Nghiên cứu khả chống ung thư hoạt chất phân lập từ Vông nem (Erythrina orientalis (L.) Murr., Fabaceae) Hậu phác (Magnolia officinalis Rehd Et wils, Magnoliaceae)

Khảo sát ảnh hưởng của ba chất Honokiol , Magnolol và Derrone lên sự tăng trưởng của một số dòng tế bào ung thư nuôi cấy đơn lớp 2D.. Murr., Fabaceae do Viện Dược liệu Trung ương cung cấ

1

Nghiên cứu khả năng chống ung thư của các

hoạt chất phân lập từ cây Vông nem

(Erythrina orientalis (L.) Murr., Fabaceae) và cây Hậu phác (Magnolia officinalis Rehd Et

wils, Magnoliaceae) Nguyễn Thị Ngọc Ánh

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn Thạc sĩ ngành: Sinh học thực nghiệm; Mã số: 60 42 30

Người hướng dẫn: TS Hoàng Thị Mỹ Nhung

Năm bảo vệ: 2012

Abstract: Tổng quan về ung thư , các mô hình sàng lọc thuốc chống ung thư , một

số dòng tế bào ung thư , chế phẩm Honokiol , Magnolol, Derrone và thuốc Taxol Khảo sát ảnh hưởng của ba chất Honokiol , Magnolol và Derrone lên sự tăng trưởng của một số dòng tế bào ung thư nuôi cấy đơn lớp 2D Nghiên cứu ảnh hưởng của Honokiol lên mô hình 3D khối cầu đa bào các tế bào ung thư Bước đầu nghiên cứu

cơ chế tác động của Honokiol lên hệ thống vi sợi và tác động của ba chất lên hoạt

động của enzyme Aurora kinaza ở tế bào ung thư

Keywords: Cây vông nem; Cây hậu phác; Hoạt chất phân lập; Khả năng chống ung

thư; Sinh học thực nghiệm; Hóa sinh học

Content

MỞ ĐẦU

Theo Tổ chức Y tế thế giới – WHO, có khoảng 12.7 triệu ca ung thư và 7,6 triệu ca tử vong do ung thư được ghi nhận trong năm 2008, trong đó 56% số ca và 64% trường hợp tử vong là ở các nước đang phát triển Cũng theo dự báo của WHO, tới năm 2020, số người mắc ung thư trên toàn cầu có thể tăng lên đến 15 triệu ca mới mỗi năm Tỷ lệ chết do ung thư có thể chiếm 25% tổng số ca tử vong Theo số liệu công bố tại Hội thảo Quốc gia phòng chống ung thư, năm 2010 Việt Nam có 126.300 ca mắc mới Căn bệnh nan y này đang tăng nhanh so với 10 năm trước [1]

Vốn là một đất nước được thiên nhiên ưu đãi, Việt Nam có một thảm thực vật vô cùng phong phú và đa dạng với hơn 12.000 loài thực vật bậc cao khác nhau Từ nhiều thế kỷ nay, thực vật không chỉ là nguồn cung cấp dinh dưỡng cho con người mà còn là những phương thuốc chữa bệnh hết sức quý giá bao gồm cả thuốc chống ung thư Bởi vậy, nghiên

2

cứu tìm ra các hợp chất từ nguồn dược liệu thiên nhiên có khả năng chữa ung thư là một hướng nghiên cứu được nhiều nhà khoa học và thầy thuốc đầu tư tập trung nghiên cứu trong nhiều năm nay Trong xu hướng này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu hoạt tính kháng

u của ba chất Honokiol, Magnolol được tách chiết từ cây Hậu phác Magnolia officinalis Rehd Et wils, Magnoliaceae và Derrone được tách chiết từ cây Vông nem Erythrina orientalis L Murr., Fabaceae do Viện Dược liệu Trung ương cung cấp cho nhóm Nghiên

cứu Ung thư thực nghiệm, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội nhằm mục đích:

Khảo sát ảnh hưởng của ba chất Honokiol, Magnolol và Derrone lên sự tăng trưởng của một số dòng tế bào ung thư nuôi cấy đơn lớp 2D

Nghiên cứu ảnh hưởng của Honokiol lên mô hình 3D khối cầu đa bào các tế bào ung thư

Bước đầu nghiên cứu cơ chế tác động của Honokiol lên hệ thống vi sợi và tác động của ba chất lên hoạt động của enzyme Aurora kinaza ở tế bào ung thư

3

CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN

1.1 Mô hình 2D và 3D các tế bào ung thư

1.1.1 Nuôi cấy tế bào

Như ta đã biết, các thử nghiệm độc tính ban đầu được tiến hành trên sinh thiết khối u nuôi cấy nhân tạo trong môi trường có thành phần không xác định, do vậy quá trình định lượng rất khó khăn Năm 1950, nhờ sự phát triển của công nghệ nuôi cấy tế bào thành dạng đơn lớp 2D trong đĩa Petri thủy tinh hoặc nhựa, kết hợp với sự phát triển của môi trường có thành phần xác định về mặt hóa học nên quy trình sàng lọc thuốc được tiến hành đơn giản hơn trên các tế bào nuôi cấy 2D này Sử dụng các loại thuốc nhuộm protein sẽ cho phép chúng ta xác định được mối quan hệ đáp ứng liều giữa các dòng tế bào khác nhau với các nồng độ thuốc thử khác nhau [9]

Các tế bào khi được phân lập đem nuôi cấy in vitro thường phát triển thành dạng hoặc trôi

nổi, hoặc bám dính, hoặc hỗn hợp cả 2 loại [4, 8, 9]

Sử dụng mô hình tế bào 2D có nhiều ưu điểm như thời gian sàng lọc ngắn, cho phép thao tác với nhiều dòng tế bào, nhiều hợp chất khác nhau và dải nồng độ rộng cùng một lúc Tuy nhiên, mô hình này có nhược điểm là tương tác giữa TBUT với hợp chất chỉ theo một chiều, thiếu sự tương tác giữa TBUT với hệ miễn dịch cũng như của hệ miễn dịch với hợp

chất Như vậy mô hình này không mô phỏng được điều kiện in vivo của cơ thể [9]

1.1.2 Nuôi cấy khối cầu đa bào ung thư

Mô hình nuôi cấy khối cầu đa bào ung thư, gọi tắt là mô hình spheroid, là một khối hình cầu được tạo nên từ TBUT Để tạo được mô hình này người ta tiến hành nuôi cấy giọt treo các TBUT Dưới tác dụng của trọng lực cùng với các liên kết giữa các tế bào, các TBUT tập trung lại và liên kết với nhau tạo nên các khối cầu nhỏ Sau đó các khối cầu nhỏ này được đưa vào các đĩa nuôi cấy chứa môi trường nuôi cấy tương ứng, đã phủ một lớp giá đỡ bên dưới [4, 9]

So với mô hình nuôi cấy tế bào đơn lớp thì cấu trúc của spheroid gần giống với hệ thống in vivo hơn Các nghiên cứu gần đây cho thấy các tế bào được nuôi cấy trong mô hình 3D

biểu hiện các đặc tính khác so với khi nuôi cấy 2D Những sự khác biệt này được coi như

là yếu tố giúp mô hình 3D phản ánh tốt hơn sự tương tác giữa các TBUT với môi trường in vivo

1.2 Chế phẩm Honokiol, Magnolol, Derrone

1.2.1 Honokiol (H) và Magnolol (M)

Vỏ cây và rễ của các loài thuộc họ Ngọc lan Magnoliaceae đã được sử dụng như một phương thuốc cổ truyền ở Hàn Quốc, Trung Quốc và Nhật bản Trong số các hợp chất tách chiết được từ các loài cây này, các nhà khoa học đặc biệt chú ý đến hai chất Honokiol và Magnolol Đây là hai đồng phân của một hợp chất chứa gốc phenol được tách chiết từ vỏ

cây Hậu phác Magnolia officinalis Rehd Et wils, còn gọi là Hậu phác bắc Honokiol

(3,5'-diallyl-4,2'-dihydroxybiphenyl) chiếm khoảng 1-5% trọng lượng vỏ cây và Magnolol

(5,5'-4

diallyl-2,2'-dihydroxybiphenyl) chiếm khoảng 2-10% đều có công thức cấu tạo là C18H18O2 với trọng lượng phân tử M = 266,33

1.2.2 Derrone (D)

Derrone (5,4-dihydroxy-7,8-(2,2-di- methylpyrano) isoflavone) có công thức hóa học là

C20H16O5, M = 336,1 là hợp chất được tách chiết từ cây Vông nem Erythrina orientalis

(L.) Murr., Trong công trình nghiên cứu được công bố vào tháng 6 năm 2012, Hayet Edziri và cộng sự đã chứng minh Derrone có tác động kháng khuẩn với vi khuẩn

Pseudomonas aeruginosa và Escherichia coli với nồng độ trong khoảng từ 7,81 – 15,62

µg/mL Ngoài ra, Derrone cũng thể hiện tính kháng nấm mạnh với các loài thuộc họ Candida ở nồng độ 7,81 µg/mL và có tính độc với dòng tế bào ung thư gan HepG2 Tuy nhiên, các cơ chế chuyên sâu về tác động của Derrone lên tế bào vẫn còn chưa được biết rõ [3, 5]

5

CHƯƠNG 2 – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

- Các dòng TBUT HCT116, Hela, MCF7 và KPL4 do Nhóm nghiên cứu Ung thư thực nghiệm – Bộ môn Tế bào, Mô, Phôi và Lý sinh – Khoa Sinh học – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội cung cấp

- Mẫu Honokiol (H), Magnolol (M) và Derrone (D) do Viện Dược liệu Trung ương cung cấp, dạng dung dịch đồng nhất lưu trữ ở nồng độ 20.000µg/mL trong dung môi DMSO và đ ối chứng dương Taxol, dạng thương phẩm 30mg/5mL, tương đương 6.000µg/mL

2.2 Phương pháp thử độc tính MTS

MTS (3 - (4,5-dimethylthiazol-2-yl) – 5 - (3-carboxymethoxyphenyl) – 2 - (4-sulfophenyl)

- 2H - tetrazolium) khi có mặt PMS (phenazine methosulfate) sẽ được tế bào chuyển hóa, tạo ra một sản phẩm formazan tan trong môi trường nuôi cấy tế bào, hấp thụ ánh sáng tối

đa ở bước sóng 490-500 nm trong đệm PBS Lượng formazan tạo ra sẽ được định lượng bằng lượng ánh sáng ở bước sóng 490nm bị hấp thụ và tỷ lệ thuận với lượng tế bào sống trong môi trường nuôi cấy đó Phương pháp MTS thường được coi là phương pháp MTT 1 bước, có tính tiện lợi cao do chỉ cần bổ sung thẳng chất vào môi trường nuôi cấy tế bào mà không cần bất kỳ bước rửa hay chuẩn bị nào khác

2.3 Phương pháp thử độc tính trên mô hình spheroid

 Tạo giá thể cho khối spheroid

 Tạo khối spheroid bằng phương pháp gio ̣t treo và hạ giọt treo

 Với thí nghiệm theo dõi tốc độ sinh trưởng của khối spheroid: Theo dõi hàng ngày và thay môi trường, chụp ảnh 2 ngày/lần cho đến khi khối spheroid phân

rã Đo kích thước khối spheroid và tính thể tích khốidựng đường cong sinh trưởng để biết quy luật tăng trưởng của khối spheroid

 Với thí nghiệm kiểm tra tác động của H lên khả năng tạo khối spheroid: Sau khi tạo giá thể, tiến hành tạo giọt treo bằng môi trường có chứa H nồng độ (NĐ) 5µg/mL và môi trường có chứa H NĐ 10µg/mL Hạ giọt treo xuống các giếng chứa môi trường hoặc môi trường chứa H với nồng độ tương ứng Theo dõi và tính thể tích khối, dựng đường cong sinh trưởng của khối spheroid ở ba mẫu

6

khác nhau và so sánh sự khác biệt xem liệu H có ảnh hưởng đến quá trình tạo khối hay không

 Với thí nghiệm theo dõi tác động của H lên quá trình tăng trưởng khối spheroid: Sau khi tạo giá thể, tạo giọt treo và hạ giọt treo, tiến hành chia các giếng có chứa các khối spheroid đồng đều, phát triển khỏe mạnh thành ba nhóm mẫu: Đối chứng sinh học (ĐCSH), mẫu ủ H NĐ 10µg/mL, và mẫu ủ H NĐ 20µg/mL Theo dõi và tính thể tích khối, dựng đường cong sinh trưởng của khối spheroid xem H có tác động lên quá trình sinh trưởng của khối spheroid hay không

2.4 Phương pháp nhuộm miễn dịch huỳnh quang

Nồng độ thuốc thử:

 H: 10 µg/mL và 20 µg/mL (với thí nghiệm kiểm tra tác động lên actin)

 H, M, D: 10 µg/mL (với thí nghiệm kiểm tra tác động lên Aurora kinaza)

 Nhuộm mẫu theo các bước như sau:

o Cố định mẫu bằng PFA 4% ở nhiệt độ phòng trong 10 phút

o Đục màng tế bào bằng TrytonX 0,5% ở nhiệt độ phòng trong 10 phút

o Block các liên kết không đặc hiệu và bộc lộ các liên kết đặc hiệu bằng cách

ủ mẫu với BSA 5% ở nhiệt độ phòng trong 30 phút

o Nhuô ̣m kháng thể 1, 2 và nhân với thuốc nhuộm tương ứng

7

CHƯƠNG 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Kết quả khảo sát đô ̣c tính trên mô hình 2D

3.1.1 Với dòng HCT116

Sau 48h ủ, ngay ở nồng độ thứ nhất (5µg/mL) H đã có tác dụng rõ rệt: 80% các tế bào co tròn lại Ở nồng độ thứ hai (10µg/mL) các tế bào chỉ còn là các chấm tròn nhỏ và không còn sự khác biệt rõ rệt về hình thái với 3 nồng độ 20µg/mL, 40µg/mL và 50µg/mL còn lại Magnolol (M) tác động rõ rệt đến tế bào HCT116 theo xu hướng tương tự ngay từ nồng độ 5µg/mL và cũng không có sự khác biệt rõ rệt về hình thái ở 4 nồng độ 10 µg/mL,

20µg/mL, 40µg/mL và 50µg/mL còn lại

Với Taxol, sau 48h ủ, ở nồng độ thứ nhất 0,003µg/mL tế bào đã có xu hướng co lại so với mẫu ĐCSH Xu hướng này tăng rõ rệt theo chiều tăng nồng độ, các tế bào co lại thành dạng tròn và nhỏ dần từ nồng độ 0,03µg/mL, 0,3µg/mL, 3µg/mL đến 30µg/mL

3.1.2 Với dòng Hela

Quan sát dưới KHV cũng cho thấy mức độ ảnh hưởng của H lên dòng Hela xuất hiện rõ rệt bắt đầu từ nồng độ thứ ba (20µg/mL) sau đó tăng dần ảnh hưởng cho đến nồng độ thứ năm (50µg/mL) Với mẫu Hela ủ Taxol, các tế bào có xu hướng co dần lại khi tăng dần nồng độ thuốc thử Tác động của Taxol có thể thấy rõ rệt ngay từ nồng độ thứ nhất (0,003µg/mL)

và đến nồng độ cuối cùng (30µg/mL) tế bào thành dạng chấm tròn nhỏ

3.1.3 Với dòng MCF7

Tế bào MCF7 có kích thước lớn, đang ở trạng thái khỏe mạnh và mật độ vừa phải Với dòng MCF7, H chỉ có tác dụng ở các nồng độ cao, bắt đầu từ nồng độ thứ ba (20µg/mL) trở đi Tại các nồng độ này, sau 48h ủ với mẫu, các tế bào không trải rộng trên bề mặt nuôi cấy mà bị co tròn lại, liên kết lỏng lẻo, một số trôi nổi trong môi trường nuôi cấy Nhiều tế bào không còn sáng màu mà nhăn nheo và trở nên đậm màu Đây chính là các tế bào chết

Số lượng các tế bào này ở nồng độ thứ năm (50µg/mL) chiếm tỷ lệ lớn nhất so với các nồng độ còn lại

Với mẫu ủ Taxol, sự biến đổi hình dạng tế bào có thể quan sát được rõ ràng ngay từ nồng

độ đầu tiên (0,003µg/mL), tiếp đó sự khác biệt về hình thái quan sát được là không lớn với

3 nồng độ sau (0,03µg/mL, 0,3µg/mL, 3µg/mL) nhưng đến nồng độ thứ năm (30µg/mL), các tế bào hầu hết không còn độ bóng, ở dạng tròn ép dẹt vào bề mặt đĩa nuôi cấy

3.1.4 Với dòng KPL4

Cả ba chất Honokiol, Magnolol và Derrone đều có xu hướng tác động làm ức chế tăng sinh mạnh mẽ dòng KPL4 ở nồng độ thứ ba (20 µg/mL) Ở nồng độ này, hình thái tế bào ở cả

ba mẫu thay đổi khá giống nhau so với mẫu ĐCSH và các mẫu ủ với nồng độ thấp hơn Với Taxol, KPL4 bị tác động làm biến đổi hình thái rõ rệt ngay từ nồng độ đầu tiên (0,003 µg/mL) Mức độ biến đổi này được duy trì ở ba nồng độ kế tiếp, chỉ đến nồng độ thứ năm (30 µg/mL) hình thái tế bào mới thay đổi rõ rệt một lần nữa Các tế bào lúc này có kích thước rất nhỏ, mất đi hẳn độ sáng bóng bình thường Kết quả đo chỉ số hấp thụ ánh sáng tại bước sóng 490 nm cũng cho kết quả tương đồng

8

Bảng 1: Tổng hợp giá trị IC 50 và chỉ số tương quan R 2 của Honokiol, Magnolol, Derrone

và Taxol

Chất

IC50

(µg/mL) R

(µg/mL) R

(µg/mL) R

(µg/mL) R

2

Tất cả các giá trị IC50 này đều có chỉ số tương quan R2 >0,9, đảm bảo đủ độ tin cậy Honokiol, Magnolol và Derrone khi thử trên cùng dòng tế bào đều cho giá trị IC50 cao hơn

so với Taxol ngoại trừ với dòng KPL4, Honokiol cho giá trị IC50 tương đương với Taxol Với Honokiol, chỉ số IC50 giảm dần đối với dòng Hela, MCF7, KPL4 và HCT116, bước đầu cho thấy độc tính của nó tăng dần tương ứng Chỉ số IC50 thu được với Hela cao hơn, chỉ số với MCF7 nằm trong khoảng, và với KPL4, HCT116 thì thấp hơn các giá trị IC50 đã công bố [2, 6, 7] Với Magnolol và Derrone, giá trị IC50 thu được cũng nằm trong khoảng các giá trị IC50 đã từng công bố [3]

3.2 Kết quả nghiên cứu tác đô ̣ng của Honokiol trên mô hình 3D

3.2.1 Kết quả theo dõi sự tăng trưởng khối spheroid MCF7

Kết quả ghi nhận được cho thấy khối spheroid MCF7 có xu hướng phát triển mạnh về kích thước từ ngày thứ 9 sau khi hạ giọt treo và tăng tiếp cho đến ngày thứ 17, sau đó giảm dần với tốc độ chậm hơn Trong khoảng thời gian này, cấu trúc của khối spheroid cũng ổn định dần, viền đậm và rõ nét hơn, spheroid tròn hơn; cấu trúc lõi hoại tử xuất hiện từ ngày thứ 5 sau khi hạ giọt treo Viền phân cách giữa lõi hoại tử với phần tế bào tăng sinh bên ngoài khối rõ dần, lõi hoại tử tăng dần diện tích một cách tương quan với sự tăng thể tích khối Sau ngày thứ 17, đi cùng với suy giảm kích thước là cấu trúc khối spheroid trở nên bất ổn: viền ngoài không còn rõ nét, khối tròn mất dần, cấu trúc liên kết giữa các tế bào trong khối trở nên lỏng lẻo dần và các tế bào bong dần ra khối spheroid

3.2.2 Kết quả kiểm tra tác động của Honokiol lên quá trình tạo khối spheroid

MCF7

Sau hai ngày tạo giọt treo với môi trường chứa H ở các nồng độ 5µg/mL và 10µg/mL, quan sát dưới KHV chúng tôi nhận thấy: tất cả các giọt treo tạo bởi môi trường chứa 10µg/mL H đều không tạo thành khối spheroid, các tế bào được đưa vào tạo khối đã chết

và nằm phân tán trong giọt treo Điều này cho thấy H tác động mạnh đến tế bào MCF7 khi

ở trạng thái huyền phù, so với kết quả kiểm tra tác động ở mô hình 2D thì ở nồng độ 10µg/mL, chỉ số tăng sinh của tế bào MCF7 hoàn toàn không bị suy giảm

Với các giọt treo còn lại ở các mẫu ĐCSH và H nồng độ 5µg/mL đều hình thành giọt treo

và chưa thấy có sự khác biệt rõ rệt giữa hai mẫu này Ở ngày thứ 5, các khối spheroid ủ H

có kích thước tương đương với mẫu ĐCSH nhưng lõi hoại tử đã xuất hiện rõ rệt hơn, chưa

có viền phân định rõ ràng với lớp tế bào tăng sinh bên ngoài Đến ngày thứ 7, các tế bào ở

9

khối lớp vỏ spheroid này đã tách ra khỏi cấu trúc khối, toàn bộ khối thu hẹp lại về kích thước trong khi các khối spheroid ở mẫu ĐCSH vẫn tiếp tục tăng trưởng bình thường

3.2.3 Kết quả kiểm tra tác động của Honokiol lên sự tăng trưởng của khối spheroid

MCF7

Với mẫu ủ H NĐ 10µg/mL, đến ngày thứ 9 các khối spheroid đã có sự khác biệt rõ rệt với mẫu ĐCSH Lõi hoại tử của khối spheroid với mẫu này lớn dần lên và viền phân cách với lớp tăng sinh bên ngoài mờ dần đi cho đến khi cả khối gần như sẫm đồng màu vào ngày thứ 15 Trong khi đó lớp tăng sinh bên ngoài cũng thể hiện sự bất ổn như viền xù xì, màu không còn sáng nhưng vẫn giữ được một độ “đặc” nhất định của khối Sau khi toàn bộ khối hoại tử thì các tế bào bắt đầu bong ra thành mảng

Với mẫu ủ H nồng độ 20µg/mL, toàn khối spheroid thể hiện rõ rệt sự bất ổn khi lớp lõi hoại tử gần như không tăng lên về kích thước trong khi lớp tế bào tăng sinh bên ngoài trở nên lỏng lẻo hơn dẫn đến sự tăng kích thước của khối Tuy nhiên, lớp tế bào này do tác động của H ức chế tăng sinh nên lớp tăng sinh này cũng chuyển màu xám dần và gần như ngừng tăng kích thước từ ngày thứ 13 Sau ngày thứ 15, các khối này cũng bị phân rã

3.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của Honokiol lên hệ vi sợi actin

Kết quả cho thấy, quần thể tế bào HeLa sau khi ủ với Honokiol ở nồng độ 10 µg/mL có sự thay đổi rõ rệt Từ cùng một lượng tế bào ban đầu, sau 48h xử lý với chất, các tế bào phân

bố thưa thớt và rời rạc hơn so với đối chứng (do không tăng lên về số lượng, đồng thời xuất hiện các tế bào chết) Các tế bào phần lớn có dạng sợi chứ không trải rộng hình sao, chiều ngang bị thu hẹp nhiều so với đối chứng

Khoảng cách giữa các tế bào lớn, đặc biệt giữa các tế bào cách xa nhau vẫn nối với nhau bởi các sợi actin kéo dài Sự tồn tại của dạng cấu trúc này có thể do ảnh hưởng của chất lên quá trình phân chia tế bào chất dẫn đến sự phân tách hai tế bào sau quá trình nguyên phân diễn ra không hoàn toàn, hai tế bào vẫn còn dính nhau bởi các sợi actin Sự biểu hiện của F-actin trong tế bào cũng thay đổi: Trong khi ở các tế bào đối chứng, hệ sợi actin phân bố đều trên toàn bộ tế bào chất và màng tế bào, có thể quan sát được cấu trúc dạng sợi thì trên rất nhiều tế bào HeLa xử lý với Honokiol, có thể dễ dàng nhận thấy hệ thống sợi actin kém biểu hiện (tín hiệu huỳnh yếu hơn so với đối chứng), vùng tế bào chất tối màu, không quan sát được actin tồn tại ở dạng sợi căng Một số tế bào vẫn biểu hiện nhiều F-actin, tuy nhiên các sợi actin trên các tế bào này lại tập trung nhiều ở màng tế bào hoặc thành các cụm chứ không phân bố thành dạng sợi và liên kết thành mạng lưới như ở đối chứng Như vậy có thể thấy Honokiol đã ảnh hưởng rõ rệt lên sự biểu hiện cũng như cách sắp xếp, phân bố của actin Đồng thời sự tổ chức của actin cũng bị rối loạn, không tồn tại thành dạng mạng lưới sợi mà co cụm thành tứng đám trên màng tế bào và cả ở trong tế bào chất Đây có thể là nguyên nhân dẫn đến sự biến đổi hình dạng và thu nhỏ kích thước của tế bào

3.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của Derrone lên sự phosphoryl hóa Histon H3

tại vị trí Serine 10

Ở các tế bào đối chứng, toàn bộ tế bào phân chia ở các kỳ trước, giữa, sau và cuối của pha

M đều cho kết quả dương tính với kháng thể H3PS10, nghĩa là sự phosphoryl hoá H3 diễn

ra bình thường Chúng tôi cũng quan sát thấy một số tế bào không phân chia vẫn biểu hiện huỳnh quang, đây là các tế bào pha G2 chuẩn bị bước vào giai đoạn M Ta biết rằng tất cả

10

các quá trình chuẩn bị cho phân chia đều diễn ra ở G2, trong đó có quá trình khởi động của

sự cuộn xoắn nhiễm sắc thể, đó là lúc histone H3 bắt đầu được photphoryl hóa Các tế bào phân chia sẽ co tròn lại, màng nhân tiêu biến Các NST cuộn xoắn và biểu hiện mạnh H3PS10 Các tế bào ở kỳ trung gian trải rộng trên nền nuôi cấy, có dạng hình sao, không biểu hiện sự photphoryl hóa Histon H3 Một số tế bào biểu hiện là các tế bào ở pha G2 chuẩn bị bước vào phân bào

Trong số 03 mẫu chất thử tại nồng độ 10 µg/mL, chúng tôi nhận thấy có Derrone có biểu hiện rõ rệt sự ức chế H3P ở mức độ tế bào Các tế bào phân chia dù ở cùng một pha lại có

sự biểu hiện huỳnh quang rất khác biệt Một số tế bào có tín hiệu rất mạnh, tương đương với đối chứng, trong khi đó một số biểu hiện yếu hoặc gần như không biểu hiện Đặc biệt ở mẫu Derrone có sự giảm sút đáng kể tín hiệu huỳnh quang trên các tế bào ở cả ba kỳ: đầu (prophase), đầu-giữa (prometaphase) và kỳ giữa (metaphase) Chúng tôi đếm số lượng tế bào âm tính với tín hiệu huỳnh quang, hoặc tín hiệu yếu thì thu được tỷ lệ là 42% trên tổng

số tế bào phân chia Đối với mẫu Honokiol và Magnonol, các tế bào phần lớn đều biểu hiện mạnh H3PS10 ở tất cả các kỳ trong phân bào Tỷ lệ tế bào biểu hiện yếu H3PS10 là 1,2 % ở mẫu Honokiol và 1,5 % ở mẫu Magnonol

Derrone thuộc nhóm chất flavonoid, là nhóm chất có nhiều hoạt tính sinh học Rất nhiều chất thuộc nhóm này đã và đang được ứng dụng trong điều trị ung thư Kết quả nghiên cứu này của chúng tôi cho thấy Derrone có ảnh hưởng ức chế sự phosphoryl hóa histon H3 tại serine 10 Đây là cơ chất đã được chứng minh của enzyme Aurora B