Screening of mycosporine like compounds in the dermatocarpon genus phytochemical study of the lichen dermatocarpon luridum (with ) j r laundon

Ce repérage inédit de mycosporines dans un chlorolichen : Dermatocarpon luridum nous a amené à focaliser notre étude sur ce genre et tout particulièrement cette espèce qu’il était possi

ANNÉE 2014

THÈSE / UNIVERSITÉ DE RENNES 1

sous le sceau de l’Université Européenne de Bretagne

pour le grade de

DOCTEUR DE L’UNIVERSITÉ DE RENNES 1

Mention : Chimie

Ecole doctorale Sciences De La Matière

Thi Thu Tram NGUYEN

Préparée dans l’unité de recherche UMR CNRS 6226

Equipe PNSCM (Produits Naturels Synthèses Chimie Médicinale)

(Faculté de Pharmacie, Université de Rennes 1)

Kim Phi Phung NGUYEN

Professeur à l’Université des sciences naturelles

d’Hô-Chi-Minh-Ville Vietnam / Examinateur

i

Remerciements

En premier lieu, je tiens à remercier Monsieur le Dr Holger Thüs et Monsieur le Dr Erwan

Ar Gall d’avoir accepté d’être les rapporteurs de mon manuscrit, ainsi que Madame la Professeure Marie-Dominique Galibert d’avoir accepté de participer à ce jury de thèse

J’exprime toute ma gratitude au Dr Marylène Chollet-Krugler pour avoir guidé mes pas dès les premiers jours et tout au long de ces trois années Je la remercie particulièrement pour

sa disponibilité et sa grande gentillesse, son écoute et sa patience Sa parfaite maỵtrise scientifique et ses idées qui m’ont si souvent sortie de l’embarras et parfois des impasses

Je remercie très sincèrement le Professeur Joël Boustie, mon directeur de thèse, de m’avoir accueillie dans son laboratoire et de m’avoir permis d’accéder à l’univers passionnant

de la chimie des lichens Je lui suis reconnaissante de m’avoir laissée une grande liberté afin que je puisse développer mes propres idées au cours de cette thèse Je le remercie vivement de

sa disponibilité et de sa rigueur scientifique qui m'ont permis de travailler dans les meilleures conditions

Je remercie chaleureusement Madame la Professeure Kim Phi Phung Nguyen, qui a été

ma directrice de master recherche au Vietnam C’est auprès d’elle que j’ai acquis mes premières connaissances en chimie des produits naturels et en chimie moléculaire C’est également grâce à son aide que j’ai pu rencontrer le Professeur Joël Boustie

Je tiens également à exprimer ma gratitude à l’ensemble de l’équipe qui m’a soutenue ces trois années, pour leurs conseils avisés, leurs remarques pertinentes, leur écoute, leur aide

et leur gentillesse Ils ont fait de ce travail le fruit d’une véritable réflexion collective Je voudrais adresser plus particulièrement tous mes remerciements à Françoise pour m’avoir guidée dans la réalisation des tests biologiques afin de valoriser les molécules que j'avais isolées Merci à Aurélie de m’avoir expliqué le fonctionnement des appareillages les premiers jours et de m’avoir procuré les produits chimiques dont j’avais besoin Isabelle et Solenn, merci pour votre aide dans la réalisation des tests biologiques Merci à Sophie et à Béatrice pour vos relectures Merci à Audrey de m’avoir donné l’accès aux herbiers (H des Abbayes et L J-C Massé) Anne-Cécile, Claudia, David, Maryse, Marie-Laurence, Patricia, Philippe, Pierre,

Lichénologie pour m’avoir fourni des échantillons de Dermatocarpon

Je remercie Isabelle Gallais et le Pr Odile Sergent (UMR Inserm 1085, IRSET, Université de Rennes 1) pour la réalisation des tests antioxydants portant sur la peroxydation lipidique

Je tiens également à exprimer ma reconnaissance à tout le personnel du CRMPO pour les analyses de masse effectuées sur les produits que j'avais isolées

Merci à tous les étudiants et post-doctorants pour les discussions et les agréables moments: Pierre, Delphine, Nathalie, Friardi, Mạwenn, Sarah Komaty et Vianney

Je remercie tous mes amis vietnamiens, surtout Binh, Duy, Linh, Tu, Hung, Huyen et Ha, qui ont partagé ma vie au quotidien pendant mon séjour en France Un grand merci à Tam pour ton aide sur les analyses statistiques

J’exprime toute ma gratitude envers le Gouvernement vietnamien pour l'attribution de la bourse qui m’a permis de mener cette thèse Je remercie également le laboratoire du professeur Joël Boustie pour le complément de financement qui a permis la réalisation de ce travail en France

Je remercie du fond du cœur ma famille pour leurs encouragements et leur soutien au quotidien Merci à mes parents qui ont tant fait pour moi Merci à mon frère aỵné et à ma sœur pour notre complicité J’ai une pensée toute particulière pour mon petit garçon Khanh, qui m’a fait sourire dans les moments difficiles; à ma belle-sœur Thuy qui m’a aidée dans les démarches administratives surtout quand c’était en français; à mon mari Thien pour ses encouragements, son dévouement auprès de notre fils pendant mon absence et son amour inconditionnel Enfin merci à tous ceux qui liront cette thèse pour l’intérêt qu’ils porteront à mon travail…

iii

Table of Contents

Remerciements i

Table of Contents iii

List of abbreviations vii

List of Tables ix

List of Figures xi

Résumé en français xv

Introduction 1

CHAPTER 1: LICHENS AND PHOTOPROTECTION 3

1 Presentation of lichens 5

1.1 Definition 5

1.2 Thallus morphology and anatomy 5

1.3 Symbiosis 8

1.4 Chemical compounds 9

2 Photoprotective responses of lichens 11

2.1 Harmful effects of UV radiation 11

2.2 Photoprotective mechanisms 12

2.2.1 Screening mechanism 13

2.2.2 Quenching mechanism 13

2.2.3 Repair mechanism 15

2.3 Chemical features of UV absorbing compounds 15

3 Mycosporines and MAAs – natural photoprotectants 18

3.1 History 18

3.2 Characteristics 19

3.3 Biosynthesis 22

3.4 Role of mycosporine-like compounds in nature 23

3.5 Mycosporine-like compounds in lichens 24

CHAPTER 2: SCREENING AND QUANTIFICATION OF MYCOSPORINE-LIKE COMPOUNDS IN THE DERMATOCARPON GENUS 29

Purpose of this study 31

1 Screening of mycosporine-like compounds 33

1.1 Materials and methods 33

1.1.1 Lichen material 33

1.1.2 Extraction and purification of mycosporine-like compounds 40

1.1.3 HPTLC-UV spectrophotodensitometry and HPLC-DAD-MS analysis 42

1.1.4 Esterification conditions of mycosporine glutamicol 43

1.2 Results and discussion 44

1.2.1 Extraction and purification of mycosporine-like compounds 44

1.2.2 HPTLC-UV spectrophotodensitometry 45

1.2.3 HPLC-DAD-MS analysis 46

iv

1.2.4 Esterification conditions of mycosporine glutamicol 48

2 Quantification of mycosporines 53

2.1 Materials and methods 53

2.1.1 Lichen materials 53

2.1.2 Extraction of mycosporines 54

2.1.3 Quantification of mycosporines 55

2.2 Results and discussion 56

3 Experimental 60

3.1 Identification of mycosporines and MAAs 60

3.1.1 Extraction and purification of mycosporines and MAAs 60

3.1.2 Analysis 60

3.2 Quantification of mycosporines 61

3.2.1 Extraction of mycosporines 61

3.2.2 Mycosporines standards 61

3.2.3 Internal standard 61

3.2.4 Validation of analytical procedure 62

3.2.5 HILIC-HPLC-DAD analysis 62

CHAPTER 3: PHYTOCHEMICAL STUDY ON DERMATOCARPON LURIDUM (WITH.) J.R LAUNDON 63

Purpose of this study 65

1 Description of Dermatocarpon luridum (With.) J.R Laundon 66

1.1 Ecology 66

1.2 Botany and description 67

1.3 Chemical studies 68

2 Materials and methods 70

2.1 Lichen material 70

2.2 Extraction 70

2.3 Purification 71

2.3.1 Mycosporines 71

2.3.2 Other isolated compounds 73

2.4 Determination of physico-chemical properties of mycosporines 73

2.4.1 The molar extinction coefficient 73

2.4.2 pKa values 73

3 Results and discussion 75

3.1 Mycosporines 76

3.1.1 Extraction and purification 76

3.1.2 Structure elucidation 79

3.1.3 Determination of physico-chemical properties 83

3.2 Other isolated compounds 87

3.2.1 Isolation 87

3.2.2 Structure elucidation 89

4 Experimental 96

v

4.1 Extraction 96

4.2 Purification and identification of mycosporines 96

4.2.1 Purification on cation exchange resin 96

4.2.2 Purification by CPC 96

4.2.3 A new purification protocol 97

4.2.4 Sources, physico-chemical and spectroscopic data 99

4.3 Other isolated compounds 107

4.3.1 Purification and identification 107

4.3.2 Structure elucidation 109

4.4 Determination of the (ε) and pKa values of the isolated mycosporines 122

4.4.1 The molar absorption coefficient 122

4.4.2 pKa values 122

CHAPTER 4: BIOLOGICAL TESTS AND PHOTOPROTECTIVE EVALUATION 125 Purpose of this study 127

1 Cytotoxic activity 129

2 Photoprotective activity 130

2.1 UV-filters 131

2.2 Cytotoxic and phototoxic activities 134

2.3 Antioxidant activity 135

2.3.1 DPPH and NBT assays 136

2.3.2 Lipid peroxidation assay 137

2.4 Photostability under UVA and UVB 140

3 Experimental 142

3.1 Cytotoxic activity 142

3.2 UV filters 142

3.2.1 Emulsion preparation 142

3.2.2 Sample preparation 143

3.2.3 Measurements and calculations 143

3.3 Antioxidant activity 145

3.3.1 DPPH assay 145

3.3.2 NBT assay 145

3.3.3 Lipid peroxidation assay 146

3.4 Cytotoxic and phototoxic activities 148

3.5 Photostability under UVA and UVB 149

Discussion–Conclusion 151

References 157

General experimental procedures 169

Appendix 173

vi

COSY Correlation Spectroscopy

CPC Centrifugal Partition Chromatography

DEPT Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer

DL1 crude aq extract of D luridum

DL2 semi-purified aq extract of D luridum

DM1 crude aq extract of D miniatum

DM2 semi-purified aq extract of D miniatum

DMSO Dimethyl sulfoxide

DNA Deoxyribonucleic acid

HILIC Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography

HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation Spectroscopy

HPLC High Performance Liquid Chromatography

HPLC-DAD-MS High Performance Liquid Chromatography coupled to a Diode Array

Detector and a Mass Spectrometer HPTLC-UV High Performance Thin Layer Chromatography coupled to a

spectrophotodensitometer HRMS-ESI High Resolution Mass Spectrum Electrospray Ionization

HSQC Heteronuclear Single Quantum Correlation spectroscopy

ppm parts per million (chemical shift value)

Prep HPLC Preparative High Performance Liquid Chromatography Prep TLC Preparative Thin-Layer Chromatography

ix

List of Tables

Table 1: Mycosporine-like compounds distribution in lichens 26

Table 2: Collected samples data for screen mycosporine-like compounds 34

Table 3: Morphological comparison of the four Dermatocarpon species 36

Table 4: Physico-chemical properties and mass fragmentation of 1, 2 and 3 51

Table 5: Linearity validation results of mycosporines 1 and 2 57

Table 6: List of metabolites isolated from D luridum 76

Table 7: pKa and molar extinction coefficient values of mycosporines 1 and 3 86

Table 8: Summary of the collected tubes corresponding to the mode used in CPC experiment 97

Table 9: Preparation of buffer solutions with pH>2 122

Table 10: Preparation of buffer solutions with pH<2 123

Table 11: Measured absorbance at 310 nm depending on pH of two mycosporines 1 and 3 (n=6) 124

Table 12: IC50 values for compound 7 on the eight cell lines and selectivity indexes (SI) relative to HaCaT and Fibroblast 130

Table 13: Absolute, relative indexes and predicted results of the aq extracts along with the three mycosporines comprared to three commercialized UV filters 133

Table 14: Cytotoxicity and phototoxic activities of aq extracts and mycosporines 135

x

xi

List of Figures

Figure 1: Major growth forms of lichen 5

Figure 2: Structure thallus homoeomerous (a) and heteromerous (b) 7

Figure 3: Reproductive organs of lichens 7

Figure 4: The nutritional exchange between partners of lichens 8

Figure 5: Probable pathways leading to the major groups of lichen products 10

Figure 6: Electromagnetic spectrum of UV radiation and biologic effects 12

Figure 7: Defence strategies adopted by lichens to counteract the harmful effects of UV radiation 12

Figure 8: Two major xanthophyll cycles involved in the dissipation of excess light energy 14

Figure 9: UV absorption characteristics of common functional groups 16

Figure 10: Chemical structures of compounds from lichens reported as UV screens 17

Figure 11: Organisms contain mycosporines and MAAs 19

Figure 12: Structure characteristics of oxo- and imino-mycosporines 20

Figure 13: Common fungal mycosporines (a) and MAAs from marine organisms (b): structures, chemical and spectroscopic characteristics 21

Figure 14: Postulated convergent pathways of MAAs biosynthesis in cyanobacteria 22

Figure 15: The two different habitats of the four Dermatocarpon species investigated 33 Figure 16: Purification process of lichen crude aq extract by cation exchange resin Dowex chromatography 42

Figure 17: TLC profile of D miniatum extracts before and after using NaCl in Dowex purification chromatography 44

Figure 18: Comparative amounts (dry residue weight) of aq extracts obtained from 100 mg lichen material 45

Figure 19: The obtained UV absorption profiles of each extract screened by spectrophotodensitometry (C = 1 mg/mL) 46

Figure 20: (a) and (b): PDA chromatogram of crude aq extract and semi-purified aq extract of D miniatum; (c), (d), (e): UV spectra of mycosporines 1, 2, and 3; (f), (g), and (h): MS spectra of mycosporines 1, 2, and 3, respectively 49

Figure 21: The proposed fragmentation patterns of mycosporines 1, 2 and 3 50

Figure 22: UV absorption profiles obtained in different conditions investigating esterification by spectrophotodensitometry (C = 1 mg/mL) 52

Figure 23: View of lichens samples analysed from H des Abbayes herbarium (a) and Natural History Museum (London, UK) (b) for mycosporines quantification 54

Figure 24: Biphasic solvent distribution at silica surface in HILIC mode 55

Figure 25: HILIC-HPLC chromatogram of D miniatum (UV detector at 310 nm) and inset absorbance spectra of compounds 1 and 2 56

Figure 26: Calibration curves of mycosporine 1 (a) and mycosporine 2 (b) 57

xii

Figure 27: Information of Dermatocarpon species in H des Abbayes herbarium before

and after analysis 59

Figure 28: Distribution of D luridum in France 66

Figure 29: D luridum on submerged rock (a), macroscope observation of dried thallus (b), microscope observation of thallus transverse cut stained with cotton blue (c) 67

Figure 30: Polyol and steroid constituents in the Dermatocarpon genus 68

Figure 31: Free amino acids in the Dermatocarpon genus 69

Figure 32: Carotenoids in the Dermatocarpon genus 70

Figure 33: Kromaton Technologies FCPC 50mL apparatus 72

Figure 34: Extraction procedure of Dermatocarpon luridum 75

Figure 35: The TLC profile of semi-purified aq extract of D luridum using CPC in multiple dual mode 78

Figure 36: A novel isolation protocol of mycosporines from aq extract of D luridum 80 Figure 37: IR spectra of mycosporines 1 (a), 2 (b) and 3 (c) 81

Figure 38: 1H NMR spectrum of 3 (D2O, 300 MHz) 82

Figure 39: 13C NMR spectrum of 3 (D2O, 75 MHz) 82

Figure 40: Key 1H-1H COSY (bold line) and HMBC (1H→13C) correlations of 3 83

Figure 41: UV spectra of compounds 1, 2 and 3 at C= 2.5×10-5M in water 83

Figure 42: UV spectra of mycosporine 3 at pH range from -1 to 7 (C= 1.56×10-5M) 84

Figure 43: UV spectra of mycosporine 1 at pH range from -1 to 3.84 (C0= 6.82×10-5M) 85

Figure 44: UV spectra of mycosporine 3 at pH range from -1 to 3.62 (C0= 1.56×10-5M) 85

Figure 45: Resonance delocalization of the base form B 86

Figure 46: Distribution diagramm of mycosporines 1 or 3 87

Figure 47: Isolation procedure of ten compounds from D luridum 88

Figure 48: Three possible structures (a): -L-glutamylglycine, (b): -L-glutamylglycine and (c) of dipeptide 6 91

Figure 49: The similar fragmentation patterns observed of two structures (a) and (b) 91

Figure 50: Key 1H–1H COSY (bold line) and HMBC (1H→13C) correlations of compound 7 92

Figure 51: ESI-MS fragmentation of 8 94

Figure 52: Galactosylceramides isolated in lichen Ramalina celastri (Gal: galactose) 95 Figure 53: 1H NMR spectrum of 2 (D2O, 500 MHz) 103

Figure 54: 13C NMR spectrum of 2 (D2O, 125 MHz) 103

Figure 55: 1H-1H COSY NMR spectrum of 3 106

Figure 56: HSQC NMR spectrum of 3 106

Figure 57: HMBC NMR spectrum of 3 107

Figure 58: 1H NMR spectrum of 4 (D2O, 300 MHz) 110

Figure 59: 13C NMR spectrum of 4 (D2O, 75 MHz) 110

Figure 60: 1H NMR spectrum of 6 (D2O, 300 MHz) 113

Figure 61: 13C NMR spectrum of 6 (D2O, 75 MHz) 113

xiii

Figure 62: 1H NMR spectrum of 7 (CDCl3, 300 MHz) 116

Figure 63: 13C NMR spectrum of 7 (CDCl3, 75 MHz) 116

Figure 64: 1H NMR spectrum of 8 (pyridine-d5, 500 MHz) 119

Figure 65: 13C NMR spectrum of 8 (pyridine-d5, 125 MHz) 119

Figure 66: HSQC NMR spectrum of 8 120

Figure 67: Cytotoxicity of compounds 2, 3, 4, 6, 7 and 8 against eight cell lines at C = 25µM 129

Figure 68: Cross section of the skin and penetration of sunlight radiation into the tissues 131

Figure 69: Principal component analysis (PCA) of the tested compounds and extracts discriminating UV absorbing properties 133

Figure 70: Mycosporine contents in crude aq extract and semi-purified aq extract of D luridum and D miniatum 134

Figure 71: Antioxidant activity of the aq extracts and three mycosporines 1, 2, 3 through DPPH and NBT methods compared to the positive control quercetin 137

Figure 72: Proposed model for the role of early ROS-induced fluidizing effect of ethanol in the amplification of oxidative stress 138

Figure 73: Effect of DM2 extract (5.20 µg/mL) and mycosporine 3 (4.00 µg/mL ~ 12 µM) on WIF-B9 cell line by ethanol-induced lipid peroxidation assay 139

Figure 74: HPLC chromatograms of trolox (left) and mycosporine 1 (right) 141

Figure 75: Solution preparation for UV-filters test 143

Figure 76: Reaction leads to the formation of superoxide anion 145

xiv

1 sera donc consacré à la description des lichens, aux mécanismes de photoprotection qu’ils ont mis en place et à la présentation des mycosporines et MAAs

Récemment au laboratoire, un protocole de criblage de ces molécules particulières a été mis au point dans les lichens [3] et a permis de mettre en évidence la présence de ces composés uniquement dans des cyanolichens, organismes issus de la symbiose entre un champignon et une cyanobactérie Alors que les chlorolichens (cyanobactérie remplacée par une algue verte) correspondent à 90% des espèces de lichens, aucun composé de type mycosporine n’y a été jusqu’ici détecté La poursuite de ce criblage nous a donc semblé importante pour plusieurs raisons : recherche de nouvelles mycosporines, confirmation de leur intérêt en tant que marqueurs chimiotaxonomiques de différents genres et élucidation de leur biogenèse au sein

xvi

de l’association lichénique Une étude préliminaire sur deux chorolichens et deux cyanolichens

a permis de repérer la présence de composés de type mycosporine dans les deux cyanolichens mais aussi dans un des deux chlorolichens Ce repérage inédit de mycosporines dans un

chlorolichen : Dermatocarpon luridum nous a amené à focaliser notre étude sur ce genre et tout

particulièrement cette espèce qu’il était possible de collecter en quantité suffisante en Bretagne pour une étude phytochimique Il s’agit d’un lichen foliacé saxicole hydrophile appartenant au

genre Dermatocarpon (Verrucariaceae), vivant sur les rochers retrouvés dans des milieux

fréquemment inondés comme les cours d’eau Nous avons aussi décidé de poursuivre ce

criblage sur les trois autres Dermatocarpon aquatiques/semi-aquatiques présents en Bretagne :

D meiophyllizum, D leptophyllodes et D miniatum Si D miniatum a un habitat un peu différent [4] elles contiennent toutes l’algue verte Diplosphaera chodatii (Trebouxiophyceae)

comme photobionte

Dans le chapitre 2, nous présentons le résultat du criblage Celui-ci doit nous permettre

de confirmer ou non la présence de composés types mycosporines dans les trois autres espèces,

de confirmer aussi leur intérêt en tant que marqueurs chimiotaxonomiques et d’avancer d’éventuelles hypothèses sur leur biogénèse Nous espérons pouvoir aussi faire un lien entre l’écologie du lichen, la date de la collecte et leur contenu en mycosporines Pour cela nous avons cherché à mettre au point une méthode de quantification des mycosporines à partir d’une faible biomasse Nous avons eu l’opportunité de collaborer avec le Dr Holger Thüs, conservateur de l’herbier lichen au Natural History Museum de Londres, spécialiste des Verrucariaceae qui nous a fourni 49 échantillons mis en herbier depuis plus de 170 ans Cette étude a été complétée avec 30 échantillons provenant de l’herbier de Rennes (herbiers des Pr Henry des Abbayes et Dr Louis, Jean-Claude Massé) et 15 échantillons récoltés depuis moins

de 10 ans Nous avons aussi visé à démontrer qu’un herbier peut être une source importante d’informations pour nos études, au-delà de ses fonctions habituelles

Suite à ce criblage, Dermatocarpon luridum (With.) J.R Laundon 1984, en quantité

suffisante dans le Finistère et espèce non menacée [69], est choisi afin de l’étudier plus en détail d’un point de vue phytochimique (chapitre 3) Nous espérons ainsi isoler les mycosporines détectées au cours du criblage, préciser leur structure et déterminer de nouvelles propriétés spectroscopiques et physicochimiques L’étude phytochimique doit aussi nous permettre d’identifier d’autres métabolites originaux, étant donné qu’aucun composé polyphénolique

habituellement retrouvé dans les lichens n’a été à ce jour décrit dans le genre Dermatocarpon

xvii

Dans le cadre d’une évaluation dans le domaine de la photoprotection, le chapitre 4 est consacré aux activités biologiques des composés isolés en quantité suffisante ainsi que

d’extraits aqueux de deux espèces de Dermatocarpon Un test préliminaire consistera à évaluer

leur activité cytotoxique sur 8 lignées cellulaires sur la plateforme ImPACcell à l’Université

de Rennes 1 Outre leur intérêt possible dans le traitement du cancer pour les composés hautement cytotoxiques, le profil cytotoxique sur un panel de lignées cellulaires est une première étape importante pour sélectionner les composés ainsi que la dose appropriée pour d'autres tests En ce qui concerne l’évaluation des capacités photoprotectrices, un premier test consistera à évaluer leur capacité en tant que filtre UV Ensuite leur phototoxicité sur cellules non tumorales de kératinocytes humains, soumises à des radiations UVA, sera étudiée

L’oxydation au sein des systèmes biologiques fait appel à différents processus Trois tests in vitro et in cellulo, mettant en jeu des mécanismes différents, seront donc réalisés pour

déterminer l’activité antioxydante des composés et extraits Enfin, dans le but de confirmer leur potentielle utilisation en tant photoprotecteur d’origine naturelle, leur photostabilité sous irradiations UVA et UVB sera évaluée

Indépendamment de notre contribution au profilage chimique du genre Dermatocapon,

avec l'accent mis sur la présence de mycosporines, nous espérons que ce travail apportera de nouvelles perspectives dans le métabolisme des lichens et qu’il soulignera l'intérêt général des lichens comme une source prometteuse de substances biologiquement actives

CHAPITRE 1: LICHENS ET PHOTOPROTECTION

Afin de mieux présenter les espèces sur lesquelles nous avons travaillé et le cadre de nos travaux, ce chapitre donne quelques précisions sur les lichens et leurs métabolites en mettant l’accent sur les propriétés photoprotectrices de quelques métabolites Dans la symbiose lichénique, le mycosymbiote est le partenaire englobant le photosymbiote dans une structure originale : le thalle lichénique Il présente une grande diversité de formes et de couleurs et peut aussi porter un certains nombres d’organes divers On distingue 3 grands groupes de thalles pour les macrolichens en fonction de leur forme : crustacés, foliacés et fruticuleux [5] Le mycosymbiote appartient au groupe des ascomycètes (98%) et plus rarement au groupe des basidiomycètes (2%) Quant aux photosymbiotes, les plus fréquents sont les algues vertes des

xviii

genres Trebouxia et Trentepohlia, et la cyanobactérie du genre Nostoc On décrit environ 18500

espèces de lichens dans le monde colonisant tous les milieux terrestres [6] Certains lichens appelés tripartites (moins de 5%) incorporent les deux photosymbiotes : algue verte et cyanobactérie Au sein de l’association, le champignon assure la protection physique à l’ensemble et fournit au photosymbiote l’eau, les sels minéraux et la vitamine C Le photosymbiote apporte de son côté la matière organique carbonée sous forme de glucose ou polyols et fait du lichen un organisme autotrophe (Figure 4) Les métabolites lichéniques secondaires résultent de différentes voies de biogénèse, la majorité d’entre eux dérivent de la voie des acétates polymalonates, les voies de biogénèse de l’acide shikimique et de l’acide mévalonique sont également présentes (Figure 5) Le nombre de substances lichéniques identifiées à ce jour dépasserait les 1050 [14]

En réponse aux radiations UV, les lichens ont développé des systèmes de protection efficaces mettant en œuvre des mécanismes physiologiques et biochimiques (Figure 7) Parmi ceux-ci on peut citer la production et l’accumulation de composés aromatiques polyfonctionnalisés dans la couche corticale du lichen [2] Ces métabolites appartiennent à la famille des depsidones, depsides, diphenyl éther, anthraquinones, xanthones, acides pulviniques et scytonémine Leurs structures ainsi que leurs caractéristiques spectrales sont résumées dans la Figure 10

D’autres métabolites présentant un intérêt dans la photoprotection, ont été récemment décelés au sein des lichens Il s’agit des mycosporines et des MAAs (Mycosporine-like Amino Acids) Ils sont formés par un noyau cyclohexènone (oxo-mycosporine) ou cyclohexènimine (imino-mycosporine) (Figure 12) Leur voie de biosynthèse dans les lichens mérite d’être précisée Chez les champignons et les cyanobactéries, ils sont dérivés de la voie de l’acide shikimique, cependant une nouvelle voie de biosynthèse à partir de la voie des pentoses phosphates a été décrite chez des cyanobactéries [54] (Figure 14) Ils ont des coefficients d’extinction molaires compris entre ε=28 000 M-1.cm-1 et ε=50 000 M-1.cm-1 (310-365 nm), sont très polaires, hydrosolubles et de faible poids moléculaire (<400 g/mol) Outre leur principale propriété d’être de bons filtres UV, de nombreuses études ont montré leur implication dans le stress osmotique, la reproduction fongique, la dessiccation et enfin leur rôle

en tant qu’antioxydants Enfin, un bilan de la distribution des composés de type mycosporine dans 40 lichens montre que seuls les cyanolichens et quelques lichens tripartites produisent des mycosporines (Tableau 1) La poursuite du criblage sur deux chorolichens et deux cyanolichens

xix

nous a permis de mettre en évidence pour la première fois des composés types mycosporines

dans un chlorolichen : Dermatocarpon luridum

CHAPITRE 2: CRIBLAGE ET QUANTIFICATION DE COMPOSES

DE TYPE MYCOSPORINE DANS LE GENRE DERMATOCARPON

Afin de confirmer ce résultat inédit, nous avons choisi de cribler les quatre espèces

appartenant au genre Dermatocarpon présentes en Bretagne par une collecte dans le Finistère :

D luridum, D meiophyllizum, D leptophyllodes et D miniatum Après une description

botanique des quatre espèces, un protocole d’extraction aqueuse, de purification et d’analyse par HPTLC-UV et HPLC-DAD-MS est appliqué La comparaison des profils d’absorption en spectrophotométrie UV et en spectrométrie de masse des extraits (Figures 19 et 20) avec les données bibliographiques (Appendice 2), met en évidence pour la première fois dans les quatre chlorolichens la présence de deux composés de type oxo-mycosporine Il s’agit de la

mycosporine glutaminol 1 et de la mycosporine glutamicol 2 (Tableau 4) Ces deux

mycosporines sont présentes dans l’extrait brut mais on peut noter qu’au cours de l’étape de

purification de l’extrait, la mycosporine glutaminol 1 est instable et s’hydrolyse en mycosporine 2 Ces deux substances (y compris leur forme glycosylée) ont été observées pour

la première fois dans des ascomycètes terrestres, puis dans une cyanobactérie terrestre pour la

mycosporine 1 et un cyanolichen pour la mycosporine 2 Un troisième composé, la

mycosporine 3 a été détecté dans deux extraits D luridum et D miniatum, il correspond à l’ester

éthylique de la mycosporine glutamicol Nous avons démontré qu’il n’était pas d’origine naturelle et qu’il se formait au cours de l’étape de purification Néanmoins il s’agit d’un composé nouveau

La présence systématique des mycosporines 1 et 2 dans les quatre espèces de

Dermatocarpon apporte un argument supplémentaire quant à leur rơle en tant que marqueurs

chimiotaxonomiques de genre Cette découverte apporte aussi des arguments en faveur d’une biogenèse ó le mycosymbiote serait impliqué dans la biosynthèse des mycosporines au sein des lichens

Afin de confirmer ces résultats, nous avons eu l’opportunité d’étendre le criblage sur

des échantillons d’herbier appartenant à 12 espèces différentes de Dermatocarpon en

xx

provenance d’Amérique du Nord et d’Europe, soit un total de 94 échantillons (Appendice 3) Notre travail a consisté dans un premier temps, à partir d’une courbe de calibration, à valider une méthode de dosage rapide et sensible étant donné la faible biomasse mise à disposition (entre 15 et 50 mg de lichen) (Tableau 5) Ainsi, une méthode comprenant une extraction aqueuse suivie d’un dosage par HPLC-DAD basée sur une séparation en mode HILIC est appliquée pour la première fois, elle a permis de séparer et de déterminer le contenu en

mycosporines 1 et 2 avec une séquence d’analyse de 16 min (Figure 25) Sur le panel

d’échantillons, cette étude a montré que le contenu global en mycosporine variait entre 4.56 et 46.77 mg/g d’extrait sec correspondant à 0.1 et 1.4 mg/g de lichen L’étude a montré une

instabilité de la mycosporine glutaminol 1 dont la teneur devient nulle dans les échantillons collectés depuis plus de 15 ans alors que la teneur en mycosporine glutamicol 2 est mesurable

et importante dans la plupart des échantillons Il est difficile de faire une cinétique de dégradation au cours du temps car nous ne connaissons pas le contenu initial en mycosporine mais notre travail apporte un point de départ à une analyse de ces échantillons sur le long terme

Concernant les quatre lichens frais collectés le même jour à des endroits différents (D luridum,

D meiophyllizum, D leptophyllodes et D miniatum), nous remarquons une différence notable

en contenu en mycosporine totale ; il est beaucoup plus élevé dans le D miniatum Ceci peut être corrélé à leur écologie différente : exposition au soleil sur rochers secs pour D miniatum

et une exposition à l’ombre sur rochers immergés pour les 3 autres Une étude complémentaire

à partir des quatre espèces collectées dans la même zone devra être mise en place pour confirmer l’influence de l’exposition ou des saisons sur le contenu en mycosporines

CHAPITRE 3: ETUDE PHYTOCHIMIQUE DU DERMATOCARPON

LURIDUM (WITH.) J.R LAUNDON

Une étude phytochimique plus approfondie de D luridum a été entreprise dans le but

d’isoler dans un premier temps les mycosporines décrites précédemment Le chapitre débute

par une présentation de l’écologie et de la morphologie du D luridum suivie d’un bilan bibliographique concernant les constituants retrouvés dans le genre Dermatocarpon Il apparaỵt

que ce genre est très pauvre en métabolites secondaires polyfonctionnalisés En revanche, il est riche en polyols, en acides aminés et en caroténọdes

xxi

A partir de 150 g de lichen séché et broyé, nous avons procédé à une extraction successive par des solvants de polarité différente en commençant par l’eau puis le chloroforme (après séchage du lichen) et enfin l’acétone (Figure 34) L’extrait aqueux, le plus riche quantitativement et contenant les mycosporines a été traité en premier La purification a consisté en une première étape de chromatographie échangeuse de cations afin d’éliminer les polyols Puis, après quelques essais non concluants de chromatographie de partage centrifuge (CPC) pour éliminer les acides aminés, nous avons adopté une nouvelle combinaison pour la purification de ces composés : une flash chromatographie en mode HILIC suivie d’une chromatographie en phase inversée sur colonne ouverte et enfin une chromatographie semi-préparative en phase inversée (Figure 36) Cela a conduit à l’isolement de 5 mg de mycosporine

glutaminol 1, 6,5 mg de mycosporine glutamicol 2 et 6 mg de la mycosporine ester 3 Leur

spectre UV dans l’eau a été enregistré permettant ainsi de calculer leur coefficient d’extinction molaire à max = 310 nm Une détermination de la constante d’acidité pKa des mycosporines

1 et 3 par spectrophotométrie a ensuite été entreprise pour la première fois Les pKa de l’ordre

de 1.2 montrent que les deux mycosporines se comportent comme des acides très forts L’intérêt de cette étude est d’une part, de connaître sous quelle forme se trouve la mycosporine

en fonction du pH du milieu et d’autre part, de mettre en évidence une forte délocalisation des électrons au sein du noyau cyclohexenone (Figures 45 et 46)

Trois autres composés polaires 4, 5 et 6 ont été isolés à partir de l’extrait aqueux (Figure 47) Il s’agit de trois substances azotées Le composé 4 (acide 2-amino-3-

acétylaminopropionique) est un composé appartenant à la famille des acides aminés non protéiques qui n’ont jusqu’ici jamais été isolés dans les lichens, ils auraient un rôle défensif

contre les insectes herbivores Le composé 5, la L-Proline est un acide aminé classique déjà

décrit dans un Dermatocarpon, il joue un rôle de composé osmotiquement efficace dans les

lichens et les algues vertes Le composé 6 (-L-Glutamylglycine) est un dipeptide composé d’une unité glycine associé à un acide glutamique, la structure exacte a été élucidée grâce à la RMN et à la fragmentation en masse Ce type de composé n’a jamais été décrit dans un lichen

A partir des extraits acétone et chloroforme quatre composés 7, 8, 9 et 10 ont été isolés Le cerevisterol 7 est un stérol comportant 3 hydroxyles, la configuration absolue a pu être

déterminée en comparant son pouvoir rotatoire avec celui de la littérature, il a déjà été décrit

dans les lichens mais pas dans le genre Dermatocarpon Le composé 8 est un céramide ou un

sphingolipide constitué d’une sphingosine formant une liaison amide avec un acide gras La

xxii

longueur des deux chaỵnes alkyles a pu être déterminée à partir de la fragmentation MS C’est

la première fois qu’un sphingolipide non glycosylé est décrit dans un lichen Les céramides sont des composés très hydrophobes, par conséquent ils jouent un rơle d’imperméabilisant en empêchant la perte d’eau et pourraient aussi empêcher l’entrée de microorganismes Les

composés 9 et 10 ont été isolés en mélange 85:15, il s’agit de deux polyols, respectivement le

D-volémitol et le D-mannitol

Au total, 10 composés ont été identifiés à partir du D luridum Il est intéressant de

souligner que ce lichen est pauvre en constituants polyphénoliques Son profilage chimique est

à rapprocher de celui d’un cyanolichen connu pour accumuler des polysaccharides et des substances azotées telles que les mycosporines

CHAPITRE 4: TESTS BIOLOGIQUES ET EVALUATION DE LA PHOTOPROTECTION

Les différents composés obtenus en quantité suffisante ainsi que des extraits aqueux ont pu être testés pour leurs activités cytotoxiques et certains évalués pour leurs propriétés

photoprotectrices Ainsi la cytotoxicité des six composés isolés 2, 3, 4, 6, 7 et 8 a été évaluée

sur six lignées cellulaires cancéreuses: Huh7, CaCo-2, MDA-MB-231, HCT116, PC3, H727, et deux lignées cellulaires de la peau non cancéreuses: HaCaT et Fibroblastes La plupart des composés testés ne sont pas toxiques à une concentration de 25 µM, à l'exception du

NCI-stérọde cérevisterol 7 (Figure 67) Le composé 7 est en effet toxique sur sept lignées cellulaires

avec des valeurs de CI50 comprises entre 5 à 24 µM, à l'exception de la lignée cellulaire de cancer du sein humain MDA-MB- 231 Ce résultat est en accord avec l’activité cytotoxique du stérọde décrite il y a peu [138]

L’absence de toxicité des mycosporines sur les cellules de la peau est un résultat très encourageant pour une éventuelle application dans le domaine de la photoprotection Aussi l’évaluation des capacités photoprotectrices des trois mycosporines a été entreprise ainsi que

celle des extraits aqueux bruts et semi-purifiés de D luridum (respectivement DL1 et DL2) et

D miniatum (respectivement DM1 et DM2) Tout d’abord, nous avons commencé à évaluer

leur capacité en tant que filtre UV étant donné que les mycosporines 1-3 possédaient un

coefficient d’extinction moléculaire supérieur à 10000 M-1.cm-1 et une absorption maximale

xxiii

dans les UV à 310 nm L’activité photoprotectrice a été déterminée in vitro en enregistrant le

spectre d’absorption dans une émulsion huile/eau contenant 10% de chaque produit En utilisant une analyse en composantes principales (ACP), il apparaît que les 3 mycosporines

ainsi que l’extrait DM2 (extrait semi-purifié de D miniatum) s’avèrent être de bons candidats

comme filtres UVB en comparaison du 4-methylbenzylidene Camphor (4-MBC), un filtre commercial (Figure 69) Nous avons aussi démontré que l’activité des extraits était corrélée avec leur teneur en mycosporines

Suite à ces observations, leur phototoxicité sur cellules non tumorales de kératinocytes humains, soumises à des radiations UVA a été évaluée dans l’hypothèse d’une application cosmétique Les résultats suggèrent que les extraits lichéniques et les composés purs sont non-phototoxiques (Tableau 14)

Un filtre solaire est d’autant plus intéressant qu’il possède une capacité antioxydante En effet, les dommages dus aux UV passent par des mécanismes d’oxydation directs ou indirects des constituants de la peau et plus particulièrement de l’ADN, ce qui peut mener à terme l’apparition de cancers cutanés Après un bilan bibliographique des propriétés antioxydantes des oxo-mycosporines et imino-mycosporines décrites à ce jour (Appendice 4), nous avons

testé leur activité antioxydante en effectuant deux tests in vitro (DPPH et NBT) et un test in cellulo (peroxydation lipidique) mettant en jeu des mécanismes différents Le test DPPH

consiste à mesurer la capacité des composés à réduire un composé radicalaire (par transfert d’électrons) alors que le test NBT concerne principalement la capacité des molécules à piéger l’anion superoxyde O2.-

Les mycosporines 1-3 ainsi que les extraits semblent présenter peu

d’activité réductrice sur le test DPPH alors que la mycosporine 3 et les extraits DL2 et DM2 présentent une activité notable dans le piégeage de O2.- comparée au témoin positif, la

quercétine (Figure 68) On note également une activité modérée des mycosporines 1 et 2

suggérant une interaction synergiste entre les constituants présents dans les extraits DL2 et DM2 Le dernier test de peroxydation lipidique a été effectué en collaboration avec Mme Isabelle Gallais et le Pr Odile Sergent au sein de l’UMR Inserm 1085, IRSET à l’Université

de Rennes 1 Ce test consiste à mesurer la quantité de malondialdehyde (MDA) formée suite à

la production de ROS sous l’effet de l’éthanol sur des cellules WIF-B9 Seul l’extrait DM2 et

la mycosporine 3 ont été testés car ils présentaient la meilleure activité antioxydante sur l’essai

NBT Le résultat de ce test préliminaire (car seulement issu de deux expériences) semble

xxiv

confirmer une activité antioxydante des deux produits basée sur la diminution de la peroxydation lipidique lorsqu’elle est induite par l’éthanol (Figure 73) Ce résultat très prometteur devra être confirmé par une troisième expérience En effet, il montre pour la première fois une activité des deux produits comparable à la vitamine E à la différence près que la Vit E est lipophile et que l’extrait et la mycosporine 3 sont hydrophiles

Enfin, dans le but de confirmer la potentielle utilisation des mycosporines 1-3 et de

l’extrait DM2 en tant photoprotecteur d’origine naturelle, leur photostabilité sous irradiations UVA et UVB a été évaluée par HPLC-UV La comparaison des chromatogrammes obtenus après irradiations ou non des solutions, montre une absence de dégradation des 4 produits après une exposition de 5 J/m2 alors qu’une dégradation du trolox apparaît dès 0.5 J/m2

CONCLUSION

Le profil chimique intrigant du lichen dulcicole Dermatocarpon luridum correspondant

à un chlorolichen de l’ordre des Verrucariales mais ne possédant pas les composés phénoliques habituels, nous a incité à approfondir une étude phytochimique sur ce lichen ainsi que sur quelques espèces voisines Parmi les composés polaires, nous avons repéré un profil UV caractéristique de mycosporines, connues pour être des filtres UV naturels Il s’agit ici de deux

oxomycosporines dont l’une avait été signalée dans un cyanolichen, Degelia plumbea [3] Ce

résultat étant inattendu, nous avons d'abord vérifié la présence de mycosporines sur une variété

d'échantillons de D luridum et étendu notre prospection à une dizaine d’espèces proches En

employant des méthodes HPTLC-UV et HPLC-DAD-MS, deux oxomycosporines

(Mycosporine glutaminol 1 et mycosporine glutamicol 2) ont été caractérisées dans les extraits

aqueux des quatre espèces fraîches de Dermatocarpon (D luridum, D meiophyllizum, D leptophyllodes, et D miniatum) collectées en Bretagne Un ester éthylique de la mycosporine

glutamicol a également été identifié dans quelques extraits Il correspond à un composé nouveau mais il est en réalité un artefact formé pendant le processus de purification

Les taux de mycosporine dans les Dermatocarpons semblent être influencés par des

intensités de rayonnements solaires puisque un contenu plus élevé en mycosporines est trouvé

dans les espèces plus exposées (D miniatum présente une teneur au moins deux fois supérieure

en mycosporines par rapport à D leptophyllodes et D meiophyllizum qui sont avec D luridum

du Nord A partir d’un échantillon récolté en 1841 et conservé au NHM, 14 mgs de mycosporine glutamicol par gramme de résidu sec d’un extrait aqueux de ce lichen (15 mgs de thalle) ont été mesurés Excepté pour quelques échantillons, la teneur totale des mycosporines

se situe entre 0,1 et 1,4 mg/g de lichen sec avec une bonne reproductibilité pour des échantillons anciens mais conservés dans des conditions similaires La diminution, dépendante

du temps (baisse puis disparition totale en moins de 15 ans), de la mycosporine glutaminol alors que la mycosporine glutamicol s'accumule dans la plupart des échantillons étudiés est à rapprocher de la conversion probable du premier en second L’absence de l'ester éthylique de

la mycopsorine glutamicol dans ce protocole simplifié montre bien que ce n’est pas un produit originel Le caractère stable de la mycosporine glutamicol dans les échantillons de

Dermatocarpon conservés en herbier pourra sans doute être mis à profit pour une cinétique de

datation à partir des données de référence que nous avons établies

Il reste à vérifier que ces mycosporines - qui n’avaient jusqu’alors pas été recherchées compte tenu de la focalisation faite sur l’intérêt chimiotaxonomique des composés phénoliques

- est bien réel en étendant plus largement le criblage Si le repérage de ces composés est aisé, leur isolement l’est beaucoup moins car ces composés polaires sont peu abondants et mélangés aux acides aminés et aux sucres L'isolement et l'identification structurale par spectroscopie ont

permis d’établir la structure des deux oxomycosporines 1 et 2 et de l’artéfact 3 à partir de

l'extrait aqueux de D luridum

Concernant leur détection dans les Dermartocarpons, l'ordre des Verrucariales doit

maintenant être ajouté aux ordres des Peltigerales, des Lichinales et des Lecanorales dans lesquels des mycosporines avaient été caractérisées pour quelques espèces de lichens Des

iminomycosporines sont suspectées dans des lichens tripartites du genre Stereocaulon [190]

mycosporine glutamicol pourrait être un marqueur taxonomique des Dermatocapons et

probablement des Verrucariales comme la mycosporine serinol qui est principalement trouvée dans les Peltigerales (8 Peltigeraceae) et la mycosporine glycine dans les Lichinales (7 espèces

de Lichinaceae et de Peltulaceae) (Tableau 1) Etant donné le peu d’études phytochimiques sur les Verrucariales, il serait intéressant dans les perspectives à donner à ce travail d’étendre cette étude à d’autres espèces appartenant à cet ordre, la chimie pouvant venir en aide à la taxonomie des Verrucariales [215]

L’étude phytochimique sur le lichen D luridum (150 g de thalle) a mené à l'isolement

et à l'identification de dix composés Un nouveau protocole de purification de mycosporines comprenant la chromatographie en mode HILIC, suivie d’une chromatographie en phase inverse avec HPLC-DAD a permis d’isoler une douzaine de mgs des deux mycosporines

natives 1 et 2 avec l’artefact 3 Trois autres composés polaires ont été isolés dans l'extrait aqueux, y compris l'acide 2 amino-3-acetylaminopropionique 4, la L-proline 5, et la γ-L- glutamylglycine 6 À partir des extraits au chloroforme et à l’acétone, le cérevistérol 7, un céramide 8 et un mélange de D-volémitol 9 et de D-mannitol 10 (85:15) ont été également obtenus Les composés 4, 6 et 8 n'ont pas été mentionnés dans les lichens jusqu'ici et le composé

7 est ici décrit pour la première fois dans D luridum Le céramide 8 est le premier représentant

non glycosylé décrit dans les lichens et son rôle dans le lichen reste à élucider (stabilisation de

la membrane ou médiateur de signalisation) Ces composés, qui sont généralement trouvés dans

la nature sous une forme plus complexe, pourrait jouer un rôle important dans la rétention hydrique et la plasticité du thalle

Pour les quelques composés isolés en quantité suffisante, des essais biologiques ont été

réalisés La cytotoxicité de six d’entre eux 2, 3, 4, 6, 7 et 8 a été évaluée sur six lignées de

cellules cancéreuses et deux lignées de Keratinocytes HaCaT et Fibroblastes qui sont informatives pour apprécier la tolérance possible sur la peau La plupart des composés

xxvii

examinés ne sont pas toxiques à une concentration de 25 µM, excepté un stérọde, le

cérevistérol 7 L’absence de toxicité des mycosporines sur les cellules de la peau est un résultat

très encourageant pour une éventuelle application dans le domaine de la photoprotection De

plus, la mycosporine 3 et l’extrait DM2 n'induisent pas de phototoxicité sur les Kératinocytes

HaCaT exposées à des rayonnements UVA et ont également une bonne photostabilité sous irradiation UV Ainsi ils ont les conditions requises pour être développés comme produits de protection solaire Cependant, la synthèse ou l'approche biotechnologique doivent être envisagées en priorité pour leur obtention car le lichen ne peut pas être envisagé comme une source viable Nous notons avant tout qu’une combinaison de composés semble être plus efficace que le composé pur mais le mélange optimal reste à étudier Les activités antioxydantes obtenues avec ces composés semblent également être synergiques et la confirmation de

résultats in cellulo pour la peroxydation lipidique de la mycosporine 3 est attendue avec grand

intérêt car il est inhabituel d’obtenir de tels résultats avec des composés hydrophiles

Ces tests antioxydants et photoprotecteurs ont toutefois leurs limites et nous préjugeons que ces composés sont considérablement plus actifs au sein des lichens comme le révèlent des expériences publiées en 2004 par Kranner et al [194] Les effets photoprotecteurs et antioxydants du cycle des xanthophylles doivent certainement aussi y participer comme observés par Clother Coste pour des lichens subaquatiques [109]

En conclusion de ce travail, nos résultats ont permis de revoir un concept qui mettait jusqu'à maintenant en avant la production de mycosporine uniquement dans des cyanolichens [189] Une prolongation du travail par des analyses génétiques pour repérer les clusters de

gènes formant les mycosporines devra être entreprise dans les Dermatocarpons De la même

manière, d’autres lichens doivent être étudiés dans ces approches de génome-mining et en particulier des lichens tripartites formant des céphalodies La distribution des mycosporines dans le thalle lichénique serait aussi importante à étudier, tant pour connaitre leur distribution que leur rơle On notera ici que la plupart des organismes produisant des mycosporines sont des organismes très hydrophiles ou évoluant dans un milieu aqueux, cela soulève la question

en lien avec l'adaptation terrestre des espèces marines Comment interpréter d’autre part la relation qu’il peut y avoir entre un métabolisme de chlorolichen aboutissant à la production massive de composés phénoliques et celle d’un chlorolichen ayant un métabolisme plus proche

de celui d’un cyanolichen?

xxviii

Par ailleurs, l’élargissement de l’étude à des échantillons issus de collections historiques

de lichens en herbiers a été un défi passionnant La valeur de ces collections pour la science est fortement sous-estimée À notre connaissance, peu de dosages ont été réalisés sur les métabolites secondaires à partir de collections [195], [196], [197], [198] Le développement des techniques analytiques nous permet de travailler sur des quantités d’échantillon très réduites ce qui nous ouvre un accès raisonné à ces ressources d’une valeur inestimable En dehors de leur but principal de taxonomie et de référencement, ces collections d'herbier ont des implications dans les domaines environnementaux, pour l'analyse génétique, la régénération d’espèces mais aussi la constitution de banques de diversité chimique tout à fait remarquables, [206] Bien que notre travail ait précisé la labilité de certains composés au cours du temps, nous avons pu mesurer toute la nécessité de maintenir et d’enrichir de telles collections, en y apportant notamment des données qui ouvrent la voie à de futurs travaux

1

Introduction

Over the past ten years, the team involved in natural products research in Rennes has a special interest in lichens These symbiotic organisms are classified in the fungi kindom and result from the association between algae and/or cyanobacteria (the photobiont) and fungi (the mycobiont) and dedicated bacterial communities [1] They appeared about 680 million years ago, primarily aquatic they were able to adapt to the terrestrial environment Based on this association, lichens are able to survive under extreme ecological conditions, such as intense radiation, extreme temperatures, dessication, etc In response to environmental factors and taking into account their specific metabolism, lichens produce a variety of secondary metabolites, most of them being unique With regard to UV radiation, lichens have developed various mechanisms of photoprotection such as the production of a series of photoprotective compounds [2] Most of them are typical polyphenolic compounds but lichens also produce non-aromatic photoprotective compounds such as mycosporine-like compounds Chapter 1 of the manuscript is devoted to the presentation of lichens and to their photoprotective responses, drafting an overview of mycosporine-like compounds as natural photoprotectants

To now, the distribution of mycosporine-like compounds has been reported in cyanolichens (symbiotic organisms resulting from an association between a fungus and a cyanobacterium) [3] Although chlorolichens correspond to 90% of lichen species, mycosporine-like compounds have not yet been described in chlorolichens in which cyanobacteria are replaced by green algae From our interest in such metabolites in lichens, we performed a new screening in four lichen species, including two chlorolichens and two cyanolichens As expected, mycosporines were detected in both cyanolichens and undetected

in one chlorolichen Interestingly, we observed the possible occurrence of such compounds in

the second chlorolichen Dermatocarpon luridum - a foliose, freshwater aquatic chlorolichen belonging to the Dermatocarpon genus (Verrucariaceae)

Members of this genus exhibit rather diverse morphologies and habitats Some species are aquatic or semi-aquatic lichens Other members are not associated with watercourses and

live on rocks or on soil [4] In chapter 2, four available Dermatocarpon species located in Brittany (D luridum, D meiophyllizum, D leptophyllodes, and D miniatum containing Diplosphaera chodatii (Trebouxiophyceae) photobionts), were screened for mycosporines to

2

confirm the presence of such compounds in chlorolichens and to have a better understanding

of their biogenesis in lichens Due to occurrence of mycosporines in the four fresh species

investigated and a suitable physico-chemical profile of these compounds for a UV dosage,

quantification of such metabolites in ancient preserved herbarium samples (even more than 170

years) were then performed: 49 samples kindly offered by Dr Holger Thüs from Natural

History Museum (London, UK) and 30 samples originated from our herbariums at Rennes,

France (H des Abbayes and L.J.-C Massé) Our work aimed to respectfully use a little part of

the herbarium samples to generate data which could be useful for a possible survey of

mycosporines over years and chemotaxonomy

After this mycosporine screening and quantification, chapter 3 presents their isolation

from D luridum lichen material collected in Finistère (Brittany) With a suitable quantity of

the purified mycosporines, we confirmed their structures, and determined some of their

characteristic spectroscopic and physico-chemical properties Moreover, this study contributed

to investigate the other chemical constituents of D luridum as a previous phytochemical

screening revealed that chlorolichens belonging to the Dermatocarpon genus had no usual

polyphenolic lichen substances

Chapter 4 reports some biological tests carried on Dermatocarpon aqueous extracts and

all the isolated compounds The preliminary cytotoxicity screening on eight cell lines

(ImPACcell Plateform, University of Rennes 1) provides an overview on cytotoxic activity

Beside the possible interest of highly cytotoxic compounds on cancer cells to be use in cancer

therapy, the cytotoxic profile on a panel of cell lines is an important initial step to select

compounds and an appropriate dose for further tests In term of photoprotective activity,

samples were evaluated as UV filters by the calculation of the absolute (UV-PF, c, UVA-PF)

and relative index (SUI, ISP) Their phototoxicity were then tested on HaCaT cells exposed to

UVA radiations Their antioxidant activity was evaluated in vitro assays based on electron

transfer and superoxide radicals scavenging as well as in cellulo on WIF-B9 cell line by using

ethanol-induced lipid peroxidation assay Finally, to confirm their possible applications as

natural photoprotectants, we evaluated their photostability under UVA and UVB exposure

Beside the contribution to the chemical profile in the Dermatocapon genus along with

the focus on lichen mycosporines, we hope this work will give new insights in lichen

metabolism and also enlight the broad interest of lichens as a source of valuable compounds

3

CHAPTER 1: LICHENS AND PHOTOPROTECTION

4

Trebouxia is the most common genus of green algae while Nostoc is the most commonly

occurring cyanobacteria genus

The mycobiont is unique in the symbiotic association and usually dominates the association, therefore, lichens are traditionally classified as a life-form of fungi and the scientific names used for lichens are actually those applied to the fungal partner The photosynthetic partner has a scientific name related to some dozens of the algae or cyanobacteria genera and only given when independent lichen description Due to an apparently successful form of fungal symbioses, the lichen-forming habit is maintained by one-

fifth of all fungi, which includes more than ca 40% of ascomycetes, but only a few

basidiomycetes [6]

1.2 Thallus morphology and anatomy

Lichens are traditionally divided into three growth morphological forms: crustose (representing 90% of the lichen), foliose and fruticose [5] (Figure 1)

Figure 1: Major growth forms of lichen

6

Crustose lichens may be subdivided as leprose, endolithic, endophloeodic, squamulose,

peltate, pulvinate, lobate, effigurate and suffruticose crusts Majority of crustose lichens grows directly on the surface of the substrate and is referred to as episubstratic, while a small minority grows inside the substratum is called endosubstratic The episubstratic thallus consists of a crust-like growth adherent or attached to the substratum throughout its underside by hyphae and cannot be detached without destruction

The foliose or leafy thallus of lichens is typically flattened, dorsiventral, spreading and

expanding horizontally outwards and usually attached to the substratum by rhizines arising from the lower surface Foliose lichens develop a great range of thallus size, color and shape diversity

Squamulose lichens are intermediate between foliose and crustose thalli in structure

The thallus is composed of numerous small lobes or squamules up to 1 cm long The internal structure is similar to that of foliose lichens but without any lower cortex or rhizines

Fruticose type of lichen is either erect or pendent shrubby growth attached to the

substratum at the base by basal disc or holdfast (formed by mycobiont hyphae) Some groups have dorsiventrally arranged thalli but most of them exhibit a radial symmetric

Among the different growth forms of lichens in the evolutionary series, leprose are considered pioneers followed by crustose, squamulose, foliose, and fruticose being the latest Leprose, crustose and squamulose lichens are called microlichens as they are smaller in size and mostly require a microscopic study for identification Foliose and fruticose lichens on the other hand are called macrolichens Macrolichens have a comparatively larger thallus and a hand lens and stereozoom microscope are generally sufficient for identification of the most common species

Anatomically, if the algae are scattered throughout the medulla of the thallus, the

structure is homoeomerous or unstratified (Figure 2 a) A more complex structure found in the most widespread lichens thalli is heteromerous, where different layers are recognizable: an

upper cortex, a medulla layer and a lower cortex, constituted by fungal pseudo-tissues; and a photobiont layer housed between the upper cortex and the medulla (Figure 2 b)

Figure 2: Structure thallus homoeomerous (a) and heteromerous (b)

Figure 3: Reproductive organs of lichens [7]

8

1.3 Symbiosis

In lichens, the fungus plays a role in water and mineral supply and provides a mechanical protection of the organism The algal partner realizes photosynthesis and provides carbohydrates which are then supplied to the fungus (Figure 4) The fungus consequently produces a variety of secondary metabolites According to the type of carbohydrate provided

to the fungus and fungal metabolism, the final secondary metabolite produced have different patterns Green algae produce polyol (ribitol, erythritol, sorbitol) while cyanobacteria produce simple glucose Besides, cyanobionts are capable of fixing atmospheric nitrogen and to provide fixed-nitrogen to the mycobionts Therefore, cyanolichens have higher nitrogen content than the lichens with only green algae as photobionts [8] As a general trend, these chlorolichens are producing a variety of polyphenolic metabolites while cyanolichens are considered to be devoided of these substances, accumulating high contents of polar compounds including large amounts of polysaccharides

Figure 4: The nutritional exchange between partners of lichens [9]

The mycobiont is firmly connected to the photobiont through haustoria and cannot be easily separated Thalli are generally closely attached to their support but fairly not dependent from the support for nutrients Due to this type of relationship, lichens are eminently successful and enjoy worldwide distribution being encountered in every conceivable habitat and growing

on a variety of substrata: on rock (saxicolous), trees (corticolous), soil (terricolous), wood (lignicolous), leaves (foliicolous), rubber, plastic, glass, etc

9

1.4 Chemical compounds

Compounds produced by lichens fall into two classes: primary metabolites and secondary metabolites Primary metabolites are intracellular products which are directly involved in the metabolic activities of the lichens such as growth, development and reproduction They include proteins, amino acids, polyols and polysaccharides, which are bound to the cell walls and protoplasts They are often water soluble and can be extracted with boiling water The primary metabolites are either of fungal or algal origin or both They are also nonspecific and present

in free-living alga, fungus, higher plants and other organisms

Secondary metabolites are produced by utilising the primary metabolites and are not involved in the direct metabolism of the lichen They are the byproducts of primary metabolism and biosynthetic pathways act as storage substances, some having an important ecological role Secondary metabolites are known to protect lichens against increasing environmental stresses such as light exposure, water potential changes, microbial and herbivore interactions and other changes associated with changes in environmental conditions The secondary metabolites are deposited on the surface of the hyphae rather than within the cells They are called extrolites

as extracellular compounds and popularly described as lichen acids or lichen substances Probable hypothesis of secondary metabolites production is that a fungus undergoes maximum growth when all required nutrients are available in optimal quantities and proportions If one nutrient becomes altered, then primary metabolism is affected and fungal growth is slowed, which may be due to abiotic factors including environmental changes [10] The intermediates of primary metabolism that are no longer needed in the quantity in which they are produced may be shifted to another pathway It is thought that the intermediates may

be used in the secondary metabolic pathways serving as an alternative sink for the extra products of primary metabolism while allowing nutrient uptake mechanisms to continue to operate [11] Thus secondary metabolites are mainly products of an unbalanced primary metabolism resulting from slowed growth, including metabolites that are no longer needed for growth

The detoxification of primary metabolites is another hypothesis that has been proposed

to explain the production of secondary metabolites If growth of the fungus slows down, but metabolism is still very active, toxic products of primary metabolism may accumulate The

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transformation of these into secondary metabolites may be one method to prevent toxic accumulation of byproducts This hypothesis may be integrated within the first hypothesis on slow growth rates to explain the production of secondary compounds by fungi [5]

The chemical aspect of lichen substances was published by Zopf in early 19th century The structure of most lichen substances remained unknown till the studies of Asahina and Shibata in early 20th century The development of TLC and HPLC in 1960s, together with modern spectroscopic methods led to the isolation and identification of many new lichen substances [12], [13] Most lichen substances are phenolic compounds, dibenzofuranes, depsides, depsidones, depsones, lactones, quinones, and pulvinic acid derivatives with more than 1050 secondary metabolites known The lichen substances are synthesised mainly via three metabolic pathways (Figure 5):

- Acetyl-polymalonyl pathway: includes most common lichen substances

(anthraquinones, xanthones, usnic acid, depsidones, depsides, etc.) and about 80% of the secondary metabolites are synthesised through this pathway

- Mevalonic acid pathway: produces about 17% of total compounds including steroids

and triterpenes

- Shikimic acid pathway: very small portion of secondary metabolites are synthesised

by this pathway including terphenylquinones and pulvinic acid derivatives

Figure 5: Probable pathways leading to the major groups of lichen products [14]