Ảnh hưởng của nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng lên quá trình nhân chồi lan hoàng thảo trầm (dendrobium parishii) bằng phương pháp cấy mô

TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG KHOA NÔNG NGHIỆP – TÀI NGUYÊN THIÊN NHIÊN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC SINH VIÊN ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ CÁC CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG LÊN QUÁ TRÌNH NHÂN CHỒI LAN HO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG KHOA NÔNG NGHIỆP – TÀI NGUYÊN THIÊN NHIÊN

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC SINH VIÊN

ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ CÁC CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG LÊN QUÁ TRÌNH NHÂN CHỒI LAN HOÀNG THẢO TRẦM

(Dendrobium parishii)

BẰNG PHƯƠNG PHÁP

NUÔI CẤY MÔ

AN GIANG, THÁNG 12 - NĂM 2016

TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG KHOA NÔNG NGHIỆP – TÀI NGUYÊN THIÊN NHIÊN

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP KHOA

ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ CÁC CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG LÊN QUÁ TRÌNH NHÂN CHỒI LAN HOÀNG THẢO TRẦM

(Dendrobium parishii)

BẰNG PHƯƠNG PHÁP

NUÔI CẤY MÔ

AN GIANG, THÁNG 04 – NĂM 2017

TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG KHOA NÔNG NGHIỆP – TÀI NGUYÊN THIÊN NHIÊN

ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ CÁC CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG LÊN QUÁ TRÌNH NHÂN CHỒI LAN HOÀNG THẢO TRẦM

Đề tài nghiên cứu khoa học “Ảnh hưởng của nồng độ các chất điều hòa sinh

trưởng lên quá trình nhân chồi lan Hoàng thảo trầm (Dendrobium parishii)

bằng phương pháp nuôi cấy mô” do sinh viên Trương Nhật Minh thực hiện dưới sự hướng dẫn của Th.s Nguyễn Thị Thúy Diễm Tác giả đã báo cáo kết quả nghiên cứu và được Hội đồng Khoa học và Đào tạo thông qua ngày………

i

LỜI CẢM TẠ

Trong suốt quá trình thực hiện đề tài “Ảnh hưởng của nồng độ các chất

điều hòa sinh trưởng lên quá trình nhân chồi lan Hoàng thảo trầm

(Dendrobium parishii) bằng phương pháp nuôi cấy mô”, tôi đã nhận được sự

ủng hộ, giúp đỡ to lớn của các Thầy Cô, gia đình và bạn bè!

Trước tiên tôi xin bày tỏ lòng tri ân sâu sắc đến ba mẹ, người thân trong gia đình đã đóng góp một phần không nhỏ trong việc hoàn thành đề tài này

Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất đến Cô Nguyễn Thị Thúy Diễm, Cô Huỳnh Trường Huê và Cô Võ Thị Xuân Tuyền đã quan tâm, giúp đỡ và hướng dẫn tận tình Cám ơn các cô vì các cô luôn tận tình chỉ dạy và hết mình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến Chị Nguyễn Thị Xuân Đào - cán bộ phòng quản lý thiết bị đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành đề tài

Cuối cùng xin cảm ơn các bạn Nguyễn Linh Tuấn DH13TT, anh Nguyễn Kim Trọng cùng các bạn trong tập thể lớp DH14BT đã hỗ trợ tôi hoàn thành đề tài này

Xin trân trọng cảm ơn!

An Giang, ngày 08 tháng 05 năm 2017

Người thực hiện

Trương Nhật Minh

ii

TÓM TẮT

Đề tài “Ảnh hưởng của nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng lên quá

trình nhân chồi lan Hoàng thảo trầm (Dendrobium parishii) bằng phương

pháp nuôi cấy mô” được thực hiện nhằm mục đích xác định ảnh hưởng của các

nồng độ chất điều hòa tăng trưởng lên quá trình nhân protocorm và nhân nhanh chồi lan Hoàng thảo trầm in vitro Đề tài được thực hiện với 2 thí nghiệm bao gồm: (1) Ảnh hưởng của BA và TDZ lên quá trình nhân protocorm lan Hoàng thảo

trầm; (2) Ảnh hưởng của tổ hợp BA với NAA và TDZ với NAA lên quá trình nhân

nhanh chồi lan Hoàng thảo trầm in vitro Thí nghiệm được bố trí theo thể thức

hoàn toàn ngẫu nhiên Kết quả cho thấy:

- Môi trường cho hiệu quả nhân nhanh protocorm lan Hoàng thảo trầm tối

ưu nhất là: môi trường MS bổ sung 1,5 mg/L TDZ (A8) cho số protocorm mới hình thành sau 8 tuần nuôi cấy thu được 30 protocorm với trọng lượng trung bình đạt

0,75 g

hợp nhất đối với quá trình nhân nhanh chồi lan Hoàng thảo trầm đạt 4,6 chồi với các chỉ tiêu về chiều cao, chồi số lá và số rễ lần lượt đạt 25 mm, 13,6 lá và 8,0 rễ sau 8 tuần cấy Đây là nguồn vật liệu rất có ý nghĩa cho quá trình tạo cây hoàn

chỉnh ở các thí nghiệm tiếp theo trong qui trình vi nhân giống in vitro

iii

ABSTRACT

The study was carried out to establish a micropropagation process of

Dendrobium parishii for production Experiments comprised: (1) effects of BA

and TDZ on protocorm multiplication; (2) The effect of BA, NAA and TDZ on shoot proliferation in vitro The test is arranged in a completely randomized form Results of experiments showed that medium for protocorms multiplication

obtained the best result on medium supplemented MS with 1,5 mg/ L TDZ (30 protocorms/explants and 0,75 g/ explants at 8 week after cultured) The optimal

medium for in vitro shoots was MS medium containing 1,5 mg/ L BA and 0,2 mg/

L NAA, on with 4,6 shoots/ explants, 13,6 leafs/ explants, 8 roots/ explants within

iv

LỜI CAM KẾT

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu trong công trình nghiên cứu này có xuất xứ rõ ràng Những kết luận mới về khoa học của công trình nghiên cứu này chưa được công bố trong bất kỳ công trình nào khác

An Giang, ngày 08 tháng 05 năm 2017

Người thực hiện Trương Nhật Minh

v

MỤC LỤC

Trang

LỜI CẢM TẠ i

TÓM TẮT ii

ABSTRACT iii

LỜI CAM KẾT iv

MỤC LỤC v

DANH SÁCH BẢNG viii

DANH SÁCH HÌNH ix

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT x

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1

1.1 TÍNH CẦN THIẾT CỦA ĐỀ TÀI 1

1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 2

1.3 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 2

1.4 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 2

1.5 NHỮNG ĐÓNG GÓP CỦA ĐỀ TÀI 2

1.5.1 Đóng góp về mặt khoa học 2

1.5.2 Đóng góp công tác đào tạo 2

1.5.3 Đóng góp phát triển kinh tế xã hội 2

1.5.4 Đóng góp bảo vệ môi trường 2

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 3

2.1 GIỚI THIỆU VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 3

2.2 LƯỢC KHẢO VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 3

2.2.1 Giới thiệu lan Hoàng thảo trầm (Dendrobium parishii) 3

2.2.2 Giá trị của chi lan Hoàng thảo 5

2.3.1 Khái niệm về phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 7

2.3.2 Ưu và khuyết điểm trong nhân giống in vitro 8

vi

2.3.3 Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy tế bào thực vật 9

2.3.4 Ứng dụng chất điều hòa sinh trưởng trong nuôi cấy mô 11

2.3.5 Tình hình nghiên cứu nuôi cấy in vitro một số cây thuộc họ lan Hoàng Thảo (Dendrobium) 13

2.4 CÂU HỎI NGHIÊN CỨU HOẶC GIẢI THUYẾT NGHIÊN CỨU 15

CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

3.1 MẪU NGHIÊN CỨU 16

3.2 THIẾT KẾ NGHIÊN CỨU 16

3.2.2 Giai đoạn tạo vật liệu khởi đầu 16

3.2.3 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của Cytokinin (BA, TDZ) lên quá trình nhân protocorm lan Hoàng thảo trầm 18

3.2.4 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của sự tổ hợp Auxin (NAA) và Cytokinin (BA và TDZ) lên quá trình nhân chồi lan Hoàng thảo trầm 19

3.3 CÔNG CỤ NGHIÊN CỨU 21

3.4 PHÂN TÍCH DỮ LIỆU 21

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3

4.1 HIỆU QUẢ CỦA BA VÀ TDZ LÊN QUÁ TRÌNH NHÂN PROTOCORM CÂY LAN HOÀNG THẢO TRẦM IN VITRO 22

4.1.1 Hiệu quả của BA và TDZ lên sự gia tăng số lượng hạt protocorm của lan Hoàng thảo trầm 22

4.1.2 Hiệu quả của BA và TDZ lên sự gia tăng trọng lượng protocorm của lan Hoàng thảo trầm 26

4.2 HIỆU QUẢ CỦA BA, TDZ VÀ NAA LÊN QUÁ TRÌNH NHÂN CHỒI CÂY LAN HOÀNG THẢO TRẦM IN VITRO 27

4.2.1 Thời gian xuất hiện chồi 27

4.2.2 Hiệu quả của các tổ hợp BA +NAA và TDZ + NAA lên quá trình nhân chồi của chồi lan Hoàng thảo trầm 29

4.2.3 Hiệu quả của các tổ hợp BA + NAA và TDZ + NAA lên sự gia tăng chiều cao chồi lan Hoàng thảo trầm 37

4.2.4 Hiệu quả của các tổ hợp BA + NAA và TDZ + NAA lên quá trình gia tăng số lá của chồi lan Hoàng thảo trầm 41

vii

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ 52

5.1 KẾT LUẬN 52

5.2 KHUYẾN NGHỊ 52

TÀI LIỆU THAM KHẢO 53

PHỤ LỤC BẢNG 58

PHỤ LỤC HÌNH 65

viii

DANH SÁCH BẢNGBảng Tên bảng Trang

1 Các nghiệm thức của thí nghiệm 1 18

2 Các nghiệm thức của thí nghiệm 2 20

tuần sau khi cấy 23

8 tuần sau khi cấy 26

5 Thời gian bắt đầu xuất hiện chồi lan Hoàng thảo trầm in vitro trên các môi

trường nuôi cấy 28

ở thời điểm 2, 4, 6 và 8 tuần sau khi cấy 30

cao chồi ở thời điểm 2, 4, 6 và 8 tuần sau khi cấy 38

thời điểm 2, 4, 6 và 8 tuần sau khi cấy 42

thời điểm 6, 7 và 8 tuần sau khi cấy 48

ix

DANH SÁCH HÌNH Hình Tên hình Trang

1 Hoa lan Hoàng thảo trầm 3

2 Quy trình gieo hạt lan 17

3 Protocorm lan Hoàng thảo trầm phát triển ở tuần 8 trên các môi

trường A5, A0, A8 và A9 24

0,2 mg/L NAA (b) ở thời điểm 4 ngày sau khi cấy 29

NAA (a) và nghiệm thức MS bổ sung 1,5 mg/L BA kết hợp 0,2 mg/L NAA (b) ở thời điểm 6 tuần sau khi cấy 32

với NAA và nghiệm thức đối chứng ở giai đoạn 8 tuần SKC 33

với NAA ở thời điểm 4 tuần sau khi cấy 35

với NAA và nghiệm thức đối chứng ở giai đoạn 8 tuần SKC 36

9 Chiều cao chồi lan Hoàng thảo trầm trên các môi trường bổ TDZ và

BA kết hợp với NAA ở thời điểm 6 tuần sau khi cấy 39

bổ sung 1,5 mg/L BA kết hợp 0,2 mg/L NAA (b) ở thời điểm 8 tuần sau khi cấy 43

11 Số lá trên chồi lan Hoàng thảo trầm trên các nghiệm thức A6 và A10 ở thời điểm 8 tuần SKC 45

12 Sự hình thành hoa in vitro trên chồi lan Hoàng thảo trầm ở thời điểm 6

tuần sau khi cấy ở nghiệm thức A9 và A10. 46

13 Sự hình thành rễ in vitro trên chồi lan Hoàng thảo trầm ở nghiệm thức

A0 và A3 sau 8 tuần nuôi cấy 38

14 Sự hình thành rễ in vitro trên chồi lan Hoàng thảo trầm ở thời điểm 8

tuần SKC trong nhóm TDZ kết hợp với NAA 50

x

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

1

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1.1 TÍNH CẦN THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Lan rừng tuy không mang những kiểu cách và màu sắc sặc sỡ như những loại lan ngoại nhập nhưng chính nó lại mang vẻ đẹp tự nhiên mộc mạc và sức sống mãnh liệt Vì thế, nó luôn được ưa chuộng đối với những người yêu thích lan Thế giới lan rừng đa dạng phong phú với nhiều chủng loại từ màu sắc, kiểu dáng cho đến

mùi hương đặc biệt hấp dẫn Trong đó lớn nhất phải kể đến chi Dendrobium (còn

gọi là Hoàng Thảo) với hơn 1.600 loài nguyên thủy hiện diện ở khắp nơi trên thế giới Riêng Việt Nam là một quốc gia thuộc vùng khí hậu nhiệt đới rất lí tưởng cho

sự phát triển của các loài lan với 133 giống Dendrobium (Bùi Xuân Đáng, 2013),

Võ Văn Chi đã liệt kê được 104 loài Trong chi Dendrobium phải kể đến lan Hoàng thảo trầm (Dendrobium parishii) là loại hoa tuyệt đẹp và quý hiếm với

những điểm đặc biệt thu hút, có thể được tìm thấy ở Trung Quốc, Ấn Độ, Việt Nam,… ở độ cao 250 - 1700 m Ở nước ta Hoàng thảo trầm có nhiều tên gọi khác nhau như Song hồng (Phạm Hoàng Độ, 1993), Hoàng thảo tím hồng (Trần Hợp, 1998) Thân ngắn, tăng dần hoặc rủ xuống hình trụ Hoa to thơm, màu thạch anh tím và có hai chấm màu đỏ đậm ở mỗi mặt của môi, hoa mọc từng chùm ở các đốt

của cây già Ở Việt Nam, Hoàng thảo trầm (Dendrobium parishii) chủ yếu phân bố

ở Lào Cai, Điện Biên, Tây Nguyên,…nhưng hiện nay do bị khai thác quá nhiều vô tình làm mất đi giống lan đặc hữu quý hiếm mang nhiều gái trị của Việt Nam Bên cạnh đó công tác bảo tồn và nhân giống chưa được triển khai một cách toàn diện

và sâu rộng Ở Việt Nam, cho đến nay mới có rất ít công trình nghiên cứu bảo tồn

và nhân giống lan rừng Một số nghiên cứu nuôi cấy mô trên lan Hoàng thảo như Hoàng thảo thân gãy (Nguyễn Thanh Tùng & cs., 2010), lan Thạch hộc (Nguyễn Thị Tình & cs., 2015), lan Nhất điểm hồng (Trần Hoàng Nam, 2009), Vì vậy, đề

tài “Ảnh hưởng của nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng lên sự nhân quá

trình nhân chồi lan Hoàng thảo trầm (Denrobium parishii) bằng phương pháp nuôi cấy mô” được thực hiện nhằm mục đích nhân nhanh số lượng lan Hoàng thảo

trầm đáp ứng nhu cầu lớn về nguồn cây giống cho thị trường Đồng thời góp phần giữ gìn và phục hồi giống lan đặc biệt quý hiếm không chỉ của Việt Nam mà còn ở các khu vực khác

2

1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Xác định nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng BA, TDZ và NAA phù hợp nhất

cho việc nhân nhanh protocorm và chồi lan Hoàng thảo trầm in vitro

1.3 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Lan Hoàng thảo trầm được mua từ tỉnh Điện Biên Mẫu lan Hoàng thảo trầm in

vitro được lưu trữ tại phòng Nuôi cấy mô thuộc Khoa Nông nghiệp & TNTN -

Trường Đại học An Giang

1.4 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Nghiên cứu ảnh hưởng của BA, TDZ và NAA phù hợp nhất cho việc nhân nhanh

protocorm và chồi lan Hoàng thảo trầm in vitro

1.5 NHỮNG ĐÓNG GÓP CỦA ĐỀ TÀI

1.5.1 Đóng góp về mặt khoa học

Tìm được nồng độ chất điều hòa tăng trưởng thích hợp để nhân nhanh chồi lan

Hoàng thảo trầm in vitro

Tạo ra được một lượng lớn cây con in vitro Tạo cơ sở cho các hướng nghiên cứu

ứng dụng lâu dài (phục vụ cho các bước nghiên cứu tiếp theo về lan Hoàng thảo trầm như thích nghi trong vườn ươm, lai tạo, chọn giống)

1.5.2 Đóng góp công tác đào tạo

Các thí nghiệm của đề tài được thực hiện trong phòng nuôi cấy mô có thể tạo cơ hội tốt cho các sinh viên thực hiện đề tài nghiên cứu và làm luận văn tốt nghiệp Kết quả của đề tài là nguồn tài liệu tham khảo rất có ý nghĩa

1.5.3 Đóng góp phát triển kinh tế xã hội

Kết quả nghiên cứu thành công giúp cho người sản xuất giảm được chi phí giống, đáp ứng nguồn giống gieo trồng với quy mô lớn, đồng đều

Đáp ứng nhu cầu sưu tầm loài lan quý này, hạ thấp giá thành lan Hoàng thảo trầm trên thị trường hoa lan

1.5.4 Đóng góp bảo vệ môi trường

Giảm bớt gánh nặng nguồn lan giống từ rừng đặc biệt là các khu rừng nguyên sinh, tránh tình trạng khan hiếm nguồn lan Hoàng thảo trầm nguyên thủy từ rừng dẫn đến khai thác tận diệt Bảo tồn nguồn gen nguyên thủy

3

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 2.1 GIỚI THIỆU VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ Cytokinin (BA, TDZ) lên quá trình nhân

protocorm lan Hoàng thảo trầm (Dendrobium parishii)

Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp chất điều hòa tăng trưởng Cytokinin (BA, TDZ)

và Auxin (NAA) lên việc nhân chồi lan Hoàng thảo trầm (Dendrobium parishii)

2.2 LƯỢC KHẢO VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

2.2.1 Giới thiệu lan Hoàng thảo trầm (Dendrobium parishii)

Danh pháp: Dendrobium parishii

Đồng danh: Callista parishii (Rchb f.) Kuntze 1891; Callista rhodopterygia

(Rchb f.) Kuntze 1891

Tên Việt: Trầm rừng, Song Hồng, Hoàng thảo tím hồng

 Mô tả: Phong lan cỡ trung, thân dài có thể đến 50 cm, có đường kính khoảng 1 - 2 cm Lá mọc đối xứng, lá ít hay nhiều có hình elíp, hơi dẻo dai, sớm

rụng dài 6 – 8 cm, rụng vào mùa thu như ở hầu hết các loài Dendorobium lá bọc

các mắt ngủ (Trần Văn Huân & Văn Tích Lượm, 2000) Vòi hoa xuất phát trên các đốt cuả thân, mỗi vòi có 2 - 3 hoa, hoa màu hồng lợt hoặc sáng Môi màu đậm hơn

và có lông tơ (Phạm Tiến Khoa, 2016) Bắt đầu nở từ mùa xuân tùy thuộc môi trường và tiểu vùng mà cây có thể cho hoa đến cuối hè

(Nguồn: Thomas Ditlevsen, 2006)

Hình 1: Hoa lan Hoàng thảo trầm

4

Nơi sống: Lan biểu sinh, trong các khu rừng rụng lá với ảnh hưởng mạnh của khí hậu gió mùa, trên độ cao 250 – 1.500 m Phân bố ở Ấn Độ, Myanmar, Lào, Việt Nam, Vân Nam Trung Quốc (Phạm Tiến Khoa, 2016)

Lan Dendrobium parishii rất dễ nhầm lẫn với Lan Dendrobium anosmum nhưng nhìn bên ngoài Dendrobium parishii thân ngắn chỉ chừng 30 - 40 cm và hoa tím sẫm hơn nhiều so với Dendrobium anosmum

Nuôi trồng: Loại này dễ trồng Tốt hơn hết là trồng trong chậu hoặc các giỏ nhỏ treo có phân trộn thoát nước tốt Nên tưới nước thường xuyên suốt thời kì tăng trưởng nhưng sau đó nên ngừng tưới vài tuần Suốt thời kì ngừng tưới loài này rụng lá và đòi hỏi nhiều ánh sáng hơn bình thường để tạo các cụm hoa (Trần Văn Huân & Văn Tích Lượm, 2000)

 Mùa nghỉ lan Hoàng Thảo

Một trong những điều kiện cần thiết cho đời sống của thực vật nói chung và của

họ lan nói riêng là phải có sự nghỉ ngơi định kỳ hàng năm Nhất là đa số các loài lan có nguồn gốc từ rừng nhiệt đới với 2 mùa nắng, mưa rõ rệt Đây cũng là thời

kỳ mà cây lan ngưng phát triển, thời kỳ này cần về mặt sinh lý, nhất là trổ bông

Sự nghỉ ngơi là thời gian cần phải có do sự thích nghi lâu đời để qua mùa khô,

mùa nghỉ của các loài thuộc giống Dendrobium cần thiết hơn nhiều (Lê Ngọc

có đúng với điều kiện thiên nhiên của cây lan đòi hỏi hay không (Lê Ngọc Mai, 2007)

Mùa nghỉ của lan là mùa có ẩm độ thấp và nhiệt độ thấp trong năm, do đó ở nước

ta mùa khô được chọn là mùa nghỉ của lan Các tỉnh Nam Bộ, mùa khô bắt đầu từ tháng 12 đến tháng 5, các tỉnh phía Bắc từ tháng 12 đến tháng 1 Riêng ở thành

phố Hồ Chí Minh mùa nghỉ của Dendrobium bắt dầu từ tháng 3 đến cuối tháng 4

(Nguyễn Duy, 2013)

5

2.2.2 Giá trị của chi lan Hoàng thảo

Hiện nay người trồng lan có thu nhập cao gấp nhiều lần so với người trồng lúa, gấp

3 - 5 lần so với người trồng rau cải, cỏ cho chăn nuôi Theo số liệu thống kê của

Vụ Kế Hoạch thuộc Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn nếu trồng lan cất

cành Dendrobium và Mokara 1 hecta có thể cho doanh thu 500 triệu - 1 tỉ

đồng/hecta/năm (Đào Thanh Vân & Đặng Thị Tố Nga, 2008)

Một số hoạt tính sinh học của lan Dendrobium đã được xác định là do những

polysaccharides thô (CPs) có trong lan Các CPs này có những tác động trên các hoạt động của đại thực bào như kích khởi sự thực bào, sự tiết NO và những

cytokines IL-1-alpha, IL6, IL10 và THF-alpha Trích tinh Dendrobium chứa

những hoạt chất dendrobine, dendroxine, dendramine Trong số này, dendrobine được xem là có dược tính làm giảm đau, chống sưng (Nguyễn Công Nghiệp, 1989)

Đa số polysaccharides trong lan Dendrobium thuộc loại beta (1 - 4) và (1 - 6)

mannose, những mannose này được cho là có ái lực với những thụ thể mannose/glucan, thụ thể dectin-1 và thụ thể loại Toll 2/4 nhờ đó kích khởi các hoạt động thực bào, tạo phản ứng chống oxy-hóa, gây phân hóa nội bào và tạo yếu tố kappa-B nơi nhân tế bào (Lan-Zhen Meng & et al, 2013)

Hoàng thảo trầm còn được nuôi cấy để tách chiết tinh dầu trầm sử dụng cho công nghiệp chế biến nước hoa Theo nghiên cứu mới nhất của Thái Lan, họ đã tách chiết được 29 hợp chất trong mẫu mô Hoàng thảo trầm nuôi cấy trong đó có một

số hợp chất chính như α-panasinsen, hexadecanoid acid, ethyl ester và β- selinene (Lan-Zhen Meng & et al, 2013)

2.2.3 Tình hình sản xuất hoa lan trên thế giới và Việt Nam

2.2.3.1 Tình hình sản xuất hoa lan trên thế giới

Từ năm 1957, Thái Lan và Indonesia bắt đầu phát triển nuôi trồng lan quy mô ngày càng lớn phục vụ cho xuất khẩu Hiện nay Thái Lan là nước đứng đầu thế giới về xuất khẩu hoa lan, đạt tới 110 triệu đô la trong năm 2003 Riêng hoa lan

cắt cành Dendrobium của Thái Lan chiếm tới 85% - 90% thị phần hoa lan

Dendrobium trên thế giới (Trần Viết Mỹ, 2009)

Singapore đã mở rộng nhiều trang trại nuôi trồng hoa lan xuất khẩu từ năm 1987 Năm 1992 xuất khẩu hơn 18 triệu USD, năm 1993 xuất 3,8 triệu cành đến châu

Âu và lượng khá lớn ở thị trường Nhật (Ngô Quang Vũ , 2002)

Năm 2002, sản lượng lan Hồ Điệp của Trung Quốc là 3 triệu cây, chủ yếu ở Quảng Đông, Phúc Kiến, Bắc Kinh, Vân Nam, Sơn Đông bao gồm 50 - 60 xí

6

nghiệp có quy mô lớn, trong đó Quảng Đông có hẳn 10 công ty sản xuất khoảng 1,2 triệu cây (chiếm 40% sản lượng lan Hồ Điệp của Trung Quốc) (Đào Thanh Vân & Đặng Thị Tố Nga, 2008)

Ở châu Âu, người ta cũng đã biết đến loài lan rất sớm, các tập di cảo dược tính, thảo mộc trong đó có nói đến cây lan đã có từ trước công nguyên Nước sản xuất hoa lan nhiều tại châu Âu là Hà Lan, sau đó là Hungary (Trần Viết Mỹ, 2009)

Hà Lan đã đầu tư 20 triệu USD vào Ấn Độ để lắp đặt các thiết bị máy móc đầu tư cho sản xuất hoa lan xuất khẩu Hoa phong lan của Hà Lan được trổng trong nhà kính với tổng diện tích 3081,75 ha

Thị trường xuất khẩu hoa lan trên thế giới ngày càng mở rộng Kim ngạch xuất khẩu hoa lan trên thế giới hàng năm đã đạt 1,8 tỷ USD (Phan Thúc Huân, 1989) Kim ngạch thương mại hoa lan cắt cành thế giới năm 2000 đạt 150 triệu USD (Đào Thanh Vân & Đặng Thị Tố Nga, 2008) Trong đó nước nhập khẩu hoa lan cắt cành thế giới nhiều nhất là Nhật Bản, sau đó là Italia, Pháp và Đức tiếp theo

là Mỹ và các nước khác

2.2.3.2 Tình hình sản xuất hoa lan ở Việt Nam

Việt Nam có khí hậu nhiệt đới ẩm hoàn toàn phù hợp với nhu cầu sinh thái của các loại hoa lan Sản xuất hoa lan còn chưa được áp dụng khoa học kỹ thuật nên mặc dù đa dạng nhưng không đạt về tiêu chuẩn, số lượng và chất lượng do đó tính cạnh tranh còn thấp Sản xuất hoa lan theo mô hình công công nghiệp mới chỉ phát triển mạnh ở các tỉnh phía Nam đặc biệt là Đà Lạt và thành phố Hồ Chí Minh (Phan Thúc Huân, 1997)

*Tại Đà Lạt

Hiện nay tại Đà Lạt cũng mới chỉ sản xuất khoảng 200.000 đơn vị lan cắt cành mỗi năm Ở Đà Lạt có khoảng 500 gia đình nuôi trồng hoa lan, trong đó có hơn

150 gia đình tham gia vào hội hoa lan của thành phố Đà Lạt Ủy ban Khoa học

Kỹ thuật của Đà Lạt và phòng Sinh học của viện Hạt nhân Đà Lạt cũng tham gia tích cực vào lập các cơ sở cấy mô phong lan và sưu tầm các loại lan Đà Lạt đã thu thập được khoảng 200 loài có khả năng nuôi trồng xuất khẩu (Phan Thúc Huân, 1997)

*Tại TP.HCM

Tính cho đến năm 1986 trong thành phố Hồ Chí Minh có khoảng 15 gia đình có vườn lan với số lượng từ 1000 – 7000 chậu Đến năm 1987, Uỷ ban khoa học thành phố tổ chức nghiên cứu đề tài về kinh tế kỹ thuật khoa học lan xuất khẩu Và

7

cũng năm 1987 thành lập công ty phong lan xuất khẩu trực thuộc Sở Lâm nghiệp Năm 2005 - 2006 thành phố đã dự kiến đầu tư 20 ha nuôi trồng hoa lan và 20 ha cây kiểng (Nguyễn Văn Chương & Trịnh Văn Thịnh, 1991)

Theo Trung tâm Nghiên cứu khoa học kỹ thuật và khuyến nông thành phố Hồ Chí Minh, trong thời gian qua diện tích trồng hoa lan trong thành phố tăng nhanh

từ 20 ha năm 2003 lên 50 ha năm 2004 và khoảng 80 ha năm 2005 Để đưa hoa lan trở thành một trong những cây chủ lực trong cơ cấu kinh tể nông nghiệp trong những năm tới, thành phố Hồ Chí Minh đề ra mục tiêu phát triển diện tích trồng hoa lan lên 200 ha vào năm 2010 và một số giải pháp chính về giống, khoa học

kỹ thuật, thị trường tiêu thụ, đào tạo nguồn nhân lực, chính sách hỗ trợ (Phan Thúc Huân, 1997)

2.3 KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ

2.3.1 Khái niệm về phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

Nuôi cấy mô tế bào thực vật là thuật ngữ được dùng một cách rộng rãi để nói về việc mô tả các phương thức nuôi cấy các bộ phận thực vật (tế bào đơn, mô, cơ quan) trong ống nghiệm có chứa môi trường xác định ở điều kiện vô trùng (Nguyễn Đức Lượng, 2006)

Mục đích chung của nuôi cấy mô tế bào thực vật là sử dụng các điều kiện như: nhiệt độ, ánh sáng, thành phần dinh dưỡng, các chất điều hòa sinh trưởng thực vật… để điều khiển quá trình sinh trưởng và phát triển của tế bào, mô nuôi cấy theo mục tiêu và yêu cầu đặt ra

Nuôi cấy mô tế bào thực vật còn là một phương pháp nghiên cứu hiệu quả nhất quá trình phát sinh hình thái ở nhiều loài thực vật Phương pháp này giúp mở ra những hướng mới trong nghiên cứu sinh lý và di truyền thực vật như: cơ chế sinh tổng hợp các chất, sinh lý phân tử - đột biến, sinh lý dinh dưỡng ở tế bào thực vật và nhiều vấn đề sinh học khác…

Tất cả dạng nuôi cấy mô đều được tiến hành qua hai bước:

- Các phần của thực vật hoặc một cơ quan thực vật nào đó được tách ra khỏi phần còn lại Đó là sự tách rời tế bào, mô hay cơ quan đang tương tác lẫn nhau trong một tổ chức thực vật nguyên vẹn

- Các phần tách ra nói trên phải đặt trong môi trường thích hợp để nó có thể biểu

lộ hết bản chất hoặc khả năng đáp ứng của nó (Nguyễn Đức Lượng, 2006)

8

2.3.2 Ưu và khuyết điểm trong nhân giống in vitro

2.3.2.1 Ưu điểm

Theo Bùi Bá Bổng (1995) công nghệ nhân giống in vitro đem lại các lợi ích sau:

Tạo các cây con đồng nhất và giống mẹ

So với điều kiện nhân giống thông thường (chiết cành, hom), nhân giống nuôi cấy

mô có ưu điểm là có thể nhân một số lượng lớn cây con từ một cá thể ban đầu trong thời gian ngắn

Không chiếm nhiều diện tích

Có thể cung cấp cây giống bất cứ thời điểm nào vì chủ động được do không bị ảnh hưởng bởi thời tiết và điều kiện ngoại cảnh

Có thể tạo ra cây con sạch bệnh bằng nuôi cấy đỉnh sinh trưởng kết hợp với xử lí nhiệt và ghép vi ống

Có thể tạo và nhân được các giống mới bằng kỹ thuật nghiên cứu phôi, chuyển gen

Một số cây quí có thể nhân nhanh để đưa vào sản xuất và việc trao đổi giống được dễ dàng

Lợi thế về vận chuyển: Các cây con kích thước nhỏ có thể vận chuyển đi xa dễ dàng và thuận lợi, đồng thời cây con tạo ra trong điều kiện vô trùng được xác nhận là sạch bệnh Do vậy, bảo đảm an toàn, đáp ứng các qui định về vệ sinh thực vật quốc tế (Lê Văn Hoàng, 2008)

2.3.2.2 Khuyết điểm

Bên cạnh những lợi ích thiết thực và to lớn trong nhân giống in vitro tuy nhiên

vẫn còn nhiều mặt hạn chế nhất định, theo Nguyễn Văn Uyển và cs (1984) có các vấn đề như:

Nhân giống trên môi trường agar nên giá thành sản xuất cao và thời gian nhân giống kéo dài

Sản xuất ở qui mô công nghiệp chi phí cho năng lượng và nhân công vẫn còn ở mức cao

Đôi khi xảy ra biến dị soma trong quá trình nuôi cấy, đặc biệt là tái sinh thông qua mô sẹo

Giới hạn sự đa dạng của dòng sản phẩm nhân giống do cây con tạo ra thường

9

đồng nhất về mặt di truyền

Ngoài ra còn các nhược điểm khác như:

Tính bất định về mặt di truyền: mục đích nhân giống in vitro là tạo ra các quần

thể nhất với số lượng lớn Tuy nhiên ở một số trường hợp không đồng nhất xảy ra

do những biến dị soma Biến dị soma xảy ra khác nhau tùy theo phương thức nuôi cấy Nuôi cấy mô sẹo dễ phát sinh biến dị hơn so với nuôi cấy mô đỉnh và chồi Mặt khác cấy chuyền nhiều lần cũng làm tăng biến dị trong nuôi cấy

Sư nhiễm bệnh do vi khuẩn: khi nuôi cấy đại đa số vi khuẩn nấm đều bị loại trừ nhưng vẫn có một số xâm nhiễm vào mô, tồn tại trong mô cấy gây tổn hại khi tế bào bắt đầu phân chia

Tạo ra các độc tố: trong một số trường hợp, các mô cấy có hiện tượng hóa nâu, hóa đen Các màu này sẽ phát tán vào trong môi trường nuôi cấy gây ảnh hưởng đến sự phát triển bình thường của các mô

2.3.3 Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy tế bào thực vật

 Môi trường nuôi cấy

Nền môi trường nuôi cấy với nồng độ và tỷ lệ khác nhau của các nguyên tố khoáng

đa, vi lượng, vitamin có ảnh hưởng rất rõ đến kết quả nuôi cấy in vitro cây lan

Nhiều tác giả đã xác nhận dùng các môi trường Vacin và Went (VW), Murashige

và Skoog (MS), Knudson C (KC) rất tốt cho cấy mô các loài thuộc họ lan

Thành phần môi trường dinh dưỡng ảnh hưởng lớn đến quá trình sinh trưởng và phát triển của tế bào Trong giai đoạn đầu của quá trình nuôi cấy, các chất dinh dưỡng giảm nhanh, sản phẩm trao đổi chất mới bắt đầu được tích tụ và tăng dần

Ba hợp phần của môi trường có ảnh hưởng lớn đến quá trình nuôi cấy tế bào thực vật là carbon, nitrogen và phospho Tuy nhiên, cũng không thể coi nhẹ các hợp phần khác của môi trường nuôi cấy, đặc biệt là các nguyên tố vi lượng và các chất điều hòa sinh trưởng Chúng đóng vai trò quan trọng trong quá trình trao đổi chất mặc dù nồng độ của chúng có trong môi trường ở mức độ rất thấp (Vũ Văn Vụ, 1999)

K (1985), Mamaril (1997) cho rằng: môi trường có vai trò rất quan trọng trong nuôi cấy, nó cung cấp chất dinh dưỡng thích hợp đảm bảo cho việc nuôi cấy mô phong lan Môi trường thích hợp cho việc nuôi cấy mô phong lan là: MS (Marushige - Shoog, 1962), VW (Vacine- Went, 1949), KC (Knudson C), F (Fonnesbeck, 1972)

10

Theo Bùi Thị Tường Thu và Trần Văn Minh (2010) cũng đã thu được kết quả tương tự khi nghiên cứu ảnh hưởng của các loại môi trường khác nhau đến nuôi cấy mô lan Trong năm loại môi trường nghiên cứu (MS, VW, KC, Orchmax và Lindemann), môi trường tốt nhất cho cây Dendrobium lai là môi trường MS Nhìn chung, môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật gồm các thành phần cơ bản sau:

+ Các khoáng đa lượng

+ Các khoáng vi lượng

+ Nguồn cacbon

+ Các vitamin

+ Amino acid và các nguồn cung cấp nitrogen khác

+ Các chất điều hòa sinh trưởng

+ Các chất bổ sung khác: nước dừa; dịch chiết nấm men; than hoạt tính; agar

 Nguồn Carbon

Mô và tế bào thực vật trong nuôi cấy in vitro sống chủ yếu dựa theo phương thức

dị dưỡng Vì vậy, việc bổ sung vào môi trường nuôi cấy nguồn carbon hữu cơ là điều bắt buộc Nguồn carbon trong môi trường nuôi cấy tế bào thực vật thường được cung cấp dưới dạng carbohydrate Carbon vừa tham gia tổng hợp các thành phần của tế bào vừa cung cấp năng lượng cho quá trình sinh trưởng và tồn tại của

tế bào Ngoài ra, carbohydrate cũng là nguồn cung cấp carbon cần thiết cho sự hình thành các sản phẩm trung gian thông qua trao đổi chất (Zhong & Yoshida, 1995)

Trong phần lớn các môi trường nuôi cấy, nguồn carbon được bổ sung chủ yếu là đường sucrose và glucose với nồng độ 20 g/L - 40 g/L Gautheret (1959) cho rằng đối với phần lớn các mô và tế bào nuôi cấy, đường sucrose và glucose là nguồn carbon tốt nhất, trong một số trường hợp khác, có thể dùng fructose, galactose và maltose (Nguyễn Đức Thành, 2000)

 Agar

Agar được sử dụng làm chất đông cứng môi trường để làm giá thể cho môi trường nuôi cấy tế bào thực vật tách rời Agar là một loại polysaccarite được trích từ tảo biển Nồng độ sử dụng thường là 6 g/L - 8 g/L Tuy nhiên, nếu nồng độ agar trong môi trường nuôi cấy cao sẽ giới hạn sự phát triển của mô sẹo hay một bộ phận

11

thực vật được nuôi cấy, vì agar nhiều sẽ làm cho môi trường đông cứng lại, hạn chế sự trao đổi chất giữa môi trường và mô nuôi cấy (Debergh, 1983)

 Các hợp chất hữu cơ bổ sung không xác định

Bổ sung nhiều chất trích hữu cơ khác nhau vào trong môi trường nuôi cấy thường mang lại kết quả thuận lợi cho sự tăng trưởng của mô Các chất bổ sung có nhiều loại như: nước cam, nước cà chua, khoai tây, chuối… Hiện nay, chất bổ sung được dùng phổ biến là nước dừa

Nước dừa đựợc bổ sung vào môi trường nuôi cấy mô lan giúp phôi tăng trưởng và nảy mầm (Hegarty,1955; Niimoto & Sagawa, 1961) Nước dừa có chứa zeatin (Letham, 1974) Cấu trúc của zeatin gần giống với kinetin nhưng hoạt tính cao hơn khoảng 10 lần Zeatin có trong nước dừa là một loại cytokinin, chất này làm tăng hoạt động phân chia tế bào trong điều kiện có auxin, giúp gia tăng kích thước tế bào và tổng hợp protein, thúc đẩy sự tăng trưởng của tế bào (Dương Tấn Nhựt & cs., 2009)

2.3.4 Ứng dụng chất điều hòa sinh trưởng trong nuôi cấy mô

Chất điều hòa sinh trưởng là yếu tố quan trọng nhất trong sự phát sinh hình thái và tái sinh cây nguyên vẹn từ tế bào và mô thực vật tách rời trong nuôi cấy mô Auxin

và cytokinin được bổ sung vào môi trường nuôi cấy để kích thích sự phát sinh hình thái và tỉ lệ hormone sử dụng để kích thích sự tạo chồi hay tạo rễ không giống nhau Tùy theo giống, loài thực vật mà nhu cầu về dạng và nồng độ của auxin và cytokinin khác nhau trong sự phát sinh hình thái (Vũ Văn Vụ, 1999)

Auxin rất thông dụng trong thực vật, có vai trò kích thích sự tăng trưởng của tế bào, cụ thể là nới lỏng vách tế bào thông qua sự hoạt hóa các enzim tổng hợp vách, khởi động cho sự giãn nở tế bào Auxin hoạt hóa sự sinh tổng hợp các hợp chất cao phân tử cần cho quá trình tăng trưởng như protein, cenlulo, pectin và ngăn cản không cho chúng bị thủy phân (Grodzinxki, 1981) Auxin kết hợp chặt chẽ các thành phần dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy để kích thích sự tăng trưởng của

mô sẹo Để tạo mô sẹo, 2,4-D thường sử dụng riêng rẽ hoặc phối hợp với cytokinin

và nó được thay thế bởi IBA hay NAA để kích thích sự phát sinh hình thái (Nguyễn Đức Lượng & Lê Thị Thủy Tiên, 2002) Nguyễn Văn Uyển (1993) lập luận rằng quan sát trên môi trường nuôi cấy phôi non ca cao có chứa NAA ở nồng

độ 8 mg/L - 48 mg/L thêm 10% nước dừa thấy có sự phát sinh cơ quan phôi, nhưng nếu dùng 8 mg/L 2,4-D kết hợp với 8 mg/L IAA thì kết quả còn tăng nhanh hơn, nhất là trên môi trường lỏng Ở giai đoạn tái biệt hóa, lượng auxin cần được

mô như diphenylurea (DPU), benzyladenine (BA), Thidiazuron (TDZ), Kinetin và 2-iP; chúng thường kích thích sự phân chia tế bào, đặc biệt nếu kết hợp với auxin

Ở nồng độ cao chúng có thể cảm ứng tạo chồi bất định nhưng ức chế tạo rễ; chúng kích thích tạo chồi nách do ức chế chồi đỉnh Để đạt tỷ lệ nhân giống cao, số lượng tương đối lớn cytokinin đã được sử dụng trong môi trường nuôi cấy

Theo Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thuỷ Tiên (2002) việc bổ sung cytokinin vào môi trường nuôi cấy có thể cảm ứng được sự tăng trưởng của vài chồi nhỏ từ các mẫu cấy sau khoảng 4 - 6 tuần nuôi cấy, nếu nồng độ cytokinin quá cao sẽ kích thích sự hình thành của nhiều chồi nhưng các chồi này không thể kéo dài hoặc lá bị biến dạng hay chồi có hiện tượng mọng nước

Tỷ lệ auxin và cytokinin trong môi trường nuôi cấy mô có ý nghĩa quan trọng trong việc nhân giống vô tính bằng phương pháp nuôi cấy mô Tỷ lệ cân đối giữa auxin và cytokinin sẽ cho phép tạo cây hoàn chỉnh Trong quá trình tạo chồi, auxin được sử dụng với nồng độ thấp kết hợp với cytokinin ở nồng độ cao sẽ làm gia tăng tốc độ nhân chồi của cây Trong khi tỷ lệ cytokinin thấp và auxin cao thì lại

thích hợp cho sự ra rễ, mức độ trung gian giữa hai tỉ lệ thích hợp cho sự tạo callus

Auxin như 2,4-D, NAA và IAA kích thích tạo mô sẹo và giảm sự tạo chồi (Lê Văn

Bé & cs., 2003) Trong việc tạo chồi trực tiếp các auxin như NAA, IAA, IBA thường được dùng so với 2,4-D; sử dụng NAA 0,5 mg/L hoặc NAA kết hợp với

IBA 0,5 mg/L - 1 mg/L đã làm cho rễ phồng lên và thân có mô sẹo ở chồi Prunus

tenella, trong khi chỉ dùng IBA 0,5 mg/L thì tạo rễ mỏng bình thường và ít mô sẹo

(Sriskandarajah & cs., 1989)

Theo Rout (2000) cho rằng mức độ auxin và cytokinin ngoại sinh giữ vai trò quan trọng trong việc kích kích và phát triển chồi, ảnh hưởng mạnh mẽ đến sự phát sinh hình thái Trong một số cây, việc tạo chồi trực tiếp được kích thích bởi cytokinin, khi thêm auxin vào thì sẽ gây ức chế Khi một mình cytokinin kích thích tạo chồi thì hoạt động của chúng có thể tùy thuộc vào sự hiện diện của auxin nội sinh bên trong cây

13

2.3.5 Tình hình nghiên cứu nuôi cấy in vitro một số cây thuộc họ lan Hoàng Thảo (Dendrobium)

2.3.5.1 Tình hình nghiên cứu ngo i nướ

Năm 2000, Ed Herman đã nuôi cấy đoạn than giống lan Dendrobium moschatum

trên môi trường bổ sung kết hợp BA và NAA Kết quả thu được cao nhất tại môi

trường MS có bổ sung BA = 3,0 mg/L và NAA = 2,0 mg/L đạt 4 protocorm

Năm 2003, Nasiruddin và cs đã thử nghiệm nuôi cấy từ lá của giống lan

Dendrobium formosum Kết quả thu được sau 40 ngày nuôi cấy với số chồi cao

nhất là 1,9 chồi tại nồng độ BA = 2,5 mg/L và NAA = 0,5 mg/L Sau 60 ngày nuôi cấy số chồi cao nhất đạt 2,68 tại nồng độ BA = 2,5 mg/L và NAA = 1 mg/L

Năm 2005, Yih-Juh Shiau và cs., tiến hành gieo các hạt giống từ quả cây lan

Dendrobium candidum Wall Ex Lindl 120 ngày tuổi sau khi thụ phấn đầu tiên đã

nảy mầm trên môi trường MS cơ bản có bổ sung 30 g/L sucrose Sau 75 ngày nuôi cấy các mẫu cấy đã phát triển thành nụ/cành trên môi bổ sung 2 mg/L benzyladenine (BA) và 0,1 mg/L acid naphthaleneacetic (NAA) đạt 73,2%

Năm 2008, Jian-Ping Luo và cs tiến hành tạo các cơ quan protocorm-like (PLBs)

từ các đoạn thân cây lan Dendrobium densiflorum Lindl ex Wall trên môi trường

MS sử dụng bổ sung 6-benzylamino-purine (BAP) và Neodymium lanthanoid Kết quả cho thấy tỷ lệ PLBs hình thành cao nhất đạt 72%, môi trường MS bổ sung 5,0 mg/L BAP đạt trung bình 15 PLBs/mẫu cấy Các PLBs phát triển thành chồi nhanh chóng trên môi trường MS có chứa 2,0 mg/L BAP Môi trường MS có bổ sung 2,0 mg/L Neodymium nitrate hình thành rễ nhiều nhất với 22 rễ/cây non

Tháng 4 năm 2010, Sana Asghar và cs đã tiến hành nghiên cứu nhân nhanh chồi

giống lan Dendrobium noibile var Emma từ chồi nách có bổ sung BAP và kinetin

Qua nghiên cứu họ nhận thấy môi trường chứa 2 mg/L IBA với tỷ lệ phần trăm rễ (95.5%) số lượng rễ (4,70%) và chiều dài cây (3,47 cm) hiệu quả hơn so với NAA Nồng độ cao hơn của IBA và NAA 3 mg/L cho thấy khả năng hình thành rễ kém

Hajong và cs (2013) đã tiến hành cấy các mắt ngủ của cây lan Dendrobium

chrysanthum trên môi trường MS bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng:

thidiazuron (TDZ), 6-benzyl purine amin (BAP) và 2 acid acetic 4 dichlorophenoxy (2,4-D) riêng biệt và kết hợp nhau ở các nồng độ khác nhau nhằm để tăng cường sự tăng sinh và kéo dài của chồi từ các mắt ngủ Tần số tối đa của mẫu cấy tạo chồi 100%, số lượng cao nhất của chồi/mẫu cấy 14,33 ± 0.14, số chồi hình thành 14,33 và chiều dài tối đa của chồi 1,97 ± 0,04 thu được trong MS vừa bổ sung 5 mM TDZ + BAP 5 mM Phần trăm rễ của chồi tái sinh đạt trung

14

bình 11,26 rễ/chồi và có chiều dài rễ trung bình khoảng 2,45 cm đã đạt được trong môi trường MS có bổ sung 10 mM (NAA)

2.3.5.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Năm 2005, Trần Quang Hoàng đã tiến hành nhân in vitro 2 giống lan Dendrobium

và Cymbidium sau 60 ngày nuôi cấy từ cụm protocorm ở môi trường nuôi cấy mô

bổ sung 1 mg/L TDZ và 0,5 mg/L NAA cho thấy khả năng hình thành phôi soma,

protocorm và chồi cao nhất trên cả hai giống lan Số chồi đạt 10,22 chồi

Năm 2005, Nguyễn Thị Hoàng Uyên đã gieo hạt Dendrobium superbum trên hai

loại môi trường gồm: môi trường MS cơ bản và môi trường Knudson C kết hợp

với BA cùng NAA Kết quả cho thấy ở giai đoạn nhân nhanh protocorm môi

trường Knudson C bổ sung 2 ppm BA và 0,5 ppm IAA cho hiệu quả cao với hệ số nhân chồi là 3x412 chồi/năm Kết quả cũng cho thấy nồng độ khử Ca(OCl)2 9% với thời gian khử 15 phút cho hiệu quả khử trùng trái lan tối ưu nhất, tỉ lệ hạt sống rất

cao (100%) mẫu hạt gieo hoàn toàn không bị nhiễm và chết

Năm 2009, Nguyễn Văn Minh và Nguyễn Hữu Lễ đã tiến hành nghiên cứu đề tài

“Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng thực vật lên sự phát sinh chồi và rễ phong

lan giả hạc Denrobium anosmum” Kết quả đề tài cho thấy sau 90 ngày nuôi cấy ở

môi trường MS được bổ sung 0,5 mg/L BA cho hiệu quả tạo chồi cao nhất (6,67 chồi/mẫu cấy) Ở môi trường có bổ sung 0,5 mg/L BA và 1 mg/L IBA có tác dụng

kích thích tạo chồi cây lan Dendrobium anosmum in vitro cao nhất

Năm 2009, Trần Hoàng Nam tiến hành “Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa

sinh trưởng và nước dừa đến quá trình nhân giống in vitro cây lan Nhất Điểm Hồng (Dendrobium draconis)” Kết quả cho thấy môi trường MS bổ sung 1,5

mg/L BA thích hợp nhất cho sự hình thành chồi với số chồi hình thành cao (3,17 chồi), thời gian hình thành ngắn (15,89 NSC) Sự kết hợp giữa nồng độ BA = 1 mg/L và NAA = 0,5 mg/L trong môi trường MS cho kết quả về sự hình thành chồi tối ưu nhất, với thời gian hình thành chồi ngắn nhất (13,22 NSC), số chồi đạt cao nhất (3,28 chồi)

Năm 2011, Phan Ngọc Toàn tiến hành khảo sát môi trường tái sinh chồi và tạo

protocorm lan rừng Thủy tiên tím (Dendrobium ambile (Lour.)) cho thấy môi

trường MS + BA (2 mg/L) + NAA (0,5 mg/L) thích hợp cho sự tạo protocorm từ chồi lan thủy tiên tím Sau 80 ngày nuôi cấy thì tỷ lệ mẫu tạo protocorm là 86,67%

và số lượng protocorm tạo ra là 11,33 protocorm Sau 60 ngày nuôi cấy môi

trường MS + BA (2 mg/L) cho tỷ lệ tái sinh chồi cao nhất đạt 53,33% và chồi cao 7,23 mm

15

Năm 2012, Vũ Thanh Sắc và cs đã tiến hành nhân giống in vitro lan Hoàng thảo trầm trắng (Dendrobium Anosmun var Alba) trên môi trường khoáng có bổ sung

chất điều tiết sinh trưởng, dinh dưỡng hữu cơ (khoai tây nghiền, chuối xanh nghiền

và nước dừa) và than hoạt tính Kết quả cho thấy giai đoạn nhân nhanh cây con lan

Hoàng thảo trầm trắng in vitro có tác dụng hiệu quả nhất trên môi trường 1

/2 MS + 20g/L đường sucrose + 10g/L agar + 1,5 mg/L kinetin + 120 g/L chuối xanh +10% nước dừa + 1 g/L THT, pH = 5,82

Năm 2013, Ngô Thị Nguyệt và cs đã tiến hành nhân giống in vitro lan Phi điệp tím (Dendrobium anosmum) cho thấy môi trường tối ưu cho giai đoan nhân nhanh

lan Phi điệp tím là môi trường MS+ BAP 1,5 mg/L + 0,9 mg/L kinetin

Năm 2014, Nguyễn Xuân Dũng và cs đã tiến hành tái sinh PLBs từ lát cắt mô thân

cây lan Dendrobium sonia Kết quả cho thấy môi trường MS bổ sung 1,0 mg/L

NAA kết hợp với 0,5 mg/L hay 0,3 mg/L BA là môi trường thích hợp nhất cho PLBs tái sinh (Trọng lượng PLBs (g) đạt 8,47 ± 0,29)

Năm 2014, Trần Thị Mơ đã thực hiện nghiên cứu nhân giống vô tính in vitro giống lan Dendrobium aduncum Kết quả cho thấy môi trường MS + 0,5 mg/L BA + 0,5

mg/L NAA + 15% CW + 0,5 % AC + 2% đường + 0,8% agar cho hiệu quả nhân

nhanh protocorm cao nhất Ở môi trường MS có bổ sung 1,5 mg/L BA + 0,1 mg/L

NAA + 10% CW + 0,5 % AC + 2% đường + 0,8% agar tối ưu cho giai đoạn nhân nhanh chồi và môi trường MS + 0,9 mg/L NAA + 0,1 mg/L BA + 10% CW + 0,5

% AC+ 2% đường + 0,8% agar là môi trường cho việc tạo cây hoàn chỉnh hiệu quả nhất

2.4 CÂU HỎI NGHIÊN CỨU HOẶC GIẢI THUYẾT NGHIÊN CỨU

Nồng độ Cytokinin (BA, TDZ) bao nhiêu là thích hợp cho việc nhân protocorm lan Hoàng thảo trầm (Dendrobium parishii)?

Nồng độ của tổ hợp chất điều hòa tăng trưởng Cytokinin (BA, TDZ) và Auxin

(NAA) là bao nhiêu để việc nhân chồi lan Hoàng thảo trầm (Dendrobium parishii)

hiệu quả nhất?

16

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 MẪU NGHIÊN CỨU

Cụm protocorm lan Hoàng thảo trầm được lưu trữ tại phòng Nuôi cấy mô thuộc

Khoa Nông nghiệp & TNTN - Trường Đại học An Giang

3.2 THIẾT KẾ NGHIÊN CỨU

3.2.1 Môi trường và điều kiện nuôi cấy

Môi trường nuôi cấy: Môi trường nền theo Murashige - Shoog (1962), đường sucrose (20 g/L), agar (8 g/L) và chất điều hòa sinh trưởng bổ sung vào môi trường nuôi cấy tùy theo từng thí nghiệm pH của môi trường là 5,7 – 5,8 Các keo chứa

50 ml môi trường được hấp khử trùng ở nhiệt độ 121 oC trong 30 phút, 1 atm

 Điều kiện nuôi cấy: các keo nuôi mẫu được đặt trong phòng nuôi cấy với

 Nhiệt độ từ: 24 oC - 26 oC

3.2.2 Giai đoạn tạo vật liệu khởi đầu

Mục tiêu: Tạo vật liệu khởi đầu cho các thí nghiệm

Vật liệu: Quả lan cần thời gian từ 6 tháng đến 1 năm để chín Trái lan khi hái phải đủ già và chưa bị nứt, sau đó được đem khử trùng

 Cách khử và nuôi cấy:

 Trái lan được rửa sạch dưới vòi nước chảy 10 phút, ngâm trái lan bằng xà phòng loãng trong (5 – 10) phút (tùy trái sạch hay bẩn) sau đó rửa lại bằng nước sạch cho sạch

 Cho trái lan vào một bình sạch (tốt nhất đã hấp khử trùng) mang vào

tủ cấy vô trùng

 Dùng cồn 700 lắc sơ qua trong 30 giây, sau đó rửa lại bằng nước cất

vô trùng (3 lần)

hộp lại, bịt xung quanh miệng keo bằng bọc trắng

Hình 2: Quy trình gieo hạt lan

(a: trái lan; b: trái lan ngâm trong dung dịch xà phòng; c: trái lan ngâm trong dung dịch cồn 900; d: mổ quả lan; e: gieo hạt lan trong môi trường nuôi cấy; f: hạt lan nảy

18

3.2.3 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của Cytokinin (BA, TDZ) lên quá trình nhân

protocorm lan Hoàng thảo trầm

* Mục tiêu: Tạo số lượng lớn protocorm lan Hoàng thảo trầm in vitro

* Vật liệu: Cụm protocorm lan Hoàng thảo trầm

* Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên

Thí nghiệm gồm 11 nghiệm thức, với 5 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại gồm 1 bình, mỗi bình chứa 1 mẫu cấy

* Cách tiến hành: Cấy cụm protocorm khoảng 0,5 cm vào môi trường MS

có bổ sung agar 8 g/L, đường sucrose 30 g/L, pH= 5,6 – 5,8 và nồng độ BA và TDZ được bổ sung khác nhau theo bảng 1

Bảng 1: Các nghiệm thức của thí nghiệm 1

19

Chỉ tiêu theo dõi:

- Tỷ lệ (%) chồi được hình thành trên mẫu cấy

- Số chồi/mẫu cấy: ghi nhận thời gian xuất hiện chồi và số chồi hình thành

- Số lá/chồi: ghi nhận các lá hoàn chỉnh

- Số rễ/chồi: ghi nhận thời gian xuất hiện rễ và các rễ hình thành trên mẫu cấy

Các chỉ tiêu được theo dõi trên tuần, trong 8 tuần nuôi cấy

3.2.4 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của sự tổ hợp Auxin (NAA) và Cytokinin (BA

và TDZ) lên quá trình nhân chồi lan Hoàng thảo trầm

* Mục tiêu: Nhân nhanh chồi lan Hoàng thảo trầm

* Vật liệu: Các chồi cây Hoàng thảo trầm thu được từ thí nghiệm 1

* Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu

nhiên Thí nghiệm gồm 11 nghiệm thức với 5 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại gồm 1 bình, mỗi bình chứa 1 mẫu cấy

* Cách tiến hành: Cấy chồi lan vào môi trường MS có bổ sung có bổ sung

agar 8 g/L, đường sucrose 30 g/L, pH= 5,6 – 5,8 và nồng độ Auxin (NAA) và Cytokinin (BA, TDZ) được bổ sung khác nhau theo bảng 2

* Phân tích số liệu: Số liệu được lưu trữ trên Excel và dùng phần mềm

MSTATC để phân tích thống kê

Chỉ tiêu theo dõi:

- Tỷ lệ (%) chồi đƣợc hình thành trên mẫu cấy

- Số chồi/mẫu cấy: ghi nhận thời gian xuất hiện chồi và số chồi hình thành

- Số lá/chồi: ghi nhận các lá hoàn chỉnh

- Số rễ/chồi: ghi nhận thời gian xuất hiện rễ và các rễ hình thành trên mẫu cấy

Các chỉ tiêu đƣợc theo dõi hàng tuần, trong 8 tuần nuôi cấy

22

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 HIỆU QUẢ CỦA BA VÀ TDZ LÊN QUÁ TRÌNH NHÂN PROTOCORM CÂY LAN HOÀNG THẢO TRẦM IN VITRO

Giai đoạn nhân các cụm protocorm là giai đoạn rất quan trọng và có tác động quyết định đến hiệu quả của phương pháp vi nhân giống in vitro, thông thường

người ta thường bổ sung các chất điều hoà sinh trưởng vào môi trường nuôi cấy để

tăng hệ số nhân protocorm Trong các chất điều hòa sinh trưởng nhóm chất được

sử dụng nhiều trong các thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào thực vật là cytokinin Tỷ lệ

và hàm lượng nhóm chất này có vai trò quan trọng đến sự phát sinh hình thái và kích thích sự phân chia tế bào của mẫu nuôi cấy

Để tìm hiểu ảnh hưởng của BA và TDZ đến khả năng nhân protocorm cây lan Hoàng thảo trầm in vitro, thí nghiệm được tiến hành với 2 chất BA và TDZ bổ

sung vào môi trường MS với các nồng độ khác nhau Theo dõi khả năng sinh

trưởng và phát triển của protocorm sau 8 tuần nuôi cấy Kết quả nghiên cứu được

thể hiện ở các Bảng và Hình:

4.1.1 Hiệu quả của BA và TDZ lên sự gia tăng số lượng hạt protocorm của lan

Hoàng thảo trầm

Kết quả được thể hiện ở Bảng 5 cho thấy, trên các môi trường MS có và không có

bổ sung chất điều hòa sinh trưởng đều ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát

triển của chồi lan Hoàng thảo trầm Phần lớn, các protocorm được nuôi cấy trên

môi trường MS có bổ sung các chất điều hoà sinh trưởng BA và TDZ đều có sự

gia tăng số về số lượng các hạt protocorm cao hơn so với môi trường không bổ

sung chất điều hoà sinh trưởng Tuy nhiên do việc bổ sung dãy nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng khác nhau trên môi trường MS nên hiệu quả tác động giữa

các nhóm nghiệm thức cho sự gia tăng khác nhau về số lượng protocorm là khác

nhau ở các nhóm thí nghiệm và giữa các nghiệm thức có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê

Phân tích sự gia tăng về số lượng các hạt protocorm trên giống lan Hoàng thảo

trầm giữa các nghiệm thức trong từng tổ hợp BA và TDZ kết quả thí nghiệm

được thể hiện ở Bảng 3 như sau:

23

Bảng 3: Hiệu quả của BA và TDZ lên sự gia tăng lƣợng protocorm ở thời điểm

8 tuần sau khi cấy

với nghiệm thức MS bổ sung 0,5 mg/L BA (A1), nghiệm thức MS bổ sung 1,5 mg/L BA (A3) và khác biệt có ý nghĩa so với nghiệm thức đối chứng (A0) (Hình 3b) nhƣng không khác biệt có ý nghĩa so với các nghiệm thức còn lại trong nhóm

bổ sung BA

24

Ở nhóm có bổ sung TDZ sau 8 tuần nuôi cấy cho thấy có sự khác biệt giữa các

nghiệm thức với nhau Nhìn chung tốc độ gia tăng về lượng hạt protocorm mang

nhiều kết quả đáng ghi nhận tuy nhiên tốc độ gia tăng không đồng đều và có sự khác biệt rất lớn giữa các nghiệm thức Cụ thể ở nghiệm thức MS bổ sung 1,5

38 hạt protocorm được ghi nhận ở tuần thứ 8 này, kết quả trên cho khác biệt có ý

nghĩa với tất cả các nghiệm thức trong nhóm này và với nghiệm thức đối chứng (A0)

Hình 3: Protocorm lan Hoàng thảo trầm phát triển ở tuần 8 trên các môi

trường A5 , A 0 , A 8 và A 9

(a: MS có bổ sung 2,5 mg/L BA (A5); b: môi trường MS (A0), c: MS có bổ sung

1,5 mg/L TDZ (A8); d: MS có bổ sung 2,0 mg/L TDZ (A9))

25

Giữa 2 nhóm nghiệm thức có bổ sung BA và TDZ sau 8 tuần nuôi cấy cho thấy

rằng ở nhóm BA bổ sung khi tăng nồng độ từ 0,5 đến 2,5 mg/L cho hiệu quả gia

tăng số protocorm tăng dần đạt từ 25,2 đến 33,4 hạt ở nghiệm tức MS bổ sung 2,5

mg/L BA Ở nhóm TDZ bổ sung khi tăng nồng độ TDZ từ 0,5 đến 1,5 mg/L cho

hiệu quả gia tăng số lượng protocorm rất hữu hiệu đạt từ 29,2 đến 38,0 hạt Tuy

nhiên ở các dãy nồng độ TDZ bổ sung cao vào môi trường khi tăng trên mức 1,5

mg/L (từ 2,0 đến 2,5 mg/L) qua ghi nhận cho thấy khả năng sinh trưởng của các

hạt protocorm bị ức chế, tốc độ hình thành và sinh trưởng của protocorm rất chậm

Nghiệm thức cho khả năng gia tăng về chỉ tiêu số lượng hạt protocorm tối ưu nhất

cho khác biệt với tất cả nghiệm thức ở 2 nhóm chất bổ sung (ngoại trừ nghiệm

thức bổ sung 2,5 mg/L BA) và khác biệt so với nghiệm thức đối chứng (A0)

Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu của Trần Quang Hoàng (2005) ở giống

Dendrobium và giống Cymbidium, Bùi Thị Tường Thu và Trần Văn Minh (2011)

trên cây Hoàng lan, Budi Winarto và Fitri Rachmawati (2013) trên giống lan

Dendrobium cho thấy vai trò quan trọng của TDZ trong quá trình nhân

protocorm

Theo nghiên cứu của Lê Hồng Thủy Tiên (2006) cho thấy ở nồng độ TDZ trên 1,5

mg/L trong môi trường nuôi cấy làm cho sự sinh trưởng của protocorm bị ức chế

Theo Nguyễn Thị Quỳnh & cs., (2012) ghi nhận sự hiện diện của TDZ kết hợp với

auxin nội sinh trong mô cấy tạo cảm ứng cho sự tăng sinh của tế bào Nghiên cứu

Trần Quang Hoàng (2005) trên giống lan Dendrobium đã chỉ ra khả năng phát sinh

phôi soma rất cao với môi trường nuôi cấy có bổ sung nồng độ BA cao và khả

năng phát sinh phôi soma càng cao khi ta bổ sung BA với nồng độ cao vào môi

trường nuôi cấy, cho thấy kết quả khả năng hình thành protocorm tăng ở những

môi trường có bổ sung BA cao, do BA có vai trò kích thích sự phân chia tế bào

nên nồng độ BA cao thì khả năng phân chia tế bào càng cao

Tóm lại: nghiệm thức cho khả năng gia tăng về số lượng hạt protocorm tối ưu nhất

là nghiệm thức MS bổ sung 1,5 mg/L TDZ (A8)