Hiệu chỉnh mô hình gây sỏi tiết niệu in vivo và áp dụng để đánh giá tác dụng của các dược liệu ý dĩ, bồ đề, xấu hổ và lâm vồ

Áp dụng mô hình gây sỏi tiết niệu in vivo đã hiệu chỉnh để đánh giá tác dụng ức chế hình thành sỏi tiết niệu của các dược liệu Ý dĩ, Bồ Đề, Xấu hổ và Lâm vồ.. Tinh thể calci oxalat tron

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN VĂN CHIẾN

HIỆU CHỈNH MÔ HÌNH GÂY SỎI TIẾT

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN VĂN CHIẾN

HIỆU CHỈNH MÔ HÌNH GÂY SỎI TIẾT

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực hiện đề tài, tôi đã nhận được sự giúp đỡ rất quý báu và tận tình của các thầy cô, gia đình và bạn bè Và đó thực sự là nguồn động lực, nguồn động viên và khích lệ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Tôi xin bày tỏ lời cám ơn chân thành và lòng biết ơn sâu sắc đến:

o TS Nguyễn Thùy Dương và TS Nguyễn Hoàng Anh – những người

thầy, người cô đã chỉ bảo và định hướng tôi thực hiện đề tài này

o DS Phạm Đức Vịnh – người thầy đã trực tiếp hướng dẫn tận tình

cho tôi, giúp đỡ tôi hoàn thành đề tài

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn đến:

đỡ tôi trong suốt quá trình làm thực nghiệm

o TS Nguyễn Quỳnh Chi, Ths Lê Thanh Bình và các anh chị kĩ thuật

viên Bộ môn Dược liệu, bộ môn Công nghiệp Dược và các anh chị cán bộ Viện Dược liệu, viện Hóa sinh biển – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã

hỗ trợ tôi trong thời gian thực hiện đề tài

tài Khoa học công nghệ cấp tỉnh giai đoạn 2012 – 2013 để tôi thực hiện đề tài

đã tạo điều kiện cho tôi học tập và tích lũy những kiến thức bổ ích trong suốt 5 năm học vừa qua

Lời cuối cùng, tôi xin cảm ơn đến những người thân trong gia đình, những người bạn, anh em đã tận tình giúp đỡ, hỗ trợ và luôn bên cạnh tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu

Hà Nội, tháng 5 năm 2014 Sinh viên

Nguyễn Văn Chiến

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1 Sinh lý bệnh của sỏi tiết niệu 2

1.2 Dự phòng và điều trị bệnh lý sỏi tiết niệu 4

1.2.1 Điều trị ngoại khoa 4

1.2.2 Điều trị nội khoa 4

1.2.3 Dự phòng tái phát 4

1.3 Một số mô hình gây sỏi tiết niệu in vivo 5

1.3.1 Mô hình gây quá bão hòa oxalat niệu 5

1.3.2 Mô hình gây sỏi calci oxalat trên chuột tăng bài tiết calci do di truyền 7 1.3.3 Sử dụng chế độ ăn thiếu hụt pyridoxin 8

1.3.4 Cấy sỏi vào bàng quang 8

1.4 Vài nét về các dược liệu sử dụng trong nghiên cứu 9

1.4.1 Ý dĩ 9

1.4.2 Bồ đề 10

1.4.3 Xấu hổ 12

1.4.4 Lâm vồ 14

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Nguyên liệu nghiên cứu 16

2.2 Phương tiện nghiên cứu 16

2.2.1 Động vật thí nghiệm 16

2.2.2 Hóa chất và thuốc thử 16

2.2.3 Thiết bị và dụng cụ 17

2.3 Nội dung nghiên cứu 17

2.4 Phương pháp nghiên cứu 17

2.4.1 Gây sỏi tiết niệu in vivo trên thực nghiệm và đánh giá tác dụng của chứng dương natri citrat 17

2.4.2 Áp dụng mô hình gây sỏi tiết niệu in vivo đã hiệu chỉnh để đánh giá tác dụng ức chế hình thành sỏi tiết niệu của các dược liệu Ý dĩ, Bồ Đề, Xấu hổ và Lâm vồ 21

2.4.3 Phương pháp xử lý số liệu 22

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 23

3.1 Kết quả phương pháp gây sỏi tiết niệu in vivo trên động vật thực nghiệm 23

3.1.1 Ảnh hưởng của mô hình gây sỏi tiết niệu in vivo đến thể trạng chuột 23

3.1.2 Ảnh hưởng của mô hình gây sỏi tiết niệu in vivo đến khối lượng cơ thể chuột 23

3.1.3 Ảnh hưởng của mô hình gây sỏi tiết niệu in vivo đến một số chỉ số huyết học của động vật thí nghiệm 24

3.1.4 Ảnh hưởng của mô hình gây sỏi tiết niệu in vivo đến một số chỉ số hóa sinh máu của động vật thực nghiệm 25

3.1.5 Ảnh hưởng của mô hình gây sỏi tiết niệu in vivo đến thể tích nước tiểu 25

3.1.6 Ảnh hưởng của mô hình gây sỏi tiết niệu in vivo đến pH nước tiểu 26

3.1.7 Tinh thể calci oxalat trong nước tiểu khi sử dụng mô hình gây sỏi tiết

niệu in vivo 27

3.1.8 Sự lắng đọng tinh thể trong thận khi sử dụng mô hình gây sỏi tiết niệu

in vivo bằng ethylen glycol 0,75% 29

3.2 Kết quả của phương pháp đánh giá tác dụng ức chế tạo sỏi của các dược liệu Ý dĩ, Bồ Đề, Xấu hổ và Lâm vồ 31

3.2.1 Ảnh hưởng của các dược liệu đến thể tích nước tiểu 31

3.2.2 Ảnh hưởng của các dược liệu đến pH nước tiểu 31

3.2.3 Ảnh hưởng của các dược liệu đến số lượng tinh thể calci oxalat trong nước tiểu 32

3.2.4 Tác dụng ức chế sự lắng đọng tinh thể calci oxalat trong thận trên mô hình gây sỏi tiết niệu bằng ethylen glycol 0,75% 35

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 39

4.1 Bàn luận về việc hiệu chỉnh mô hình gây sỏi tiết niệu trên thực nghiệm bằng EG 0,75% 39

4.1.1 Về những thay đổi trong mô hình gây sỏi tiết niệu in vivo 39

4.1.2 Về kết quả hiệu chỉnh mô hình gây sỏi tiết niệu in vivo bằng EG 0,75% 41

4.2 Bàn luận về tác dụng của các dược liệu 44

4.2.1 Về tác dụng của dược liệu Ý dĩ 44

4.2.2 Về tác dụng của các dược liêu khác 45

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 47

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AC: Amoni clorid

ALT: Alanin aminotransferase

AST: Aspartat aminotransferase

CaOx: Calci oxalat

COD: Calci oxalat monohydrat

COM: Calci oxalat dihydrat

EG: Ethylen glycol

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1: Thang điểm phản ánh số lượng tinh thể CaOx trung bình 20

Bảng 3.1: Một số chỉ số huyết học của động vật thực nghiệm của 3 nhóm nghiên cứu trong 4 tuần thí nghiệm 24

Bảng 3.2: Một số chỉ số hóa sinh của động vật thực nghiệm của 3 nhóm nghiên cứu trong 4 tuần thí nghiệm 25

Bảng 3.3: Điểm đánh giá về số lượng tinh thể calci oxalat trong nước tiểu 27

Bảng 3.4: Điểm đánh giá về số lượng ống thận có kết tập sỏi 29

Bảng 3.5: Ảnh hưởng của mô hình nghiên cứu đến thể tích nước tiểu (ml) 31

Bảng 3.6: Ảnh hưởng của các dược liệu đến số lượng tinh thể calci oxalat trong nước tiểu 33

Bảng 3.7: Điểm phản ánh mức độ kết tập sỏi tại thận 35

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1: Cây Ý Dĩ (Coix lachryma-jobi L Poaceae) 10

Hình 1.2: Lá cây bồ đề (Ficus religiosa L.Moraceae) 11

Hình 1.3: Cây xấu hổ (Mimosa pudica L.Mimosaceae) 13

Hình 1.4: Lá cây Lâm vồ (Ficus Rumphii B Moraceae) 14

Hình 2.1: Quy trình gây sỏi tiết niệu 18

Hình 2.2: Quy trình thí nghiệm đánh giá tác dụng của các dược liệu trên mô hình gây sỏi tiết niệu 22

Hình 3.1: Khối lượng cơ thể của chuột của 3 nhóm nghiên cứu trong 28 ngày thí nghiệm 23

Hình 3.2: Ảnh hưởng của mô hình nghiên cứu đến thể tích nước tiểu 26

Hình 3.3: Ảnh hưởng của mô hình nghiên cứu đến pH nước tiểu chuột 26

Hình 3.4: Hình ảnh tinh thể calci oxalat trong nước tiểu ở độ phóng đại x400 28

Hình 3.5: Hình ảnh vi thể thận chuột ở độ phóng đại x100 30

Hình 3.6: Hình ảnh vi thể thận chuột ở độ phóng đại x400 30

Hình 3.7: Ảnh hưởng của từng loại dược liệu đến pH nước tiểu chuột 32

Hình 3.8: Hình ảnh tinh thể calci oxalat trong nước tiểu của 6 lô chuột ở độ phóng đại x400 34

Hình 3.9: Hình ảnh vi thể thận của 6 lô chuột ở độ phóng đại x100 36

Hình 3.10: Hình ảnh vi thể thận của 6 lô chuột ở độ phóng đại x400 37

ĐẶT VẤN ĐỀ

Sỏi tiết niệu là tình trạng sỏi được hình thành trong đường tiết niệu gây tắc nghẽn đường tiết niệu Việt Nam nằm trong vùng vành đai sỏi của thế giới, tỷ lệ mắc sỏi thận từ 2 – 12 % tùy theo từng vùng [9], trong đó tỷ lệ suy thận mạn tiến triển từ bệnh lý sỏi thận chiếm 31 – 44 % [13] Phác đồ điều trị được áp dụng cho từng trường hợp dựa vào vị trí, kích thước của sỏi, chức năng thận và sức khỏe của bệnh nhân Trong khi các thuốc hóa dược còn nhiều hạn chế về hiệu quả, điều trị ngoại khoa mặc dù cho hiệu quả cao nhưng có khả năng gây tai biến và tỷ lệ tái phát sỏi cao

Việt Nam có nguồn dược liệu đa dạng, phong phú với nhiều cây thuốc, bài

thuốc đã được sử dụng để điều trị sỏi tiết niệu Qua một số nghiên cứu sàng lọc in

vitro, đã phát hiện được các dược liệu có tác dụng ức chế hình thành tinh thể sỏi

CaOx Trong đó Ý dĩ, Bồ đề, Xấu hổ và Lâm vồ là các dược liệu có tiềm năng [4], [6], [7], [12], [16] Các dược liệu trên đã được phối hợp trong một bài thuốc dân

gian đã được tác giả Nguyễn Thị Hải đánh giá tác dụng ức chế sỏi tiết niệu in vivo

và đã cho kết quả bước đầu [5] Tuy nhiên, bài thuốc được đánh giá trên mô hình thực nghiệm tác giả Phạm Đức Vịnh đã triển khai tại bộ môn Dược lực, Trường đại học Dược Hà Nội vẫn còn một số hạn chế do sử dụng chứng dương chưa phù hợp

và độc tính của tác nhân gây sỏi trên động vật thực nghiệm [15] Với mong muốn khắc phục được những nhược điểm trên để xây dựng một mô hình gây sỏi tiết niệu

ổn định, phù hợp cho phép đánh giá chính xác tác dụng của các dược liệu Ý dĩ, Bồ

đề, Xấu hổ và Lâm vồ, chúng tôi thực hiện đề tài: “Hiệu chỉnh mô hình gây sỏi tiết

niệu in vivo và áp dụng để đánh giá tác dụng của các dược liệu Ý dĩ, Bồ đề, Xấu

hổ và Lâm vồ” với hai mục tiêu:

1 Hiệu chỉnh mô hình gây sỏi tiết niệu trên động vật thực nghiệm bằng ethylen glycol

2 Đánh giá tác dụng của các dược liệu Ý Dĩ, Bồ Đề, Xấu hổ và Lâm vồ trên mô hình gây sỏi tiết niệu bằng ethylen glycol đã hiệu chỉnh

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Sinh lý bệnh của sỏi tiết niệu

Sỏi tiết niệu là tình trạng bệnh lý thường gặp trong các bệnh lý đường tiết niệu Mặc dù đã được đề cập đến từ rất lâu trong các y văn, nhưng quá trình hình thành sỏi tiết niệu hiện chưa được hiểu biết đầy đủ Sỏi tiết niệu do nhiều nguyên nhân và nhiều quá trình phức tạp gây nên [13] Hai thuyết chính được đưa ra hiện nay để giải thích quá trình hình thành sỏi là: thuyết “hạt tự do” (free partical) và thuyết “hạt cố định” (fixed partical) [9]

- Thuyết “hạt tự do” cho rằng: hạt khởi đầu được hình thành ở ngoài tế bào (trong lòng ống thận) do hiện tượng tăng bài tiết các chất hòa tan vào nước tiểu tới mức quá bão hòa, gây kết tinh thành các tinh thể Các tinh thể trong nước tiểu sẽ dính vào nhau để tạo thành nhân, các nhân mới tiếp tục kết tập để tạo thành hạt lớn hơn Các hạt sỏi này trôi theo dòng nước tiểu và bị “bẫy” lại ở các vị trí hẹp của đường tiết niệu Tại các vị trí này, chúng tiếp tục kết tập thêm các tinh thể và lớn dần lên để tạo thành sỏi

- Thuyết “hạt cố định” cho rằng: quá trình hình thành sỏi khởi đầu bằng sự lắng đọng các muối trong các mô kẽ thận hoặc trong các tế bào ống thận Các mô và các tế bào này bị phá hủy và làm bộc lộ ra các tinh thể Các tinh thể này trở thành nhân gắn với một vị trí ở ống thận hoặc mô thận Các nhân này lớn dần lên do sự kết tập liên tục các tinh thể, rồi sau đó bong ra theo dòng nước tiểu Các hạt sỏi này

bị “bẫy” lại ở các vị trí hẹp ở đường tiết niệu và tiếp tục lớn lên để trở thành sỏi

Tuy mỗi thuyết nhấn mạnh đến vị trí và cơ chế khởi đầu của quá trình tạo sỏi khác nhau, nhưng quá trình hình thành sỏi tiết niệu có thể tóm lại thành 3 giai đoạn chính:

Giai đoạn 1: Quá trình quá bão hòa các chất hòa tan trong nước tiểu

Nước tiểu trở nên quá bão hòa khi nồng độ các ion hòa tan của một chất trong nước tiểu vượt quá giới hạn hòa tan của chất đó Sự quá bão hòa các chất hòa tan trong nước tiểu là động lực cho sự kết tinh của tinh thể Việc tăng bài tiết một số chất hòa tan như calci, oxalat, phosphat …trong nước tiểu gây quá bão hòa và các

chất hòa tan này sẽ kết tinh lại thành các tinh thể trong nước tiểu [9], [33], [53] Trong nước tiểu bình thường có các chất ức chế như citrat, magnesi …có thể làm tăng mức độ bão hòa của các muối calci trong nước tiểu [9], [17] Khi các chất này không hoạt động hoặc nồng độ các chất này giảm xuống trong nước tiểu sẽ dẫn đến

sự bão hòa các chất hòa tan trong nước tiểu và hình thành nên các tinh thể

Giai đoạn 2: Quá trình hình thành các hạt sỏi tiết niệu

Sự tạo nhân: Quá trình này bắt đầu khi các tinh thể muối kết hợp với nhau

trong nước tiểu tạo thành nhân Sự kết tập tiếp tục diễn ra ngay cả khi nồng độ các chất hòa tan thấp hơn nồng độ xảy ra quá trình kết tinh ban đầu [17] Các hạt nhân

có thể hình thành trong ống thận, trên tế bào hoặc bên ngoài tế bào [17], [53] Nhân được hình thành trên một bề mặt gọi là nhân hỗn tạp [17] Tổn thương tế bào ống thận cũng thúc đẩy quá trình kết tinh và hình thành hạt nhân do đã tạo ra những trung tâm để hình thành nên các hạt nhân hỗn tạp này [17]

Sự lớn lên của nhân: Hạt nhân lớn dần lên do 2 quá trình: các ion từ dung

dịch gắn trực tiếp vào hạt nhân và sự kết tập của những tinh thể hoặc các hạt nhân

tự do trong nước tiểu với các hạt nhân hỗn tạp [9], [17], [53] Quá trình này bị ảnh hưởng bởi nhiều chất có trong nước tiểu Sự tồn tại của “chất kết dính sinh học” như các mucoid không đặc hiệu, các mucoprotein đặc hiệu, và dạng polymer của mucoprotein Tamm-Horsfall, các chất kết dính này làm chậm di chuyển của các tinh thể và các nhân con gây kết tập chúng vào nhau và vào nhân hỗn tạp [9], [17]

Giai đoạn 3: Quá trình gắn các tinh thể sỏi vào mô thận

Cơ chế tương tác giữa tế bào và tinh thể sỏi rất phức tạp, hiện chưa được hiểu biết đầy đủ Quá trình gắn của các hạt được hình thành trước đó vào các tế bào biểu mô ống thận có thể do tương tác vật lý, trong đó, các hạt sỏi trong nước tiểu bị

“bẫy” lại tại các vị trí hẹp ở đường tiết niệu, gắn và tiếp tục phát triển lớn lên [9], [53] Quá trình gắn được thúc đẩy bởi một số phân tử như hyaluronan, nucleolin, annexin II, và osteopontin [53]

1.2 Dự phòng và điều trị bệnh lý sỏi tiết niệu

1.2.1 Điều trị ngoại khoa

Việc chỉ định điều trị ngoại khoa và phương pháp ngoại khoa áp dụng phụ thuộc vào vị trí, kích thước của sỏi, tình trạng chức năng thận và thể trạng của bệnh nhân [9], [13], [37] Đối với những sỏi có đường kính > 5mm khó lọt qua niệu quản và/hoặc bất kì dấu hiệu nào của sự tắc nghẽn đường tiết niệu do sỏi, nhất là sỏi đã gây tắc nghẽn làm giãn đài bể thận độ 2 trở lên thì cần phải can thiệp ngoại khoa [9] Một số phương pháp ngoại khoa có thể sử dụng là tán sỏi ngoài cơ thể, nội soi lấy sỏi, loại sỏi bằng laze, hoặc tán sỏi qua da… [9], [37], [52]

1.2.2 Điều trị nội khoa

- Thuốc tống sỏi ra ngoài cơ thể: các nghiên cứu gần đây đã cho thấy thuốc chẹn kênh calci và thuốc chẹn β giao cảm là những thuốc có tiềm năng trong điều trị sỏi tiết niệu Trong đó, thuốc chẹn kênh calci có tác dụng làm giãn cơ trơn, chống

co thắt niệu quản Một số thuốc giãn cơ trơn khác được sử dụng như thuốc chẹn α giao cảm, kích thích chọn lọc α1 [9], [37], [47] Bên cạnh đó, có thể sử dụng một số thuốc có nguồn gốc dược liệu như nước nụ vối Hiệu quả của nước nụ vối đã được

chứng minh trong một số nghiên cứu in vitro và in vivo [9]

- Thuốc giảm đau được sử dụng làm giảm các triệu chứng của bệnh nhân Trong đó, các thuốc giảm đau chống viêm không steroid (NSAIDs) như meloxicam, diclofenac… được sử dụng là lựa chọn đầu tay để giảm đau cho bệnh nhân Các thuốc giảm đau trung ương như morphin, codein…cũng có thể được sử dụng khi các NSAIDs không hiệu quả [13], [67]

- Kháng sinh: được sử dụng khi có sỏi struvit hoặc sỏi tiết niệu kèm theo nhiễm khuẩn [9], [67]

- Các thuốc điều trị biến chứng (nếu có) như đái máu, suy thận… [9], [13]

1.2.3 Dự phòng tái phát

Chế độ ăn, uống

Ở những bệnh nhân không có nguy cơ cao, kiểm soát chế độ ăn và lượng nước uống hàng ngày có thể là đủ để dự phòng tái phát sỏi tiết niệu [9], [37], [67]

- Uống nhiều nước để đảm bảo thể tích nước tiểu 24 giờ tối thiểu là 2 lít

- Chế độ ăn nhiều rau và chất xơ, hạn chế protein (0,8 - 1g/kg), muối (<3g/ngày), các thức ăn giàu oxalat như bột mì, cacao và chè xanh

- Đối với bệnh nhân sỏi urat, hạn chế thức ăn giàu acid uric (gan, thận, một

số loại cá… )

Chế độ dùng thuốc

Trong trường hợp đã điều chỉnh chế độ ăn và lượng nước uống thích hợp nhưng chưa đủ để kiểm soát sự tái phát sỏi tiết niệu, hoặc những bệnh nhân có nguy cơ tái phát cao, cần kết hợp sử dụng thêm các thuốc như: lợi tiểu thiazid, natri citrat, orthophosphat …[9], [37], [67] Có thể dự phòng tái phát bằng việc sử dụng một số dược liệu hoặc bài thuốc cổ truyền như bài thuốc thạch kim thang [14]

1.3 Một số mô hình gây sỏi tiết niệu in vivo

Đã có rất nhiều mô hình nghiên cứu gây sỏi tiết niệu thực nghiệm được thực hiện trên thế giới Các mô hình này cho phép tìm hiểu sâu hơn về cơ chế bệnh sinh cũng như các thuốc và các phương pháp trong điều trị bệnh lý sỏi tiết niệu Mặc dù thỏ và chó đã được sử dụng trong một số nghiên cứu [54], [70], song chuột là động

vật được sử dụng phổ biến nhất trong các mô hình gây sỏi tiết niệu in vivo [21],

[30], [46], [51], [57], [58], [66] Kết quả các nghiên cứu cho thấy rất giống nhau về bản chất và thành phần của sỏi tiết niệu giữa người và chuột Hơn nữa, quá trình lắng đọng sỏi trong thận cũng tương tự giữa người và chuột khi được gây tăng nhẹ oxalat niệu [41] Như vậy, các mô hình gây sỏi tiết niệu thực nghiệm bằng việc gây tăng oxalat niệu trên chuột là phù hợp để cho phép tìm hiểu sâu hơn về bệnh lý sỏi

tiết niệu in vivo

1.3.1 Mô hình gây quá bão hòa oxalat niệu

Đây là mô hình gây sỏi tiết niệu thực nghiệm trên động vật hay được sử dụng nhất hiện nay

1.3.1.1 Nguyên tắc

Sử dụng các hóa chất (các tiền chất của oxalat) để gây tăng nồng độ oxalat trong nước tiểu như EG [19], [21], [45], [48], [51], [56], [58], [66], natri oxalat [46], amoni oxalat [46], hydroxy-L-prolin [42], acid glycolic và muối glyoxylat [49] qua thức ăn, nước uống, cho uống bằng ống thông vào dạ dày hoặc tiêm màng bụng Các tiền chất của oxalat khi vào cơ thể bị chuyển hóa tại gan tạo thành oxalat Oxalat bài tiết ra nước tiểu gây quá bão hòa oxalat nước tiểu và tạo ra các tinh thể calci oxalat (CaOx) niệu - đây là bước quan trọng cho sự hình thành tinh thể CaOx

- Kết hợp với chế độ ăn thiếu hụt magnesi [55], [61]: các nghiên cứu cho thấy, chế độ ăn thiết hụt magnesi có tác dụng làm tăng lắng đọng sỏi trong thận Khi

có mặt của magnesi oxyd (MgO), mức độ lắng đọng sỏi trong thận giảm đi rõ rệt so với chế độ ăn không có MgO

CaOx, các chỉ số hóa sinh nước tiểu Kết thúc thí nghiệm, thu tất cả thận để làm tiêu bản mô bệnh học nhằm đánh giá mức độ kết tập sỏi CaOx tại thận

Để nghiên cứu tác dụng dự phòng của thuốc, chuột được chia thành lô chứng trắng, lô chứng bệnh và lô điều trị Cả lô chứng bệnh và lô điều trị đều được gây sỏi bằng cách cho chuột uống hóa chất gây sỏi, lô điều trị được uống thêm thuốc cần nghiên cứu So sánh lô điều trị và lô chứng bệnh để đánh giá hiệu quả của thuốc trong dự phòng sỏi tiết niệu Mô hình này đã được áp dụng để nghiên cứu tác dụng

dự phòng sỏi tiết niệu của dịch chiết các dược liệu như Cynodon dactylon [39],

Flos carthami [45], Solanum xanthocarpum [51]…

Để nghiên cứu tác dụng hòa tan sỏi tiết niệu của thuốc, chuột được chia thành 3 lô như trên, tuy nhiên, lô điều trị được sử dụng hóa chất gây sỏi để gây sỏi tiết niệu trước, sau đó mới cho sử dụng thuốc cần nghiên cứu trong thời gian thích hợp Mô hình này đã được áp dụng để nghiên cứu tác dụng hòa tan sỏi tiết niệu của

dịch chiết các dược liệu Cynodon dactylon [39], Petroselinum sativum [56]…

1.3.2 Mô hình gây sỏi calci oxalat trên chuột tăng bài tiết calci do di truyền

1.3.2.1 Nguyên tắc

Bằng việc lai tạo qua nhiều thế hệ chuột, Bushinsky và các cộng sự đã lai tạo thành công một chủng chuột bài tiết calci niệu với số lượng gấp từ 8 – 10 lần so với chủng chuột bình thường Giống chuột này được sử dụng trong các mô hình để đánh giá tác dụng một số thuốc điều trị sỏi thận do tăng calci niệu và sinh lý bệnh tăng calci niệu di truyền [28], [29]

1.3.2.2 Thiết kế thí nghiệm

Để gây sỏi CaOx, nhóm chuột tăng bài tiết calci niệu được cho ăn thức ăn chứa thêm hydroxy L - prolin trong vòng 18 tuần để gây sỏi calci oxalat Mẫu nước tiểu được thu gom 2 tuần một lần để làm các xét nghiệm hóa sinh Kết thúc thí nghiệm, thu thận để làm xét nghiệm mô bệnh học nhằm đánh giá sự kết tập sỏi CaOx tại thận

Mô hình này đã được áp dụng để nghiên cứu tác dụng của một số thuốc điều trị sỏi tiết niệu như cinacalcet [30], thiosulfat [22], thiazid [28]

1.3.3 Sử dụng chế độ ăn thiếu hụt pyridoxin

1.3.3.1 Nguyên tắc

Vitamin B6 (pyridoxin) ức chế enzym oxy hóa các tiền chất oxalat như glycin, glyoxylat thành oxalat Khi thiếu vitamin B6, quá trình tổng hợp oxalat nội sinh tăng lên, oxalat tăng bài tiết ra nước tiểu kết hợp với calci hình thành các tinh thể calci oxalat [68]

1.3.3.2 Thiết kế thí nghiệm

Động vật được chia thành 3 lô: lô chứng trắng, lô chứng bệnh và lô thử Cả 3

lô được cho ăn với chế độ hoàn toàn thiếu hụt vitamin B6 Lô chứng trắng được bổ sung thêm 6mg/kg vitamin B6 vào thức ăn hàng ngày Lô thử được sử dụng thêm thuốc cần nghiên cứu Thời gian thí nghiệm kéo dài 12 tuần Tiến hành lấy mẫu nước tiểu và mẫu thận ở cuối thí nghiệm để xét nghiệm các chỉ số hóa sinh nước tiểu, đánh giá sự kết tập sỏi calci oxalat trong thận [68]

Mô hình gây sỏi tiết niệu bằng chế độ ăn thiếu hụt vitamin B6 đã được áp dụng trong nghiên cứu tác dụng dự phòng sỏi tiết niệu của pentosan polysulfat [68]

1.3.4 Cấy sỏi vào bàng quang

1.3.4.1 Nguyên tắc

Tạo hạt sỏi calci oxalat in vivo rồi đưa vào bàng quang của chuột thông qua phẫu thuật để gây sỏi bàng quang [32]

1.3.4.2 Thiết kế thí nghiệm

Tạo hạt sỏi calci oxalat in vitro bằng phản ứng kết tủa giữa dung dịch natri

oxalat và calci clorid ở nồng độ thích hợp Những tinh thể nhỏ được tách khỏi dung dịch và tạo quá trình kết tập bằng cách duy trì trạng thái ổn định ở 37oC trong vòng

2 tuần Hạt sỏi CaOx được tạo ra có đường kính khoảng 4 mm Cấy hạt sỏi CaOx vào bàng quang của chuột thông qua phẫu thuật mở bàng quang Tất cả chuột sau phẫu thuật cấy sỏi được chia thành hai lô: lô chứng bệnh và lô thử Sau thời gian thí nghiệm, lấy mẫu máu và mẫu nước tiểu để xét nghiệm các chỉ số hóa sinh, đồng thời lấy sỏi ra từ bàng quang để phân tích kích thước, hình thái và thành phần cấu

tạo So sánh lô thử với lô chứng bệnh để đánh giá tác dụng hòa tan sỏi tiết niệu của

thuốc [32]

Mô hình gây sỏi tiết niệu bằng cách cấy sỏi trực tiếp vào bàng quang của chuột cống trắng được áp dụng để nghiên cứu tác dụng hòa tan sỏi tiết niệu của dịch

chiết dược liệu chó đẻ răng cưa (Phyllanthus niruri) [32]

1.4 Vài nét về các dược liệu sử dụng trong nghiên cứu

1.4.1 Ý dĩ

Tên khác: Cườm – gạo, tên tiếng anh là Job’tears

- Tên khoa học: Coix lachryma-jobi L họ lúa, Poaceae

Ý dĩ mọc tự nhiên, phân bố rải rác ở một số tỉnh vùng núi phía bắc như Lào Cai, Hà Giang, Lai Châu… Cây thường mọc gần nguồn nước, dọc bờ khe suối ở cửa rừng hay trong thung lũng [3], [8]

Hình 1.1: Cây Ý Dĩ (Coix lachryma-jobi L Poaceae)

(chụp tại ngoại thành Hà Nội tháng 7-2011)

- Tác dụng:

Hạt Ý dĩ có tác dụng ức chế tế bào ung thư [1], [2]

Lá và rễ có tác dụng chống viêm [1]

Hạt và thân cây có tác dụng điều trị đái tháo đường type 2 [44]

Thân Ý dĩ có tác dụng in vitro làm giảm sự hình thành sỏi calci oxalat, làm

tăng tỷ lệ COD/COM [12], [16]

- Công dụng:

Ý dĩ đã được sử dụng trong các bài thuốc Y học cổ truyền để chữa tiểu tiện

ra sỏi, chữa bệnh phổi, nôn ra máu, chữa lao lực và chữa tê thấp Ý dĩ khi dùng chín

có tác dụng lợi tiểu tiện, chữa tả lỵ, chữa gân co quắp không duỗi ra được, phong thấp lâu ngày [11]

1.4.2 Bồ đề

Tên khác: Đa hay đa bồ đề

- Tên khoa học: Ficus religiosa L họ Dâu tằm, Moraceae

- Đặc điểm thực vật và phân bố:

Bồ đề là cây gỗ lớn, hoàn toàn nhẵn Lá màu xanh đậm, có kích thước 10 –

18 x 7,5 x 10 cm, hình thoi – tam giác, cụt hay hơi hình tim ở gốc, hầu như tù và đột

nhiên thu hẹp dần ở đuôi có chóp dài 2 – 3 cm, mỏng, giòn Có khoảng 5 đến 7 gân

lá ở trên mỗi nửa lá Cuống mảnh, dài 5 – 8 cm Hoa đực mọc ở kẽ gần đỉnh ngọn

và không cuống, đài hoa gồm 2 – 3 thùy, có 1 nhị nhỏ và ngắn Hoa cái không cuống, đài hoa có 4 thùy, bầu nhụy hình cầu Quả dạng sung, xếp 1 – 2 cái trên các nhánh có lá, không cuống, hình cầu đường kính 7 - 8mm, lúc chín có màu đỏ đậm [3], [8], [73]

Mùa hoa quả vào khoảng tháng 1 – 4

Cây Bồ Đề phân bố ở các nước cận nhiệt đới và nhiệt đới, chủ yếu ở các nước châu Á như: Ấn Độ, Trung Quốc, Việt Nam Cây thường được trồng ở các chùa, các chợ và công viên [3], [8], [73]

Hình 1.2: Lá cây bồ đề (Ficus religiosa L.Moraceae)

(chụp tại ngoại thành Hà Nội tháng 7-2011)

- Tác dụng:

Vỏ làm săn da; Quả có tác dụng nhuận tràng, làm toát mồ hôi, chấn kinh; Hạt

có tác dụng thanh nhiệt; Lá và nhánh non gây xổ Nước chiết vỏ có tác dụng ngăn

cản hoạt động của các vi khuẩn tụ cầu (Staphylococcus) và Escherichia coli [3]

Một nghiên cứu tổng quan [60] cho thấy Bồ đề có khoảng 50 tác dụng in vivo hoặc in vitro khác nhau như chống co giật, hạ đường huyết, chống viêm giảm đau,

làm lành vết thương, kháng khuẩn, kháng virus, chống oxy hóa [62], sỏi tiết niệu [6], [24]…

- Công dụng:

Vỏ thân được dùng ở Trung Quốc làm thuốc súc miệng chữa đau răng và làm chắc răng Ở Ấn Độ, người ta dùng vỏ trị bệnh lậu, nước pha vỏ cây dùng đường uống để trị ghẻ [3], [11] Ở Việt Nam, người dân thường dùng vỏ cây nấu thành nước rửa, chữa lở loét và bệnh ngoài da Quả (cụm hoa) dùng để giải nhiệt, làm dễ tiêu hóa; hạt giúp giải khát Lá và nhánh non gây tẩy, nhưng dịch lá tươi chữa được

ỉa chảy [3]

Dịch chiết cồn 70o của Bồ đề có tác dụng ức chế hình thành tinh thể CaOx và

làm tăng tỷ lệ COD/COM trên in vitro [4], [7], [12]

1.4.3 Xấu hổ

Tên khác: Trinh nữ, Cây mắc cỡ, Cây thẹn

- Tên khoa học: Mimosa pudica L họ Trinh nữ, Mimosaceae

- Đặc điểm thực vật và phân bố:

Cây nhỏ, phân nhiều nhánh, mọc thành bụi, lòa xòa trên mặt đất, cao khoảng

50 cm, thân có nhiều gai hình móc Lá kép lông chim hai lần, cuống phụ xếp hình chân vịt, khi đụng chạm nhẹ thì lá cụp xẹp lại, hoặc buổi tối cũng cụp lại Lá chét nhỏ gồm 12 – 14 đôi Hoa nhỏ, màu tím nhạt, tụ lại thành hình đầu Quả giáp nhỏ, dài khoảng 2 cm, rộng 2 – 3mm, tụ lại thành hình ngôi sao, có lông cứng, hạt nhỏ, dẹt dài khoảng 2mm, rộng 1 – 1,5mm [3], [11], [18], [23]

Mùa hoa vào khoảng tháng 6 - 8

Cây xấu hổ mọc hoang nhiều nơi ở nước ta như ven đường, bờ ruộng, trên đồi và ở những nơi có không gian mở [18]

Hình 1.3: Cây xấu hổ (Mimosa pudica L.Mimosaceae)

(chụp tại ngoại thành Hà Nội tháng 7-2011)

- Bộ phận dùng: Toàn bộ cả cây, lá hoặc rễ [18], [23]

- Thành phần hóa học:

Các nghiên cứu về các hợp chất hóa học có hoạt tính sinh học trong Bồ đề cho thấy sự có mặt của các chất: alkaloid, amino acid không protein (mimosin), các flavonoid C-glycosid, sterol, terpenoid, tanin và các acid béo [18], [23]

Hạt chứa chất nhầy, lá chiết ra một chất tương tự adrenalin Trong lá và quả đều có selen

- Tác dụng:

Theo các nghiên cứu in vivo, Xấu hổ có những tác dụng như: chữa lành vết

thương, tái sinh lại dây thần kinh hông, chống trầm cảm, chống co giật, lợi tiểu, tăng đường huyết, cầm máu cổ tử cung, chống oxy hóa và giải độc gan, giải độc, kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus….[18], [23]

Phần trên mặt đất có tác dụng ức chế hình thành sỏi urat và có tác dụng lợi tiểu [20, 69]

Tác dụng ức chế thần kinh trung ương, chấn kinh, giảm đau và giải độc acid asenic [11]

Nghiên cứu in vitro cũng cho thấy, Xấu hổ có tác dụng chuyển dạng tinh thể

CaOx rất mạnh từ dạng COM sang dạng COD, làm tăng tỷ lệ COD/COM [12]

- Công dụng:

Theo Y học cổ truyền, Xấu hổ được sử dụng để điều trị trĩ, tiêu chảy, táo bón dai dẳng và điều trị các bệnh phụ khoa [18], [23], dùng làm thuốc ngủ, dịu dây thần kinh và chữa nhức xương [11]

Trong y học hiện đại: Xấu hổ được sử dụng trong điều trị các bệnh xuất huyết, tiêu chảy và các bệnh phụ khoa [18], [23]

Lá cây Xấu hổ kết hợp các lá dược liệu khác điều trị nhiễm khuẩn tiết niệu

và xuất huyết Rễ cây sắc để điều trị bệnh lỵ, sốt, giang mai, bệnh phong, côn trùng cắn, mất ngủ, căng thẳng….[18], [23]

1.4.4 Lâm vồ

Tên khác: Lâm vồ hay Đa bồ đề

- Tên khoa học: Ficus rumphii B họ Dâu tằm, Moraceae

- Đặc điểm thực vật:

Cây gỗ lớn, có nhánh to, dày khoảng 5 cm, rất nhẵn, vỏ mốc trắng Lá hình tam giác cụt, có khi hơi thót lại ở cuống, có mũi nhọn hình tam giác và sắc dài 1 cm, màu lục nhạt ở cả hai mặt, dài 8 – 15cm, rộng 6 – 11 cm, gân gốc 5; cuống lá mảnh, dài 3 – 5 cm, quả sung xếp từng cặp trên những nhánh có lá, không có cuống, hình cầu, đường kính 7 – 12 mm, khi chín màu đỏ sẫm [3], [73]

Loài phân bố trong vùng Ấn độ - Malaysia, các tỉnh phía Nam từ Quảng Trị vào Bình Thuận, Ninh Thuận [3], [73]

Hình 1.4: Lá cây Lâm vồ (Ficus Rumphii B Moraceae)

(http://www.hkwildlife.net/)

- Bộ phận dùng: Cành, nhựa, quả [3]

- Thành phần hóa học:

Trong vỏ cây, người ta mới phân lập đươc được sự có mặt của 2 chất là β – sitosterol, 3’ – methoxyflavon – 3 – glucosid [25] Nghiên cứu mới đây về thành phần hóa học của cây Lâm vồ cho thấy, lá cây Lâm vồ có chứa triterpenoid, flavonoid, đường khử và acid amin [10]

- Tác dụng:

Nhựa cây gây nôn, sát trùng; vỏ có tác dụng chống độc [3]

Ở Việt Nam cho đến nay mới có một số đề tài nghiên cứu về tác dụng

in vitro của lá cây Lâm vồ trên sỏi CaOx Kết quả cho thấy dich chiết nước có tác

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu nghiên cứu

 Dược liệu nghiên cứu:

− Thân cây Ý dĩ (Coix lachryma-jobi L.Poaceae)

− Lá cây Bồ đề (Ficus religiosa L.Moraceae)

− Bộ phận trên mặt đất của cây Xấu hổ (Mimosa pudica L.Mimosaceae)

− Lá cây Lâm vồ (Ficus rumphii B.Moraceae)

Các dược liệu được thu hái ở ngoại thành Hà Nội vào tháng 10 năm 2012 và được xác định tên khoa học bởi tiến sĩ Trần Thế Bách (Viện Sinh Thái Tài Nguyên Sinh Vật – Viện Khoa Học Việt Nam) Dược liệu được rửa sạch, cắt nhỏ, phơi sấy khô, cắt, tán nhỏ

 Chuẩn bị dịch chiết dược liệu:

Dịch chiết của từng dược liệu được chuẩn bị bằng phương pháp ngâm lạnh với dung môi là ethanol 70o Ngâm lạnh 48 giờ đầu thu được dịch chiết lần 1 Lần thứ 2 và thứ 3 cũng ngâm lạnh với cồn 70º và tiến hành rút dịch chiết sau 24 giờ Gộp dịch chiết, lọc qua giấy lọc 0,45 µm, cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm, tiếp tục tiến hành cô dịch chiết được cao lỏng 3:1 Các dịch chiết của từng dược liệu đem thử tác dụng sinh học

2.2 Phương tiện nghiên cứu

2.2.1 Động vật thí nghiệm

Chuột cống trắng sáu tuần tuổi, giống đực, cân nặng khoảng 110 ± 20 gam,

do Học viện quân y cung cấp

Động vật được nuôi ổn định với điều kiện phòng thí nghiệm đến cân nặng khoảng 140 ± 20 gam trước khi thực hiện nghiên cứu, động vật được cho ăn bằng thức ăn tiêu chuẩn do Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương cung cấp, uống nước tự do

2.2.2 Hóa chất thuốc thử

- Ethylen glycol ( ), 1,111 – 1,115g/ml (Xilong chemical)

- Natri citrat (C6H5Na3O7), 99,9 - 100,1 % (Merck)

- Các dung môi, hóa chất và thuốc thử khác đạt tiêu chuẩn phân tích

2.2.3 Thiết bị và dụng cụ

- Máy cất nước 2 lần Hamillton của hãng Hamillton Laboratory Glas Limited

- Kính hiển vi kết nối máy ảnh của hãng Laica

- Máy đo PH Euteck instrument pH 510

- Máy li tâm HERMLE Z300

- Máy cất quay Buchi Rotavapor R210

- Tủ sấy chân không Heraeus-instrument vacutherm-Kelvitront

- Cân kĩ thuật Precisa-BJ610C, TE 412 (Sartorius)

- Cân phân tích AY220 (Shimadzu)

- Dụng cụ hứng nước tiểu

- Các dụng cụ khác sử dụng trong quá trình lấy mẫu và xét nghiệm như : micropipet, ống nghiệm, đầu côn các loại…

2.3 Nội dung nghiên cứu

- Hiệu chỉnh mô hình gây sỏi tiết niệu thực nghiệm bằng ethylen glycol

- Đánh giá tác dụng của các dược liệu Ý dĩ, Bồ đề, Xấu Hổ và Lâm vồ trên

mô hình gây sỏi tiết niệu bằng ethylen glycol đã hiệu chỉnh

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Gây sỏi tiết niệu in vivo trên thực nghiệm và đánh giá tác dụng của chứng

dương natri citrat

Hiệu chỉnh mô hình gây sỏi tiết niệu thực nghiệm bằng EG đã được thực hiện bởi tác giả Phạm Đức Vịnh:

- Về tác nhân gây sỏi: sử dụng EG đơn độc thay cho EG kết hợp với AC

- Về nồng độ chất gây sỏi: sử dụng EG 0,75%, đây là nồng độ thấp hơn so với nồng độ EG được sử trong nghiên cứu triển khai là 1%

- Về động vật thí nghiệm: chỉ sử dụng chuột cống trắng giống đực, không sử dụng chuột cống trắng giống cái

- Về thời gian gây sỏi: 4 tuần, điều này không có thay đổi so với nghiên cứu triển khai trước đó

2.4.1.1 Thiết kế thí nghiệm

Chuột đực cống trắng được chia ngẫu nhiên thành 3 lô:

Lô bình thường: cho chuột ăn, uống chế độ bình thường Thường ngày cho chuột uống nước cất 1ml/100g chuột

Lô EG 0,75%: cho chuột uống dung dịch EG 0,75% thay cho nước uống hàng ngày Thường ngày cho chuột uống nước cất 1ml/100g chuột

Lô EG 0,75% + citrat: tương tự như lô 2, tuy nhiên thay nước cất bằng dung dịch natri citrat 25% (kl/tt) với liều 2,5g/kg chuột, thể tích natri citrat uống là 1ml/100g chuột

Chuột uống nước cất và natri citrat vào cùng một thời điểm trong ngày trong suốt quá trình thí nghiệm

Thí nghiệm được tiến hành trong 28 ngày

Kết thúc thí nghiệm, thu nước tiểu 5h, lấy máu làm xét nghiệm huyết học và sinh hóa máu, giải phẫu thận làm mô bệnh học

Quy trình nghiên cứu được mô tả ở hình 2.1:

Hình 2.1: Quy trình gây sỏi tiết niệu

2.4.1.2 Các thông số đánh giá

 Khối lượng cơ thể và thể trạng chuột

Tất cả chuột được theo dõi khối lượng vào thời điểm trước ngày bắt đầu thí nghiệm và hàng tuần sau khi thí nghiệm bắt đầu

Thể trạng của chuột (bao gồm lượng thức ăn, lượng nước tiêu thụ, hoạt động của chuột, các dấu hiệu bất thường trên chuột) cũng được theo dõi chặt chẽ trong thời gian nghiên cứu

 Các thông số huyết học

Lấy máu chuột từ xoang hốc mắt bằng ống mao quản vào ống nghiệm chứa chất chống đông Xác định các thông số: số lượng hồng cầu (RBC), nồng độ hemoglobin (HGB), tỷ lệ hematocrit (HCT), số lượng tiểu cầu (PLT), số lượng bạch cầu (WBC) tại bệnh viện Bạch Mai

 Các thông số hóa sinh máu

Lấy máu từ xoang hốc mắt của chuột bằng ống mao quản vào ống nghiệm không chứa chất chống đông Để lắng tự nhiên ở nhiệt độ phòng trong vòng 1 giờ Sau đó, ly tâm ở tốc độ 3000vòng/phút trong 15 phút để lấy huyết thanh Xác định các thông số nồng độ creatinin (Cr), ALAT, ASAT huyết thanh tại bệnh viện Bạch Mai

 Thể tích nước tiểu

Nước tiểu 5 giờ được lấy vào ngày trước ngày kết thúc thí nghiệm thông qua lồng hứng nước tiểu Rút thức ăn trong quá trình lấy mẫu Vào thời điểm ban đầu, cho chuột uống nước hoặc thuốc đối chiếu natri citrat đã được quy định theo lô Sau

đó, cứ mỗi 2h cho chuột uống loại nước tương ứng với từng lô (nước hoặc EG 0,75%) với thể tích 1ml/100g chuột Nước tiểu ngay sau đó được xác định thể tích bằng ống đong

 pH nước tiểu

pH nước tiểu của từng chuột được xác định ngay sau khi thi gom nước tiểu

 Tinh thể niệu

Ngay sau khi thu gom, lấy 2ml nước tiểu đem ly tâm với tốc độ 3000 vòng/phút trong 10 phút Loại bỏ 1,7ml dung dịch phía trên Phần còn lại được làm đồng đều, sau đó đưa lên phiến kính và soi bằng kính hiển vi quang học dưới ánh sáng thường ở độ phóng đại x100 và x400 Quan sát kích thước và mật độ của tinh thể calci oxalat (bao gồm tinh thể COM và COD) trong nước tiểu trên 5 vi trường độc lập Xác định số lượng tinh thể calci oxalat trung bình và cho điểm theo thang (bảng 2.1)

Bảng 2.1: Thang điểm phản ánh số lượng tinh thể CaOx trung bình

Số lượng tinh thể calci oxalat trung bình Điểm

2.4.2 Áp dụng mô hình gây sỏi tiết niệu in vivo đã hiệu chỉnh để đánh giá tác dụng ức chế hình thành sỏi tiết niệu của các dược liệu Ý dĩ, Bồ Đề, Xấu hổ và Lâm vồ

2.4.2.1 Thiết kế thí nghiệm

Chuột cống trắng giống đực được chia ngẫu nhiên thành 6 lô:

Tất cả các lô chuột đều được gây sỏi bằng dung dịch EG 0,75% bổ sung vào nước uống hàng ngày Cho chuột ăn với chế độ ăn bình thường

Lô chứng bệnh: Hàng ngày chuột được uống nước cất với thể tích 1ml/100g chuột

Lô chứng dương: Hàng ngày chuột được uống dung dịch natri citrat 25% (kl/tt) với liều 2,5g/kg chuột

Lô Ý dĩ: Hàng ngày cho chuột uống cao lỏng Ý dĩ với liều 2,52g/kg chuột

Lô Bồ Đề: Hàng ngày cho chuột uống cao lỏng Bồ đề với liều 2,52g/kg chuột

Lô Xấu hổ: Hàng ngày cho chuột uống cao lỏng Xấu hổ với liều 2,52g/kg chuột

Lô Lâm vồ: Hàng ngày cho chuột uống cao lỏng Lâm vồ với liều 2,52g/kg chuột

Chuột uống nước cất và các dung dịch theo qui định vào cùng một thời điểm trong ngày trong suốt quá trình thí nghiệm

Thí nghiệm được thực hiện trong 28 ngày

Tại thời điểm kết thúc thí nghiệm, thu gom nước tiểu 5 giờ để xác định thể tích, pH, số lượng và kích thước tinh thể calci oxalat trong nước tiểu Giải phẫu thận chuột để làm mô bệnh học

Quy trình thí nghiệm được mô tả trong hình 2.2:

2.4.2.2 Các thông số đánh giá

 Thể tích nước tiểu

 pH nước tiểu

 Tinh thể niệu

 Mô bệnh học thận

Cách lấy mẫu, xử lý và đánh giá các thông số tương tự như phần 2.4.1.2

Hình 2.2: Quy trình thí nghiệm đánh giá tác dụng của các dược liệu trên mô

hình gây sỏi tiết niệu in vivo

2.4.3 Phương pháp xử lý số liệu

Kết quả được biểu diễn dưới dạng mean SE (mean: giá trị trung bình từng

lô, SE: sai số chuẩn) So sánh giá trị trung bình giữa các lô bằng one-way ANOVA, dùng hậu kiểm Dunnett test để so sánh giá trị trung bình của các lô thử với lô chứng bệnh (với thiết kế nhiều lô) hoặc TTest để so sánh giá trị trung bình của lô chứng bệnh với lô chứng trắng

Với các số liệu không thuộc phân phối chuẩn, kết quả được trình bày dưới dạng trung vị và tứ phân vị Dùng thuật toán Mann – Whitney U test để so sánh kết quả giữa lô thử với lô chứng

Phân tích thống kê bằng phần mềm SPSS 16.0, sự khác biệt giữa các lô được coi là có ý nghĩa khi p < 0,05