

bơm, 1 bơm 2 nòng để chuyển pha động vào cột phân tích và bơm Knauer Model

64 để chuyển pha động vào cột chiết Van tiêm (V1) 6 cửa có các vòng mẫu 20, 100 hoặc 200 µl để đưa mẫu vào cột chiết Sử dụng các cột 25 - 4 mm được lấp đầy các hạt LiChrospher RP-18 ADS (kích thước hạt 25 µm) và cột VARIAN ODS C-18 (25 cm × 4,6 mm,5 µm) lần lượt là cột chiết và cột phân tích Cột chiết và cột phân tích được gắn với van xoay 6 cửa Rheodyne được điều khiển bằng bơm 2 nòng Sử dụng detector UV-DAD Perkin-Elmer LC 235 ở bước sóng 258 nm với flowcell 12

µm để phát hiện các tín hiệu

Các pha động được chuẩn bị như sau: Pha động để chiết (Pha động 1): chứa

natri octan sulfonate (SOS) 10mM và axit orthophosphoric 0,05 M được pha bằng nước cất 2 lần, và lọc màng 0,45 µm Điều chỉnh pH đến 2,8 bằng TEA và thêm 2-propanol nồng độ 3% (v/v) Pha động để phân tích (Pha động 2): methanol 40 % và SOS 10 mM trong axit orthophosphoric 0,05 M, điều chỉnh đến pH 2,8 bằng TEA

Các dung dịch và pha động được lọc màng 0,45 µm và loại khí trong bể siêu

âm trước khi sử dụng Giới hạn phát hiện, tỉ lệ tín hiệu / Nhiễu đường nền (Signal/ Noise) với S/N > 3 là 0,005 µg/ml PQ với thể tích tiêm mẫu 200 µg

Trong nghiên cứu của Guangliang Hong, các tác giả sử dụng hệ thống dung

môi pha động là acetonitrile cho kênh A Kênh B là hỗn hợp: 20 mM natri dihydrophosphate và 0,4 mM natri heptansulfonate (hỗn hợp này được điều chỉnh

về pH=2,3 bằng axit phosphoric) Thiết lập một chế độ gradien dung môi thích hợp

và PQ được phát hiện ở bước sóng 258 nm Khoảng tuyến tính của PQ trong nền mẫu huyết tương nằm trong khoảng 0,05-25 µg/ml Giới hạn phát hiện rất tốt ngưỡng 0,01 µg/ml Cũng đạt được ngưỡng phát hiện này nhưng tác giả Chiaki Fuke lại sử dụng pha động gồm: 10 mM Natri octan sulfonate, 10 mM trietylamine, 0,5 M kali bromide (điều chỉnh hỗn hợp này về pH=3,0 bằng axit phosphoric) Tốc

độ của pha động là 0,1 ml/phút, chạy với chế độ đẳng dòng PQ được phát hiện ở 5,2 phút với bước sóng là 290 nm

Nhìn chung, định lượng PQ bằng phương pháp HPLC có rất nhiều các điều kiện tối ưu, hoàn toàn có thể áp dụng một trong các điều kiện đó để định lượng nhanh, chính xác nồng độ PQ trong huyết tương, phục vụ rất tốt trong chẩn đoán và điều trị bệnh nhân ngộ độc PQ

1.2.4 Phương pháp điện di mao quản (CE)

Hiện nay, phương pháp điện di mao quản (CE) là một phương pháp phân tích nhanh, hiệu quả và ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong và ngoài nước

Đã có rất nhiều công trình nghiên cứu sử dụng phương pháp này để định lượng PQ trong các mẫu sinh học

Lanaro R [29], Vinner E [12], O.Nunez [25] và Masafumi Tomita [23] đều

áp dụng phương pháp CE để định lương PQ và các nhóm chất TTS liên quan trong

mẫu huyết tương, nước tiểu người Tuy nhiên, tác giả Lanaro R lại sử dụng

detector DAD, còn các tác giả còn lại sử dụng detector UV để phát hiện PQ

Lanaro R sử dụng mao quản silica với tổng chiều dài 48,5 cm (chiều dài

đệm diện di là đệm phosphate 40 mM điều chỉnh pH = 2,5 bằng axit phosphoric, Mẫu được bơm vào mao quản bằng phương pháp thuỷ động lực học với áp suất 50 mbar trong 10s, thế tách +21 kV PQ được phát hiện rất nhanh trong 2,5 phút ở bước sóng 195nm Phương pháp cho giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) lần lượt là 0,05µg/ml và 0,1µg/ml Đây là nghiên cứu đầu tiên sử dụng nước bọt đóng vai trò là một dịch sinh học để chẩn đoán ngộ độc PQ

Ba nghiên cứu của 3 nhóm tác giả Vinner E, O.Nunez và Masafumi Tomita

sử dụng phương pháp CE - UV với kỹ thuật bơm mẫu thủy động lực học, PQ được phát hiện ở bước sóng là 200 nm Mặc dù vậy, các điều kiện nghiên cứu tối ưu cho quá trình định lượng PQ lại hoàn toàn khác biệt

Với nghiên cứu của Vinner E [12], các tác giả sử dụng dung dịch đệm điện

di là 50mM đệm phosphate (pH = 2,5) Mao quản được sử dụng là mao quản silica với tổng chiều dài 57 cm (chiều dài hiệu dụng 50 cm), đường kính trong là 75 µm Nghiên cứu sử dụng kĩ thuật bơm mẫu kiểu thuỷ động học dưới áp suất 0,5 psi trong 3s, thế tách lần lượt là +18kV trong phân tích các mẫu huyết thanh Nhiệt độ duy trì cột 20 oC với tổng thời gian phân tích 10 phút Hiệu suất thu hồi PQ trong mẫu huyết thanh là 52,6 % Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của PQ trong huyết thanh tương ứng là 1,9 µg/ml và 13 µg/mL

Trong khi đó, nhóm nghiên cứu của O.Nunez lại sử dụng dung dịch pha động

điện di là axit acetic – ammonium acetate 50mM (pH = 4,0) với 0,8mM CTAB và MeOH 5% Mẫu được bơm vào mao quản bằng kỹ thuật thuỷ động lực học với áp suất 140 kPa, thời gian bơm mẫu 0,25 phút và thế tách +20kV Đường chuẩn tuyến

tính cho paraquat, diquat và difenzoquat trong khoảng nồng độ từ 30 – 850 µg/l với giới hạn phát hiện (LOD) là 15 µg/l (S/N = 3)

Masafumi Tomita sử dụng dung dịch pha động điện di là 10 mM glyxin –

đệm HCl (pH = 3,0), 40 mM NaCl và 20% MeOH Sự phân tách điện di được tiến hành trên cột mao quản silica có đường kính trong 50 µm với tổng chiều dài 75 cm

PQ và DQ được tách hoàn toàn ra khỏi nền mẫu trong khoảng thời gian 10 phút với thế tách +20 kV Giới hạn phát hiện cho cả PQ và DQ trong mẫu huyết thanh là 0,05 µg/ml (S/N = 2) Ở nồng độ 0,5 và 2,5 µg/ml, RSD cho PQ lần lượt là 4,3% và 1,7%; RSD cho DQ tương ứng là 6,5% và 2,2% Hiệu suất thu hồi của PQ và DQ trong nền mẫu đạt khoảng 97% trong khoảng giới hạn nồng độ 0,5 – 2,0 µg/ml

Ngoài một số nghiên cứu về định lượng PQ trong mẫu sinh học, cũng có rất nhiều nghiên cứu thực hiện trong mẫu nước

Mallat E và cộng sự [22] sử dụng phương pháp CE với detector UV để phân

tích PQ trong mẫu nước PQ được tách trên một mao quản có tổng chiều dài là 47

cm, chiều dài hiệu dụng là 40 cm, đường kính trong 75 µm Pha động điện di bao gồm 50 mM ammonium acetate và 100 mM NaCl trong nước, hỗn hợp được điều chỉnh về pH=3,3 bằng dung dịch HCl, sau đó thêm tiếp vào hôn hợp methanol 10% Nhiệt độ của cột tách là 250C Mẫu được bơm vào mao quản bằng phương pháp điện động học với thế là 10V, thời gian bơm mẫu là 5s PQ được phát hiện ở bước sóng 214 nm, giới hạn phát hiện của PQ trong mẫu nước khoáng (thêm chuẩn) và mẫu nước sông lần lượt là 0,3 và 0,6 µg/l

Trong một nghiên cứu khác, Núñez O và cộng sự [25] sử dụng CE-UV để

định lượng PQ, DQ và difenzoquat trong nước Các chất được tách trên một mao

di bao gồm 50 mM đệm ammonium acetat (pH=4,0), methanol 5%, 0,8 mM CTAB

255 nm với giới hạn phát hiện với mẫu nước khoáng, nước máy, nước sông lần lượt

là 10; 48; 18 µg/l

Ngoài ra, cũng với phương pháp CE, sử dụng detector DAD, Qingxiang

Zhou và cộng sự [28] đã tiến hành nghiên cứu phân tích đồng thời paraquat và

khi XLM, các chất được tách trên một mao quản có chiều dài 60 cm, đường kính

100 µm, chiều dài hiệu dụng là 51,5 cm Mẫu được bơm vào mao quản với áp suất

50 mbar trong 6s, thế tách là 15 kV PQ được phát hiện ở bước sóng 254 nm Giới hạn phát hiện của PQ trong mẫu nước đạt 1,95 µg/l Hiệu suất thu hồi PQ rất tốt đạt 84,15 - 95,38 %

Tóm lại, phương pháp CE là một phương pháp định lượng rất nhanh, đơn giản và hiệu quả PQ trong nhiều loại mẫu khác nhau (mẫu sinh học, môi trường, thực phẩm)

 Ngoài tất cả các phương pháp định lương PQ đã đề cập ở trên, còn có một

số phương pháp khác như phương pháp miễn dịch ELISA, phương pháp điện hóa

1.3 Các phương pháp xử lý mẫu sinh học (huyết tương, nước tiểu) nhằm phân tích paraquat

1.3.1 Phương pháp chiết lỏng- lỏng

Chiết lỏng – lỏng là quá trình chiết mà hai pha đều ở trạng thái lỏng Trong

chất Xi) còn pha kia là dung môi chiết, chất chiết (thường là dung môi hữu cơ) [2]

Seung Kyung Baeck và cộng sự [33] đã sử dụng kỹ thuật chiết lỏng-lỏng

(LLE) để chiết PQ ra khỏi huyết tương người Tác giả đưa ra 5 loại dung môi chiết với tỉ lệ khác nhau và so sánh hiệu quả chiết của chúng Các dung môi bao gồm: chloroform:ethanol (7:3, 4:1), ammonium sulphate:ethanol (7:3, 4:1) và axit sunfosalixylic Quy trình chiết rất đơn giản: 0,5 ml huyết tương được thêm 0,5 ml một trong 5 dung môi chiết trên cho vào một ống Eppendorf Lắc hỗn hợp trong 1 phút, ly tâm 13000 rpm trong 3 phút Sau đó, lấy dung dịch phía trên đi phân tích Kết quả so sánh hiệu suất thu hồi của PQ trong huyết tương cho thấy cả 5 dung môi chiết trên đều cho hiệu suất tốt ở cả 3 mức nồng độ của PQ (cao, trung bình, thấp)

Tuy nhiên, dung môi chiết chloroform:ethanol (7:3) cho kết quả tốt nhất với hiệu suất đạt ≥ 99%

Arys K [6] xử lý mẫu bằng cách lấy 1 ml (hoặc 1 g) mẫu, thêm 50 µl chuẩn nội và thêm nước vừa đủ 4 ml Kết tủa protein bằng axit trichloroacetic là bước làm sạch đầu tiên của các mẫu máu, gan, thận Thêm 1,5 ml dung dịch axit trichloroacetic 25%, lắc 10 phút, ly tâm 4000 vòng/phút trong 5 phút Sau khi chuyển dịch trong ở trên sang ống nhựa sạch, phần tủa protein phía dưới được hòa tan lại bằng 2,5 ml dung dịch axit trichloroacetic 5%, lắc 10 phút, ly tâm 1100 vòng/phút trong 5 phút, gộp phần dịch trong lại, chuyển sang ống silan hóa Tuy nhiên ở một số trường hợp đã được chứng minh cần thêm bước ly tâm nữa (2200 vòng/phút trong 10 phút) để thu được phần dịch sạch hoàn toàn Đối với nước tiểu

và dịch dạ dày, bước loại protein có thể bỏ qua và làm ngay bước tiếp theo là khử

PQ bằng natri borohydride Điều chỉnh pH của dung dịch đến pH lớn hơn 10 bằng 1

ml NaOH 1M (đối với nước tiểu và dịch dạ dày) hoặc 1 ml NaOH 5M (đối với các

làm mát ở nhiệt độ phòng, chiết dung dịch với 8 ml diethyl ether bằng máy trong 15 phút Sau khi ly tâm (1100 vòng/phút trong 10 phút), chuyển lớp hữu cơ phía trên sang ống silan hóa hình nón Bay hơi dịch chiết đến khô bằng dòng khí nitơ Cắn được hòa tan trong 60 µl pha động (dung dịch A:dung dịch B là 50:50, v/v) và tiêm

50 µl vào hệ thống HPLC

Phương pháp này đã được E.Vinner cùng cộng sự [12] sử dụng để xử lý mẫu

huyết thanh và nước tiểu nhằm xác định đồng thời PQ và DQ Với 1ml huyết thanh, cho 300 µl dung dịch chất chuẩn nội (Amitrole), 1ml nước cất, 2ml chloroform, 1,2g ammonium sunfat, hỗn hợp này được xoáy trộn trong 2 phút và ly tâm ở 3000 rpm trong 5 phút Dịch phía trên được chuyển sang một ống polypropylene khác Sau đó, thêm 100 µl dung dịch bão hoà ammonium sulfate vào cắn, lắc xoáy, ly tâm như ở trên, tiến hành 2 lần rồi gộp dịch phía trên vào polypropylene ở trên Thêm

và ly tâm ở 3000 rpm trong 5 phút Chuyển lớp phenol phía trên vào ống

polypropylene 1,5 ml, thêm 300 µl ether, 200 µl nước cất sau đó hỗn hợp được lắc xoáy trong 30s và ly tâm ở 5000 rpm trong 2 phút Sau đó đem bay hơi dịch rửa giải bằng dòng khí nitơ ở 60 oC rồi hoà tan cắn bằng 50 µl nước cất

Với 1ml nước tiểu, cho 300 µl dung dịch chất chuẩn nội (Amitrole), 0,6g ammonium sulfate, hỗn hợp này được xoáy trộn trong 30s PQ và DQ được chiết bằng cách thêm 300 µl phenol ở 60 oC, tiếp tục xoáy trộn trong 30s và ly tâm ở 3000rpm trong 5 phút Chuyển lớp phenol sang ống polypropylene 1,5 ml, sau đó thêm 300 µl ether, 200 µl nước cất sau đó hỗn hợp được lắc xoáy trong 30s và ly

rồi hoà tan cắn bằng 50 µl nước cất

Trong khi đó, Akerblom M và cộng sự [21] cũng sử dụng phương pháp này

để chiết PQ trong nước tiểu 4 ml nước tiểu được thêm 4 mml dung dịch đêm ammonium phosphate pH=6,5; 0,4 ml bromthymol blue (BTB) 0,1M, 8 ml dicloromethan Hỗn hợp được lắc đều trong 2 phút Sau đó, thêm tiếp 5 ml dung môi hữu cơ PQ được chiết ra bằng 5 ml dung dịch NaCl Lắc hỗn hợp này trong vòng 2 phút, lấy phần dung môi hữu cơ phía trên Như vậy, PQ đã được chiết khỏi nền nước tiểu Cơ chế tách dựa vào sự tạo thành cặp ion giữa PQ và BTB, mặt khác BTB là dung dịch có màu nên đo hỗn hợp PQ-BTB bằng phương pháp quang phổ Với phương pháp này, hiệu suất thu hồi PQ chỉ đạt 68-75%, giới hạn phát hiện của

PQ đạt 0,03 mg/l

Phương pháp chiết lỏng-lỏng (LLE) là một phương pháp đơn giản, nhanh chóng để tách PQ ra khỏi nền mẫu là dịch sinh học Tuy nhiên với nền mẫu phức tạp như huyết tương thì việc loại bỏ protein, các ion ảnh hưởng là rất khó khăn, đòi hỏi một kỹ thuật xử lý mẫu tốt hơn có khả năng làm sạch, làm giàu PQ đó là kỹ thuật chiết pha rắn (SPE)

1.3.2 Phương pháp chiết pha rắn

Chiết pha rắn là một dạng sắc ký lỏng được cải tiến thành hấp thụ pha rắn với các cơ chế khác nhau Kỹ thuật này dựa trên nguyên tắc sự phân bố của chất tan giữa hai pha không tan vào nhau

Có rất nhiều công trình nghiên cứu đã sử dụng phương pháp này nhưng với các loại cột tách khác nhau để tách chiết PQ ra khỏi huyết tương

Tuy nhiên, trước khi đưa mẫu nạp vào cột, cần phải xử lý sơ bộ mẫu để loại

bỏ protein trong mẫu huyết tương Có 3 giải pháp loại bỏ protein thường được sử dụng là acetonitrile (ACN), methanol, axit trichloroacetic (TCA)

 Một số công trình nghiên cứu sử dụng cột chiết pha rắn C18

Seung Kyung Baeck và cộng sự [33] đã sử dụng cột C18 để tách và làm giàu

PQ trong nền mẫu huyết tương 0,5 ml mẫu huyết tương được thêm 0,2 ml TCA 25%, lắc đều trong 2 phút, ly tâm trong 10 phút, lấy phần dịch phía trên thêm 2 ml dung dịch NaOH 0,1M Quy trình chiết như sau: Cột C18 được hoạt hóa bằng 5 ml

thổi khô cột, PQ được rửa giải ra khỏi cột bằng 5 ml dung dịch HCl với tốc độ 1,5 ml/phút Với phương pháp chiết này, hiệu suất thu hồi PQ chỉ đạt cao nhất là 80%

Trong một nghiên cứu khác, Pedro Nuno Moreira [24] sau khi đã kết tủa

protein trong mẫu huyết tương với TCA, thêm 1,5 ml đệm phosphate (pH = 8,0), 10

thêm vào hỗn hợp để khử PQ và EPQ thành dẫn xuất HPQ và HEPQ Phản ứng khử

ml đệm phosphate (pH = 8,0) Nạp mẫu vào cột, rửa tạp với 2ml nước đeion, sau đó rửa giải bằng 2ml methanol với tốc độ 1,5ml/phút trong chân không Dịch chiết được bay hơi ở nhiệt độ phòng dước dòng khí nitơ Sau đó, cắn được hoà tan bằng 100µl methanol và tiêm 1µl vào hệt thống GC-IT/MS

Kỹ thuật chiết pha rắn cũng được tác giả Masafumi Tomita [23] sử dụng để

tách và làm giàu PQ trong nền mẫu huyết thanh 1,0 ml TCA 10% được thêm vào 1,0 ml huyết thanh để kết tủa protein Ly tâm ở 900g trong 10 phút, dung dịch phía

được hoạt hoá bởi 5 ml nước đeion, 5 ml MeOH và 5 ml nước đeion; sau đó thêm 5

ml CTAB 0,05% (g/ml); 5 ml nước đeion, 5 ml MeOH, 5 ml nước đeion; cuối cùng

là 10 ml natri heptansunfonate Nạp mẫu vào cột, rửa tạp với 3 ml nước đeion, 3ml MeOH Sau đó, rửa giải bằng 5 ml methanol acidic ( MeOH:HCl = 10:1) Bay hơi

và lọc qua màng 0,45 µm rồi tiêm mẫu vào cột mao quản để thực hiện quá trình phân tách điện di

 Ngoài cột C18, kết quả chiết tách PQ trong các loại cột MCX, WCX cũng được báo cáo trong một số nghiên cứu

Nhóm nghiên cứu của tác giả M.E.Koivunen [15] đã lấy mẫu nước tiểu 24

thành 8 ống nhựa 15ml Sau khi làm đông, mẫu được chuyển đến phòng thí nghiệm chờ phân tích Rã đông mẫu nước tiểu trong 16 giờ ở nhiệt độ phòng, sau đó lắc

polypropylene 15 ml khác Hoạt hoá cột Oasis MCX 3ml bằng 2 ml dung dịch đệm natri phosphate (pH = 6,5) Nạp mẫu vào cột với tốc độ 2ml/phút Sau đó, rửa tạp

Nhóm nghiên cứu của Proenca P [27] xử lý mẫu bằng cách lấy 1 ml máu

hoặc 1 ml nước tiểu thêm 50 µl chuẩn nội (10 µg/ml) và 2 ml acetonitrile Lắc xoáy,

ly tâm 2500 rpm trong 10 phút Cột chiết pha rắn (Oasis, 3cc) được rửa lần lượt với

1 ml methanol và 1 ml nước khử khoáng, sau đó nạp mẫu vào cột chiết pha rắn Rửa tạp với 1 ml đệm phosphate pH = 7; 1 ml nước khử khoáng và 1 ml methanol Sau khi làm khô 10 phút trong chân không, rửa giải cột với 1,5 ml acetonitrile / nước /

TFA (84:14:2, v/v/v) Dịch rửa giải được bay hơi đến cắn dưới dòng khí nitơ ở

LC-ESI-MS

Trong một nghiên cứu khác, Zhaohong Wang [38] xử lý 1,0 ml máu, thêm 3

ml đệm phosphate 0,1M (pH = 7) và dung dịch chuẩn nội 100ng/ml Ly tâm 8000 rpm trong 10 phút Cột Waters Oasis WCX 3 mL được hoạt hoá lần lượt bằng 3 ml methanol, 3 ml nước deion (DI) và 1 ml đệm phosphate 0,1 M (pH = 7) Sau khi cho mẫu chạy qua cột, rửa tạp với 3 ml đệm phosphate 0,1 M (pH = 7), 3 ml nước

DI và 3 ml methanol Sấy khô chân không cột trong 10 phút Chất phân tích được rửa giải bằng 2 ml dung dịch axit formic 2% trong acetonitrile 80% Bay hơi dịch rửa giải bằng dòng khí nitơ ở 45oC Hòa tan cắn bằng 50 μl pha động (dung dịch acetonitrile và amoni formate 250 mM tỉ lệ 1:1)

Như vậy, phương pháp chiết pha rắn nhưng sử dụng cột MCX hay WCX cho hiệu quả chiết khá tốt, các thao tác chiết cũng đơn giản hơn rất nhiều so với cột C18

Quá trình phân tích, định lượng PQ trong mẫu sinh học (máu, nước tiểu) từ lâu đã được quan tâm và có rất nhiều công trình khoa học nghiên cứu đã tiến hành định lượng PQ bằng rất nhiều các phương pháp phân tích, các phương pháp xử lý mẫu khác nhau Tuy nhiên, các thiết bị phân tích được sử dụng phần lớn đều là các trang thiết bị đắt tiền (LC-MS, GC-MS, HPLC) Do vậy, muốn phương pháp định lượng này được phổ biến rộng rãi (từ phòng xét nghiệm ở trung ương đến địa phương) là rất khó khăn Hiện nay, phương pháp CE là một giải pháp tối ưu để triển khai ở tuyến cơ sở Hiện tại, chưa có công trình khoa học nào sử dụng phương pháp điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc để định lượng PQ trong huyết tương Mặt khác, thiết bị này đang ngày càng được phát triển, ứng dụng nhiều

ở Việt Nam cũng như trên thế giới Do vậy, mục tiêu của đề tài là ứng dụng phương pháp này kết hợp với các quá trình xử lý mẫu bằng chiết pha rắn để đưa ra một quy

trình tối ưu nhất định lượng PQ, áp dụng chuyển giao kỹ thuật xuống các đơn vị xét nghiệm của bệnh viện tuyến địa phương

di mao quản dạng xách tay đầu tiên trên thế giới sử dụng nguồn thế cao mini của hãng Spellman Detector đo độ dẫn không tiếp xúc kết nối theo kiểu tụ điện (C4D) được thiết kế ở dạng thu nhỏ, với nguồn kích thích 200V, với hai điện cực hình ống đồng trục có chiều dài 4mm và đường kính 400 μm đặt cách nhau 1mm Tấm chắn Faraday (nối đất) được sử dụng để ngăn cách hai điện cực Hiện nay, hệ thiết bị điện

di sử dụng detector đo độ dẫn không tiếp xúc thương phẩm (ER815, eDAQ, Úc) đang được triển khai ứng dụng, kiểm tra đánh giá và phát triển hoàn thiện tại trung tâm Chống Độc, bệnh viện Bạch Mai, hướng đến ứng dụng cho các bệnh viện tuyến

cơ sở

b) Hình ảnh bên trong thiết bị CE – C4D

Hình 2.1 Ảnh chụp hệ thiết bị CE – C 4 D sử dụng nghiên cứu

(1: Hộp thế an toàn, 2: Bộ điều khiển cao thế, 3: Cảm biến đo độ dẫn không

tiếp xúc)

- Bể siêu âm: Model S30/H, hãng ELMA, Đức

- Cân phân tích Precisa XT 220A, độ đọc của cân 0,0001g

- Máy đo pH Meter 744, giá trị đọc ± 0,01, khoảng đo pH = 0,00 – 14,00

- Máy ly tâm Universal 320, hãng Hettich, Đức, tốc độ tối đa 4000 vòng/phút

- Máy lắc xoáy model: 3005 của hãng GFL, Đức

- Tủ sấy model: 500 của hãng Memmert, Đức

- Máy cất nước hai lần: Model A4000D/Aquatron hãng Stuart - Barloworld Scientific, 4 l/h, Anh

- Bộ lọc nước siêu sạch: Model WaterPro PS/HPLC/UF hybrid - Labconco, 115V, 60Hz, Mỹ

- Các lọ falcon 15 ml, 45 ml và lọ polypropylen (PP) để đựng các dung dịch chuẩn

2.1.3 Hóa chất, dung môi

khiết 99,5%)

- Didecyldimethyl amonium bromide (DDAB) (Merck, hàm lượng 98%)

- Tween 20 (C58H114O26) (Sigma, độ tinh khiết 98%)

- Axit ascorbic (C6H8O6), (PA, Merck, Đức)

- Axit chlohydric (HCl), (PA, Merck, Đức)

- Nước siêu tinh khiết là nước cất hai lần được lọc qua bộ lọc nước siêu tinh khiết Model WaterPro PS/HPLC/UF hybrid - Labconco, 115V, 60Hz, Mỹ

2.1.4 Chuẩn bị các dung dịch hóa chất

 Pha dung dịch chuẩn gốc PQ

Cân chính xác trên cân phân tích có độ đọc của cân một lượng chất chuẩn khoảng 20 mg chất chuẩn paraquat dichloride (C12H14Cl2N2 4H2O) vào bình định mức 100 ml, hòa tan bằng nước deion và định mức tới vạch thu được dung dịch có nồng độ khoảng 200 μg/ml Nồng độ của dung dịch chuẩn gốc tính toán dựa trên lượng cân thực tế và độ tinh khiết của chất chuẩn Dung dịch được bảo quản trong

 Pha dung dịch chuẩn trung gian 40 μg/ml:

Lấy chính xác một lượng thể tích dung dịch chuẩn gốc PQ cho vào bình định mức 100 ml và thêm nước deion đến vạch Dung dịch được bảo quản trong tủ lạnh

 Dãy dung dịch chuẩn làm việc:

Các dung dịch 1; 2; 5; 10; 15; 20; 30; 40; 50 μg/ml được pha từ dung dịch chuẩn gốc 200 μg/ml và dung dịch chuẩn trung gian 40 μg/ml trong nước đeion hoặc trong nền mẫu huyết tương (sử dụng để xây dựng đường chuẩn từ dung dịch chuẩn và trên nền mẫu) Các dung dịch này chỉ được pha trước khi sử dụng

 Pha dung dịch đệm điện di:

Dung dịch pha động điện di kết hợp giữa histidine và axit acetic được pha như sau: Cân chính xác 0,0388g histidine chuyển vào cốc có dung tích 50,0 ml rung siêu âm trong 5 phút cho tan hết sau đó thêm từ từ axit acetic vào đến khi pH của dung dịch là 4,0 (sử dụng máy đo pH) Dung dịch đệm được pha mới hàng ngày

0,125%

Cân 50 mg CTAB chuyển vào bình định mức 100 ml, thêm 0,5 ml dung dịch

Cân 2,00 g natri heptansulfonate vào bình định mức 100 ml thêm 0,5 ml

2.2.1 Nội dung nghiên cứu

Để đạt được mục tiêu đã đề ra, các nội dung cần thực hiện bao gồm:

- Nghiên cứu, khảo sát các điều kiện tối ưu để tách paraquat chuẩn bằng phương pháp điện di mao quản sử dụng detector đo độ dẫn không tiếp xúc theo kiểu

kết nối tụ điện (CE – C4D), bao gồm: khảo sát hệ đệm, nồng độ và pH của dung dịch đệm điện di

- Nghiên cứu, tối ưu quy trình chiết paraquat ra khỏi nền mẫu huyết tương

- Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp phân tích

- Áp dụng phân tích paraquat trong huyết tương bệnh nhân ngộ độc paraquat tại trung tâm Chống độc – bệnh viện Bạch Mai

- Đối chứng kết quả phân tích PQ trong huyết tương bằng phương pháp CE

2.2.2 Đối tượng nghiên cứu

Để xây dựng quy trình và đánh giá phương pháp phân tích PQ trong huyết tương người, chúng tôi tiến hành nghiên cứu trên các đối tượng sau:

- Mẫu trắng: là mẫu huyết tương người khỏe mạnh được cung cấp bởi viện huyết học và truyền máu Trung ương

- Mẫu thêm chuẩn: do paraquat không gắn với protein huyết tương nên mẫu thêm chuẩn có thể coi là mẫu trắng được thêm một lượng xác định PQ chuẩn Mẫu được chuẩn bị bằng cách lấy 2 ml huyết tương được thêm chuẩn 50 µl dung dịch PQ 200 µg/ml, sau đó mẫu này sẽ được dùng để khảo sát, tìm ra các điều kiện tối ưu cho quy trình xử lý mẫu bằng phương pháp chiết pha rắn Ngoài ra, mẫu này cũng được dùng để xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp phân tích

- Mẫu thực: là mẫu huyết tương bệnh nhân ngộ độc PQ mới vào viện hoặc đang điều trị, mẫu này thu được từ mẫu máu, ly tâm, lấy phần huyết tương

- Dãy dung dịch chuẩn để xây dựng đường chuẩn: Các dung dịch sử dụng

để lập đường chuẩn có nồng độ trong khoảng 1,00 - 50,00 μg/ml và được pha loãng

- Mẫu chuẩn xây dựng đường chuẩn: Chuẩn bị các mẫu huyết tương trắng, thêm PQ để thu được các mẫu thêm chuẩn có nồng độ PQ từ 1,00 - 20,00 μg/ml

Chúng tôi xây dựng đường chuẩn với 7 nồng độ PQ được thêm vào mẫu huyết tương trắng lần lượt là: 0;1; 2; 5; 10; 15 và 20 μg/ml Sau đó xử lý mẫu và tiến hành phân tích trên hệ thiết bị CE – C4D

2.3.1 Phương pháp phân tích

2.3.1.1 Nghiên cứu tìm điều kiện tối ưu phân tích paraquat bằng phương pháp điện

di mao quản CE – C 4 D

Thông qua các tài liệu tham khảo và một số khảo sát sơ bộ, chúng tôi đưa ra

Việc khảo sát một số điều kiện tách PQ được thực hiện trên hệ thiết bị CE –

C4D với một mao quản có chiều dài 60 cm, chiều dài hiệu dụng là 50 cm, đường kính trong 75 µm Mẫu được bơm vào mao quản bằng phương pháp thủy động lực học kiểu xi phông bằng cách nâng một đầu mao quản lên độ cao 10 cm so với đầu mao quản còn lại trong thời gian 30s, PQ được tách ra ở thế +20kV

Ngoài ra, một số điều kiện khác cũng được khảo sát để tìm ra điều kiện tối

ưu phân tích PQ bao gồm: Dung dịch đệm diện di (pH, thành phần và nồng độ), ảnh hưởng của các cation cơ bản

2.3.1.2 Nguyên tắc định lượng paraquat bằng phương pháp điện di mao quản CE – C 4 D

Phương pháp phân tích là phương pháp điện di mao quản sử dụng detector

Để xác định hàm lượng chất phân tích trong mẫu ta có thể sử dụng phương pháp đường chuẩn hoặc thêm chuẩn dựa trên cơ sở của sự phụ thuộc tuyến tính trên

2.3.2 Phương pháp xử lý mẫu

Nền mẫu huyết tương rất phức tạp, có chứa rất nhiều protein, các cation cơ bản như canxi, natri, magie Các yếu tố này có ảnh hưởng rất lớn tới tín hiệu PQ khi phân tích điện di Do vậy, việc xử lý nền mẫu huyết tương rất quan trọng

Qua tài liệu tham khảo [17, 25] chúng tôi dự kiến quy trình xử lý mẫu huyết tương trên cột C18 theo cơ chế tạo cặp ion như sau:

- Tiền xử lý mẫu: mẫu thêm chuẩn hoặc mẫu thực được thêm 0,4 ml TCA

và 0,6 ml nước deion, lắc xoáy 3 phút, ly tâm ở 4000 vòng/phút trong 10 phút Dịch

M Đây là dung dịch mẫu chuẩn bị cho qua cột C18

- Sử dụng chất tạo cặp ion với PQ:

Cột chiết pha rắn Sep-Pak Water 3 ml C18 được hoạt hóa lần lượt bởi 2,5 ml nước deion, 2,5 ml MeOH và 2,5 ml nước deion; sau đó thêm 3 ml CTAB 1,4 mM

mẫu vào cột với tốc độ 1 ml/phút Rửa tạp với 5 lần 2,5 ml nước deion, 4 lần 2,5 ml MeOH, tốc độ 2,5 ml/phút Tiếp theo rửa giải bằng 4 ml MeOH (CH3COOH 1%)

quản để thực hiện quá trình phân tách điện di

Sau khi tham khảo tài liệu và dựa vào các điều kiện sẵn có của phòng thí nghiệm, chúng tôi tiến hành lựa chọn cột chiết pha rắn C18 (Sep - Pak Water, Mỹ, 3 ml), sử dụng quy trình xử lý mẫu như trên và khảo sát một số điều kiện như sau:

- Khảo sát khả năng loại bỏ cation của cột C18