ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG tạo CHẤT HOẠT hóa bề mặt SINH học của VI KHUẨN, ỨNG DỤNG xử lý môi TRƯỜNG NHIỄM KIM LOẠI NẶNG

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --- NGUYỄN THỊ THU HÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG TẠO CHẤT HOẠT HÓA BỀ MẶT SINH HỌC CỦA VI KHUẨN, ỨNG DỤNG XỬ LÝ MÔI TRƯỜNG NHIỄM KIM LO

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

NGUYỄN THỊ THU HÀ

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG TẠO CHẤT HOẠT HÓA BỀ MẶT SINH HỌC CỦA VI KHUẨN, ỨNG DỤNG XỬ LÝ MÔI TRƯỜNG NHIỄM KIM LOẠI NẶNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – Năm 2014

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

NGUYỄN THỊ THU HÀ

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG TẠO CHẤT HOẠT HÓA BỀ MẶT SINH HỌC CỦA VI KHUẨN, ỨNG DỤNG XỬ LÝ MÔI TRƯỜNG NHIỄM KIM LOẠI NẶNG

Chuyên ngành: KHOA HỌC MÔI TRƯỜNG

Mã số : 60 44 03 01

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS KIỀU THỊ QUỲNH HOA

TS TRẦN THỊ HUYỀN NGA

Hà Nội – Năm 2014

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới TS Kiều Thi ̣ Quỳnh Hoa, phó Trưởng phòng Phòng Vi Sinh Vật Dầu Mỏ, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đồng hướng dẫn TS Trần Thị Huyền Nga -

Giảng viên Khoa Môi trường, đã tận tình hướng dẫn và truyền đạt những kiến thức, kinh nghiệm quý báu cho tôi trong suốt quá trình thực tập và làm luận văn tốt nghiệp

Để hoàn thành luận văn này, tôi xin cảm ơn các cán bộ, học viên, sinh viên thuộc Phòng Vi Sinh Vâ ̣t Dầu Mỏ , Viện Công nghệ Sinh học đã hỗ trợ và tạo điều kiện thuận

lợi cho tôi trong quá trình làm thực nghiệm

Đồng thời, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến tập thể thầy cô giáo Khoa Môi trường, Trường Đại học Khoa học tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội đã truyền thụ những kiến thức quý báu cho tôi trong suốt quá trình học tập

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè, những người đã quan tâm giúp đỡ, động viên và khuyến khích tôi trong suốt thời gian qua để tôi hoàn thành luận văn được tốt hơn

Tuy đã có những cố gắng nhất định nhưng do thời gian và trình độ có hạn nên chắc chắn luận văn này có nhiều thiếu sót và hạn chế nhất định Kính mong nhận được sự góp ý của thầy cô và các bạn

Hà Nội, tháng 12 năm 2014

Học viên cao học

Nguyễn Thị Thu Hà

CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN

KLN Kim loại nặng

CHHBMSH Chất hoạt hóa bề mặt sinh học

CHHBM Chất hoạt hóa bề mặt

TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam

CMC Nồng độ mixen tối thiểu

WHO Tổ chức sức khỏe thế giới

EEC Cộng đồng kinh tế Châu Âu

BTNMT Bộ tài nguyên môi trường

HKTS Hiếu khí tổng số

DO Diesel Oil

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Hàm lượng KLN trong chất thải của một số mỏ vàng điển hình tại Úc…….5 Bảng 1.2 Phân loại CHHBMSH tạo ra từ vi sinh vật……….… 14 Bảng 1.3 Một số loài vi sinh vật có khả năng tạo CHHBMSH……….… 19 Bảng 3.1 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào của 24 chủng vi khuẩn nghiên

cứu 38 Bảng 3.2 Khả năng sinh trưởng và tạo CHHBMSH của các chủng vi khuẩn

nghiên cứu……….40 Bảng 3.3 Khả năng loại Cd và Pb của CHHBMSH ta ̣o ra từ chủng CB5a………… 55

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Mối quan hệ giữa nồng độ CHHBMSH và sự hình thành các mixen,

sức căng bề mặt……….26 Hình 1.2 Cơ chế loại kim loại nặng từ đất của CHHBMSH……… 27 Hình 3.1 Hình thái khuẩn lạc của chủng vi khuẩn CB5a……….42 Hình 3.2 Hình thái tế bào của chủng CB5a dưới kính hiển vi điện tử quét ……….42 Hình 3.3 Ảnh hưởng của các nguồn carbon khác nhau đến sinh trưởng và tạo

CHHHBMSH của chủng CB5a……….44 Hình 3.4 Khả năng tạo CHHBMSH của chủng CB5a ở các nguồn carbon khác

nhau……… ….44 Hình 3.5 Ảnh hưởng của nồng độ glycerol đến sinh trưởng và tạo CHHBMSH của chủng CB5a……… 46 Hình 3.6 Khả năng tạo CHHBMSH của chủng CB5a ở các hàm lượng glycerol

nuôi cấy khác nhau……….47 Hình 3.7 Ảnh hưởng của các nguồn nitơ khác nhau đến quá trình sinh trưởng và tạo CHHBMSH của chủng CB5a……….48 Hình 3.8 Khả năng tạo CHHBMSH của chủng CB5a ở các nguồn nitơ khác nhau….48 Hình 3.9 Ảnh hưởng của hàm lượng Urea đến sinh trưởng và tạo CHHBMSH của chủng CB5a………50 Hình 3.10 Khả năng sinh trưởng và tạo CHHBMSH của chủng CB5a ở các hàm lượng Urea khác nhau………50 Hình 3.11 Ảnh ưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh trưởng và tạo CHHBMSH của chủng CB5a……….51 Hình 3.12 Khả năng tạo CHHBMSH của chủng CB5a ở các nhiệt độ khác nhau… 52 Hình 3.13 Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh trưởng và tạo CHHBMSH của chủng CB5a………53 Hình 3.14 Khả năng tạo CHHBMSH của chủng CB5a ở các điều kiện pH môi trường khác nhau………54

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU……… 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU……….3

1.1 Ô nhiễm kim loại nặng……… 3

1.1.1 Khái niệm kim loại nặng………3

1.1.2 Tính độc hại của kim loại nặng……… 4

1.1.3 Ô nhiễm Chì (Pb)………6

1.1.3.1 Sự phân bố - dạng tồn tại của chì trong môi trường………6

1.1.3.2 Nguồn ô nhiễm………7

1.1.3.3 Tính độc của Chì……… 9

1.1.4 Ô nhiễm Cadimi (Cd)……… 10

1.1.4.1 Sự phân bố - dạng tồn tại của cadimi trong môi trường……… 10

1.1.4.2 Nguồn ô nhiễm……… 11

1.1.4.3 Tính độc của Cadimi……… 11

1.1.5 Hiện trạng ô nhiễm Chì và Cadimi ở Việt Nam……….12

1.2 Chất hoạt hóa bề mặt sinh học (CHHBMSH)……… 13

1.2.1 Khái niệm chất hoạt hóa bề mặt sinh học……….13

1.2.2 Phân loại chất hoạt hóa bề mặt sinh học……… …….13

1.2.3 Tính chất của chất hoạt hóa bề mặt sinh học……… 16

1.2.3.1 Hoạt tính bề mặt……… 16

1.2.3.2 Khả năng chịu nhiệt, pH và chịu lực ion……….….….17

1.2.3.3 Khả năng phân hủy sinh học và tính độc thấp……….…….17

1.2.3.4 Sự hình thành nhũ hóa chủa CHHBMSH……… 17

1.2.3.5 Đa dạng về cấu trúc hóa học……… 18

1.2.4 Vi sinh vật có khả năng tạo chất hoạt hóa bề mặt sinh học……… 18

1.2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tạo chất hoạt hóa bề mặt sinh học……… 20

1.2.5.1 Ảnh hưởng của nguồn cacbon……… 20

1.2.5.2 Ảnh hưởng của nguồn nitơ……… 21

1.2.5.3 Ảnh hưởng của các yếu tố môi trường……… … 22

1.2.6 Ứng dụng của chất hoạt hóa bề mặt sinh học trong công nghiệp và xử lý ô nhiễm môi

trường……….22

1.3 Một số phương pháp xử lý kim loại nặng……… 23

1.3.1 Xử lý bằng phương pháp hóa học……….23

1.3.2 Xử lý bằng phương pháp hóa lý……… 23

1.3.3 Xử lý bằng phương pháp sinh học……… 24

1.4 Xử lý kim loại nặng bằng chất hoạt hóa bề mặt sinh học……… 25

1.4.1 Cở chế xử lý đất nhiễm kim loại nặng bằng CHHBMSH……… 25

1.4.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới và Việt Nam………27

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU………29

2.1 Vật liệu………29

2.1.1 Chủng giống……… 29

2.1.2 Hóa chất……… 29

2.1.3 Thiết bị máy móc……… 30

2.1.4 Môi trường nuôi cấy……… 30

2.2 Phương pháp nghiên cứu……… 31

2.2.1 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái của vi khuẩn……… 31

2.2.2 Phương pháp xác định Gram của vi khuẩn……… 32

2.2.3 Phương pháp quan sát hình thái tế bào dưới kính hiển vi quang học 32

2.2.4 Phương pháp quan sát hình thái tế bào bằng kính hiển vi điện tử quét (SEM - Scanning Electron Microscope) 32

2.2.5 Phương pháp phân lập vi khuẩn tạo CHHBSMH trên môi trường chọn lọc 33

2.2.6 Phương pháp đánh giá khả năng sinh tổng hợp CHHBMSH của các chủng vi khuẩn phân lập thông qua chỉ số nhũ hoá E24 33

2.2.7 Đánh giá khả năng sinh trưởng của vi khuẩn dựa vào phương pháp đo độ đục của dung dịch nuôi cấy (OD) 34

2.2.8 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện môi trường nuôi cấy lên khả năng sinh trưởng và tạo CHHBMSH 34

2.2.9 Lên men, tách chiết và tinh sạch CHHBMSH 35

2.2.10 Loại Cd và Pb từ đất ô nhiễm bằng CHHBMSH……… …35

2.2.11 Phân tích trình tự gen 16S rDNA định tên đến loài chủng CB5a……… 36

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38

3.1 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc, đặc điểm gram các chủng vi khuẩn phân lập 38

3.2 Khả năng tạo CHHBMSH của các chủng vi khuẩn 40

3.3 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào chủng vi khuẩn CB5a………41

3.4 Định tên loài chủng CB5a…….……….43

3.5 Ảnh hưởng các yếu tố môi trường đến khả năng tạo CHHBMSH của chủng vi khuẩn nghiên cứu……… 43

3.5.1 Ảnh hưởng của nguồn cacbon lên quá trình sinh trưởng và tạo CHHBMSH của chủng vi khuẩn nghiên cứu……… 43

3.5.2 Ảnh hưởng của nồng độ Glycerol……… 45

3.5.3 Ảnh hưởng của nguồn nitơ ……… 47

3.5.4 Ảnh hưởng của nồng độ Urea đến quá trình sinh trưởng và tạo CHHBMSH của chủng CB5a……… 49

3.5.5 Ảnh hưởng của nhiêt độ nuôi cấy……… 51

3.5.6 Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh trưởng và tạo CHHBMSH của chủng CB5a……….52

3.6 Nghiên cứu khả năng xử lý đất nhiễm Cd và Pb từ đất bằng CHHBMSH tạo ra bởi chủng CB5a……… 54

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……… 56

TÀI LIỆU THAM KHẢO……… 57

MỞ ĐẦU

Ô nhiễm kim loại nặng đang là vấn đề môi trường được quan tâm ở Việt Nam

và trên thế giới Ô nhiễm kim loại nặng gia tăng cùng với sự phát triển của quá trình công nghiệp hóa cũng như các hoạt động khai thác khoáng sản Kim loại nặng như Pb,

Cd, Cr, Cu, As, Zn, Hg và Ni được xem là những nguyên tố chính gây ô nhiễm Sự tích tụ của những kim loại nặng độc hại này trong đất và nước gây ảnh hưởng tiêu cực tới con người, sinh vật cũng như môi trường xung quanh Đặc biệt, ở người, các bệnh thường gặp ở những vùng ô nhiễm kim loại nặng là bệnh viêm đường hô hấp, quái thai, gan, thận, ung thư, sẩy thai, thai chết lưu

Các phương pháp thường được sử dụng để xử lý đất nhiễm kim loại nặng bao gồm: kết tủa, hấp phụ, trao đổi ion, ổn định hóa, chôn lấp Tuy nhiên, phương pháp kết tủa, hấp phụ, trao đổi ion thường có giá thành cao, gây ô nhiễm thứ cấp do sử dụng nhiều hóa chất, phương pháp ổn định hóa và chôn lấp lại đòi hỏi nhiều diện tích để xử

lý Với những đặc tính như tính hòa tan, ổn định và tạo được phức bền với kim loại, chất hoạt hóa bề mặt sinh học (CHHBMSH) tạo bởi vi sinh vật có tiềm năng xử lý hiệu quả kim loại từ môi trường ô nhiễm CHHBMSH là hợp chất sinh học do vi sinh vật (vi khuẩn, nấm men, nấm mốc) tạo ra chứa cả hai nhóm chức ưa nước và kị nước trong cùng một phân tử Vì vâỵ, chúng có thể tập trung tác động tương hỗ với nhau làm giảm sức căng bề mặt, đồng thời làm giảm lực hút tĩnh điện ở bề mặt tiếp giáp giữa hai pha (lỏng –lỏng; lỏng – rắn) giúp CHHBMSH (tích điện âm) dễ dàng tiếp xúc và tạo phức bền vững với kim loại nặng (tích điện dương) Ưu điểm của việc ứng dụng CHHBMSH

để xử lý kim loại nặng là tính tương hợp, khả năng phân hủy sinh học, an toàn với môi trường, giá thành rẻ do có thể tận dụng được các chất thải làm nguồn carbon, nitơ, không tạo nhiều cặn dư thừa gây ô nhiễm thứ cấp cho môi trường và chịu được các yếu

tố môi trường (pH, nhiệt độ, .) khắc nghiệt Do những ưu điểm vượt trội kể trên, nghiên cứu xử lý kim loại nặng bằng CHHBMSH hiện thu hút được sự quan tâm của

nhiều nhà khoa học trên thế giới Tuy nhiên, ở Việt Nam hướng nghiên cứu này vẫn còn mới mẻ

Từ thực trạng ô nhiễm kim loại nặng nói chung, cũng như cadimi (Cd) và chì (Pb) nói riêng, cùng với nhu cầu tìm kiếm các giải pháp phù hợp để xử lý môi trường

nhiễm kim loại nặng hiệu quả ở Việt Nam, chúng tôi thực hiện đề tài luận văn “Đánh giá khả năng tạo chất hoạt hóa bề mặt sinh học của vi khuẩn, ứng dụng xử lý môi trường nhiễm kim loại nặng”

 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU:

• Lựa chọn được một chủng vi khuẩn có khả năng tạo chất hoạt hóa bề mặt sinh học cao, cùng các điều kiện sinh trưởng và tạo CHHBMSH tối ưu

• Đánh giá được khả năng loại chì (Pb) và cadimi (Cd) trong đất ô nhiễm bằng CHHBMSH tạo bởi chủng vi khuẩn lựa chọn

 Đưa ra các phương pháp tiếp cận mới nhằm xử lý đất ô nhiễm KLN

• Tìm được điều kiện tối ưu cho sinh tổng hợp CHHBMSH của chủng vi khuẩn

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Ô nhiễm kim loại nặng

1.1.1 Khái niệm kim loại nặng

Hiện nay, trên thế giới có rất nhiều quan điểm về kim loại nặng, như:

- Quan điểm phân loại theo tỉ trọng: cho rằng kim loại nặng là các kim loại có tỉ trọng (ký hiệu d) lớn hơn 5, bao gồm: Pb (d = 11,34), Cd ( d = 8,6), As (d = 5,72), Zn (d = 7,10) Co (d = 8,9), Cu (d = 8,96), Cr (d = 7,1), Fe (d = 7,87), Mn ( d = 7,44) Trong số các nguyên tố này có một số nguyên tố được coi là nguyên tố vi lượng cần cho dinh dưỡng của con người, cây trồng và sinh vật ở liều lượng thấp, ví dụ: Mn,

Co, Cu, Zn, Fe….Tuy nhiên, với hàm lượng cao các nguyên tố này sẽ gây độc [53]

- Theo quan điểm độc học: kim loại nặng là các kim loại có nguy cơ gây nên các vấn đề về môi trường, bao gồm: Cu, Zn, Pb, Cd, Hg, Ni, Cr, Co, Vn, Ti, Fe, Mn, Ag,

Sn, As, Se Có 4 nguyên tố được quan tâm nhiều là Pb, Cd, As và Hg Bốn nguyên tố

này gây độc cho sinh vật và con người kể cả ở liều lượng thấp [7]

Một định nghĩa khác cho rằng, kim loại nặng là những nguyên tố có đặc tính kim loại và có số nguyên tử lớn hơn 20 Các nguyên tố này thường ở dạng vết trong môi trường đất tự nhiên [43] Các kim loại nặng phổ biến nhất là: Cd, Cr, Cu, Zn, Pb,

Hg Các KLN nói chung ở nồng độ cao là yếu tố cực kì độc hại đối với quá trình trao đổi chất của tế bào Ô nhiễm KLN có thể dẫn đến mất cân bằng của các loài động, thực vật bậc cao, đặc biệt trong môi trường đất chứa hàm lượng KLN cao thực vật phát triển kém dẫn đến độ che phủ bề mặt thấp, hậu quả là các KLN từ đất sẽ xâm nhập vào nguồn nước mặt và nước ngầm [43]

1.1.2 Tính độc hại của kim loại nặng

Trong số 70 kim loại nặng tồn tại trong tự nhiên, chỉ có một số nguyên tố là các nguyên tố vi lượng (<10-4) như: Cu, Zn, Mn, B, Mo…Những nguyên tố này cần thiết cho cơ thể ở lượng rất nhỏ, cần dùng trong các chức năng trao đổi chất quan trọng cho cuộc sống Đa số các kim loại nặng như Pb, Hg, Cd, As…không cần thiết cho sự sống, với đặc tính bền vững trong môi trường, khả năng gây độc ở liều lượng thấp và tích lũy lâu dài ở chuỗi thức ăn, những kim loại nặng này được xem như chất thải nguy hại tác động tiêu cực đến môi trường sống của sinh vật và con người Kim loại nặng xâm nhập vào cơ thể người và sinh vật chủ yếu qua đường hô hấp, tiêu hóa và da Chúng tác động đến gốc sulfate làm vô hiệu hóa các enzyme, gây cản trở sự chuyển hóa của các chất qua màng tế bào của người và sinh vật Độ độc của kim loại nặng không chỉ phụ thuộc vào bản thân kim loại mà nó còn liên quan đến hàm lượng trong đất, trong nước và các yếu tố hoá học, vật lý cũng như sinh vật Trong tự nhiên kim loại nặng thường tồn tại ở dạng tự do, khi ở dạng tự do thì độc tính của nó yếu hơn so với dạng liên kết, ví dụ khi

Cu tồn tại ở dạng hỗn hợp Cu - Zn thì độc tính của nó tăng gấp 5 lần khi ở dạng tự do [20]

Độc tính của KLN đối với sinh vật liên quan đến cơ chế oxy hóa và độc tính gen Tác hại của KLN đối với động vật và con người là làm giảm chức năng của hệ thần kinh trung ương, giảm năng lượng sinh học, tổn hại đến cấu trúc của máu, phổi, thận, gan, và các cơ quan khác Tiếp xúc với KLN trong thời gian dài có thể ảnh hưởng mãn tính đến thể chất, cơ và quá trình thoái hóa hệ thần kinh dẫn đến biểu hiện các bệnh Parkinson, bệnh teo cơ, bệnh đa xơ cứng…Hơn nữa KLN còn làm tăng các tương tác dị ứng và gây nên đột biến gen, cạnh tranh với các kim loại cần thiết trong cơ thể ở các vị trí liên kết sinh hóa và phản ứng như các kháng sinh giới hạn rộng chống lại cả

vi khuẩn có lợi và có hại